Orientadores: Nicola Amanda Conran Zorzetto, Fernando Ferreira Costa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-23T06:18:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Proenca-Ferreira_Renata_D.pdf: 5501623 bytes, checksum: d6f51a08081eca63858550d8e3d423fd (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A anemia falciforme (AF) é uma doença causada por uma mutação de ponto (troca do aminoácido glutâmico pela valina), que resulta na síntese de uma hemoglobina anômala, a hemoglobina S (HbS). A principal causa de morbidade para portadores de AF é a vaso-oclusão, que resulta da adesão anormal de células vermelhas e brancas ao endotélio, e consequêntemente diminui o fluxo sanguíneo. As plaquetas de pacientes AF apresentam um aumento das suas propriedades adesivas, e por isso, sugere-se a sua participação no processo de vaso-oclusão. Nossos dados mostraram que essas plaquetas são capazes de ativarem células endoteliais, in vitro, em ensaios de co-culturas com células endoteliais de veia umbilical humana (HUVEC) com plaquetas. A expressão da molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1) e a da E-selectina das células HUVEC aumentou significativamente na sua superfície, após a sua co-incubação com plaquetas de pacientes AF. A ativação das moléculas de adesão depende do contato físico entre plaquetas e células HUVEC, pois a utilização de insertos de transwell inibiu significativamente a expressão de ICAM-1 e E-selectina na superfície das HUVEC. A co-incubação de plaquetas de pacientes AF com as células HUVEC resultou em uma maior produção e liberação de mediadores inflamatórios (citocinas); a interleucina 8 (IL-8) e da interleucina 1 beta (IL-1?) quantificadas do sobrenadante das co-culturas com essas células. As plaquetas desses pacientes possuem propriedades inflamatórias, pois liberaram mais fator plaquetário 4 (PF4), uma quimiocina pró-agregante, quantificada do sobrenadante de cultura dessas plaquetas, em relação às plaquetas de indivíduos saudáveis. O aumento na expressão das moléculas de adesão, integrina ?IIb?3 e P-selectina, na superfície das plaquetas de pacientes AF, podem indicar que há um aumento na sua ativação plaquetária, favorecendo a sua adesão ao endotélio inflamado. O fator nuclear-?B (NF-?B) é um fator de transcrição nuclear muito importante envolvido na ativação de genes, como genes que codificam de moléculas de adesão endotelial, e os nossos resultados de expressão gênica mostraram que há um aumento na expressão do gene NF?BIA (subunidade p50 do NF-?B), em associação com o aumento na expressão do gene ICAM1 (que codifica a molécula de adesão ICAM-1) em HUVEC, após co-cultura dessas células com plaquetas de pacientes AF. A presença do inibidor BAY 11-7082 (inibe a via de sinalização NF-?B), diminuiu a expressão das moléculas de adesão ICAM-1 e E-selectina na superfície das células HUVEC, quando co-incubadas com plaquetas de pacientes AF. Os nossos dados são importantes e corroboram com a nossa hipótese de que as plaquetas participam no processo de vaso-oclusão na anemia falciforme, pois apresentam a capacidade de ativar células endoteliais (in vitro) tornando-as inflamatórias e mais adesivas. Portanto, sugerimos que as plaquetas representam um importante alvo para novas abordagens terapêuticas na anemia falciforme / Abstract: Sickle cell anemia (SCA) is a disease caused by a point mutation (causing the exchange of glutamic acid for valine), which results in the synthesis of an abnormal hemoglobin, hemoglobin S (HbS). The principal cause of morbidity in patients with SCA is vaso-occlusion, which results from the abnormal adhesion of red blood cells and white cells to blood vessel walls, leading to decreases in blood flow. Platelets from SCA patients present an increase in their adhesive properties and, therefore, we have previously suggested that they may participate in the vaso-occlusive process. Our current data show that platelets from SCA patients are able to activate endothelial cells, in vitro, in co-culture assays using Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) that were co-incubated with platelets from SCA patients. The expression of intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) and E-selectin was significantly increased on the surface of HUVEC cells after their co-incubation with platelets from SCA patients (SCA platelets). The activation of adhesion molecule expression observed depended on the physical contact between platelets and HUVEC cells, as transwell inserts were able to significantly inhibit the expression of ICAM-1 and E-selectin on HUVEC following their culture in the presence of SCA platelets. The co-incubation of SCA platelets with HUVEC cells also resulted in a higher production and release of inflammatory mediators (cytokines), such as interleukin 8 (IL-8) and interleukin 1 beta (IL-1?) in the supernatant of these co-cultures. Platelets from SCA patients have inflammatory properties, releasing more platelet factor 4 (PF4), a pro-aggregating chemokine, than platelets from healthy subjects. The increased expression of the adhesion molecules, integrin ?IIb?3 and P-selectin, on the surface of platelets from SCA patients, may also indicate an increased platelet activation, favoring their adhesion to the inflamed endothelium. Nuclear factor-?B (NF-?B) is an important nuclear transcription factor involved in the activation of genes, including endothelial adhesion molecules genes. We found an increased gene expression of NF?BIA (encoding the p50 subunit of NF-kB), in association with increased gene expression of ICAM1 (encodes ICAM-1) in HUVEC, following the co-culture of these cells with platelets from SCA patients. The presence of the BAY 11-7082 inhibitor (inhibits the NF-?B signaling pathway) decreased the expressions of the ICAM-1 and E-selectin adhesion molecules on the surface of HUVEC cells when co-incubated with platelets from SCA patients. Our data corroborate our hypothesis that platelets probably participate in the process of vaso-occlusion in sickle cell anemia, since they have the ability to activate endothelial cells (in vitro), in turn, making them more inflammatory and adhesive. As such, we suggest that platelets represent an important target for new therapeutic approaches in sickle cell anemia / Doutorado / Clinica Medica / Doutora em Clínica Médica

Orientador: Marta Helena Krieger / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T15:25:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_MarianaGoncalvesde_M.pdf: 2027053 bytes, checksum: c424b2043397f6d28d8adebb3fc72bd3 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O óxido nítrico (NO) é um multifuncional agente biológico que nas últimas décadas tem sido alvo de uma infinidade de estudos e constitui hoje um dos mais importantes mediadores de processos intra e extracelulares. Diversos estudos demonstram sua capacidade de prevenção da ativação e adesão plaquetária ou leucocitária e inibição da proliferação e migração de células musculares lisas vasculares (VSMCs), entretanto, em condições de baixa disponibilidade do NO esses processos são prejudicados. Atualmente há o grande interesse no desenvolvimento de compostos capazes de liberar NO de forma modulada e estável, e, nesse sentido, os complexos nitrosilos de rutênio têm se destacado por suas características excepcionais. É amplamente reconhecido que a modulação fenotípica de VSMCs tem papel crítico na progressão de diversas doenças vasculares proeminentes. Sabe-se que o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF-BB) é um dos principais estimulantes desse processo. Este estudo se propôs a caracterizar os efeitos inibitórios do complexo de rutênio trans-[Ru(NO)Cl(cyclam)](PF6)2, nomeado Ru(cyclam)NO, na modulação fenotípica, resposta proliferativa e migratória de VSMCs induzidas por PDGF-BB. VSMCs foram obtidas por técnica de cultura primária. A citotoxicidade do complexo, na faixa de concentração de 100 ?M a 1500 ?M, foi determinada em ensaios de redução do MTT e incorporação neutral red (NR), e comparadas a do nitroprussiato de sódio (SNP). A concentração 100 ?M foi definida para os demais protocolos experimentais. Western blotting, ensaios transwell e wound healing, e incorporação de timidina triciada foram utilizados para determinação da modulação fenotípica, migração e proliferação celular, respectivamente, e níveis de nitrato no meio foram determinados por quimiluminescência para avaliação do perfil de liberação de NO. O complexo demonstrou baixa citotoxicidade, mesmo na maior concentração e após 48 horas de exposição, reduzindo ao máximo em 30% a porcentagem de células viáveis em ambos os ensaios, demonstrando ser menos tóxico que o SNP. Níveis de nitrato no meio atigiram a concentração máxima após 30 minutos (11 ?M ± 4,8), de maneira mais lenta em relação ao SNP, cuja concentração máxima foi após 5 minutos (13 ?M ± 3,7). A proliferação das VSMCs induzida por PDGF-BB foi inibida, reduzindo à metade a radioatividade incorporada, bem como a expressão do marcador de proliferação PCNA. Observou-se redução de 45% na migração induzida por PDGF-BB nos ensaios transwell, e no wound-healing, embora qualitativo, a redução é notável. A modulação fenotípica da VSMC foi observada pela redução em 60% da expressão da proteína alfa-actina, característica do fenótipo maduro, e foi quase totalmente prevenida pelo tratamento com o complexo. Tal prevenção pode ser mediada pelo fator de transcrição ELK-1, que favorece a expressão de genes de diferenciação, e cuja fosforilação foi estimulada pelo PDGF-BB, porém inibida em quase 50% pelo pré-tratamento com Ru(cyclam)NO. As respostas observadas nos tratamentos com Ru(cyclam)NO foram promissoras, e, embora seu mecanismo de ação x ainda não esteja completamente esclarecido, este complexo demonstrou atividade biológica singular, e sua aplicação em condições clínicas onde há descontrole de processos de proliferação e migração de VSMCs, como a reestenose, apresenta-se como uma proposta interessante / Abstract: Nitric oxide (NO) is a multifuctional biological agent that in the recent decades has been the subject of a plethora of studies and today is one of the most important intracellular and extracellular processes mediators. Several studies have demonstrated its ability to prevent leukocyte or platelet adhesion and activation, and inhibition of vascular smooth muscle cells (VSMCs) proliferation and migration. However, low availability of NO conditions determines impairement of these processes. There is a keen interest in the development of compounds capable of releasing NO modulated so stable, and the nitrosyl ruthenium complexes have gained prominence for its exceptional features. It is widely recognized that the phenotypic modulation of VSMCs, and its uncontrolled proliferation and migration, plays a critical role in the progression of several prominent vascular diseases. It is known that the platelet-derived growth factor (PDGF) is a primary stimulant of the process. This study aimed to determine the inhibitory effects of the ruthenium complex NO donor trans-[Ru(NO)Cl(cyclam)](PF6)2, named Ru(cyclam)NO, in the phenotypic switching, on migratory and proliferative responses of VSMCs induced by PDGF-BB, and its biological response. VSMCs were obtained from primary culture methodology. The complex cytotoxicity were determined by MTT reduction and incorporation of neutral red (NR) assays, in the range of concentration from 100 ?M to 1500 ?M, and compared to sodium nitroprusside (SNP). For the following experimental protocols the concentration of the 100 ?M was set. Western blotting, transwell and wound healing assays, and incorporation of tritiated thymidine were used for determination of phenotypic switching, cell migration and proliferation, respectively. Evaluation of the NO profile release was determined as nitrate levels in the culture medium by chemiluminescence. The complex Ru(cyclam)NO showed low cytotoxicity even at the highest concentration evaluated and after 48 hours of exposition, reducing only 30% the percentage of viable cells in both trials, showing be less toxic than the SNP. Medium nitrate levels exibhited the highest concentration after 30 min (11 ?M ± 4.8), slower when compared to SNP, which reached the maximum concentration after 5 minutes (13 ?M ± 3.7). The proliferation of VSMCs induced by PDGF-BB was inhibited by half of the radioactivity incorporated counting, as well as the reduction on the expression of the proliferation marker PCNA. Observed a reduction by 45% in the migration induced by PDGF-BB determined in transwell assays, and on the wound-healing, although a qualitative result, the reduction of migration induced by PDGF-BB. The 60% reduction by PDGF-BB treatment of the contractile protein expression ?-SMA, characteristic of mature phenotype, revealed the modulation of VSMCs phenotype, and it was almost completely prevented by treatment with the complex. Such prevention was associated with inhibition by almost 50% of phosphorylation of the transcription factor ELK-1 stimulated by PDGF-BB. The responses determined with complex treatments revealed promising for future development of cardiovascular devices. Although its xii mechanism of action is not completely understood, this complex showed singular biological activity, and its application in some clinical conditions where there is uncontrolled proliferation and migration of VSMCs presents as a substancial proposal / Mestrado / Fisiologia / Mestra em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Maria Helena Andrade Santana, William Dias Belangero / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química / Made available in DSpace on 2018-08-23T23:34:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Perez_AmandaGomesMarcelino_D.pdf: 5504365 bytes, checksum: dfd77169a41938bfecc5af20b2eddd27 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O plasma rico em plaquetas (PRP) é um tratamento autólogo, portanto não imunogênico, capaz de estimular e acelerar a regeneração tecidual. A qualidade do PRP preparado é fundamental para o sucesso da sua aplicação clínica. Apesar do intenso uso desta terapia em diversas áreas da medicina, as condições de preparação reportadas na literatura são muito dispersas e, juntamente com a natureza autóloga do produto e com a falta de caracterização dos diferentes PRPs, dificultam a interpretação dos dados da literatura e a comparação de resultados clínicos. Portanto, profissionais e estudiosos reivindicam a padronização do PRP como base para os estudos clínicos. Entretanto, a padronização do PRP exige estudos de ciência básica, os quais ainda são muito escassos. Tal como citado na literatura, devido à natureza autóloga do PRP o problema não é necessariamente estudar o PRP, mas antes o desenvolvimento desses estudos. Buscando contemplar estes aspectos, neste trabalho desenvolveu-se inicialmente uma estratégia de estudo para análise integrada das etapas do processo de preparação do PRP, de modo a tornar factível o delineamento das propriedades das formulações em função das condições de preparação, com um número reduzido de experimentos. Essa estratégia foi aplicada ao P-PRP, um PRP rico em plaquetas e pobre em leucócitos. A análise dos resultados permitiu selecionar três arquiteturas de géis de fibrina, derivados da ativação de plaquetas íntegras, como representativos de uma ampla gama de condições de ativação das plaquetas. Esses géis foram caracterizados quanto às propriedades reológicas, à liberação dos seus fatores de crescimento (FCS), o tempo de gelificação e à capacidade de sustentação do crescimento de células mesenquimais derivadas no tecido adiposo humano (hADSCs). Em uma segunda etapa, os estudos envolveram a incorporação do PRP em géis de ácido hialurônico visando proteção e liberação gradual dos seus FCs e seu desempenho como scaffolds no cultivo de hADSCs . Os resultados obtidos contribuem para a padronização do P-PRP, e também abrem novas possibilidades para utilização dos scaffolds naturais de fibrina em combinação com ácido hialurônico. / Abstract: Platelet Rich Plasma (PRP) is an autologous, no immunogenic therapy, which is able to stimulate and accelerate tissue regeneration. The PRP quality is essential for success in clinical applications. Despite the widely use of PRP therapy in different areas of medicine, the preparation conditions described in literature are dispersed and, together with the autologous nature of PRP and the absence of characterization, turn difficult the interpretation of literature data and comparison of clinical results. Therefore, professional and researchers claim for the standardization of PRP preparation as the basis for clinical studies. However, the standardization of PRP preparations requires basic science studies, which are still scarce. As described in literature, due to the autologous nature of PRP, the challenge is not to study PRP, but the development of these studies. Aiming to overcoming these challenges, we developed a strategy to analyze, the integration of the steps in PRP preparation, to turn feasible the design of the formulations properties a function of the preparation conditions, with a reduced number of experiments. This strategy was applied to P-PRP, a type of PRP rich in platelets and poor in leukocytes. The analysis of the results allowed selecting three architectures of fibrin gels, derived from the activation of intact platelets, as representative of a wide range of conditions for platelet activation. These gels were characterized with respect to rheological properties, GFs release, clotting time and the ability to sustain the growth of human adipose-derived mesenchymal stem cell (hADSCs). In a second phase, the studies contemplated the incorporation of PRP in hyaluronic acid gels aiming protection, sustained release of growth factors and the ability to sustain the growth of hADSCs .The obtained results contribute to standardization of the P-PRP, as well as open new opportunities to the use the natural fibrin scaffolds in combination with hyaluronic acid. / Doutorado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Doutora em Engenharia Quimica

Orientadores: Marcio Zaffalon Casati, Antonio Wilson Sallum / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-04T19:00:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gurgel_BrunoCesardeVasconcelos_D.pdf: 2894613 bytes, checksum: b68eb32e96e2245f94ae9bfdc771987e (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: O objetivo do presente estudo foi avaliar histometricamente o reparo ósseo obtido após a utilização do plasmarico em plaquetas (PRP) e/ou de membranas não reabsorvíveis no tratamentode defeitos ósseos peri-implantares, do tipo deiscência, criados cirurgicamente em cães. Foram utilizados 1O cães adultos, machos, sem raça definida, nos quais os pré-molares inferiores (P2,P3, P4)e o primeiro molar foram extraídos. Após 3 meses das extrações, os leitosparaos implantes foram criados e posteriormente 2 deiscências ósseas vestibulares bilaterais, sendo então inseridos 4 implantes dentais de titânio. As deiscências foram designadas aleatoriamente às seguintes modalidades terapêuticas: 1) controle; 2) ROG; 3)PRP;4) PRP + ROG. Após 3 meses do tratamento, os animais foram sacrificados e os blocos contendo os implantes e tecidos duros adjacentes processados para secções não descalcificadas. Na análise histométrica, os parâmetros avaliados foram o contato osso-implante, a área de preenchimento ósseo dentro das roscas, a área e a densidade de tecido ósseo formado na região fora das roscas. Análise deVariância foi utilizada para a análise estatística dos dados (p<O,O5). Os resultados demonstraram diferenças estatísticas significativas para todos os parâmetros analisados em favor dos grupos tratados commembrana (p<O,O5), no entanto, não foram observadas diferenças quando o PRP foi utilizado (p>O,O5). Dentro dos limites do presente estudo, pôde-se concluir ue o PRP não exerce efeitos adicionais no reparo ósseo e que a ROG promove uma maior formação óssea ao redor dos implantes dentais / Abstract: The aim of the present study was to evaluate, histometrically, the bone healing after utilizing the platelet-rich plasma (PRP) and/ornon-resorbable membranes on the treatment of peri-implant bone defects, deiscense type, surgically created in dogs. Ten mongrel male adult dogswere used; in which the threel ow premolars (P2,P3,P4) and the first molar were extracted. Three months after dental extraction, dental implants sites were created and lately two bilater albuccal bone dehiscence, in which four titanium dental implants were inserted. Dehiscences werer and omly assignedfor the following treatment: 1) contrai; 2) GBR;3) PRP; 4) PRP+ GBR. After 3 months, animais were sacrificed; dental implants and adjacent hard tissues were pracessed for undecalcified sections. At histometrical analysis,the parameter se valuated were bone-implant contact, bone filling area into threads, bone tissue area and bone density formed out the threads. Variance Analysis was utilized for statistical analysis of the data (p<O,O5). There sults demonstrated statically significant differences for ali parameters toward membrane treated graups (p<O,O5), although, differences were not observed when PRP was utilized( p>O,O5). Within the limits of the present study, it was concluded that PRP do not exert additional effects on bone healing and that guided bone regeneration provides increased bone formation araund dental implants / Doutorado / Periodontia / Doutor em Clínica Odontológica

The increase in the NTPDase and 5'-nucleotidase enzymatic activities, in patients with diabetes and hypertension, unchained the investigation of the possible mechanisms involved in the alterations in ectonucleotidases activities. The oxidative stress level and also the answer of the antioxidant systems were evaluated in patients with type 2 diabetes, hypertension and type 2 diabetes with associated hypertension. The interference of the glucose concentration was evaluated in the enzymatic activity of the ectonucleotidases, serum cholinesterase and also antioxidant enzymes. The curves in vitro demonstrated that the increase in enzymatic activity was proportional to the elevation in the glucose concentrations, demonstrating a direct interference of the hyperglycemia. The increase in the NTPDase expression demonstrated an important correlation with adenine nucleotide ATP and ADP hydrolyze in patients with diabetes and associated hypertension. The increment in markers of oxidative stress and antioxidant systems levels in patients with diabetes and associated hypertension seems to be related with a compensatory mechanism to prevent oxidative damages. Low serum acid ascorbic levels increase exposes to oxidative damages in patients with diabetes and associated hypertension, resultant of the increase in reactive oxygen species generation. The increment in the serum cholinesterase activity can be potentially related with glycemia levels and lipid metabolism in patients with diabetes and associated hypertension. The medicines administered to the patients did not alter the enzymatic responses in the analyzed groups. Therefore, there were a possible interference of the diabetes and hypertension in the catalytic mechanism of the serum cholinesterase enzyme. Data obtained in the studies permit to suggest that high blood glucose levels constitute one of the principal factors capable to promote alterations in the enzymatic responses in patients with diabetes and associated hypertension. / O aumento na atividade enzimática da NTPDase e 5'-nucleotidase, em pacientes com diabetes e hipertensão, desencadeou a investigação dos possíveis mecanismos envolvidos nas alterações na atividade das ectonucleotidases. O nível de estresse oxidativo e também a resposta dos sistemas antioxidantes foram avaliados em pacientes com diabetes tipo 2, hipertensão e diabetes tipo 2 com hipertensão associada. A interferência da concentração de glicose foi avaliada na atividade enzimática das ectonucleotidases, colinesterase sérica e também das enzimas antioxidantes. As curvas in vitro demonstraram que o aumento na atividade dos sistemas enzimáticos foi proporcional à elevação nas concentrações de glicose, demonstrando uma interferência direta da hiperglicemia. O aumento na expressão da enzima NTPDase demonstrou uma importante correlação com a hidrólise dos nucleotídeos de adenina ATP e ADP em pacientes com diabetes e hipertensão associada. O incremento nos níveis de marcadores de estresse oxidativo e dos sistemas antioxidantes, em pacientes com diabetes e hipertensão associada, parecem estar relacionados com um mecanismo compensatório para prevenir o dano oxidativo. Os baixos níveis de ácido ascórbico sérico aumentam a exposição dos pacientes, com diabetes e hipertensão associada, aos danos oxidativos resultantes do aumento na geração de espécies reativas de oxigênio. O aumento na atividade da enzima colinesterase sérica, em pacientes com diabetes e hipertensão associada, pode estar potencialmente relacionado com os níveis de glicemia e com o metabolismo dos lipídios. Os medicamentos administrados aos pacientes não alteraram as respostas enzimáticas nos grupos analisados. Portanto, houve uma possível interferência do diabetes e da hipertensão no mecanismo catalítico da colinesterase sérica. Os dados obtidos nos estudos permitem sugerir que os elevados níveis de glicose sangüínea constituem um dos principais fatores capazes de promover alterações nas respostas enzimáticas em pacientes diabéticos e com hipertensão associada.

Orientador: Sisi Marcondes Paschoal / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-26T18:31:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bonfitto_PedroHenriqueLeite_M.pdf: 791921 bytes, checksum: 967c29bbcdf8e6df7bd3a2d919b84111 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: As plaquetas são importantes células na inflamação, entretanto, os trabalhos que estudam as citocinas na reatividade plaquetária são raros. O objetivo do presente trabalho foi estudar os efeitos do fator de necrose tumoral-alfa (TNF-?) em plaquetas. Ensaios de agregação foram realizados incubando-se plaquetas com crescentes concentrações de TNF-? (1 - 3000 pg/ml) por diferentes intervalos de tempo (5 - 60 min), na ausência ou presença do antagonista não seletivo dos receptores TNFR1 e TNFR2, o R7050. Também foi estudado o efeito do TNF-? na viabilidade plaquetária utilizando-se o MTT. O efeito do TNF-? na mobilização de Ca2+ em plaquetas foi investigado através de ensaios de fluorescência utilizando-se o fluo-3-AM; os ensaios de western blotting foram realizados para o estudo da ativação da enzima c-Src e do receptor de fibrinogênio. Finalmente, foram determinados os níveis intraplaquetários de AMPc e GMPc por ELISA. O TNF-? inibiu a agregação plaquetária induzida por ADP ou trombina de forma dependente da concentração da citocina e do tempo de incubação. O efeito inibitório máximo do TNF-? na agregação induzida por ADP (5 ?M) foi obtido com a concentração de 300 pg/ml por um tempo de incubação de 30 min (90 ± 7% de inibição), o qual foi significativamente prevenido pela pré-incubação das plaquetas com o R7050. A viabilidade plaquetária não foi modificada pela incubação por 60 min com o TNF-? (30 e 3000 pg/ml). A incubação de plaquetas com TNF-? (300 pg/ml, 30 min) reduziu em 53% o aumento da concentração de Ca2+ total causado pela adição de trombina (200 mU/ml). A queda da concentração de Ca2+ citosólica plaquetária causada pelo TNF-? foi em decorrência da diminuição em 1,8 e 3,4 vezes da mobilização interna do íon e do influxo do mesmo, respectivamente. O TNF-? reduziu em 60% os níveis de AMPc em plaquetas ativadas com ADP. Por outro lado, o TNF-? aumentou significativamente os níveis de GMPc em plaquetas ativadas por ADP (aumento de 51%). A pré-incubação de plaquetas com o inibidor da guanilil ciclase ODQ não reduziu o efeito inibitório do TNF-? na agregação induzida por ADP. Os ensaios de western blotting mostraram que o TNF-? reduziu significativamente a fosforilação do resíduo de Tyr416 da c-Src em plaquetas ativadas. Da mesma forma, o TNF-? reduziu em 37% a fosforilação do resíduo de Tyr773 da subunidade ?3 da integrina ?IIb?3 (receptor de fibrinogênio) em plaquetas ativadas por ADP. Portanto concluímos que o TNF-? inibe a agregação plaquetária via receptores TNFR1 e/ou TNFR2, sem reduzir a viabilidade das plaquetas. O efeito inibitório do TNF-? na agregação é acompanhado pela redução de Ca2+ citosólico e inibição de c-Src e do receptor de fibrinogênio em plaquetas, sendo estes independentes de AMPc ou GMPc / Abstract: Platelets have been described as important cells in inflammation; however, the effects of cytokines on platelet reactivity are rarely studied. The objective of the present work was to investigate the effects of the tumor necrosis factor-alpha (TNF-?) in platelets. Aggregation assays were carried out incubating platelets with increasing TNF-? concentrations (1 - 3000 pg/ml) for different intervals of times (5 - 60 min), in the absence or in presence of the non-selective antagonist of TNFR1 and TNFR2, R7050. Effect of TNF-? on platelet viability was determined using MTT. The effect of TNF-? on the Ca2+ mobilization in platelets was investigated through fluorescence assays using fluo-3AM and Western blotting assays were carried out to determine the activation of c-Src and the fibrinogen receptor. Finally, the cAMP and cGMP levels in platelets were determined by ELISA. TNF-? dose- and time-dependently inhibited ADP or thrombin-induced platelet aggregation. The inhibitory effect of TNF-? on ADP(5 ?M)-induced platelet aggregation was maximum in a concentration of 300 pg/ml incubated with platelets for 30 min (90 ± 7% of inhibition), which was significantly prevented by the incubation of platelets with R7050. Platelet viability was not modified by TNF-? (30 and 3000 pg/ml) incubated for 5 to 60 min. Incubation of platelets with TNF-? (300 pg/ml, 30 min) reduced the increased total Ca2+ concentration induced by thrombin (200 mU/ml) by 53%. Decreasing Ca2+ internal mobilization (1,8 fold) and decreasing in external Ca2+ influx (3,4 fold) led to a reduction of total cytosolic Ca2+ in TNF-? activated platelets. TNF-? reduced the cAMP levels in ADP-activated platelets by 60%. On the other hand, TNF-? significantly increased cGMP levels in ADP-activated platelets (51% increase). Pre-incubation of platelets with the guanylyl cyclase inhibitor ODQ did not modify the inhibitory effect of TNF-? on ADP-induced platelet aggregation. Western blotting analysis showed that TNF-? significantly reduced phosphorylation on Tyr416 of c-Src in activated platelets. Similarly, TNF-? reduced by 37% the Tyr773 phosphorylation of ?3 subunit of ?IIb?3 integrin (fibrinogen receptor) in ADP-activated platelets. Therefore, our results show that TNF-? inhibits platelet aggregation via TNFR1 and/or TNFR2 receptors, without affecting platelet viability. The inhibitory effect of TNF-? on aggregation is accompanied by a reduction in cytosolic Ca2+ and the inhibition of c-Src and fibrinogen receptor activation, which are cAMP and cGMP-independent effects / Mestrado / Farmacologia / Mestre em Farmacologia

Doenças crônicas sistêmicas, em especial o diabetes mellitus, favorecem o aparecimento e a continuidade de lesões dermo-epidérmicas, sendo o impacto econômico e social significativo. No âmbito da medicina regenerativa para o tratamento de lesões cutâneas crônicas, o emprego clínico da bioengenharia de tecidos associada à terapia celular tem sido considerado uma promissora alternativa terapêutica. Neste contexto, o estudo tem como objetivo avaliar a eficácia terapêutica no tratamento de úlceras cutâneas de pacientes diabéticos, empregando células-tronco mesenquimais do tecido adiposo (CT-TA) associadas a plasma rico em plaquetas (PRP) obtido de sangue autólogo. A pesquisa aplicada foi composta por seis pacientes diabéticos e portadores de úlceras cutâneas crônicas. A reepitelização total ocorreu em 5 das 9 lesões tratadas, sendo o índice de cicatrização médio superior a 70% após 3 meses da aplicação. Desta forma, é possível concluir que a terapia com CT-TA associadas a PRP proporciona uma redução na área ulcerosa de lesões cutâneas crônicas em pacientes diabéticos. / Systemic chronic diseases, especially diabetes mellitus, favor the emergency and continuity of dermal-epidermal lesions, being significant the economic and social impact. Within the regenerative medicine field for treatment of cutaneous chronic wounds, the clinical use of tissue bioengineering and cell therapy has been considered as a promising therapeutic alternative. In this context, the present study aims to evaluate the therapeutic efficiency, using adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSC) associated with platelet-rich plasma (PRP) obtained from autologous blood, for the treatment of cutaneous ulcers from diabetic patients. The applied research was composed of six diabetic patients with chronic skin ulcers. The total re-epithelialization occurred in 5 of the 9 lesions treated, and the average wound healing index greater than 70% after 3 months of application. In this way, it can be concluded that ADSC therapy associated with PRP provides a reduction in ulcer area of chronic skin lesions in diabetic patients.

Made available in DSpace on 2016-01-26T18:55:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Karina.pdf: 2597948 bytes, checksum: d65c6af5a956ec0d8f0afae614fe6d8a (MD5) Previous issue date: 2014-03-17 / The platelet rich plasma is a source of several growth factors and appears as a new biotechnology in tissue repair, with great therapeutic power. Patients with general health problems and the lack of volume of blood required for autologous production of concentrate, may be restricted to receive this innovative treatment. To overcome the limitation, this study evaluated the effects of heterologous platelet-rich plasma gel obtained from a healthy dog, in the healing of dermal wounds in rabbits by standard morphological, morphometric and histological analyzes. Two surgical incisions were made on the back of six rabbits using a punch of 8 mm diameter. Randomly one side was denominated as a Control (A), leaving the contralateral Treaty as (B). 0.9% saline solution and heterologous platelet-rich plasma gel were applied topically to the lesions (A) and (B) respectively, on days 0, 3, 7, 10 and 14 after surgery. Macroscopic observations recorded on the days mentioned above, including the 17th, which is also a biopsy for histological analysis was performed, demonstrated similarity between the lesions in relation to the study variables, pain sensitivity, color of wound edema, hyperemia, exudate, crust and granulation tissue. The process of contraction of the lesion area (A) and (B) similarly developed linearly, so that histologically complete reepithelialization was achieved in 90% of lesions (A) and 100% of the lesions (B), no differences statistically significant. Such differences were also not found between wounds in relation to other histological parameters analyzed: presence of crust, neovascularization, collagen, fibroblasts and macrophages, cell type and intensity of the inflammatory process. The results of this study suggest that the heterologous platelet-rich plasma gel was able to promote the healing of dermal wounds in rabbits, no harmful effects. / O plasma rico em plaquetas é fonte de diversos fatores de crescimento e surge como uma nova biotecnologia na reparação tecidual, com grande potencial terapêutico. Pacientes com problemas de saúde geral e ausência de volume de sangue necessário para produção autóloga deste concentrado, podem ficar limitados para receber este tratamento inovador. Para ultrapassar a limitação, o presente estudo avaliou os efeitos do gel de plasma rico em plaquetas obtido a partir de um cão saudável, na cicatrização de feridas dérmicas padronizadas em coelhos mediante análises morfológicas, morfométricas e histológicas. Foram produzidas duas incisões no dorso de seis coelhos utilizando punch de 8 mm de diâmetro. Aleatoriamente, um dos lados foi denominado Controle (A), permanecendo o contralateral Tratado (B). Solução fisiológica a 0.9% e gel de plasma rico em plaquetas heterólogo foram aplicados topicamente nas lesões (A) e (B) respectivamente, nos dias 0, 3, 7, 10 e 14 de pós-operatório. Observações macroscópicas registradas nos dias mencionados acima, incluindo o 17o, no qual também foi realizada uma biópsia para análise histológica, demonstraram semelhança entre as lesões em relação às variáveis estudadas, sensibilidade dolorosa, cor da ferida, edema, hiperemia, exsudato, crosta e tecido de granulação. O processo de contração da área das lesões (A) e (B) evoluiu similarmente de forma linear, de modo que, histologicamente, reepitelização total foi alcançada em 90% das lesões (A) e 100% das lesões (B), sem diferenças estatisticamente significantes. Tais diferenças também não foram constatadas entre as feridas em relação aos demais parâmetros histológicos analisados: presença de crosta, neovascularização, colagenização, quantidade de fibroblastos e macrófagos, tipo celular e intensidade do processo inflamatório. Os resultados desta pesquisa sugerem que o gel de plasma rico em plaquetas heterólogo foi capaz de promover a cicatrização de feridas dérmicas em coelhos, sem efeitos prejudiciais.

Made available in DSpace on 2016-07-18T17:53:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Karina.pdf: 2597948 bytes, checksum: d65c6af5a956ec0d8f0afae614fe6d8a (MD5) Previous issue date: 2014-03-17 / The platelet rich plasma is a source of several growth factors and appears as a new biotechnology in tissue repair, with great therapeutic power. Patients with general health problems and the lack of volume of blood required for autologous production of concentrate, may be restricted to receive this innovative treatment. To overcome the limitation, this study evaluated the effects of heterologous platelet-rich plasma gel obtained from a healthy dog, in the healing of dermal wounds in rabbits by standard morphological, morphometric and histological analyzes. Two surgical incisions were made on the back of six rabbits using a punch of 8 mm diameter. Randomly one side was denominated as a Control (A), leaving the contralateral Treaty as (B). 0.9% saline solution and heterologous platelet-rich plasma gel were applied topically to the lesions (A) and (B) respectively, on days 0, 3, 7, 10 and 14 after surgery. Macroscopic observations recorded on the days mentioned above, including the 17th, which is also a biopsy for histological analysis was performed, demonstrated similarity between the lesions in relation to the study variables, pain sensitivity, color of wound edema, hyperemia, exudate, crust and granulation tissue. The process of contraction of the lesion area (A) and (B) similarly developed linearly, so that histologically complete reepithelialization was achieved in 90% of lesions (A) and 100% of the lesions (B), no differences statistically significant. Such differences were also not found between wounds in relation to other histological parameters analyzed: presence of crust, neovascularization, collagen, fibroblasts and macrophages, cell type and intensity of the inflammatory process. The results of this study suggest that the heterologous platelet-rich plasma gel was able to promote the healing of dermal wounds in rabbits, no harmful effects. / O plasma rico em plaquetas é fonte de diversos fatores de crescimento e surge como uma nova biotecnologia na reparação tecidual, com grande potencial terapêutico. Pacientes com problemas de saúde geral e ausência de volume de sangue necessário para produção autóloga deste concentrado, podem ficar limitados para receber este tratamento inovador. Para ultrapassar a limitação, o presente estudo avaliou os efeitos do gel de plasma rico em plaquetas obtido a partir de um cão saudável, na cicatrização de feridas dérmicas padronizadas em coelhos mediante análises morfológicas, morfométricas e histológicas. Foram produzidas duas incisões no dorso de seis coelhos utilizando punch de 8 mm de diâmetro. Aleatoriamente, um dos lados foi denominado Controle (A), permanecendo o contralateral Tratado (B). Solução fisiológica a 0.9% e gel de plasma rico em plaquetas heterólogo foram aplicados topicamente nas lesões (A) e (B) respectivamente, nos dias 0, 3, 7, 10 e 14 de pós-operatório. Observações macroscópicas registradas nos dias mencionados acima, incluindo o 17o, no qual também foi realizada uma biópsia para análise histológica, demonstraram semelhança entre as lesões em relação às variáveis estudadas, sensibilidade dolorosa, cor da ferida, edema, hiperemia, exsudato, crosta e tecido de granulação. O processo de contração da área das lesões (A) e (B) evoluiu similarmente de forma linear, de modo que, histologicamente, reepitelização total foi alcançada em 90% das lesões (A) e 100% das lesões (B), sem diferenças estatisticamente significantes. Tais diferenças também não foram constatadas entre as feridas em relação aos demais parâmetros histológicos analisados: presença de crosta, neovascularização, colagenização, quantidade de fibroblastos e macrófagos, tipo celular e intensidade do processo inflamatório. Os resultados desta pesquisa sugerem que o gel de plasma rico em plaquetas heterólogo foi capaz de promover a cicatrização de feridas dérmicas em coelhos, sem efeitos prejudiciais.

Made available in DSpace on 2016-07-18T17:53:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Valeria Cardoso.pdf: 519085 bytes, checksum: 5ce9c2c85a8919b74df1fa049692802e (MD5) Previous issue date: 2016-03-23 / Significant scientific advances have been made in the last ten years to ascertain the effects of the use of platelet-rich plasma (PRP) and its contribution not only to the hemostatic process, but also wound healing, by releasing growth factors that have tissue regenerating induction properties. The effects of autologous PRP gel and the quality of collagen fibers produced were evaluated after induction of dermal wounds in 6 New Zealand rabbits, treated or not with autologous PRP gel. The wounds were followed for 17 days. On days 7, 10 and 17 the animals were evaluated for the morphological and morphometric behavior of the wounds. Regarding the percentage of collagen fibers, there was a greater quantity (P <0.05) in the untreated rabbits (85.7%) compared to those receiving autologous PRP gel (75.0%). However, microscopically, increased expression of collagen fibers was observed in the samples treated with autologous PRP gel, displaying a more homogenous layout and better fiber reorganization, demonstrating a dense network involving all attachments and newly formed vessels characterized by high dermal birefringence. It can be concluded from this study that the use of autologous PRP gel on wounds improved the quality and reorganization of collagen fibers. / Avanços científicos significativos nos últimos dez anos foram feitos para verificar os efeitos do uso do plasma rico em plaquetas (PRP) e a sua contribuição não só para o processo hemostático, mas também para cicatrização de feridas através da liberação de fatores de crescimento que têm propriedades de indução de regeneração tecidual. Avaliou-se o efeito do PRP autólogo gel e a qualidade de fibras colágenas produzidas após realização de ferida dérmica em 6 coelhos da raça Nova Zelândia tratados ou não com PRP autólogo gel. As lesões foram acompanhadas durante 17 dias. Nos dias 7, 10, e 17, os animais foram avaliados quanto ao comportamento das feridas morfológica e morfometricamente. Em relação à porcentagem das fibras de colágeno, houve uma quantidade maior (P<0,05) nos coelhos não tratados (85,7%) comparados aos que receberam PRP autólogo em gel (75,0%). Porém, microscopicamente, observou-se aumento de expressão de fibras de colágeno nos coelhos tratados com PRP autólogo gel, mostrando uma disposição mais homogênea com melhor reorganização dessas fibras, evidenciando uma rede densa que envolveu todos os anexos e com vasos neoformados caracterizados pela alta birrefringência da derme. Pode-se concluir neste estudo que o uso do PRP autólogo gel em feridas melhora a qualidade e a reorganização das fibras colágenas.