Clopidogrel is an antiplatelet drug prescribed to prevent stent thrombosis after a percutaneous coronary intervention (PCI). Previous evidence suggests that some widely prescribed statins may inhibit the antiplatelet effects of clopidogrel via competitive metabolism of its activating enzyme cytochrome P450 3A4 (CYP3A4). / The objective was to investigate the possibility of an interaction post-PCI between statins and clopidogrel. / We carried out a population-based cohort study identifying 10,491 patients using clopidogrel post-PCI (2001-2004). The outcome was a composite of death of any cause, myocardial infarction, unstable angina, repeat revascularization, and cerebrovascular events. We found that co-prescription of CYP3A4-metabolized statins (hazard ratio (HR) 0.95, 95% confidence interval (CI) 0.79-1.15), or non-CYP3A4-metabolized statins (HR 0.82, 95% CI 0.63-1.07) with clopidogrel was not associated with increase in adverse outcomes. / We observed no evidence of interaction between clopidogrel and statins in a large population cohort of PCI patients, suggesting unlikelihood of an important interaction.

Radiofrequency catheter ablation (RFA) is a rapidly developing, minimally invasive method of treatment for heart arrhythmias. Its employment is however limited due to complications, including thromboembolic ones. The basic of seven objectives of this dissertation were to: 1. by using different agonists of aggregation, to evaluate alteration of platelet aggregation in the venous blood and platelet-rich plasma, fibrinogen and D-dimer levels before RFA, immediately after, 24 hours and 72 hours after RFA under the influence of RFA in patients suffering from heart arrhythmia; 2. to establish the influence of the total RFA energy, structural heart disease, antithrombotic medicines know in the alteration of platelet aggregation induced by different agonists and in the alteration before RFA, immediately after and 24 hours after RFA. The obtained data show that changes in PA after RFA depended on whether PA proceeded in the venous blood or plasma and on the agonist used to induce aggregation. According to the results, PA is suppressed immediately after RFA and increases in 24 hours. The level of the applied total energy had an effect on changes in platelet aggregation after RFA. The dynamics of PA in patients with and without a structural heart disease were similar. The obtained pre-RFA values of PA were lower in blood and even lower in plasma in the group of patients who used aspirin, as compared to those who used low molecular mass heparin or no antithrombotic medicines. Despite the... [to full text]

Thesis (Ph.D. in Immunology) -- University of Colorado Denver, 2007. / Typescript. Includes bibliographical references (leaves 177-196). Free to UCD affiliates. Online version available via ProQuest Digital Dissertations;

Von Willebrand disease (vWD) is one of the most common inherited bleeding diseases, caused by a qualitative or quantitative deficiency of the von Willebrand factor (vWF). vWF is a multimeric glycoprotein synthesized by megakaryocytes and endothelial cells and it is present in the subendothelial matrix, blood plasma, platelets and endothelium. This glycoprotein represents an important role in thrombus formation by initiating platelet adhesion to sites of injury as well as platelet aggregation. The objective of this study was determine the activities of NTPDase (CD39), 5 -nucleotidase (EC 3.1.3.5, CD73) and Ectonucleotide Pyrophosphatase/Phosphodiesterase (E-NPP) enzymes in platelets patients from von Willebrand disease and healthy patients, as well as ristocetin-induced platelet aggregation (RIPA) and polymorphisms of the α2 gene of the α2β1 integrin. The following groups were studied: 14 patients diagnosed with vWD and 14 healthy patients for control group. For ristocetin-induced platelet aggregation was used a Platelet Rich Plasma (PRP) and Platelet Poor Plasma (PPP), using a final concentration of ristocetin in 1.25mg/mL. The polymorphisms of the α2 gene was analyzed through the Polymerase chain reaction (PCR), used for digestion of the PCR product of the Bgl II restriction site. NTPDase and E-NPP were decreased in platelets of patients with vWD compared to the group control. Moreover, the activity of the enzyme 5'- nucleotidase was not statistically significant. The results of the RIPA were significantly reduced in patients with vWD compared with the control. The allelic frequencies among vWD patients were found to be 78.57% for 807C and 21.43% for 807T. Our results indicate an decreased NTPDase and E-NPP activities in platelets, may be related to the low adhesiveness of platelets in patients with vWD. The allelic frequency 807C predominant suggests, in agreement with other studies, this polymorphism and factor characteristic of hemorrhagic manifestations in patients with DvW. / A doença de von Willebrand (DvW) é uma das mais comuns entre as doenças hemorrágicas, e é provocada por uma deficiência qualitativa ou quantitativa do fator de von Willebrand (FvW). O FvW é uma glicoproteína multimérica sintetizada por megacariócitos e células endoteliais e está presente no matriz subendotelial, no plasma sanguíneo, nas plaquetas e no endotélio. Esta glicoproteína desempenha um papel importante na formação do trombo plaquetário, iniciando a adesão plaquetária ao local do dano vascular, bem como, a agregação plaquetária. O objetivo deste estudo foi determinar a atividade das enzimas NTPDase (EC 3.6.1.5, CD39), 5'-nucleotidase (EC 3.1.3.5, CD73) e Ectonucleotideo pirofasfatase/fosfodiesterase (E-NPP) em plaquetas de pacientes com a DvW e em plaquetas de pacientes saudáveis, bem como agregação plaquetária induzida pela ristocetina (RIPA) e o polimorfismo do gene α2 da integrina α2β1 da superfície de plaquetas. Os grupos foram divididos da seguinte forma: 14 pacientes diagnosticados com DvW e 14 pacientes saudáveis, para o grupo controle. Para a RIPA foram utilizados um Plasma Rico em Plaquetas (PRP) e um Plasma Pobre em Plaquetas (PPP), utilizando-se uma concentração final de ristocetina de 1.25mg/mL. O polimorfismo do gene α2 foi analisado através da reação em cadeia de polimerase (PCR), utilizando para a digestão do produto da PCR a enzima de restrição Bgl II. Constatou-se que a atividade das enzimas NTPDase e E-NPP foram reduzidas em plaquetas de pacientes com DvW comparadas ao grupo controle. Por outro lado, a atividade da enzima 5'-nucleotidase não foi estatisticamente significativa. Os resultados para os RIPA foram significativamente reduzidos em pacientes com DvW comparado com o controle. A freqüência alélica encontrada entre os pacientes com DvW foi de 78,57% para o alelo 807C e de 21,43% para o alelo 807T. Nossos resultados indicam que a redução da atividade da NTPDase e da E-NPP em plaquetas pode estar relacionada à baixa adesividade das plaquetas em pacientes com DvW. A freqüência alélica 807C predominante sugere, de acordo com outros estudos, que este polimorfismo é fator característico das manifestações hemorrágicas em pacientes portadores da DvW.

Submitted by Maike Costa (maiksebas@gmail.com) on 2017-01-31T12:37:20Z No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 2719783 bytes, checksum: 00456e5b8ca69f853baec641a28cd6f2 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-31T12:37:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 2719783 bytes, checksum: 00456e5b8ca69f853baec641a28cd6f2 (MD5) Previous issue date: 2016-04-01 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / The β-D-glucans are polysaccharides constituting the cell wall of yeasts such as Saccharomyces cerevisiae. Evidence shows polymers have several beneficial effects, mainly related to immunomodulation. However, their action on platelet and endothelial function is understudied. This study aimed to evaluate the effect of (1-3) (1-6) β-D-glucan extracted from S. cerevisiae and derivative carboxymethylated (CM-G) on vascular and platelet function in rats. The animals were treated orally with CM-G and BG-Sc at a dose of 20 mg/kg daily for eight days and the controls received saline as placebo. At end, were collected blood and thoracic aortic artery to study platelet activation and aggregation by light transmission, flow cytometry, vascular reactivity and cytokine assay. In vitro studies of platelet activation and aggregation induced by adenosine diphosphate (ADP) and collagen were conducted with CM-G at different concentrations (100 and 300 μg/mL). Significant reduction in IL-8 levels (4,18 ± 0,72 pg/mL) in the group treated with CM-G was also found when compared to control (22,7 ± 6,9 pg/mL) and the BG-Sc group (16,4 ± 2,4 pg/mL). The reactivity studies shows BG-Sc and CM-G had no influence on vascular response to phenylephrine (PHE) compared to the control. In the group treated with BG-SC, the response to vasorelaxantes agents such as acetylcholine (ACH; Emax = 90,2 ± 14,1%; pD2 = 6,36 ± 0,30 M) and sodium nitroprusside (SNP; Emax = 92,3 ± 2,4%; pD2 = 10,21 ± 0,10M) were impaired compared to controls (ACH: Emax = 100 ± 7,5%; pD2 = 8,17 ± 0,25 M; SNP: Emax = 100 ± 9,5%; pD2 = 11,18 ± 0,27 M). However, treatment with CM-G (max = 93,1 ± 2,7%; pD2 = 11,71 ± 0,07 M) increased the potency of NPS when compared with the control (Emax = 100 ± 9.5%; pD2 = 11.18 ± 0.27). In vitro studies of platelet aggregation by light transmission reveals CM-G inhibited the aggregation stimulated by ADP in doses of 100 and 300 mg/ml, reaching 25,7 ± 2,7% and 14,8 ± 3,2% of aggregation, respectively. When aggregation was induced by collagen, only the dose 300 mg/ml had inhibitory activity (33 ± 6,2%). The antiplatelet effect was similar to acetylsalicylic acid when the aggregation was generate by ADP. Aggregation inhibition was also demonstrated by flow cytometry, however was observed that CM-G had no effect on platelet activation. In treated animals, there was inhibition of platelet aggregation induced by ADP (45% ± 3,9 and 45 ± 6%, respectively). However, when induced by collagen, antiplatelet effect was observed only in animals receiving the BG-Sc (22,6 ± 7,7%). The treatment and in vitro aggregation assays suggest that CM-G appears to be more selective for ADP. The findings indicate the CM-G and BG-Sc feature antiplatelet effect and modulating vascular function. Thus, the use of these polysaccharides may be a possible tool for the prevention of cardiovascular diseases / As β-D-glucanas são polissacarídeos constituintes da parede celular de leveduras, como a Saccharomyces Cerevisae. Evidências mostram que esses polímeros possuem diversos efeitos benéficos, principalmente relacionados a imunomodulação. Entretanto, a sua ação sobre a função plaquetária e endotelial é pouco estudada. Assim, este estudo teve como objetivo avaliar o efeito da (1-3) (1-6) β-d-glucana extraída de S. cerevisae e do seu derivado carboximetilado (CM-G) sobre a função vascular e plaquetária em ratos. Os animais foram tratados por via oral com CM-G e BG-Sc na dose de 20 mg/Kg, diariamente, durante oito dias, e os controles receberam solução salina como placebo. Ao final, foram coletados o sangue e a artéria aorta torácica para estudos de agregação e ativação plaquetária por transmissão luminosa, citometria de fluxo, reatividade vascular e dosagem de citocinas. Foram realizados estudos in vitro de agregação e ativação plaquetária induzida por adenosina difosfato (ADP) e colágeno com a CM-G em diferentes concentrações (100 e 300 μg/mL). Constatou-se redução significativa dos níveis de IL-8 (4,18±0,72 pg/mL) no grupo tratado com CM-G ao se comparar com o grupo controle (22,7±6,9 pg/mL) e com o grupo BG-Sc (16,4±2,4 pg/mL). Os estudos de reatividade mostraram que a BG-Sc e a CM-G não exerceram influência sobre a resposta vascular da fenilefrina (PHE) em relação ao controle. No grupo tratado com BG-SC, a resposta aos agentes vasorelaxantes acetilcolina (ACH; Emax = 90,2 ± 14,1%; pD2 = 6,36 ± 0,30 M) e nitroprussiato de sódio (NPS; Emax = 92,3± 2,4%; pD2 = 10,21 ± 0,10M) foram prejudicadas em relação aos controles (ACH: Emax = 100 ± 7,5%; pD2 = 8,17 ± 0,25 M; NPS: Emax = 100 ± 9,5%; pD2 = 11,18 ± 0,27 M). Porém, o tratamento com a CM-G (Emax = 93,1 ± 2,7 %; pD2 = 11,71 ± 0,07 M) aumentou a potência do NPS quando comparado com o controle (Emax = 100 ± 9,5%; pD2 = 11,18 ± 0,27 M). Os estudos de agregação plaquetária in vitro por transmissão luminosa revelam que a CM-G inibiu a agregação estimulada por ADP nas doses de 100 e 300 μg/mL, atingindo 25.7±2.7% e 14.8±3.2% de agregação, respectivamente. Quando a agregação foi induzida pelo colágeno, apenas a dose 300 μg/mL teve ação inibitória (33 ± 6,2%). O efeito antiagregante foi similar ao ácido acetilsalicílico quando a agregação foi induzida por ADP. Inibição da agregação também foi demonstrada na técnica de citometria de fluxo, porém observou-se que a CM-G não afetou a ativação plaquetária. Nos animais tratados, verificou-se inibição da agregação plaquetária induzida por ADP (45 ± 3.9% e 45 ± 6 %, respectivamente). Entretanto, quando induzido por colágeno, o efeito antiagregante foi visto apenas nos animais que receberam BG-Sc (22.6 ± 7.7%). O tratamento e os ensaios de agregação in vitro sugerem que a CM-G parece ser mais seletiva para o ADP. Os achados indicam que a CM-G e a BG-Sc apresentam efeito antiagregante e moduladora da função vascular. Assim, o uso desses polissacarídeos pode ser uma possível ferramenta para a prevenção de doenças cardiovasculares.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / In the development of this research, 15 New Zealand rabbits were used, with the aim of storing platelet-rich plasma (PRP) during 30 days refrigerated at 4-6oC. There was a preparation of 30 samples of PRP which were sorted in three equal groups. Every three days a sample would be removed for evaluation, before and after storage, for the number of platelets, mean platelet volume (MPV), pH of the plasma, aggregation post addition of calcic thromboplastin and for the presence of bacterial and fungal contamination. In the variables of number of platelets, there was no linear relationship in function of time, when comparing the number of platelets before x after storage, a statistical difference was observed. The hemogram MPV variables, before and after storage also did not relate with time, however there was a statistical difference in the comparisons of MPV on blood count x MPV before storage and of MPV before storage x MPV post storage. On the evaluation of the pH there was no influence of time on the variables, but statistical differences were found in the samples after storage in between the periods of 30 and 6; 30 and 24; 30 and 27 days. Platelet aggregation occurred within twenty seconds in all samples independent of storage time. There was no growth of bacteria or yeast in any sample, however mold growth occurred in the samples 21 days of storage on group one and three. It can be concluded that platelet-rich plasma of rabbits can be stored under refrigeration of 4 to 6 °C for maintaining the number of platelets, without significant pH alteration and absence of bacterial or fungal contamination during 18 days. / Utilizou-se 15 coelhos da raça Nova Zelândia para o desenvolvimento da pesquisa, com o objetivo de armazenar plasma rico em plaquetas (PRP) durante 30 dias sob refrigeração de 4-6ºC. Preparou-se 30 amostras de PRP que foram divididas em três grupos iguais. A cada três dias uma amostra foi retirada para avaliação antes e após o armazenamento quanto ao número de plaquetas, volume plaquetário médio (VPM), pH do plasma, agregação pós adição de tromboplastina cálcica e presença de contaminação bacteriana e fúngica. Nas variáveis número de plaquetas, não houve relação linear em função do tempo, na comparação do número de plaquetas pré x pós armazenamento, observou-se diferença estatística. As variáveis de VPM do hemograma, pré e pós armazenamento também não apresentaram relação com o tempo, porém obteve-se diferença estatística nas comparações VPM no hemograma x VPM pré armazenamento e VPM pré-armazenamento x VPM pós armazenamento. Na avaliação do pH não houve influência do tempo nas variáveis, mas houve diferença estatística nas amostras pós armazenamento entre os períodos 30 e 6; 30 e 24; 30 e 27 dias. A agregação plaquetária ocorreu dentro de vinte segundos em todas as amostras independente do tempo de estocagem. Não houve crescimento bacteriano e de leveduras em nenhuma amostra, porém ocorreu crescimento de bolores nas amostras 21 dias de armazenamento dos grupos um e três. Pode-se concluir que o plasma rico em plaquetas de coelhos pode ser armazenado sob refrigeração de 4 a 6ºC por manter o número de plaquetas, sem alteração significativa do pH e ausência de contaminação bacteriana e fúngica durante18 dias. / Mestre em Ciências Veterinárias

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / CAPÍTULO II: Peçonhas de serpentes são uma mistura complexa de compostos orgânicos e inorgânicos, proteínas e peptídeos, tais como as aminotransferases, acetilcolinesterases, hialuronidases, L-aminoácido-oxidases, fosfolipases A2, metaloproteases, serinoproteases, lectinas, desintegrinas, entre outros. As fosfolipases A2 influenciam direta ou indiretamente no efeito fisiopatológico no envenenamento, pois além de sua participação na digestão das presas, elas apresentam várias outras atividades como ação hemolítica indireta, neurotoxicidade, cardiotoxicidade, ação agregadora de plaquetas, atividades anticoagulante, edematogênica, miotóxica e inflamatória. Neste trabalho, descrevemos a caracterização funcional de BaltMTx, uma PLA2 de Bothrops alternatus que inibe a agregação plaquetária e apresenta efeito bactericida. A purificação de BaltMTx foi realizada por uma combinação de três passos cromatográficos (cromatografia de troca iônica em DEAE-Sephacel, seguido de cromatografia de interação hidrofóbica em Phenyl-Sepharose, e cromatografia de afinidade em Heparina HiTrap™ HP). A proteína foi purificada até à homogeneidade, tal como avaliado pelo seu perfil de migração em SDS-PAGE, corado com azul de Coomassie, que mostrou uma massa molecular de cerca de 15 kDa sob condições redutoras e cerca de 25 kDa em condições não redutoras. BaltMTx mostrou um efeito inibidor específico sobre a agregação plaquetária induzida por epinefrina em plasma humano rico em plaquetas, de uma maneira dose dependente. Todavia, apresentou pouco ou nenhum efeito sobre a agregação plaquetária induzida por colágeno e adenosinadifosfato. BaltMTx, também, mostrou atividade antibacteriana contra Staphylococcus aureus e Escherichia coli. Altas concentrações de BatlMTx estimulou a proliferação de Leishmania (Leishmania) infantum e Leishmania (Viania) braziliensis. BaltMTx induziu a produção de mediadores inflamatórios tais como IL-10, IL-12, TNF-α e NO. BaltMTx apresenta grande interesse médico, tanto como uma nova ferramenta para o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos para a prevenção e tratamento de distúrbios trombóticos, quanto como agente bactericida. / CHAPTER II: Snake venoms are a complex mixture of organic and inorganic compounds, proteins and peptides such as aminotransferases, acetylcholinesterase, hyaluronidases, L-amino acid oxidase, phospholipase A2, metalloproteases, serine proteases, lectins, disintegrins, and others. Phospholipase A2 directly or indirectly influence the pathophysiological effect on envenomation, as well as their participation in the digestion of the prey. They have several other activities such as hemolytic indirect action, cardiotoxicity, aggregating of platelets, anticoagulant, edema, myotoxic and inflammatory activities. In this work, we describe the functional characterization of BaltMTx, a PLA2 from Bothrops alternatus that inhibits platelet aggregation and present bactericidal effect. The purification of BaltMTx was carried out through three chromatographic steps (ion-exchange on a DEAE-Sephacel column, followed by hydrophobic chromatography on Phenyl–Sepharose and affinity chromatography on HiTrap™ Heparin HP). The protein was purified to homogeneity as judged by its migration profile in SDS–PAGE stained with coomassie blue, and showed a molecular mass of about 15 kDa under reducing conditions and approximately 25 kDa in non-reducing conditions. BaltMTx showed a rather specific inhibitory effect on platelet aggregation induced by epinephrine in human platelet-rich plasma in a dose-dependent manner, whereas it had little or no effect on platelet aggregation induced by collagen or adenosine diphosphate. BaltMTx also showed antibacterial activity against Staphylococcus aureus and Escherichia coli. High concentrations of BatlMTx stimulated the proliferation of Leishmania (Leishmania) infantum and Leishmania (Viania) braziliensis. BaltMTx induced production of inflammatory mediators such as IL-10, IL-12, TNF-α and NO. BaltMTx could be of medical interest as a new tool for the development of novel therapeutic agents for the prevention and treatment of thrombotic disorders as well as bactericidal agent. / Dissertação (Mestrado)

Orientador:Marcos Hikari Toyama / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T05:12:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fonseca_FabianaVieira_D.pdf: 15606775 bytes, checksum: 3232092d1eced36a575f660d994b44a9 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: No Brasil a espécie predominante de serpente peçonhenta do gênero Crotalus é a Crotalus durissus, que é composta por várias subespécies encontradas em todo território nacional, as subespécies alvos de nosso estudo são a Crotalus durissus ruruima e a Crotalus durissus cumanenses, presentes na região amazônica e na Venezuela respectivamente, mas que ainda não foram tão bem estudadas quanto a Crotalus durissus terrificus. As principais frações já caracterizadas para o veneno total de Crotalus são: convulxina, giroxina, crotoxina e crotamina. Através de uma combinação de varias metodologias em HPLC como exclusão molecular e em fase reversa conseguimos isolar os principais constituintes da crotoxina (PLA2, crotapotina e as proteínas "trombina-like") dos venenos totais. Durante o fracionamento do veneno total em coluna de HPLC de exclusão molecular foi detectado com atividade fosfolipásica nas frações crotoxínicas de Crotalus durissus ruruima e Crotalus durissus cumanenses sendo confirmado através de eletroforese PAGE-SDS e espectrometria de massa MALDI-TOF. As PLA2 das duas subespécies alvo apresentaram alta homegeneidade com massa molecular de aproximadamente 14kDa e mostraram uma maior quantidade de aminoácidos básicos; lisina e arginina para um total de 122 aminoácidos. O N-terminal da seqüência de aminoácidos de PLA2 mostrou homologia com outras proteínas PLA2 do gênero crotálico. A fosfolipase (PLA2) constitui o maior componente presente no veneno de serpente e tem sido extensivamente investigado não só por ser mais abundante, mas por exibir uma ampla gama de efeitos biológicos, incluindo neurotoxidade, miotoxicidade, citotoxidade, efeito edematogênico, anti-coagulante, agregação plaquetária, hipotensivo, bactericida, anti-HIV, anti- tumor e anti-parasitário. Devido a esta diversidade funcional, estas proteínas estruturalmente semelhantes despertaram o interesse de muitos pesquisadores como modelos moleculares para o estudo das relações estrutura-função. No presente trabalho foi nosso propósito purificar o veneno total de Crotalus dirussus ruruima e Crotalus durissus cumanenses, isolar a fração fosfolipásica e verificar que as atividades biológicas e bioquímicas foram afetadas após prévias modificações estruturais com p-bromofenacil brometo e cumarinas sintéticas. Os resultados apresentados neste trabalho proporcionam a obtenção de uma ferramenta bioquímica útil para acrescentar novos conhecimentos à relação entre sítios farmacológicos, região catalítica nas fosfolipases A2 e função / Abstract: In Brazil the predominant species of poisonous snake of the genus Crotalus is the Crotalus durissus, which is composed of several subspecies found throughout the country. The sub-targets of our study is the Crotalus durissus ruruima and Crotalus durissus cumanensis present in the Amazon region and Venezuela respectively, that haven't been as well studied as the Crotalus durissus terrificus. The main fractions we know for the total of Crotalus poison were convulxin, giroxin, crotoxin and crotalin. Through a combination of many methodologies such as HPLC molecular exclusion and in a reverse phase we managed isolate the principal components of crotoxin (PLA2, crotapotin and proteins "thrombin-like") of the total poison. During the division of the total poison in column HPLC the molecular exclusion was detected a phospholipase activity in the fractions crotoxin Crotalus durissus ruruima and Crotalus durissus cumanensis that confirmed through SDS-PAGE and electrophoresis of the mass MALDI-TOF. The two subspecies of PLA2 show us they are highly homogeneous with the molecular mass of almost 14kDa and a great amount of basic amino acids, lysine and arginine for a total of 122 amino acids. The N-terminal amino acid sequence of PLA2 showed homology with other proteins of the kind Crotalus PLA2. The phospholipase (PLA2) is the major component present in snake poison and has been extensively investigated not only because it is more abundant, but it shows a wide range of biological effects, including neurotoxicity, myotoxicity, cytotoxicity, edematogenic effect, anti-coagulant, platelet aggregation, hypotensive, bactericidal, anti-HIV, anti-tumor and anti-parasitic. Because of this functional diversity, these proteins structurally similar aroused the interest of many researchers as molecular models for the study of structure-function relationships. In this study our purpose was to purify the total poison of Crotalus durissus ruruima and Crotalus durissus cumanensis and isolate the fraction of phospholipase and found that the biochemical and biological activities were affected after previous structural changes with p-bromofenacil bromide and synthetic coumarins. The results presented in this work allow them to obtain a useful biochemical tool to add new knowledge to the relation between pharmacological sites, the catalytic region in phospholipases A2 and function / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

FundaÃÃo de Amparo à Pesquisa do Estado do Cearà / CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O gÃnero Lonchocarpus à bastante conhecido e amplamente estudado, porÃm nÃo hà registros na literatura cientÃfica dos usos farmacolÃgicos da espÃcie Lonchocarpus sericeus (Poir.) Kunth, (Leguminosae Papilionaceae). Estudos quÃmicos demonstraram que a fraÃÃo hexÃnica das cascas das raÃzes de L. sericeus (FLS) à rica nas chalconas: lonchocarpina (LCC) e derricina (DRC). O objetivo deste trabalho foi investigar os efeitos tÃxicos e as aÃÃes farmacolÃgicas da FLS e de sua chalconas LCC e DRC. A DL50 para FLS em camundongos foi de 781,5 mg/kg por v.o. e 446,2 mg/kg, por via i.p. A FLS e a DRC mostraram efeito inibitÃrio concentraÃÃo-dependente sobre o desenvolvimento embrionÃrio de ovos de ouriÃo-do-mar Lytechinus variegatus. A FLS, LCC e DRC apresentaram ainda atividade citotÃxica sobre cÃlulas de leucemia linfocÃtica de origem humana. A FLS, administrada por via sistÃmica, apresentou atividade antiedematogÃnica nos modelos de edema de pata induzidos por carragenina (Cg) e levedura de cerveja, mas nÃo sobre aqueles induzidos por dextrano ou bradicinina. O efeito da FLS no edema por Cg nÃo foi modificado pela associaÃÃo com a indometacina ou L-NAME, mostrando que a mesma parece nÃo interferir com a via da COX ou do sistema NO. Entretanto, este efeito da FLS foi potencializado pela pentoxifilina (PTX) evidenciando uma possÃvel inibiÃÃo da FDE e/ou da sÃntese de citocinas inflamatÃrias como o TNF-alfa. Apesar de ter inibido significativamente a migraÃÃo de neutrÃfilos na cavidade peritoneal de ratos induzida por Cg, a FLS apresentou um efeito inibitÃrio bem maior sobre Ãquela induzida por fMLP, demonstrando que a mesma alÃm de bloquear a sÃntese e/ou liberaÃÃo de mediadores inflamatÃrios como PGs, LTs e citocinas, pode tambÃm bloquear uma das etapas da migraÃÃo ou ainda, inibir alguma das molÃcula de adesÃo envolvidas neste processo. A FLS tambÃm reduziu o dano tissular induzido por Ãcido acÃtico em ratos, evidenciado atravÃs de seu efeito inibitÃrio sobre a atividade da MPO. Entretanto, a mesma nÃo foi capaz de suprimir a formaÃÃo do tecido de granulaÃÃo, induzida por pellet de algodÃo, onde as PGs desempenham um papel essencial. A atividade antinociceptiva da FLS tambÃm foi observada em modelos experimentais de dor como teste das contorÃÃes abdominais induzidas pelo Ãcido acÃtico e teste da formalina, em camundongos. Todavia, a FLS nÃo modificou a resposta nociceptiva ao estÃmulo tÃrmico no teste da placa quente. Este efeito antinociceptivo da FLS independe do sistema opiÃide e da via do NO, e tambÃm nÃo envolve a participaÃÃo do componente adrÃnergico, porÃm alÃm de outros mecanismos, a inibiÃÃo da FDE e/ou da sÃntese de citocinas como TNF-alfa parecem exercer um papel importante na antinocicepÃÃo da FLS. A atividade antiagregante plaquetÃra da FLS, LCC e DRC tambÃm foi estudada e os resultados demonstraram que as mesmas possuem efeito inibitÃrio da agregaÃÃo in vitro em plasma humano rico em plaquetas, frente aos agonistas ADP, colÃgeno, trombina, Ãcido araquidÃnico e adrenalina. O efeito antiagregante plaquetÃrio da FLS, LCC e DRC foi potencializado pela PTX, um inibidor da fosfodiesterase de AMPc, mas nÃo pela L-arginina ou pelo Ãcido acetilsalicÃlico. Desta forma, a FLS possui atividade citotÃxica, antiinflamatÃria, analgÃsica e antiagregante plaquetÃria. Estes efeitos parecem ser mediados pelas chalconas LCC e DRC, presentes na FLS. / The Lonchocarpus genus is well known and much studied though there is no record on scientific publications about the pharmacological properties of the species Lonchocarpus sericeus (Poir.) Kunth, (Leguminosae Papilionaceae). Chemical research determined that the hexanic fraction from root bark of L. sericeus (FLS) is rich in two chalcones: lonchocarpin (LCC) and dericin (DRC). This workâs purpose was to investigate the toxical effects and the pharmacological actions of FLS and its chalcones LCC e DRC. The LD50 of FLS in mice was 781,5 mg/kg, p.o. and 446,2 mg/kg, i.p. FLS and DRC showed concentration-dependent inhibition on the development of the sea urchin Lytechinus variegatus eggs. Additionaly, FLS, LCC and DRC showed cytotoxic activity on human lymphocytic leukemia cells. Sistemically administered FLS demonstrated anti-edematogenic activity on carragenan (Cg)- and yeast-induced rat paw edema models, but did not show any effect on dextran- or bradikinin-induced rat paw edema models. The FLS effect on Cg model was not modified by treatment with indomethacin or L-NAME what implies that it seems not to affect COX or NO pathways. Notwithstanding, this FLS effect was indeed potentiated by pentoxifylline (PTX) suggesting a possible phosphodiesterase (PDE) or TNF-alfa like cytokines inhibition. Even though FLS significantly inhibited the Cg-induced neutrophil migration on peritoneal cavity of rats, it showed a even stronger inhibitory effect upon fMLP-induced neutrophil migration on peritoneal cavity. This demonstrates that FLS, besides blocking the synthesis or liberation of inflammation mediators such as PG, LT and cytokines can also block one of the migration steps or maybe some of the adhesion molecules involved. FLS also reduced tissue damage induced by acetic acid in rats, demonstrated by its ability to inhibit myeloperoxidase (MPO) activity. However, FLS was not capable of blocking cotton pellet induced granulation tissue formation, which is dependet on PG. FLS antinociceptive activity was observed in experimental pain models, such as the acetic acid-induced abdominal contractions and formalin test, both in mice. Nevertheless, FLS did not modify nociceptive response to thermic stimuli in the hot plate model. FLS antinociceptive effect does not depend on opioid or NO release, and equally is independent from adrenergic activity, though it seems to involve PDE and/or TNF-alfa and other cytokines inhibition. Anti-platelet activity of FLS, LCC and DRC was also studied and all of them showed in vitro platelet aggregation inhibition in platelet-rich human plasma, upon ADP, collagen, thrombin, arachidonic acid or adrenalin agonist addition. FLS, LCC and DRC anti-platelet effect was potentiated by PTX, a PDE inhibitor, but not by L-arginine or aspirin. In conclusion, FLS possess cytotoxic, anti-inflammatory, analgesic and anti-platelet activities. These effects seem to be mediated by the chalcones LCC e DRC, present in FLS.

Os envenenamentos causados pelas serpentes do gênero Bothrops são os mais importantes do ponto de vista médico e econômico na América Central. Dentre estas, a serpente Bothrops asper é responsável por 90% dos envenenamentos ofídicos registrados no Panamá anualmente. Apesar da relevância médica e econômica, só a peçonha de populações de B. asper da Costa Rica e Guatemala tem sido estudadas em detalhes. Neste trabalho apresentamos a caracterização da peçonha da B. asper do Panamá e o isolamento, a caracterização funcional e estrutural de quatro fosfolipases A2 básicas denominadas MTX-I, MXT-II, MTX-III e MXT-IV e de uma fosfolipase A2acídica denominada Basp-I-PLA2. As fosfolipases A2 foram isoladas da peçonha em duas etapas usando cromatografia de troca iônica em CM-Sepharose (0,05 M NH4HCO3 pH 8,1), e cromatografia hidrofóbica em Fenil-Sepharose (0,05 M Tris-HCl pH 7,4) seguida de gradiente de concentração de 4 a 0 M NaCl no mesmo tampão a temperatura ambiente (25°C). A isoforma acídica demonstrou maior atividade catalítica que as isoformas básicas, quando atuou sobre fosfatidilcolina e fosfatidilglicerol. A focalização isoelétrica evidencia pIs de 8,1 a 8,3 para as MTXs e 4,6 para isoforma Basp-I-PLA2. A determinação da massa molecular por espectrometria de massa mostrou que MTX-1 14,156.5; MTX-2 14,249.5 e MTX-3 14,253.0 e Basp-I-PLA2 14,246.0 Da. As PLA2s (MTX-I, II, III e IV) induziram atividade miotóxica, reação inflamatória com migração de leucócitos ao músculo e ativação de macrófagos para exercer fagocitose e produção de superóxido. MTX-II exerceu um forte efeito citotóxico contra células tumorais JURKAT, C. albicans e E. coli. A fosfolipase A2 acídica, testada no plasma enriquecido com plaquetas, mostrou potente efeito inibitório na agregação plaquetária induzida pela ADP e colágeno. A análise de seqüência N- terminal demonstrou que as proteínas MTX-I, MTX-III e Basp-I-PLA2 pertencem à subclasse de fosfolipases A2 Asp49 cataliticamente ativas, enquanto que, MTX-II e MTX-IV pertencem à subclasse de fosfolipases A2 Lys49-homólogas cataliticamente inativas. Além disso, a sequência N-terminal das fosfolipases A2 básicas isoladas, demonstrou claramente que as miotoxinas isoladas neste trabalho são similares às miotoxinas previamente isoladas da peçonha da B. asper da Costa Rica. A Basp-I-PLA2 é uma nova fosfolipase A2 acídica isolada da peçonha de B. asper do Panamá e sua seqüência N-terminal revelou uma alta homologia com outras PLA2s acídicas Asp49 isoladas de peçonhas de serpentes. / Envenoming by Bothrops snakes is the most serious kind of envenoming from the medical and economical point of view in Central America. Bothrops asper snake is responsible for 90% of the snakebites registered in Panama every year. Despite its medical and economical relevance, only the venom of Costa Rica and Guatemala populations of this species has been studied to some detail, and there is very little information on intraspecies variability in venom composition and toxicity. In this study the crude venom of B. asper from Panama was characterized and its pharmacological and biochemistry activities were investigated with standard laboratory assays. Furthermore, we describe the isolation, functional and structural characterization of four basic phospholipases A2, named MTX-I, MTX-II, MTX-III, MTX-IV and a new acid phospholipase A2 named Basp-I-PLA2. The proteins were isolated from the crude venom by a combination of two chromatographic steps, using ion-exchange chromatography on CM-Sepharose (0.05 M NH4HCO3 pH 8.1 buffer), and hydrophobic chromatography on Phenyl-Sepharose (0.05 M Tris-HCl pH 7.4), followed by concentration gradient from 4 to 0 M NaCl at 25°C in the same buffer. Analyses of phospholipids hydrolyzed by these enzymes have shown that all phospholipases belong to type A2. The acidic isoform demostraded more catalytic activity than the basic PLA2s. This enzyme was more active on substrates as phosphotidylcholine and phosphatidylglycerol. The isoelectric focusing evidenced pIs beetwen 8.1 to 8.3 for the MTXs and 4.6 for the isoform Basp-I-PLA2. Its mol. Wt was estimated by Mass spectrometry to be MTX-1 14,156.5; MTX-2 14,249.5 and MTX-3 14,253.0 and Basp-I-PLA2 14,246.0 Da. The PLA2s (MTX-I, II, III and IV) induced myotoxic activity, inflammatory reaction mainly leukocyte migration to the muscle and activation of macrophages to exert phagocytic activity and production of superoxide. MTX-II, the most abundant one showed to be cytotoxic against JURKAT tumor cell line, C. albicans and E. coli. The acidic phospholipases A2 when tested in platelet rich plasma, showed a potent inhibitory effect on aggregation induced by ADP and collagen. The analysis of the sequence N-terminal demonstrated that the MTX-I, MTX-III and BASP-I-PLA2 belong to the subclass of Asp49 phospholipases A2 catalytically active, whereas, MTX-II and MTX-IV belong to proteins of the subclass of the enzymatically inactive Lys49 PLA2 s-like. In addition, a sequence of the region N-terminal of the PLA2s basic isolated, demonstrated clearly, that the isolated myotoxins in this work are similar of the previously isolated myotoxins of the snake venom Bothrops asper from Costa Rica. The Basp-I-PLA2 is a new acidic PLA2 and his sequence N-terminal revealed a high homology with other Asp49 acidic PLA2 s from snake venoms.