Cortisol, the principal glucocorticoid secreted from the adrenal glands, is essential for life. Healthy cortisol levels are maintained through negative feedback on the central nervous system (CNS) – pituitary stimulatory apparatus which regulates production of adrenocorticotropin (ACTH) and contains a light–entrained intrinsic CNS driven diurnal rhythm. Cortisol participates in a regulatory mechanism where inflammatory cytokines stimulate cortisol release and cortisol in turn suppresses cytokine release. The effects of cortisol in inflammatory states include elevating blood pressure and metabolic regulation. This thesis contains three exploratory studies examining circulating cortisolaemia using the best available methodologies (total and free cortisol and corticosteroid-binding globulin (CBG)) in clinical states characterized by immune activation/ inflammation and altered blood pressure. These clinical states include: (1) septic shock, (2) hypertensive disorders of pregnancy and (3) obesity-induced hypertension. Prior to the studies described here, little was know about cortisolaemia in these common pathological states. Septic shock is a life threatening condition that complicates severe infection and is characterized by systemic inflammation and refractory hypotension. High plasma total cortisol levels and attenuated responses to synthetic ACTH stimulation are associated with increased mortality. The use of corticosteroids in septic shock has been highly controversial for decades, however recent trials have reported haemodynamic and survival benefits associated with the use of physiologic steroid replacement in patients with relative adrenal insufficiency (RAI) – currently defined as a total cortisol increment of 248 nmol/L or less following ACTH (250 μg) stimulation. However, CBG and albumin levels fall by around 50% with an increase in plasma free cortisol in critical illness. Hence, total cortisol may not reflect the biologically active free (unbound) cortisol, suggesting that standard assays for plasma cortisol (which measure total plasma cortisol) underestimate HPA axis activity. In this study, we have showed that plasma free cortisol is a better guide to circulating glucocorticoid activity in systemic infection than total cortisol. We have also validated the use of Coolens’ method in estimating free cortisol in systemic infection, using plasma total cortisol and CBG measurements as plasma free cortisol is not performed in clinical laboratories. Free cortisol measurement allows better categorization of RAI and non-RAI groups with a free cortisol increment of 110 nmol/L as cut-off. Moreover, we have shown that survivors of RAI have normal adrenocortical function on follow-up testing suggesting a lack of functional adrenal reserve rather than adrenal damage during critical illness. Larger randomized controlled trials will be required to redefine RAI using free cortisol measurements and relate that to clinical outcomes and responses to corticosteroid therapy. Nitric oxide (NO) is normally produced in the endothelium by the constitutive form of the NO synthase and this physiologic production is important for blood pressure regulation and blood flow distribution. Studies have shown that an overproduction of NO by the inducible form of NO synthase (iNOS) may contribute to the hypotension, cardiodepression and vascular hyporeactivity in septic shock. Clinical studies of non-selective inhibitors of the L-arginine nitric oxide pathway showed increased mortality from cardiovascular complications. However, glucocorticoids, which improve vasopressor sensitivity, may act by partially suppressing NO synthesis through selective direct inhibition of iNOS, and suppression of inflammatory cytokine synthesis. Hence, plasma nitrate/ nitrite (NOx) levels may provide a titratable end point to individualize glucocorticoid therapy in sepsis. The NOx study in this thesis showed that cortisol (total and free), CBG and NOx correlated to illness severity. Free cortisol, and to a lesser extent total cortisol, but not NOx levels, predicted septic shock. NOx levels were characteristically stable within individuals but inter-individual differences were only partly accounted for by illness severity or renal dysfunction. NOx levels correlated weakly with cortisol, did not relate to the need for vasopressors and were not suppressed by hydrocortisone treatment. Thus, NOx is not a suitable target for glucocorticoid therapy in septic shock. Pregnancy is the only sustained physiologic state of hypercortisolism in humans. A large body of data suggests that excessive foetal and prenatal glucocorticoid exposure leads to reduced birth weight and adverse health in offspring such as elevated blood pressure and insulin resistance. Pre-eclampsia and gamete donor pregnancies are associated with immune activation, elevated inflammatory cytokines as well as elevated blood pressure. Prior to the study described in this thesis however, there was no prospective data on maternal cortisolaemia in these complicated pregnancies. My study has demonstrated for the first time that there was a substantial fall in plasma CBG levels in the last few weeks of gestation with a corresponding rise in free cortisol in normal pregnancy, a finding obscured for methodological reasons in past studies. This free cortisol elevation in late pregnancy may facilitate organ maturation in the foetus and perhaps prepare the mother for the metabolic demands of labour. In pre-eclampsia and gestational hypertension, plasma CBG, total and free cortisol levels were lower in late third trimester; and in IUGR, plasma CBG levels were suppressed from 28 weeks gestation until delivery but with no significant difference in plasma total and free cortisol. Women with assisted reproduction using donor gametes/ embryos had significantly lower plasma CBG, total and free cortisol levels even in those with normal pregnancy outcomes. Low CBG may be due to reduced synthesis or enhanced inflammation-driven degradation. Low maternal cortisol may be due to a lack of placental corticotropin-releasing hormone, or reduced maternal ACTH, driving cortisol production. This unanticipated maternal hypocortisolism in complicated pregnancies may trigger precocious activation of the foetal HPA axis and could have implications for postnatal and adult health. Speculatively, since excess prenatal GCs increase HPA axis activity, we proposed that maternal hypocortisolism may predispose to the hypocortisolaemic state characterized by fatigue, pain and stress sensitivity, in offspring. The third state of immune/ inflammatory activation associated with blood pressure dysregulation studied in this thesis is obesity. The epidemiologic relationship between obesity and hypertension is widely recognised. Central obesity in particular has been associated with exaggerated HPA responses to stimuli. Studies of severe dieting and starvation resulted in hypercortisolism and a significant decrease in CBG. The HPA axis and the renin-angiotensin-aldosterone system (RAAS) have been implicated in the pathophysiology of obesity-induced hypertension. However, there is little data on the effect of moderate weight loss (30% caloric restriction) on adrenocortical function, and the relation of adrenal hormones to altered blood pressure with weight loss. In this study, measures of HPA axis and RAAS and blood pressure monitoring were performed in twenty-five obese subjects before and after a 12-week diet program (6000kJ/day). Short-term, moderate weight loss (mean 8.5 kg) was associated with a small reduction in blood pressure (mean arterial pressure 6 mmHg) and significantly reduced levels of aldosterone and renin but not cortisol levels. These findings suggest that aldosterone may have an important role in the blood pressure reduction with weight loss via a renin mediated mechanism, perhaps involving renal sympathetic tone. In contrast to severe caloric restriction, HPA axis activation does not occur with moderate weight loss. This suggests a threshold effect of weight loss on the HPA axis where greater caloric restriction is required for HPA stimulation, or a counterbalancing of central and direct adrenal effects on HPA axis function. Overall, these three exploratory studies have provided novel data on HPA axis function in systemic infection, pregnancy and in diet-induced weight loss. Each study offers a basis for further studies of HPA axis function in these disorders. / http://proxy.library.adelaide.edu.au/login?url= http://library.adelaide.edu.au/cgi-bin/Pwebrecon.cgi?BBID=1289330 / Thesis(Ph.D.)-- School of Medicine, 2007.

Adenomas que se desenvolvem a partir da linhagem corticotrófica (corticotropinomas) secretam ACTH (hormônio adrenocorticotrófico) de modo autônomo. Esta secreção induz a produção crônica e excessiva de cortisol, pelo córtex das glândulas suprarrenais, caracterizando a doença de Cushing (DC). A grande maioria dos adenomas visível à ressonância magnética é microadenoma ( < 10 mm) e apenas 10-30 % dos indivíduos com DC possuem macroadenomas ( > 10 mm), enquanto macroadenomas invasivos são considerados raros. Para investigar os diferentes fenótipos destes tumores, estudamos o padrão de expressão gênica entre microadenomas e macroadenomas, incluindo como critério de classificação sua capacidade de invasão. Utilizando a metodologia de microarray, estudamos 12 amostras de corticotropinomas de indivíduos com diagnóstico clínico, laboratorial e histopatológico de DC (microadenomas não-invasivos n = 4, macroadenomas não-invasivos n = 5 e macroadenomas invasivos n = 3). Além disso, foi investigada a presença de mutações do gene USP8. Observamos que micro e macrocorticotropinomas não-invasivos possuem uma assinatura gênica semelhante, com apenas 48 genes diferencialmente expressos entre si. Por outro lado, macroadenomas invasivos apresentaram um perfil de expressão diferencial mais acentuado, com 168 genes diferencialmente expressos em relação aos não-invasivos (ANOVA p-valor < 0,05; fold change cut off = 2; FDR = 0,05). Nenhum dos pacientes apresentou variantes do USP8. Baseado em sua significância de expressão e funcionalidade, destacamos os genes CCND2, ZNF67 (hiper-expressos, DAPK1 e TIMP2 9 (hipo-expressos). A expressão desses transcritos foi validada por QPCR em 15 corticotropinomas não-invasivos e 3 invasivos, onde 28% destes tumores apresentou mutações somáticas para o gene da USP8. Dentre as vias biológicas comprometidas com pelo menos dois genes hipo ou hiperexpressos estão: via do receptor de Vitamina D, TGF-beta, sinalização por proteína G, resposta ao dano no DNA e controle do ciclo celular. Nossos resultados podem ser úteis para identificar novos marcadores envolvidos no fenótipo invasivo dos corticotropinomas clinicamente ativos. Apesar das funções específicas destes potenciais marcadores ainda precisarem ser elucidadas nos corticotropinomas, nossos resultados podem apresentar um impacto positivo na escolha e eficácia terapêutica, no prognóstico e na previsão de recorrência destes tumores / Adenomas that develop from the corticotrophic lineage (corticotrophinomas) secrete ACTH (adrenocorticotropic hormone) autonomously. This secretion leads to chronic and excessive production of cortisol, by the cortex of the adrenal glands, featuring Cushing\'s disease (CD). Most of the adenomas visible to the MRI are microadenomas (< 10 mm) and macroadenomas (> 10 mm) occur in only 10-30 % of individuals with CD, while invasive macroadenomas, although rare, have great clinical relevance. To investigate the different phenotypes of these tumors, we studied the pattern of differential gene expression between microadenomas and macroadenomas, including their invasiveness as classification a criterion. Using DNA microarray methodology, we studied 12 samples of corticotrophinomas of patients with clinical, laboratory and histopathologic diagnosis of CD (non-invasive microadenomas n = 4, non-invasive macroadenomas n = 5 and invasive macroadenomas n=3). In addition, we investigated the presence of USP8 mutations. We observed that non-invasive corticotrophinomas have a similar genic signature with each other, with only 48 genes differentially expressed between them. Moreover, invasive macroadenomas showed a more pronounced differential expression profile, with 168 differentially expressed genes compared to sellar corticotrophinomas (ANOVA p value < 0.05; fold change cut-off = 2; FDR = 0.05). None of them exhibited USP8 variants. Based on expression significance and functionality, we highlighted CCND2, ZNF676 (overexpressed), DAPK1 and TIMP2 (underexpressed). These results were validated through alfaRT-PCR in another cohort of 15 sellar and 3 invasive corticotrophinomas, in which 28% of these tumors harbored USP8 somatic mutations. Among the biological pathways committed with at least two under or overexpressed genes are: Vitamin D receptor pathway, TGF-beta, G-protein signaling, response to DNA damage and control of the cell cycle. Our results can be useful to identify new markers involved in the invasive phenotype of clinically active corticotrophinomas. Although the specific functions of these potential markers still need to be elucidated in corticotropinomas, our results may have a positive impact on choice and therapeutic efficacy, prognosis and prediction of recurrence of these tumors

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O cetoconazol, inicialmente descrito como um agente antifúngico, revelou-se um potente inibidor da esteroidogênese adrenal, podendo, assim, ser utilizado no manejo da doença de Cushing, como terapia primária ou após insucesso cirúrgico, enquanto aguarda o efeito da radioterapia. Durante o tratamento com cetoconazol, uma redução dos níveis de cortisol é observada, usualmente não acompanhada por uma elevação do ACTH plasmático, como poderia ser esperada. Este fenômeno paradoxal, caracterizado pela redução do cortisol com níveis de ACTH inadequadamente normais ou não elevados, pode estar relacionado a uma ação adicional do cetoconazol nas células hipofisárias produtoras de ACTH. Para se testar essa hipótese, alguns estudos in vitro realizados na década de 80, avaliando a secreção de ACTH na vigência do cetoconazol, sugeriram a sua ação em células adenohipofisárias. Em adição, foi evidenciado que o cetoconazol ativou vias de apoptose em linhagens tumorais não hipofisárias. O presente estudo tem como objetivo avaliar o efeito in vitro do cetoconazol na viabilidade celular e na expressão de genes envolvidos na apoptose e replicação do DNA em linhagens tumorais hipofisárias imortalizadas corticotróficas (AtT-20), gonadotróficas (alfaT3.1), mamossomatotróficas (GH3) e mamotróficas (MMQ), utilizando-se a técnica de RT-qPCR. Os resultados mostraram que, na presença do cetoconazol, ocorreu uma redução da viabilidade celular nas linhagens hipofisárias, de forma concentração-dependente, às custas do estímulo da via extrínseca e intrínseca da apoptose, com aumento da expressão dos receptores de morte celular (ex.: Fas, TNFR) e/ou caspases (ex.: -2, -3, -6 ,-7 ,-9). Estes resultados foram associados a um aumento da expressão gênica dos inibidores do ciclo celular p21 (nas linhagens GH3 e alfaT3.1) e p27 (nas linhagens GH3 e MMQ), com uma redução acentuada da expressão destes genes após retirada do cetoconazol do meio de cultura. Concluímos que o cetoconazol tem o potencial de reduzir a viabilidade celular em linhagens tumorais hipofisárias possivelmente devido a uma ação citotóxica (pelo aumento de genes pró-apoptóticos) e citostática (pelo aumento de genes inibidores do ciclo celular) / Ketoconazole, initially described as an antifungal agent, proved to be a potent inhibitor of steroidogenesis, allowing its use in the management of Cushing\'s disease as primary or after unsuccessfully surgery and waiting the effect of radiotherapy. During treatment with ketoconazole, there a reduction in the cortisol levels is observed, usually not accompanied by an elevation of plasmatic ACTH, as could be expected. This paradoxical phenomenon, characterized by reduced cortisol with ACTH levels inappropriately normal or not elevated, could be related to an additional action of ketoconazole on ACTH-producing pituitary cells. In agreement with this hypothesis, some in vitro studies in the 80\'s, evaluating ACTH secretion in the presence of ketoconazole, suggested its action in pituitary cells. In addition, ketoconazole activated apoptosis pathways in non-pituitary tumor cell lines. Therefore, the present study aims to revisit this topic and evaluate the in vitro effect of ketoconazole on cell viability and expression of genes involved in apoptosis and DNA replication by RT-qPCR in immortalized pituitary tumoral corticotroph (AtT-20), gonadotroph (alphaT3.1), mammosomatotroph (GH3), mammotroph (MMQ) cell line. As a result, there was a reduction in pituitary cell viability with ketoconazole, in a concentration-dependent manner, due to stimulation of the extrinsic and intrinsic pathway of apoptosis, with increased expression of cell death receptors (eg. Fas, TNFR) and/or caspases (eg. -2, -3, -6, -7, -9). These results were associated with an increased gene expression of the cell cycle inhibitors p21 (in GH3 and alphaT3.1 cell line), and also p27 (in GH3 and MMQ cell line), with a significant reduction in the expression of these genes after removal of ketoconazole in the media. In conclusion, the ketoconazole have the potential of reduce cell viability in pituitary tumoral lineages possibly due to a cytotoxic effect (by increasing of pro-apoptotic genes) and cytostatic (by increasing of inhibitors of cell cycle genes)

INTRODUÇÃO: Os adenomas hipofisários são neoplasias benignas que representam cerca de 15% das neoplasias intracranianas. Em sua maioria ocorre de forma esporádica. Estudos moleculares desses adenomas identificaram anormalidades genéticas que podem ter um papel na sua tumorigênese. Dentre alguns desses genes foram descritos os oncogenes GNAS e PTTG e os genes supressores tumorais AIP, CDKN1B e MEG3. OBJETIVO: realizar estudo molecular dos genes associados a tumorigênese através da pesquisa de mutações nos genes GNAS, AIP e CDKN1B e o estudo de expressão gênica de CDKN1B, PTTG e MEG3 em adenomas aparentemente esporádicos, correlacionando com os dados clínicos e laboratoriais, em pacientes acompanhados no serviço de Endocrinologia do HCFMUSP. CASUÍSTICA E MÉTODOS: Compreendeu 96 adenomas hipofisários aparentemente esporádicos: 41 somatotropinomas, 27 corticotropinomas, 21 adenomas clinicamente não funcionantes (ACNF) e 7 prolactinomas. Foi realizada avaliação restrospectiva dos dados clínicos e laboratoriais ao diagnóstico. Após a análise histológica por hematoxilinaeosina, foi realizada análise imunohistoquímica das proteínas Ki-67 e p53 e molecular do DNA genômico e RNA, extraídos do tecido tumoral. Análise mutacional das regiões codificantes de AIP e CDKN1B e dos hotspots de GNAS nos éxons 8 e 9 foi realizada através de amplificação por PCR e sequenciamento automático. A quantificação relativa do RNAm de CDKN1B, MEG3 e PTTG foi avaliada pelo método de 2-??Ct por PCR em tempo real. RESULTADOS: Presença de mutações somáticas no gene GNAS (gsp+) em 14,5% dos adenomas. Não houve diferenças significativas clínicas e laboratoriais entre os adenomas gsp+ e gsp-. Variantes com potencial patogênico não foram identificadas nos genes AIP e CDKN1B. A análise imunohistoquímica do Ki-67 apresentou média de 1,32% (0,9-4,5) e do p53 média de 1,04 (1,0-1,8). O gene CDKN1B apresentou expressão média de ,12 ± 0,74 (0,1-3,1), com expressão mais baixa nos corticotropinomas. O gene PTTG apresentou expressão média de 2,49 ± 3,10 (0,2-19,0), com maior expressão nos corticotropinomas. O gene MEG3 apresentou expressão média de 0,95 ± 1,38 (0,0-8,8), com valores mais baixos nos ACNF. Três padrões de cluster nos níveis de expressão de RNAm dos genes CDKN1B, PTTG e MEG3 foram identificados: cluster A = CDKN1B >= 1,85/ PTTG >= 1,25/ MEG3 >= 0,65 foi observado em 100% dos corticotropinomas; cluster B= CDKN1B >= 0,95/ PTTG >= 2,25/ MEG3 >= 0,65 observado apenas nos somatotropinomas (32%) e o cluster C= CDKN1B >= 0,95/ PTTG >= 1,25/ MEG3 >= 0,05 observado na maioria dos ACNF (73%). CONCLUSÕES: A maioria dos adenomas apresentaram índices de Ki-67 menor do que 3%. Em conformidade com este achado, a imunohistoquímica para p53 não se mostrou estatisticamente significativa. A mutação ativadora na proteína Gs? (gsp+) foi a mutação mais frequente em adenomas hipofisários esporádicos, principalmente em somatotropinomas. Não foram identificadas variantes com potencial patogênico nos genes AIP e CDKN1B, portanto, parece ser um evento raro em adenomas esporádicos. A expressão gênica aumentada do gene PTTG foi identificada principalmente nos corticotropinomas. No entanto, ela não foi preditiva de subtipo de adenoma. A expressão gênica do CDKN1B estava diminuída na maioria dos corticotropinomas e normal na maioria dos somatotropinomas e ACNF. A expressão gênica do MEG3 estava diminuída na maioria dos adenomas ACNF e corticotropinomas e normal na maioria dos somatotropinomas. Na análise de cluster hierárquico, foram identificados três padrões de expressão gênica que se correlacionaram com subtipo de adenoma hipofisário / BACKGROUND: Pituitary adenomas are benign tumors that account for about 15% of intracranial tumors. Mostly occurs sporadically. Molecular studies of these adenomas identified genetic abnormalities that may have a role in tumorigenesis. Some of these genes have been described as the oncogenes GNAS and PTTG and tumor suppressor genes AIP, CDKN1B and MEG3. OBJECTIVE: perform a molecular study of genes related in tumorigenesis to evaluate presence of mutations in GNAS, AIP and CDKN1B genes and gene expression analysis of CDKN1B, PTTG and MEG3 genes in apparently sporadic adenomas, correlating with the clinical and laboratory data from patients treated at the Endocrinology service of HCFMUSP.SUBJECTS AND METHODS: 96 apparently sporadic adenomas was included: 41 somatotropinomas, 27 corticotropinomas, 21 clinically nonfunctioning pituitary adenomas (NFPA) and seven prolactinomas. Retrospective evaluation of clinical and laboratory data from diagnosis. After histological analysis by hematoxylin-eosin staining, it was performed immunohistochemical analysis of Ki -67 and p53 proteins and molecular analysis of genomic DNA and RNA extracted from tumor tissue. Mutational analysis of coding regions of AIP and CDKN1B and hotspots exons 8 and 9 of GNAS was performed by PCR and automatic sequencing. Relative quantification of mRNA CDKN1B, MEG3 and PTTG was evaluated by 2-??Ct method using Real Time PCR. RESULTS: Presence of somatic mutations on GNAS gene (gsp+) in 14,5% of pituitary adenomas. There were no clinical and laboratorial differences between gsp+ and gsp- somatotropinomas. Variants with pathogenic potencial were not identified in AIP and CDKN1B genes. Imunohistochemical analysis showed mean of 1,32% (0,9-4,5) for Ki-67 and mean of 1,04% (1,0-1,8) for p53. Gene expression of CDKN1B presented a mean of 1,12 ± 0,74 (0,1-3,1) with lower expression in corticotropinomas. Gene expression of PTTG presented a mean of 2,49 ± 3,10 (0,2-19,0) with higher expression in corticotropinomas. Gene expression of MEG3 presented a mean of 0,95 ± 1,38 (0,0-8,8) with lower expression in NFPA. Three cluster patterns in the levels of mRNA expression of genes CDKN1B, PTTG and MEG3 were identified: cluster A = CDKN1B >= 1,85/ PTTG >= 1,25/ MEG3 >= 0,65 observed in 100% of corticotropinomas; cluster B= CDKN1B >= 0,95/ PTTG >= 2,25/ MEG3 >= 0,65 observed only in somatotropinomas (32%) and cluster C= CDKN1B >= 0,95/ PTTG >= 1,25/ MEG3 >= 0,05 observed in most of NFPA (73%). CONCLUSIONS: Most of the adenomas showed Ki -67 index lower than 3%. In accordance with this finding, immunohistochemistry for p53 was not statistically significant. The activating mutation in the Gs? protein (gsp+) was the most common mutation in sporadic pituitary adenomas, particularly in somatotropinomas. Variants with pathogenic potential have not been identified in the AIP and CDKN1B gene therefore seems to be a rare event in sporadic adenomas. Increased gene expression of PTTG was primarily identified in corticotropinomas. However, it was not predictive of adenoma subtype. The gene expression of CDKN1B was decreased in most corticotropinomas and normal in most somatotropinomas and NFPA. The gene expression of MEG3 was decreased in most of NFPA and corticotropinomas, and normal in most somatotropinomas. In hierarchical cluster analysis was identified three patterns of gene expression that correlated with pituitary adenoma subtype

INTRODUÇÃO: Os adenomas hipofisários são neoplasias benignas que representam cerca de 15% das neoplasias intracranianas. Em sua maioria ocorre de forma esporádica. Estudos moleculares desses adenomas identificaram anormalidades genéticas que podem ter um papel na sua tumorigênese. Dentre alguns desses genes foram descritos os oncogenes GNAS e PTTG e os genes supressores tumorais AIP, CDKN1B e MEG3. OBJETIVO: realizar estudo molecular dos genes associados a tumorigênese através da pesquisa de mutações nos genes GNAS, AIP e CDKN1B e o estudo de expressão gênica de CDKN1B, PTTG e MEG3 em adenomas aparentemente esporádicos, correlacionando com os dados clínicos e laboratoriais, em pacientes acompanhados no serviço de Endocrinologia do HCFMUSP. CASUÍSTICA E MÉTODOS: Compreendeu 96 adenomas hipofisários aparentemente esporádicos: 41 somatotropinomas, 27 corticotropinomas, 21 adenomas clinicamente não funcionantes (ACNF) e 7 prolactinomas. Foi realizada avaliação restrospectiva dos dados clínicos e laboratoriais ao diagnóstico. Após a análise histológica por hematoxilinaeosina, foi realizada análise imunohistoquímica das proteínas Ki-67 e p53 e molecular do DNA genômico e RNA, extraídos do tecido tumoral. Análise mutacional das regiões codificantes de AIP e CDKN1B e dos hotspots de GNAS nos éxons 8 e 9 foi realizada através de amplificação por PCR e sequenciamento automático. A quantificação relativa do RNAm de CDKN1B, MEG3 e PTTG foi avaliada pelo método de 2-??Ct por PCR em tempo real. RESULTADOS: Presença de mutações somáticas no gene GNAS (gsp+) em 14,5% dos adenomas. Não houve diferenças significativas clínicas e laboratoriais entre os adenomas gsp+ e gsp-. Variantes com potencial patogênico não foram identificadas nos genes AIP e CDKN1B. A análise imunohistoquímica do Ki-67 apresentou média de 1,32% (0,9-4,5) e do p53 média de 1,04 (1,0-1,8). O gene CDKN1B apresentou expressão média de ,12 ± 0,74 (0,1-3,1), com expressão mais baixa nos corticotropinomas. O gene PTTG apresentou expressão média de 2,49 ± 3,10 (0,2-19,0), com maior expressão nos corticotropinomas. O gene MEG3 apresentou expressão média de 0,95 ± 1,38 (0,0-8,8), com valores mais baixos nos ACNF. Três padrões de cluster nos níveis de expressão de RNAm dos genes CDKN1B, PTTG e MEG3 foram identificados: cluster A = CDKN1B >= 1,85/ PTTG >= 1,25/ MEG3 >= 0,65 foi observado em 100% dos corticotropinomas; cluster B= CDKN1B >= 0,95/ PTTG >= 2,25/ MEG3 >= 0,65 observado apenas nos somatotropinomas (32%) e o cluster C= CDKN1B >= 0,95/ PTTG >= 1,25/ MEG3 >= 0,05 observado na maioria dos ACNF (73%). CONCLUSÕES: A maioria dos adenomas apresentaram índices de Ki-67 menor do que 3%. Em conformidade com este achado, a imunohistoquímica para p53 não se mostrou estatisticamente significativa. A mutação ativadora na proteína Gs? (gsp+) foi a mutação mais frequente em adenomas hipofisários esporádicos, principalmente em somatotropinomas. Não foram identificadas variantes com potencial patogênico nos genes AIP e CDKN1B, portanto, parece ser um evento raro em adenomas esporádicos. A expressão gênica aumentada do gene PTTG foi identificada principalmente nos corticotropinomas. No entanto, ela não foi preditiva de subtipo de adenoma. A expressão gênica do CDKN1B estava diminuída na maioria dos corticotropinomas e normal na maioria dos somatotropinomas e ACNF. A expressão gênica do MEG3 estava diminuída na maioria dos adenomas ACNF e corticotropinomas e normal na maioria dos somatotropinomas. Na análise de cluster hierárquico, foram identificados três padrões de expressão gênica que se correlacionaram com subtipo de adenoma hipofisário / BACKGROUND: Pituitary adenomas are benign tumors that account for about 15% of intracranial tumors. Mostly occurs sporadically. Molecular studies of these adenomas identified genetic abnormalities that may have a role in tumorigenesis. Some of these genes have been described as the oncogenes GNAS and PTTG and tumor suppressor genes AIP, CDKN1B and MEG3. OBJECTIVE: perform a molecular study of genes related in tumorigenesis to evaluate presence of mutations in GNAS, AIP and CDKN1B genes and gene expression analysis of CDKN1B, PTTG and MEG3 genes in apparently sporadic adenomas, correlating with the clinical and laboratory data from patients treated at the Endocrinology service of HCFMUSP.SUBJECTS AND METHODS: 96 apparently sporadic adenomas was included: 41 somatotropinomas, 27 corticotropinomas, 21 clinically nonfunctioning pituitary adenomas (NFPA) and seven prolactinomas. Retrospective evaluation of clinical and laboratory data from diagnosis. After histological analysis by hematoxylin-eosin staining, it was performed immunohistochemical analysis of Ki -67 and p53 proteins and molecular analysis of genomic DNA and RNA extracted from tumor tissue. Mutational analysis of coding regions of AIP and CDKN1B and hotspots exons 8 and 9 of GNAS was performed by PCR and automatic sequencing. Relative quantification of mRNA CDKN1B, MEG3 and PTTG was evaluated by 2-??Ct method using Real Time PCR. RESULTS: Presence of somatic mutations on GNAS gene (gsp+) in 14,5% of pituitary adenomas. There were no clinical and laboratorial differences between gsp+ and gsp- somatotropinomas. Variants with pathogenic potencial were not identified in AIP and CDKN1B genes. Imunohistochemical analysis showed mean of 1,32% (0,9-4,5) for Ki-67 and mean of 1,04% (1,0-1,8) for p53. Gene expression of CDKN1B presented a mean of 1,12 ± 0,74 (0,1-3,1) with lower expression in corticotropinomas. Gene expression of PTTG presented a mean of 2,49 ± 3,10 (0,2-19,0) with higher expression in corticotropinomas. Gene expression of MEG3 presented a mean of 0,95 ± 1,38 (0,0-8,8) with lower expression in NFPA. Three cluster patterns in the levels of mRNA expression of genes CDKN1B, PTTG and MEG3 were identified: cluster A = CDKN1B >= 1,85/ PTTG >= 1,25/ MEG3 >= 0,65 observed in 100% of corticotropinomas; cluster B= CDKN1B >= 0,95/ PTTG >= 2,25/ MEG3 >= 0,65 observed only in somatotropinomas (32%) and cluster C= CDKN1B >= 0,95/ PTTG >= 1,25/ MEG3 >= 0,05 observed in most of NFPA (73%). CONCLUSIONS: Most of the adenomas showed Ki -67 index lower than 3%. In accordance with this finding, immunohistochemistry for p53 was not statistically significant. The activating mutation in the Gs? protein (gsp+) was the most common mutation in sporadic pituitary adenomas, particularly in somatotropinomas. Variants with pathogenic potential have not been identified in the AIP and CDKN1B gene therefore seems to be a rare event in sporadic adenomas. Increased gene expression of PTTG was primarily identified in corticotropinomas. However, it was not predictive of adenoma subtype. The gene expression of CDKN1B was decreased in most corticotropinomas and normal in most somatotropinomas and NFPA. The gene expression of MEG3 was decreased in most of NFPA and corticotropinomas, and normal in most somatotropinomas. In hierarchical cluster analysis was identified three patterns of gene expression that correlated with pituitary adenoma subtype

O cetoconazol, inicialmente descrito como um agente antifúngico, revelou-se um potente inibidor da esteroidogênese adrenal, podendo, assim, ser utilizado no manejo da doença de Cushing, como terapia primária ou após insucesso cirúrgico, enquanto aguarda o efeito da radioterapia. Durante o tratamento com cetoconazol, uma redução dos níveis de cortisol é observada, usualmente não acompanhada por uma elevação do ACTH plasmático, como poderia ser esperada. Este fenômeno paradoxal, caracterizado pela redução do cortisol com níveis de ACTH inadequadamente normais ou não elevados, pode estar relacionado a uma ação adicional do cetoconazol nas células hipofisárias produtoras de ACTH. Para se testar essa hipótese, alguns estudos in vitro realizados na década de 80, avaliando a secreção de ACTH na vigência do cetoconazol, sugeriram a sua ação em células adenohipofisárias. Em adição, foi evidenciado que o cetoconazol ativou vias de apoptose em linhagens tumorais não hipofisárias. O presente estudo tem como objetivo avaliar o efeito in vitro do cetoconazol na viabilidade celular e na expressão de genes envolvidos na apoptose e replicação do DNA em linhagens tumorais hipofisárias imortalizadas corticotróficas (AtT-20), gonadotróficas (alfaT3.1), mamossomatotróficas (GH3) e mamotróficas (MMQ), utilizando-se a técnica de RT-qPCR. Os resultados mostraram que, na presença do cetoconazol, ocorreu uma redução da viabilidade celular nas linhagens hipofisárias, de forma concentração-dependente, às custas do estímulo da via extrínseca e intrínseca da apoptose, com aumento da expressão dos receptores de morte celular (ex.: Fas, TNFR) e/ou caspases (ex.: -2, -3, -6 ,-7 ,-9). Estes resultados foram associados a um aumento da expressão gênica dos inibidores do ciclo celular p21 (nas linhagens GH3 e alfaT3.1) e p27 (nas linhagens GH3 e MMQ), com uma redução acentuada da expressão destes genes após retirada do cetoconazol do meio de cultura. Concluímos que o cetoconazol tem o potencial de reduzir a viabilidade celular em linhagens tumorais hipofisárias possivelmente devido a uma ação citotóxica (pelo aumento de genes pró-apoptóticos) e citostática (pelo aumento de genes inibidores do ciclo celular) / Ketoconazole, initially described as an antifungal agent, proved to be a potent inhibitor of steroidogenesis, allowing its use in the management of Cushing\'s disease as primary or after unsuccessfully surgery and waiting the effect of radiotherapy. During treatment with ketoconazole, there a reduction in the cortisol levels is observed, usually not accompanied by an elevation of plasmatic ACTH, as could be expected. This paradoxical phenomenon, characterized by reduced cortisol with ACTH levels inappropriately normal or not elevated, could be related to an additional action of ketoconazole on ACTH-producing pituitary cells. In agreement with this hypothesis, some in vitro studies in the 80\'s, evaluating ACTH secretion in the presence of ketoconazole, suggested its action in pituitary cells. In addition, ketoconazole activated apoptosis pathways in non-pituitary tumor cell lines. Therefore, the present study aims to revisit this topic and evaluate the in vitro effect of ketoconazole on cell viability and expression of genes involved in apoptosis and DNA replication by RT-qPCR in immortalized pituitary tumoral corticotroph (AtT-20), gonadotroph (alphaT3.1), mammosomatotroph (GH3), mammotroph (MMQ) cell line. As a result, there was a reduction in pituitary cell viability with ketoconazole, in a concentration-dependent manner, due to stimulation of the extrinsic and intrinsic pathway of apoptosis, with increased expression of cell death receptors (eg. Fas, TNFR) and/or caspases (eg. -2, -3, -6, -7, -9). These results were associated with an increased gene expression of the cell cycle inhibitors p21 (in GH3 and alphaT3.1 cell line), and also p27 (in GH3 and MMQ cell line), with a significant reduction in the expression of these genes after removal of ketoconazole in the media. In conclusion, the ketoconazole have the potential of reduce cell viability in pituitary tumoral lineages possibly due to a cytotoxic effect (by increasing of pro-apoptotic genes) and cytostatic (by increasing of inhibitors of cell cycle genes)

Introdução: Alterações nos eixos Hipotálamo-Hipófise-Adrenal (HHA) e Hipotálamo-Hipófise-Tireóide (HHT) estão associados a depressão. Objetivo: Avaliar a associação entre depressão e alterações nos eixos HHA, HHT e o estresse precoce (EP) em deprimidos. Metodologia: Foram avaliados 52 deprimidos e 52 voluntários com idade entre 18 e 45 anos. O diagnóstico de depressão foi baseado no DSM-IV e MINI. A gravidade da depressão foi avaliada pela HAM-D-17 e pelo IDB. Foram aplicados o CTQ buscando avaliar eventos estressantes na infância, além de questionário sócio-demográfico e clínico. Voluntários foram pareados segundo sexo, idade, IMC e submetidos aos mesmos questionários. Foram realizadas dosagem de TSH, T4 livre, anticorpos anti TPO e ATG, Cortisol plasmático, ACTH, DHEA-s, lipidograma, glicemia de jejum e cortisol salivar em 05 tempos. Resultados: Todos os deprimidos apresentaram história de EP. Houve concentrações maiores de TSH, anti TPO, anti TG, cortisol plasmático e salivar, ACTH, colesterol total, LDL, VLDL, triglicérides, AUC 8-23 e AUC0-30-60, além de concentrações menores de DHEA-s e HDL em casos do que controles, considerando a primeira e segunda coleta de dados e conforme a amostra estudada. Houve correlações entre as variáveis estudadas. Conclusão: O EP foi um dos fatores de risco para depressão. Achados desse estudo confirmam a literatura quando se compara deprimidos com controles e se relaciona depressão com os eixos HHT, HHA e o EP. Esse foi o primeiro estudo em que se comparou todas as variáveis supracitadas em pessoas CEP e SEP, gerando resultados positivos, além de revelar diferenças de gênero conforme o resultado. / Introduction: Changes in the axis hypothalamus-pituitary-adrenal (HPA) and hypothalamic-pituitary-thyroid (HPT) are associated with depression. Objective: Evaluating the association among depression and changes in the HPA, HPT axes and early stress (ES) in depressed. Methodology: A total of 52 depressed and 52 volunteers aged between 18 and 45 years were evaluated. Depression diagnosis was based on DSM-IV and MINI. The severity of depression was assessed by HAM-D-17 and BDI. The CTQ were applied for assessing stressful events in childhood, as well as socio-demographic and clinical questionnaire. Volunteers were paired by gender, age, BMI, and underwent the same questionnaires. TSH measurement was performed, free T4, anti TPO and ATG antibodies, plasma cortisol, ACTH, DHEA-s, lipid profile, fasting glucose and salivary cortisol in 05 times. Results: All depressed had history of ES. There were higher concentrations of TSH, anti TPO, anti TG, plasma and salivary cortisol, ACTH, total cholesterol, LDL, VLDL, triglycerides, AUC 8-23 and AUC0-30-60 and lower concentrations of DHEA-s and HDL in cases than controls, taking into account the first and second data collection and according to the studied sample. There were correlations between variables. Conclusion: The ES was one of the risk factors for depression. Findings of this study confirm the literature when compared depressed with controls and associated depression with HPT, HPA axes and ES. This was the first study in which we compared all the above variables in people WES and WOES, generating positive results and revealed gender differences according to result.

As sirtuínas 1-7 (SIRT) constituem uma família altamente conservada de desacetilases de histonas que, de modo geral, participam da regulação da longevidade em diversos organismos, modulando a resposta celular frente ao stress oxidativo e promovendo mecanismo de reparo de DNA, parada do ciclo celular, estabilidade telomérica, senescência e apoptose celulares. O envolvimento das SIRTs no processo tumorigênico tem sido bastante investigado, contudo ainda não existe descrição do estudo desses genes nos adenomas hipofisários. O objetivo desse estudo foi avaliar a expressão gênica das SIRT1-7 nos somatotropinomas e adenomas hipofisários clinicamente não funcionantes (ACNF) e sua relação com o tamanho e a invasividade do tumor. A expressão das sirtuínas foi ainda correlacionada à expressão dos marcadores de senescência CDKN1A (p21) e CDKN2A (p16) e do proto-oncogene PTTG (pituitary tumor transforming gene). Foram selecionados 68 pacientes, 37 somatotropinomas e 31 portadores de ACNF. Desses casos, 33 apresentavam tumores invasivos e 35 eram não invasivos. A quantificação do RNAm das SIRT1-7, CDKN1A, CDKN2A e PTTG foi realizada nas amostras tumorais pela técnica de PCR em tempo real utilizando o método de quantificação relativa 2-??Ct. A hiperexpressão da SIRT1 foi observada em 86,5% dos somatotropinomas versus 41,9% dos ACNF (P < 0.01), não sendo observada perda de expressão desse gene. A SIRT3 foi mais hipoexpressa nos ACNF em relação aos somatotropinomas (77,4% e 40,5%, respectivamente; P < 0.01). A SIRT4 foi hipo e hiperexpressa, respectivamente, em 45,2% e 12,9% dos ACNF e 16,2% e 24,3% dos somatotropinomas (P=0.03). A hipoexpressão da SIRT7 também foi maior nos ACNF (67,7%) versus somatotropinomas (32,4%; P=0.01) e, para ambos os subtipos, o percentual de casos apresentando hiperexpressão desse RNAm foi baixo. O padrão de expressão das SIRT2 e 5 não diferiu entre os subtipos tumorais e não se mostrou alterado em relação ao pool de hipófises normais. Não foi observada diferença estatisticamente significante na expressão dos genes das sirtuínas entre os grupos de tumores invasivos e não invasivos. Contudo, a expressão das SIRT1 e 3 foi relacionada ao tamanho tumoral; nos casos com hiperexpressão da SIRT1 a média do maior diâmetro tumoral foi 2.4 ± 1.1 enquanto nos pacientes com expressão normal foi de 3.3 ± 1.3 (P < 0.01). Já os casos com perda de expressão da SIRT3 apresentaram tumores maiores (3.1 ± 1.2) em relação aos casos com expressão normal (2.2 ± 1.1; P < 0.01). A expressão de todas as SIRTs apresentou correlação positiva moderada (SIRT1-5,7) ou forte (SIRT6) com a expressão do CDKN1A. Uma correlação positiva foi observada também em relação a expressão do CDKN2A. Contudo, essa foi fraca e presente apenas para as SIRTs 3-5. Em relação ao PTTG, foi observado apenas uma fraca correlação com a expressão da SIRT1 e SIRT3. Em conclusão, esses resultados sugerem que a hiperexpressão de SIRT1 e a hipoexpressão das SIRTs 3, 4 e 7 podem estar relacionadas ao processo tumorigênico nos somatotropinomas e ACNFs, respectivamente e, em especial as SIRT1 e 3, ao controle da proliferação celular nesses adenomas / Sirtuins 1-7 (SIRT) are a highly conserved family of histone deacetylases. In general, these proteins are involved in the regulation of longevity in several organisms, modulating the cellular response to oxidative stress. SIRTs can also regulate DNA repair, telomeric stability, cell senescence and apoptosis. Due to their functions, there is a growing interest in the role of sirtuins in tumorigenesis. However, these genes were not investigated in pituitary tumors so far. In this study, SIRT1-7 gene expression was evaluated in somatotropinomas and nonfunctioning pituitary adenomas (NFPA) and related to tumor size and invasiveness. SIRT1-7 expression was also correlated with cellular senescence markers CDKN1A (p21) e CDKN2A (p16) and with the proto-oncogene PTTG (pituitary tumor transforming gene). Sixty-eight patients were selected, 37 with somatotropinomas and 31 with NFPA. Tumor invasion was observed in 33 patients. SIRT1-7, CDKN1A, CDKN2A and PTTG mRNA levels was evaluated from pituitary tumor samples by the real-time PCR using 2-??Ct relative quantification. Pronounced differences in SIRT1, 3, 4 and 7 expressions were identified between somatotropinomas and NFPA. Overexpression of SIRT1 was observed in 86.5% of somatotropinomas versus 41.9% of NFPA (P < 0.01) whereas underexpression was not detected. SIRT3 was more underexpressed in NFPA than somatotropinomas (77.4% and 40.5%, respectively, P < 0.01). SIRT4 was under and overexpressed, respectively, in 45.2% and 12.9% of NFPA and 16.2% and 24.3% of somatotropinomas (P=0.03). SIRT7 underexpression was also higher in NFPAs (67.7%) versus somatotropinomas (32.4%; P=0.01) with few cases showing overexpression. SIRT2 and 5 expressions did not differ between tumors subtypes and was not altered in relation to the normal pituitary gland pool. No statistically significant difference was observed in the expression of these genes between invasive and non-invasive tumor groups. However, SIRT1 and 3 expressions were related to tumor size. Mean of the largest tumor diameter was 2.4 ± 1.1 and 3.3 ± 1.3 (P < 0.01) in adenomas with SIRT1 over- and normal expression, respectively. On the other hand, cases with SIRT3 underepression exhibited larger tumors (3.1 ± 1.2) compared to cases with SIRT3 normal expression (2.2 ± 1.1, P < 0.01). Moderated (SIRT1-5.7) or strong (SIRT6) positive correlation was observed between sirtuins and CDKN1A expression. A weak correlation was observed with respect to CDKN2A expression and SIRTs 3-5. Regarding PTTG mRNA, only a weak correlation with SIRT1 and SIRT3 expression was observed. In conclusion, these results suggest that overexpression of SIRT1 and underexpression of SIRTs 3, 4 and 7 could be related to the tumorigenic process in somatotropinomas and NFPAs, respectively. SIRT1 and 3 could also play a role in control of pituitary adenomas cell proliferation

Introdução: Alterações nos eixos Hipotálamo-Hipófise-Adrenal (HHA) e Hipotálamo-Hipófise-Tireóide (HHT) estão associados a depressão. Objetivo: Avaliar a associação entre depressão e alterações nos eixos HHA, HHT e o estresse precoce (EP) em deprimidos. Metodologia: Foram avaliados 52 deprimidos e 52 voluntários com idade entre 18 e 45 anos. O diagnóstico de depressão foi baseado no DSM-IV e MINI. A gravidade da depressão foi avaliada pela HAM-D-17 e pelo IDB. Foram aplicados o CTQ buscando avaliar eventos estressantes na infância, além de questionário sócio-demográfico e clínico. Voluntários foram pareados segundo sexo, idade, IMC e submetidos aos mesmos questionários. Foram realizadas dosagem de TSH, T4 livre, anticorpos anti TPO e ATG, Cortisol plasmático, ACTH, DHEA-s, lipidograma, glicemia de jejum e cortisol salivar em 05 tempos. Resultados: Todos os deprimidos apresentaram história de EP. Houve concentrações maiores de TSH, anti TPO, anti TG, cortisol plasmático e salivar, ACTH, colesterol total, LDL, VLDL, triglicérides, AUC 8-23 e AUC0-30-60, além de concentrações menores de DHEA-s e HDL em casos do que controles, considerando a primeira e segunda coleta de dados e conforme a amostra estudada. Houve correlações entre as variáveis estudadas. Conclusão: O EP foi um dos fatores de risco para depressão. Achados desse estudo confirmam a literatura quando se compara deprimidos com controles e se relaciona depressão com os eixos HHT, HHA e o EP. Esse foi o primeiro estudo em que se comparou todas as variáveis supracitadas em pessoas CEP e SEP, gerando resultados positivos, além de revelar diferenças de gênero conforme o resultado. / Introduction: Changes in the axis hypothalamus-pituitary-adrenal (HPA) and hypothalamic-pituitary-thyroid (HPT) are associated with depression. Objective: Evaluating the association among depression and changes in the HPA, HPT axes and early stress (ES) in depressed. Methodology: A total of 52 depressed and 52 volunteers aged between 18 and 45 years were evaluated. Depression diagnosis was based on DSM-IV and MINI. The severity of depression was assessed by HAM-D-17 and BDI. The CTQ were applied for assessing stressful events in childhood, as well as socio-demographic and clinical questionnaire. Volunteers were paired by gender, age, BMI, and underwent the same questionnaires. TSH measurement was performed, free T4, anti TPO and ATG antibodies, plasma cortisol, ACTH, DHEA-s, lipid profile, fasting glucose and salivary cortisol in 05 times. Results: All depressed had history of ES. There were higher concentrations of TSH, anti TPO, anti TG, plasma and salivary cortisol, ACTH, total cholesterol, LDL, VLDL, triglycerides, AUC 8-23 and AUC0-30-60 and lower concentrations of DHEA-s and HDL in cases than controls, taking into account the first and second data collection and according to the studied sample. There were correlations between variables. Conclusion: The ES was one of the risk factors for depression. Findings of this study confirm the literature when compared depressed with controls and associated depression with HPT, HPA axes and ES. This was the first study in which we compared all the above variables in people WES and WOES, generating positive results and revealed gender differences according to result.