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Malaria är en välkänd parasitsjukdom världen över som år 2015 ledde till 438000 dödsfall, varav 90% i den afrikanska regionen. Parasiterna förstör de humana erytrocyterna och sprids via Anopheles-myggor som är vektorer. Parasitsläktet som orsakar malaria kallas Plasmodium och består av fem arter. Orsaken bakom flest dödsfall är P. falciparum och därför går mycket diagnostik ut på att detektera just denna art. Sjukdomen uppkommer cirka en vecka från det att man blivit myggbiten. Symptomen kan vara väldigt varierande vilket gör det svårt att ställa en snabb diagnos. Effektiva läkemedel mot malariaparasiterna finns men de sätts i för många fall, in på fel sätt eller inte alls vilket beror på brister i diagnosticeringen. Kunskap och framförallt resurser saknas i endemiska områden. Idag används mikroskopi av blodutstryk (pheripheral blood smears (PBS)) som rutinmässig standard för malariadiagnostik, men för att kunna ställa tidigare och mer säkra diagnoser har nya metoder utvecklats. Det finns många kriterier som bör uppfyllas av en lyckad metod så som känslighet, snabbhet, omgivningsanpassning och en acceptabel kostnad. För att komma fram till vilken metod som passar bäst utifrån dessa aspekter samt framtidspotential jämförs i denna studie mikroskopi av tjocka och tunna blodutstryk, quantitative buffy coat (QBC), polymerase chain reaction (PCR), cell-microarray chip, loop-mediated isothermal amplification (LAMP) och rapid diagnostic tests (RDTs). Slutsatserna som kan dras är att mer arbete behöver göras innan en ny metod helt kan ersätta konventionell mikroskopi. I de endemiska områdena är kostnaden och enkelheten väldigt betydande och därför är LAMP den metod som jag efter att alla dessa metoder ha jämförts, anses ha mest potential för att uppfylla kriterierna och skulle kunna ersätta den konventionella mikroskopin om metoden vidareutvecklas. / Malaria is a parasitic disease known worldwide. In 2015 the disease caused 438000 deaths of which 90% occurred in the African region. The parasites destroy the erythrocytes in the human body and are transmitted by the Anopheles mosquitoes. There are five species of the genus Plasmodium that causes malaria. The species P. falciparum causes the most deaths and therefore most diagnostics are about detecting this species. Malaria occurs approximately a week after the infecting bite. The symptoms are often varying and nonspecific and hence complicate the diagnosis of the disease. Thick and thin blood film microscopy examination (Pheripheral blood smears) is the golden standard for malaria diagnosis. However, to be able to make quicker and more reliable diagnoses new methods need to be developed. Even though there are effective drugs against malaria, delayed diagnoses and treatment are major causes of death in many countries. Knowledge and resources are primarily lacking in the endemic areas where it is needed the most. There are many criteria for a method that should be fulfilled; such as sensitivity, rapidness, accuracy and cost-effectiveness. The method needs to be easy to use in the actual environment and it has to have potential for the future. This is a comparative study of microscopy of thick and thin blood smears (PBS), quantitative buffy coat (QBC), polymerase chain reaction (PCR), cell-microarray chip, loop-mediated isothermal amplification (LAMP) and rapid diagnostic tests (RDTs). The conclusion that can be drawn from this study is that more work needs to be done before a new method can replace conventional microscopy. In the endemic areas the aspects of cost and simplicity are important to take into consideration. Among the methods in this study, The LAMP seems to be the one with the most potential if it continues to develop in the future.

Embora não existam colônias reprodutivas de pinguins na costa do Brasil, o país é uma importante área de invernada para o pinguim-de-Magalhães (Spheniscus magellanicus), uma espécie nativa do sul da América do Sul. Quando encontradas debilitadas em praias brasileiras, estas aves são comumente levadas a centros de reabilitação especializados para receber cuidados veterinários e, posteriormente, serem liberadas à natureza. Durante esta permanência em reabilitação, no entanto, enfermidades infecciosas como a malária aviária podem ser importantes limitantes à recuperação destas aves. A malária aviária é uma enfermidade causada por protozoários do gênero Plasmodium (Apicomplexa: Haemosporida), veiculados às aves por meio da picada de mosquitos. Enquanto estes parasitas são relativamente pouco patogênicos para a maioria das espécies aviárias, algumas aves como os pinguins são excepcionalmente mais suscetíveis a estes patógenos, podendo constituir uma significativa ameaça à sua conservação. O presente estudo investiga a ocorrência de Plasmodium spp. e outros hemoparasitas em pinguins-de-Magalhães em centros de reabilitação na costa brasileira, assim como outras espécies de pinguins em vida livre nas Ilhas South Shetland. Métodos diagnósticos morfológicos (esfregaços sanguíneos, histopatologia) e moleculares (reação em cadeia de polimerase aninhada, sequenciamento genético) foram utilizados para estudar pinguins reabilitados em diferentes instituições em seis estados do Brasil entre 1999 e 2013. Um surto de malária aviária particularmente relevante foi estudado em detalhes em um centro de reabilitação em Florianópolis, SC, tendo sido demonstrado o envolvimento de três diferentes linhagens de Plasmodium spp. em um único evento epizoótico, com elevada morbidade e mortalidade. Além disto, a ocorrência de Plasmodium spp. foi documentada em pinguins-de-Magalhães em centros de reabilitação ao longo de grande parte da costa brasileira, do extremo sul do Rio Grande do Sul à Bahia, com uma prevalência estimada entre 6.6% e 13.5%. Estas infecções apresentam marcante sazonalidade, incidindo exclusivamente nos meses mais quentes do ano (outubro a abril), e podem envolver uma grande variedade de linhagens de Plasmodium spp., algumas das quais nunca haviam sido reportadas em pinguins como P. cathemerium, P. nucleophilum e P. tejerai. Em contraste não foram encontrados hemoparasitas em pinguins amostrados nas Ilhas South Shetland, um achado consistente com estudos anteriores. À parte destas investigações epidemiológicas, foi realizada uma extensa revisão e compilação dos aspectos da literatura científica acerca desta enfermidade e outras hemoparasitoses em pinguins buscando estabelecer um panorama mais claro acerca da sua distribuição geográfica e implicações epidemiológicas e para a conservação. Com base nisto, torna-se possível desenvolver uma discussão crítica do atual estado da arte e apontar as atuais lacunas de conhecimento que possam direcionar estudos futuros. Em suma, a malária aviária é uma enfermidade relevante para as mais diversas espécies de pinguins em todo o mundo, e possui particular importância para a reabilitação e conservação destas aves na América do Sul. / Despite no penguin breeding colonies along the Brazilian coast, the country is an important wintering area for the Magellanic penguin (Spheniscus magellanicus), a species native to the south of South America. When Magellanic penguins are found alive ashore on Brazilian beaches, they are taken to rehabilitation centers to receive veterinary care and then are released back into the wild. However, while in rehabilitation, infectious diseases such as avian malaria may become important limiting factors for the recovery of these birds. Avian malaria is a disease caused by protozoa of the genus Plasmodium (Apicomplexa: Haemosporida), which are transmitted to birds through mosquitoes. While these parasites are relatively non-pathogenic for most avian species, some birds such as penguins are exceptionally susceptible, such that Plasmodium poses a significant conservation threat. This study investigates the occurrence of Plasmodium spp. and other blood parasites in Magellanic penguins at rehabilitation centers along the coast of Brazil, and in other species of penguins at the South Shetland Islands, South Atlantic Ocean. In Brazil, a combination of morphological (blood smears, histopathology) and molecular (nested polymerase chain reaction, gene sequencing) diagnostic methods were employed to investigate the presence of haemoparasites in penguins undergoing rehabilitation in six states between 1999 and 2013. A particularly significant avian malaria outbreak was studied in detail at a rehabilitation center in Florianópolis, SC, where the involvement of three distinct Plasmodium spp. in a single epizootic event was demonstrated, with resultant high morbidity and mortality. The occurrence of Plasmodium spp. was documented in Magellanic penguins at rehabilitation centers along most of the Brazilian coast, from southernmost Rio Grande do Sul to Bahia, with an estimated prevalence between 6.6% and 13.5% of captive penguins. These infections were markedly seasonal, with the incidences exclusively restricted to the warmer months of the year (October to April), and involving a broad variety of Plasmodium spp. lineages, some of which had not yet been reported in penguins, such as P. cathemerium, P. nucleophilum and P. tejerai. In contrast, no blood parasites were detected in the penguins sampled at the South Shetland Islands, a finding that is consistent with previous studies. Aside from these epidemiological investigations, an extensive revision and compilation of the scientific literature was conducted for this disease and other penguins haemosporidioses, aiming to establish an integrated understanding of their geographic distribution and epidemiological and conservation implications. On this basis, it is possible to critically examine the state of the art and identify knowledge gaps that can be addressed in future studies. Avian malaria is a significant disease and conservation threat for most penguin species throughout the world, and has particular importance for the rehabilitation and conservation of penguins in South America.

Os receptores do tipo toll (toll-like receptors ou TLRs) são uma família de receptores na primeira linha de defesa do sistema imune inato que são capazes de reconhecer padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs), dentre os patógenos mais importantes encontra-se Plasmodium. Variações genéticas nesses receptores estão associadas à resistência ou suscetibilidade a uma variedade de doenças infecciosas. Sabe-se que as freqüências destas mutações também podem variar de acordo com a ancestralidade biogeográfica dos indivíduos. Este trabalho avaliou a relação entre 24 polimorfismos em TLRs, ancestralidade e malária em 195 indivíduos residentes em área de Mata Atlântica do Estado de São Paulo. A ancestralidade genômica individual foi estimada usando marcadores autossômicos de inserção/deleção (INDELs) e os polimorfismos em TLR foram genotipados por PCR-RFLP, sequenciamento e eletroforese capilar. Dados prévios de malária presente ou pregressa obtidos por métodos moleculares e sorológicos foram utilizados para avaliar a relação dos polimorfismos em TLRs e malária nesses indivíduos. Os resultados mostraram que: (i) nove SNPs e um microssatélite foram polimórficos; (ii) a maior parte dos indivíduos analisados apresentou maior proporção de ancestralidade europeia; (iii) as proporções médias de ancestralidade europeia diferiram significantemente nos genótipos de TLR1 (I602S) e TLR6 (P249S); (iv) a probabilidade de ter o alelo variante G em TLR1 aumenta com o aumento da ancestralidade européia assim como aumenta a probabilidade de ter o alelo variante T no TLR6; (v) o polimorfismo em TLR9 -1237T/C foi fortemente relacionado à malária, sendo demonstrado que a presença de pelo menos um alelo C nessa posição aumentou o risco para malária 2,3 vezes; e (vi) TLR9 -1486T/C em associação com o TLR6 foi protetor, pois a associação dos alelos variantes reduziu o risco de malária em 4,4 vezes. O alelo G em TLR1 tem sido relacionado a uma resposta imune diminuída, o que poderia explicar a alta prevalência de casos de malária assintomática em áreas do sudeste brasileiro. O TLR9 tem sido relacionado com a patogênese da malária em estudos em animais e em humanos, sendo possivelmente modulado por polimorfismos na região promotora. Nossos dados também reforçam a necessidade de incluir marcadores de ancestralidade em estudos de associação genética para evitar resultados enviesados. Por fim, este é o primeiro estudo a associar polimorfismos em genes de imunidade inata e malária em amostras de Mata Atlântica. / Toll-like receptors (TLRs) are a family of receptors in the first line of defense of the innate immune system and they are able to recognize molecular patterns associated with pathogens (PAMPs), among the most important pathogens is Plasmodium. Genetic variations in these receptors are associated with resistance or susceptibility to a variety of infectious diseases. It is known that the frequencies of these mutations can also vary according to the biogeographic ancestry of the individuals. This work evaluated the relationship among 24 polymorphisms in TLRs, ancestry and malaria in 195 individuals living in the Atlantic Forest area of the São Paulo State. Individual genomic ancestry was estimated using autosomal insertion/deletion markers (INDELs) and TLR polymorphisms were genotyped by PCR-RFLP, sequencing and capillary electrophoresis. Previous data about present or previous malaria were obtained by molecular and serological methods and were used to evaluate the relationship of polymorphisms in TLRs and malaria in these individuals. The results showed that: (i) nine SNPs and one microsatellite were polymorphic; (ii) the majority of the individuals analyzed presented a greater proportion of European ancestry; (iii) the average proportions of European ancestry differed significantly in the genotypes of TLR1 (I602S) and TLR6 (P249S); (iv) the probability of having the variant G allele in TLR1 increases with increasing European ancestry as well as increases the probability of having the T allele variant in TLR6; (v) the TLR9 -1237T/C polymorphism was strongly related to malaria, and the presence of at least one C allele in this position was shown to increase the risk for malaria 2.3 times; and (vi) TLR9-1486T/C in combination with TLR6 was protective, since the association of variant alleles reduced the risk of malaria by 4.4 times. The G allele in TLR1 has been related to a decreased immune response, which could explain the high prevalence of cases of asymptomatic malaria in areas of southeastern Brazil. TLR9 has been linked to the pathogenesis of malaria in animal and human studies, possibly being modulated by polymorphisms in the promoter region. Our data also reinforce the need to include ancestral markers in genetic association studies to avoid biased results. Finally, this is the first study to associate polymorphisms in genes of innate immunity and malaria in Atlantic Forest samples.

O sistema imune exerce uma contribuição fundamental na proteção contra a infecção pelo plasmódio, o agente causador da malária. Entre os mecanismos envolvidos no controle dos parasitas do sangue destacam-se aqueles mediados por anticorpos. Entretanto, outros mecanismos do sistema imune também parecem exercer papéis fundamentais, e ao mesmo tempo foram pouco estudados. O presente trabalho teve como objetivo descrever alguns dos mecanismos efetores importantes na resposta imune à malária experimental. O projeto subdivide-se em duas partes: a) verificar a relação entre o priming por IFN-g e a imunidade ao parasita durante a fase crônica da infecção sanguínea pelo Plasmodium; e b) descrever separadamente o papel de células dendríticas e macrófagos do baço na fagocitose de eritrócitos infectados durante a infecção em modelo experimental, e o subsequente papel destas células na resposta imune durante esse período. Os resultados obtidos neste projeto deverão contribuir para a compreensão dos mecanismos envolvidos na imunidade contra a malária. / The immune system is considered crucial for the protection against Plasmodium infection. Among the mechanisms involved in the control of blood-stage parasites, the ones mediated by antibodies are widely recognized. However, other mechanisms of immune system can also exert fundamental roles, being less studied. This work had the objective of describing some of the effector mechanisms important in the immune response to blood-stage experimental malaria. This work was subdivided in two main branches: a) to verify the relation between the IFN-g-induced priming and the protective immunity to the parasite during the chronic phase of blood-stage infection; and b) to describe separately the role of dendritic cells and splenic macrophages as phagocytic cells during acute Plasmodium chabaudi infection, and the subsequent role of these cells in the immune responses during this period. The results obtained in this project may contribute for the comprehension of the mechanisms involved in the immunity against malaria.