A síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA) e a malária placentária (MP) são complicações da malária, cujos mecanismos imunopatogênicos pouco compreendidos. Neste trabalho, mostramos que camundongos MyD88-/- e Casp1/11-/- não desenvolveu SDRA, morrendo devido ao quadro de anemia severa associada à hiperparasitemia. Posteriormente, demonstrou-se que, embora a patogênese da doença dependa do inflamassoma AIM2, não depende dos inflamassomas NLRP3 e NLRC4 e do eixo IL1. Em uma segunda etapa do projeto foi mostrado que a progressão da PM são decorrentes da ativação das vias de sinalização TLR4/9/MyD88, mas não do TLR2. Ademais, evidenciou-se a participação dos inflamassomas NLRP3 e AIM2, porém não do NLRC4, nesse processo. Por fim, os dados obtidos sugerem que a ativação dessas vias culmina com a liberação de IL-1β que, ao agir em seu receptor, inibe a expressão de transportadores de aminoácidos e glicose, com consequente disfunção do desenvolvimento do feto em camundongos grávidas com MP. Em conclusão, este trabalho apresenta, pela primeira vez, uma associação entre a ativação da via MyD88 e dos inflamassomas pelo plasmódio e a progressão da SDRA e MP. / Acute respiratory distress syndrome (ARDS) and placental malaria (PM) are complications of the malaria, whose the immunopathogenic mechanisms are poorly understood. In that study we showed that MyD88-/- and Casp 1/11-/- mice did not develop ARDS, dying due to severe anemia associated to hyperparasitemia. Subsequently, it was been shown that although such mechanism depends on the AIM2 inflammasome, it does not depend on the NLRP3 and NLRC4 inflammasomes and the IL-1 axis. In a second stage of the project, it should be noted that those complications are due to the activation of the TLR4/9/MyD88 signaling pathways, but not the TLR2. In addition, the participation of the NLRP3 and AIM2 inflammosomes, but not the NLRC4 was shown in that process. Finally, the data suggest that the activation of these pathways culminates with the release of the IL-1β which acts on its receptor inhibiting the amino acid expression and glucose transporters with a consequent dysfunction in the fetal development of pregnant mice with MP. In conclusion, this work makes for the first time an association between the MyD88 pathway activation and inflammasomes by plasmodium and the progression of the ARDS and MP.

O aumento da resistência do parasita da malária a maioria da drogas antimaláricas disponíveis, tornandose necessário pesquisar novos compostos com potencial atividade antimalárica. O objetivo desta tese foi inicialmente caracterizar a atividade do risedronato contra as formas intraeritrocitárias do parasita in vivo, além de identificar seu possível mecanismo de ação. A IC50 do risedronato foi de 20 <font face=\"Symbol\">mM em culturas de Plasmodium falciparum. Risedronato reduziu a biossíntese de FOH e GGOH e a isoprenilação de proteínas, inibindo a transferência do grupo FPP para as proteínas farnesiladas, entretanto, a transferência do GGPP para as proteínas geranilgeraniladas não foi inibida, isto também ocorreu quando proteínas ras e rab foram analisadas, sugerindo que a droga está inibindo a enzima FPPS. A enzima FPPS de P. falciparum foi expressa e obtivemos uma proteína recombinante fusionada a GST (rPfFPPS). Os substratos IPP, DMAPP, GPP e FPP foram utilizados para determinação da atividade catalítica da enzima, demonstrando FPP e GGPP como principais produtos. Os valores de Km para os diferentes substratos foi determinado. Demonstramos também que rPfFPPS é inibida por risedronato, podendo ser explorado como potencial alvo antimalárico. / The increased resistance of the malaria parasite most of antimalarial drugs are available, making it necessary to search for new compounds with potential antimalarial activity. The aim of this thesis was initially characterize the activity of risedronate against intraerythrocytic forms of the parasite in vivo, and identify its possible mechanism of action. The IC50 of risedronate was 20 <font face=\"Symbol\">mM in cultures of Plasmodium falciparum. Risedronate reduced biosynthesis and FOH, GGOH and protein isoprenylation, inhibiting the transfer of FPP group for farnesylated proteins, however, the transfer of GGPP to geranygeranylated proteins was not inhibited, this also occurred when ras and rab proteins were analyzed, suggesting that the drug is inhibiting the enzyme FPPS. The FPPS enzyme from P. falciparum was expressed and obtained a recombinant protein fused to GST (rPfFPPS). The substrates IPP, DMAPP, GPP and FPP were used to determine the catalytic activity of the enzyme, demonstrating FPP and GGPP as main products. The Km values for the various substrates were determined. We also demonstrate that rPfFPPS is inhibited by risedronate, which can be exploited as potential antimalarial target.

Casos de malária importada, contraídos em região endêmica, mas diagnosticados em um país não-endêmico, são um evento raro mas com desfecho potencialmente fatal. Nosso objetivo foi investigar se a análise de genomas mitocondriais permite inferir a origem geográfica de casos importados de malária vivax diagnosticados nos EUA, comparando os resultados com aqueles obtidos por análise de DNA microssatélite. Foi sequenciado o genoma mitocondrial completo de 63 amostras de P. vivax provenientes de infecções importadas dos EUA, além de 7 amostras do Brasil e 6 do Panamá. A rede de haplótipos com DNA mitocondrial foi construída com 412 sequências e foi possível classificar com precisão a origem geográfica presumida dos isolados da América do Sul, Coréia, Sudeste Asiático e Melanésia, porém os isolados do Sul da Ásia, América Central e África não puderam ser classificados geograficamente. A análise bayesiana realizada com a tipagem de marcadores de microssatélites não apresentou sucesso quanto à classificação geográfica dos isolados de P. vivax. / Cases of imported malaria, infection acquired in an endemic region, but diagnosed in a non-endemic country, are rare but can lead to a fatal outcome. Our objectives were investigate whether the analysis of mitochondrial genomes allows inferring the geographic origin of isolates of P. vivax derived from cases of imported malaria diagnosed in the USA, and compare the performance of mitochondrial genome and DNA microsatellite analysis. We sequenced full mitochondrial genomes from 63 P. vivax isolates collected at the USA from imported infections, and 7 samples from Brazil and 6 Panama. A network of mitochondrial DNA haplotypes was built with 412 genomic sequences and were able to classify accurately isolates from South America, Korea, Southeast Asia and Melanesia according to their presumed geographic origin, but failed to do so with samples from South Asia, Central America and Africa. The Bayesian analysis performed by typing microsatellite markers showed no success on the classification of geographical isolates of P. vivax.

A proteína de ligação em Duffy (PvDBP) dos merozoítos de P. vivax se liga a glicoproteínas de membrana, chamadas de grupo sanguíneo Duffy, conhecidas como DARC. Indivíduos DARC negativos são normalmente resistentes a infecção estágio sanguínea por P. vivax; portanto, PvDBP é um forte antígeno canditato a vacina. Aqui, investigamos respostas de anticorpos contra três proteínas derivadas de PvDBP e MSP119, em 343 indivíduos de uma região Amazônica brasileira. Anticorpos contra Sal III-His, OII-His, Sal III-IV-GST e MSP119-GST foram encontrados em 43,7%, 39,0%, 14,3% e 38,8% dos indivíduos. Os indivíduos FY*BESFY*BES foram os que menos apresentaram anticorpos contra PvDBP, porém encontramos proporções similares de respondedores entre indivíduos com outros genótipos. A análise de sequências revelou muitas variantes da região II de PvDBP em 41 isolados. A mais comum (encontrada em 28,8% dos isolados), difere de Sal I e PNG- O em seis codóns de aminoácidos. Nenhuma variante tipo Sal I, cujo protótipo de vacina está em teste clínico, foi encontrada nos parasitas locais. / The Duffy binding protein (PvDBP) of the P. vivax merozoites, which binds to a erythrocyte membrane glycoprotein known as Duffy blood group antigen for chemokines (DARC). DARC-negative individuals are usually resistant to blood-stage infection with P. vivax; therefore, PvDBP is a major vaccine candidate antigen. Here, we investigated antibody responses to three proteins derived from PvDBP and MSP119, in 343 subjects in the Amazon of Brazil. Antibodies to Sal III-His, OII-His, Sal III-IV-GST and MSP119-GST were found in 43,7 %, 39,0%, 14,3% and 38,8% of the subjects. FY*BESFY*BES individuals were less likely to have antibodies to PvDBP, but we found similar proportions of seropositive subjects with other genotypes. Sequence analysis revealed several region II PvDBP variants in 41 local P. vivax isolates. The most common of them (found in 28,8% isolates) differs from Sal I and PNG-O alleles in six amino acid codons. No Sal I-type variant, from which a PvDBP-based vaccine prototype currently under clinical testing has been derived, was found in local parasites.

Nesta dissertação, identificou-se que as drogas esqualestatina, fosmidomicina, risedronato e nerolidol apresentam atividades sinérgicas e aditivas quando administradas em cultura de P. falciparum. Esses resultados contribuem para a compreensão da biologia do parasita e abrem estudos para possíveis antimaláricos. Identificou-se a especificidade da droga esqualestatina inibidora da enzima fitoeno sintase por meio de marcações metabólicas utilizando precursor radioativo ([3H]GGPP), e análise pela técnica de cromatografia (RP-HPLC). Realizou-se testes de inibição para determinar o valor da IC50 na linhagem pRM2-Fito-HA, a qual encontra-se super expressando enzima fitoeno sintase e encontrou-se um valor IC50 de 5 <font face=\"Symbol\">mM para o isolado 3D7 enquanto que para a linhagem pRM2-Fito-HA foi de 30 <font face=\"Symbol\">mM. Demonstrando assim que a enzima fitoeno sintase é o principal, senão único alvo da esqualestatina em P. falciparum, o que sugere que este composto ou derivado do mesmo são potenciais antimalaricos. / In this thesis, we found that the drug squalestatin, fosmidomicina, risedronate, nerolidol have synergistic and additive activity when administered in cultured P. falciparum. These results contribute to the understanding of the biology of the parasite and open studies for potential antimalarials. We identified the specific drug squalestatin inhibiting phytoene synthase enzyme by using metabolic markers radioactive precursor ([3H] GGPP) by the technique of analysis and chromatography (RP-HPLC). Held inhibition tests to determine the IC50 value of the strain in pRM2-Phyto-HA, which is super expressing phytoene synthase enzyme and met an IC50 value of 5 microM to isolate 3D7 whereas for strain pRM2 -Phyto-HA was 30 <font face=\"Symbol\">mM. Thus demonstrating that the enzyme phytoene synthase is the primary, if not sole target of squalestatin in P. falciparum, which suggests that this compound or derivative thereof as potential antimalarials.

A malária asociada à gavidez pode gerar complicações para a mãe e para o feto. Receptores do tipo Toll (TLR) TLR2, TLR4 e TLR9, podem reconhecer componentes do Plasmódio. Estes receptores sinalizam via proteína MyD88. Contudo existem poucos dados sobre os TLR na malária placentária. Assim, o objetivo desse trabalho foi estudar o papel dos TLR2, 4, 9 e da MyD88 na malária placentária. Dentre fêmeas C57BL/6, TLR2-/-, TLR9-/- e MyD88-/-, a linhagem MyD88-/- apresentou maiores níveis de parasitemia, sobrevivência e cuidado parental, e ainda placentas de fêmeas MyD88-/- infectadas, ao contrario das TLR2-/- e TLR9-/-, não tiveram diminuição do espaço vascular em relação aos controles. Animais C57BL/6 infectados apresentaram aumento do mRNA de IL1-<font face=\"Symbol\">b e IL-6 na placenta, o que não ocorreu nos MyD88-/-. Gestantes C57BL/6 e MyD88-/- infectadas tiveram mais esplenócitos, com expansão preferencial de linfócitos B (CD19+). Também foi evidenciado nos animais C57BL/6 infectados um aumento da expressão do marcador de ativação CD69 nos linfócitos TCD8+. Em conjunto, estes resultados sugerem que a sinalização via MyD88 é importante para o desenvolvimento da malária placentaria e esta pode estar relacionada com a resposta inflamatória exacerbada induzida pelo parasita. / Pregnancy associated malaria can lead to complications both for the mother and the fetus. Toll like receptors (TLR) TLR2, TLR4 and TLR9 can recognize components of the Plasmodium sp. These receptors signal through the MyD88 protein. However there are few data on TLR in placental malaria. Thus, The objective of this work was to study the role of TLR2, 4, 9 and MyD88 in placental malaria. Among female mice C57BL/6, TLR2-/-, TLR9-/- and MyD88-/-, the lineage MyD88-/- showed higher levels of parasitemia, survival and parental care, and still placentas of MyD88-/- infected female, differently of TLR2-/- and TLR9-/-, had no decrease in the vascular space compared to controls. Animals C57BL/6 infected showed increased mRNA for IL1-<font face=\"Symbol\">b and IL-6 in the placenta, which did not occur in MyD88-/-. Pregnant infected C57BL/6 and MyD88-/- had more splenocytes, with preferential expansion of B lymphocytes (CD19+). in infected C57BL/6 was also demonstrated an increased expression of the activation marker CD69 on CD8+ T lymphocytes. Together, these results suggest that signaling through MyD88 is important for the development of placental malaria and this may be related with an increased inflammatory response induced by the parasite.

A malária é uma das principais e a mais disseminada das parasitoses humanas. A falta de uma vacina eficaz e o problema da resistência aos fármacos tem contribuído para o adiamento da solução do controle desta infecção. A busca de novos alvos biológicos tem se concentrado, em parte, na compreensão de vias metabólicas. Em P. falciparum, identificamos a biossíntese das duas formas da vitamina K (filoquinona e menaquinona). Na via MEP foram caracterizadas duas importantes enzimas bifuncionais, a farnesil difosfato sintase/geranilgeranil difosfato sintase (FPPS/GGPPS) capaz de formar farnesil difosfato e geranilgeranil difosfato e octaprenil pirofosfato sintase/fitoeno sintase (OPP/PSY) responsável pela biossíntese da cadeia isoprênica que se liga ao anel da via de ubiquinona, como também forma o primeiro caroteno na via de carotenóides. Este projeto tem como objetivo caracterizar o gene MenA da biossíntese de MQ, determinar a localização de FPPS/GGPPS em P. falciparum e investigar a importância de OPP/PSY e de FPPS/GGPPS no ciclo intraeritrocítico de P. falciparum. / Malaria is one of the main widespread human parasites. The lack of an effective vaccine and the problem of drug resistance haves contributed to the delay of the control solution of this infection. The search for new biological targets has focused in part on the understanding of metabolic pathways. In P. falciparum, identified the biosynthesis of the two forms of vitamin K (phylloquinone and menaquinone). In the MEP pathway were characterized two important bifunctional enzyme, farnesyl diphosphate synthase/geranylgeranyl diphosphate synthase (FPPS/GGPPS) able to form farnesyl diphosphate and geranylgeranyl diphosphate and octaprenyl pyrophosphate synthase/phytoene synthase (OPP/PSY) responsible for the biosynthesis of isoprenic side chains attached to the benzoquinone ring of ubiquinones, but also forms the first carotene in the carotenoid pathway. This project aims to characterize the MenA gene from the MQ biosynthesis, determine the localization of FPPS/GGPPS and investigate the importance of OPP/PSY and FPPS/GGPPS in intra-erythrocytic cycle of P. falciparum.

O Antígeno 1 de Membrana Apical (AMA-1) tem sido sugerido como candidato a compor uma vacina contra estágios assexuados sanguíneos de Plasmodium. Recentemente nosso grupo identificou o domínio II (DII) de AMA-1 de Plasmodium vivax (PvAMA-1) como uma região altamente reconhecida por anticorpos IgG de indivíduos brasileiros infectados por P. vivax. No presente estudo avaliamos as propriedades imunogênicas da proteína recombinante DII, produzida a partir de Escherichia coli. Grupos de 6 camundongos fêmeas BALB/c foram imunizados quatro vezes com 10 &#181;g dessa proteína na presença de diferentes formulações de adjuvantes [Adjuvante Completo/Incompleto de Freund (ACF/AIF), MPL-TDM, TiterMax, Hidróxido de Alumínio (Alum), Quil A, QS-21 e CpG-ODN 1826], individualmente, ou em combinação (Alum + QS-21 ou Alum + CpG-ODN 1826)). Nosso objetivo foi avaliar comparativamente a resposta de anticorpos (IgM, IgG e isotipos de IgG), induzida pelos diferentes esquemas de imunizações, visando futuros estudos pré-clínicos em primatas não humanos. Os títulos de anticorpos IgG contra (o ectodomínio) PvAMA-1 foram determinados por ELISA, duas semanas após cada imunização. A presença de IgM e dos isotipos de IgG também foi avaliada após o final do esquema de imunizações. Nossos resultados demonstraram que a proteína recombinante DII foi altamente imunogênica em camundongos BALB/c quando administrada na presença dos adjuvantes testados. Altos títulos de IgG1, IgG2a e IgG2b foram observados na maioria dos grupos (com exceção do adjuvante Alum), sugerindo uma resposta mista Th1/Th2. Finalmente, demonstramos que anticorpos monoclonais e policlonais anti-DII reconheceram a proteína nativa expressa na superfície de merozoítas de P. vivax, por imunofluorescência. Em conclusão, nossos resultados mostraram que a proteína recombinante o domínio II de PvAMA-1 (DII) foi imunogênico em camundongos BALB/c quando administrado na presença das diferentes formulações de adjuvantes testadas, sugerindo que esse antígeno possa ser utilizado como uma vacina de subunidade contra a malária vivax. / The Apical Membrane Antigen 1 (AMA-1) has been considered a malaria vaccine candidate against asexual blood stages of Plasmodium. Recently, we identified the domain II (DII) of Plasmodium vivax AMA-1 (PvAMA-1) as a region highly recognized by IgG antibodies from Brazilian individuals infected by P. vivax. In the present study, we evaluated the immunogenic properties of a bacterial recombinant PvAMA-1 DII. Groups of 6 female BALB/c were immunized four times with 10 &#181;g of recombinant protein in the presence of different adjuvant formulations [Complete/Incomplete Freunds Adjuvant (CFA/IFA), MPL-TDM, TiterMax, Aluminum hydroxide (Alum), Quil A, QS-21, CpG-ODN 1826] separately or in combination (Alum + QS-21 or Alum + CpG-ODN 1826). Our goal was to compare the antibody response (IgM, IgG and IgG subclass) induced by different protocols of immunization aiming at future pre-clinical studies in non-human primates. The IgG antibody titers against PvAMA-1 were determined by ELISA two weeks after each immunizing dose. The presence of IgM and IgG subclass were evaluated after the end of immunizations schedule. We found that the recombinant DII was highly immunogenic in BALB/c mice when administered in the presence of all adjuvant tested. High titers of IgG1, IgG2a and IgG2b were observed in all groups (except for Alum adjuvant), suggesting a mixed Th1/Th2 response. Finally, we demonstrated that monoclonal and polyclonal antibodies against DII recognized the native protein expressed on the P. vivax merozoite surface parasites by immunofluorescence. Together, our data demonstrated that the recombinant PvAMA-1(DII) was immunogenic in mice when administered in different adjuvant formulations, suggesting that this protein can be used as part of a sub-unit vaccine against malaria vivax.

O interesse em compreender a epidemiologia da malária no Brasil, fornecendo subsídios para seu controle, decorre principalmente de sua elevada morbidade em populações expostas continuamente ao risco de infecção. Entre março de 2010 e abril de 2011, foram realizados quatro cortes transversais em um assentamento agrícola localizado no estado do Amazonas, com o recrutamento de 395 indivíduos de idades entre dois meses e 66 anos. Considerando os resultados moleculares obtidos por PCR em tempo real em 731 amostras sanguíneas, obteve-se uma taxa de positividade de 17,8%, aproximadamente três vezes maior do que a detectada pelo exame microscópico, com a detecção de infecções mistas apenas pela técnica molecular. Cerca de dois terços das infecções diagnosticadas eram assintomáticas. Os resultados enfatizam a importância de infecções assintomáticas infecções, muitas vezes submicroscópicas, na manutenção da transmissão de plasmódios e caracterizam o papel de aspectos comportamentais ligados à idade e à exposição cumulativa à malária. / Understanding the epidemiology of malaria in Brazil, to support malarias control, has attracted interest mainly due to its high morbidity in populations continuously exposed to the risk of infection. Between March 2010 and April 2011, four cross-sectional were performed in a farming settlement located in the state of Amazonas, with the recruitment of 395 patients aged between two months and 66 years. Considering the molecular results obtained by real time PCR in 731 blood samples, we obtained a positivity rate of 17.8%, nearly three times greater than that detected by microscopic examination, with the detection of mixed infections only by molecular technique. About two-thirds of diagnosed infections were asymptomatic. The results emphasize the importance of asymptomatic infections, often submicroscopic, to the maintenance of the transmission of parasites and characterize the role of behavioral issues related to the age and cumulative exposure to malaria.

A malária é uma das prioridades da pesquisa mundial na área de desenvolvimento de vacinas. Apesar da contínua e crescente atividade de pesquisa nessa área, ainda não existe uma vacina capaz de impedir a infecção pelo Plasmodium spp. Devido ao complexo ciclo de vida deste agente, uma formulação vacinal eficaz para a indução de uma resposta imune protetora deverá conter uma combinação de regiões imunodominantes de antígenos do parasita. Portanto, este trabalho visou caracterizar a resposta imune humoral induzida pela imunização experimental de camundongos com o Antígeno 1 de Membrana Apical (AMA-1), região C-terminal da Proteína 1 da Superfície do Merozoíto e a Proteína 3&#946; da Superfície do Merozoíto de P. vivax, administradas isoladamente ou em combinação. As proteínas recombinantes foram purificadas por cromatografia de afinidade e por cromatografia de troca iônica, posteriormente foram analisadas por RP-HPLC confirmando o elevado nível de pureza das amostras. A imunogenicidade dessas formulações foi avaliada em duas linhagens de camundongos BALB/c e C57BL/6, e na presença de dois adjuvantes Quil A e Poly I:C. Os títulos de anticorpos IgG foram determinados por ELISA. Os camundongos C57BL/6 imunizados com a combinação dos antígenos, emulsificados em Quil A ou Poly I:C apresentaram altos títulos de anticorpos (log10>4), assim como os camundongos imunizados com os antígenos administrados individualmente. Em contraste, os camundongos BALB/c imunizados com a combinação dos antígenos apresentaram títulos de anticorpos mais baixos contra a proteína MSP119 ou contra as proteínas MSP119 e AMA-1 quando administradas na presença dos adjuvantes Quil A e Poly I:C, respectivamente. Interessantemente, observamos um aumento significativo nos títulos de anticorpos dos camundongos C57BL/6 imunizados com a combinação dos antígenos emulsificados em Poly I:C contra a proteína MSP3&#946;. A razão entre as subclasses de IgG mostraram um perfil de reposta mista Th1/Th2, em todos os grupos testados. Os anticorpos específicos mantiveram-se elevados por 6 meses após a última imunização, mostrando que a resposta imune induzida pelas imunizações experimentais foi duradoura. Nossos dados, em conjunto, demonstram que a combinação de antígenos pode ser uma estratégia promissora de vacinação contra a malária. / Malaria is one of the priorities of global research in the area of vaccine development. In spite of the continuing and growing research activity in this area, there is still no vaccine to prevent infection by Plasmodium spp. Due to the complex life cycle of this agent, an effective vaccine formulation to elicit protective immune responses should contain a combination of immunodominant regions of parasite antigens. Therefore, this study aimed at characterizing the humoral immune response induced by experimental immunization of mice with Apical Membrane Antigen 1 (AMA-1), C-terminal region of the Merozoite Surface Protein 1 and Merozoite Surface Protein 3&#946; of P. vivax, provided either alone or as a combination. The recombinant proteins were purified by affinity and ion exchange chromatography, subsequently were analyzed by RP-HPLC to confirm the high purity of the samples. The immunogenicity of these formulations was evaluated in BALB/c and C57BL/6 mice, administered in the presence of two different adjuvants, Quil A or Poly I:C. The humoral immune response was measured by IgG antibody titers using ELISA. C57BL/6 mice immunized with the recombinant antigen combination in the presence of Quil A or Poly I:C adjuvants showed high antibody titers (log10>4) similar to mice inject with a single antigen alone. In contrast, BALB/c mice immunized with the recombinant antigen combination had lower antibody titers to MSP119 or to MSP119 and AMA-1 when administered in the presence of Quil A or Poly I:C adjuvants, respectively. Interestingly, we observed a significant increased in the antibody titers of the C57BL/6 mice receiving the combination of antigens against MSP3&#946; protein in Poly I:C. The ratio between the IgG subclasses profile showed a mixed Th1/Th2 response in all groups tested. Specific antibodies were still high six months after the last immunizing dose indicating a long lived immune response. Together, our data show that the combination of antigens may be an effective strategy for immunization against malaria.