Foram desenhados três pares de primers, sendo um deles dirigido ao gene que codifica uma proteína periplasmática da Brucella (BP26) e dois outros dirigidos para a região interespaçadora entre os gene 16S e 23S do RNA ribossômico (ITS). Com os primers acima, foram padronizadas três PCRs, potencialmente capazes de detectar qualquer espécie de Brucella e denominadas PCR-ITS1, PCR-ITS2 e PCR-BP26. Soluções de DNA de sangue de cão livre de Brucella foram contaminadas com quantidades decrescentes de DNA de B. canis (RM6/66) e, então, submetidas às PCRs descritas anteriormente. Para a avaliação das PCRs quanto à capacidade de detecção de Brucella spp. em sangue de animais naturalmente infectados, foram utilizadas 75 amostras de sangue de cães provenientes de canis comerciais onde foram registrados casos clínicos sugestivos de infecção por Brucella. As 75 amostras de sangue de cães foram colhidas com anti-coagulante (citrato de sódio) por punção da veia jugular. As amostras foram separadas em duas alíquotas, uma das quais (2 ml) foi submetida ao isolamento e identificação bacteriológica e a outra alíquota (1ml), às PCRs. O DNA total das amostras de sangue foi extraído por método baseado em digestão com proteinase K, SDS e CTAB seguido de purificação com fenol e clorofórmio. Considerando os resultados da PCR de melhor desempenho (PCR-ITS1), entre as 35 amostras positivas pelo isolamento bacteriano, 30 (85,71%) foram positivas pela técnica de PCR, enquanto entre as 40 amostras negativas pelo cultivo bacteriológico, 11 (27,5%) foram positivas pela PCR. A PCR-ITS1 foi capaz de detectar um mínimo de 3,78fg de DNA bacteriano misturado a 450ng de DNA de cão, o que representa, teoricamente, a massa genômica de 1,26 bactérias. Pela aparente superior capacidade de classificar animais positivos que o método de cultura bacteriológica, a PCR-ITS1 parece ser uma técnica promissora para o diagnóstico direto da brucelose em cães. / Three pair of primers were designed against Brucella genetic sequences. Two of them were directed to 16S-23S rRNA interspacer and the other was directed to a periplasmatic protein coding gene (BP26). Three PCRs assays named PCR-ITS1, PCR-ITS2 and PCR-BP26, each one putatively capable of amplifying DNA from any Brucella species were tested using the aforementioned primers. Nucleic acid extracts from whole-blood from naïve dogs were spiked with decreasing amounts of B. canis (RM6/66) DNA and the resulting solutions were tested by PCR. The capability of the PCRs to amplify Brucella spp. genetic sequences from naturally infected dogs was evaluated by using 75 whole-blood samples from dogs raised in commercial kennels were clinically affected animals have already been detected with signs suggestive of Brucella infection. The whole-blood samples were collected with sodium citrate as anti-coagulant by venal puncturing the jugular vein. The samples were split into two aliquots, one of them (2mL) being submitted to bacterial isolation and identification and the remaining sample (1mL) to PCR. The DNA from whole-blood was extracted by using proteinaseK, SDS and CTAB following phenol-chloroform purification. Considering the results from the PCR with the best performance (PCR-ITS1), within 35 isolation positive samples, 30 were positive by PCR. Within 40 isolation negative samples, 11 were positive by PCR. PCR-ITS1 was capable of detecting as few as 3.78fg of bacterial DNA mixed to 450ng of host DNA. Theoretically, 3.78fg of Brucella DNA represents the total genomic mass of 1.26 bacterial cells. The superior ability of PCR-ITS1 on classifying positive animals suggest that PCR-ITS1 is a promising tool for the direct detection of canine brucellosis.

Strongyloides venezuelensis é um parasita intestinal de ratos frequentemente utilizado como modelo para o estudo da estrongiloidíase humana e animal. O objetivo deste estudo foi comparar os métodos parasitológicos, sorológico e molecular no diagnóstico da infecção experimental por S. venezuelensis em ratos (Rattus norvegicus). Amostras de fezes e soro foram colhidas e analisadas até o 60º dia pós-infecção (d.p.i.). Os métodos parasitológicos (contagem de ovos por gramas de fezes e cultura em carvão) foram positivos do 5º ao 45º d.p.i. Utilizando o teste sorológico (imunoenzimático, ELISA), os níveis séricos de anticorpos IgG aumentaram até o 28º d.p.i., e posteriormente reduziram até o 60º d.p.i. A reação em cadeia da polimerase (PCR) detectou DNA específico de S. venezuelensis nas amostras de fezes do 5º até 21º d.p.i. e do 2º até o 8º d.p.i. nas amostras de soro. Conclui-se que a detecção de DNA de S. venezuelensis, a partir de amostras de soro, é uma ferramenta diagnóstica promissora. Portanto, o presente estudo apresenta uma importante contribuição na melhoria do diagnóstico da estrongiloidíase experimental. / Strongyloides venezuelensis is an intestinal parasite of rats frequently used as a model for studying animal and human strongyloidiasis. The aim of this study was to evaluate the parasitological, serological and molecular methods for the diagnosis of experimental S. venezuelensis in rats (Rattus norvegicus). Stool and serum samples were collected and analyzed up to 60 days post-infection (d.p.i.). The parasitological methods (eggs per gram of feces and charcoal culture) were positive from 5 to 45 d.p.i. Using an enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) serum levels of IgG antibodies increased up to 28 d.p.i. and thereafter decreasing by 60 d.p.i. Polymerase chain reaction (PCR) assays detected S. venezuelensis DNA in stool samples of rats from 5 to 21 d.p.i. and in serum samples from 2 to 8 d.p.i. In conclusion, detection of S. venezuelensis DNA from serum samples is a promising diagnostic tool. The present study presents an important contribution to improve the diagnosis of experimental strongyloidiasis.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A leishmaniose visceral representa atualmente um grande problema de saúde pública. O cão é o principal reservatório doméstico da Leishmania (Leishmania) infantum, agente etiológico da doença. O diagnóstico correto e seguro da leishmaniose visceral canina (LVC) é muito importante para evitar a ocorrência da doença humana e canina, em destaque também o sacrifício desnecessário de cães. Uma alternativa promissora para o diagnóstico tem sido o uso da PCR (do inglês Polimerase Chain Reaction). No entanto, um dos maiores obstáculos para a implementação desta técnica é a falta de padronização e a determinação da amostra mais adequada. Poucos trabalhos foram realizados com a finalidade de comparar a sensibilidade dos diversos protocolos e amostras. O objetivo deste trabalho foi comparar a sensibilidade de cinco métodos de PCR frente a 4 tipos de amostras clínicas no diagnóstico da Leishmania infantum em cães com sinais clínicos. Os diferentes métodos de PCR foram direcionados para alvos distintos do DNA. O kDNA PCR hibridização, kDNA snPCR e a PCR em tempo real utilizaram iniciadores endereçados aos minicírculos do DNA do cinetoplasto (kDNA) e os outros dois métodos apresentam como alvo a região codificante (LnPCR) e intergênica não codificante (ITS1 nPCR) dos genes do RNA ribossomal (RNAr). As amostras clínicas de sangue periférico, pele, medula óssea e swab conjuntival foram avaliadas neste estudo. As amostras de swab conjuntival apresentaram baixo teor de contaminantes que favoreceu as amplificações, confirmando a importância deste protocolo de extração, previamente desenvolvido por nosso grupo de pesquisa. No ITS1 nPCR foi observado 97% de positividade nas amostras de medula óssea (29/30), seguido pelo swab conjuntival e pele com 83% (25/30) e o sangue periférico com 70% (21/30). Na comparação dos resultados caninos do LnPCR a medula óssea apresentou maior positividade (90%) 27/30 animais, seguida da pele com 83,3% (25/30), swab conjuntival 73,3% (22/30) e do sangue periférico com 70% (21/30). O desempenho do kDNA snPCR para as amostras de sangue foi de 50% de positividade (15/30), seguida da pele com 67% (20/30), 80% (24/30) com a utilização do swab conjuntival e 83,3% (25/30) com a medula óssea. Das 30 amostras de sangue periférico, apenas 46,6% foram positivas (14/30) no kDNA PCR hibridização (utilizando sondas marcadas com 32P), enquanto as amostras de pele obtiveram 64% de positividade (19/30), seguida pela medula óssea com 83,3% (25/30) e swab conjuntival 96,6% (29/30). A PCR em tempo real revelou os melhores resultados com 100% de amplificação para as amostras de pele, medula óssea e swab conjuntival, sendo apenas 3/30 animais nas amostras de sangue periférico negativos neste método. A quantificação foi realizada em parasitos por 20 ng/μL de DNA total, quantidade utilizada em todas as reações de PCR em tempo real. No sangue periférico houve uma variação de 0,003 a 0,55 parasitos, nas amostras de pele foram encontrados de 0,004 a 89,74, na medula óssea a variação foi de 0,001 a 118 e no swab conjuntival de 0,0002 a 22,91. Este estudo apontou a PCR em tempo real associada ao swab conjuntival como a melhor opção no diagnóstico molecular da LV em cães apresentando sinais clínicos da infecção. / Visceral leishmaniasis is currently a majorpublic health problem. Dogs are the main domestic reservoir of Leishmania (Leishmania) infantum, the etiological agent of the disease. The correct and safe diagnosis of the canine visceral leishmaniasis (CVL) is very important to prevent the occurrence of the human and canine disease, also highlighted the unnecessary culling of dogs. A promising alternative for diagnosis has been the use of PCR (Polymerase Chain Reaction). However, a major obstacle to the implementation of this technique is the lack of standardization and the selection of the most appropriate sample. Few studies have been performed comparing the sensitivity of different protocols and samples. The objective of this study was to compare the sensitivity of five PCR methods against 4 types of clinical samples for the diagnosis of Leishmania infantum in dogs with clinical signs. The different PCR methods used primers addressed to distinct DNA targets. The kDNA PCR hybridization, kDNA snPCR and real time PCR used primers addressed to minicircle of the DNAs kinetoplast (kDNA) and the other two methods for the coding (LnPCR) and non-coding intergenic spacer regions (ITS1nPCR) from ribosomal RNA genes (rRNA). Clinical samples of peripheral blood, skin, bone marrow and conjunctival swabs were evaluated in this study. Conjunctival swab samples showed low levels of contaminants that allowed high-quality amplifications, confirming the value of the extraction protocol previously developed by our research group. The ITS1 nPCR showed 97% of positivity in bone marrow samples (29/30) followed by conjunctival swab and skin with 83% (25/30) and the peripheral blood with 70% (21/30). In the comparison of the canine results of LnPCR the bone marrow showed 90% (27/30) of positivity, followed by skin with 83.3% (25/30), conjunctival swab 73.3% (22/30) and peripheral blood 70% (21/30). The kDNA snPCR presented 50% (15/30) of positivity for blood samples, 67% (20/30) for skin, 80% (24/30) using the conjunctival swab and 83,3% (25/30) for bone marrow. The kDNA hybridization PCR (using 32P labeled probes) allowed 46.6% (14/30) of positivity for peripheral blood, 64% (19/30) for skin biopsies, 83.3% (25/30) for marrow bone and 96.6% (29/30) by conjunctival swabs. The real time PCR revealed the best results with 100% amplification for skin biopsies, bone marrow and conjunctival swab samples, and only 3/30 animals for peripheral blood samples were negative by this method. Quantitative results were expressed as number of parasites per 20 ng of DNA, amount used in all real time PCR reactions. A range from 0.003 to 0.55 parasites were found in peripheral blood samples, 0.004 to 89.74 in the skin biopsies, 0.001 to 118 in bone marrow and 0.0002 to 22,91 parasites in conjunctival swabs. This study pointed the real time PCR combined with conjunctival swab as the best option in the molecular diagnosis of VL in dogs with clinical signs of infection.

Entre os casos de transmissão de agentes infecciosos por transfusão, a contaminação bacteriana ocupa o primeiro lugar no número de eventos, morbidade e mortalidade. Isto ocorre principalmente em transfusões de concentrados de plaquetas, que são armazenados à temperatura ambiente e sob agitação constante, condições propícias ao crescimento bacteriano. A cultura automatizada é adotada por alguns bancos de sangue para detecção de contaminação bacteriana, mas a um custo elevado, e oferecendo tempo inadequado na realização frente ao curto período de validade dos concentrados de plaquetas, de apenas 5 dias. Recentemente, alguns grupos vem avaliando a utilização de métodos de amplificação molecular, como um ensaio de PCR em tempo real baseado no gene de RNA ribossômico (16S RNAr), um método prático, uma vez que um par de iniciadores/sonda permite a detecção da mais ampla gama de bactérias. O objetivo do nosso trabalho foi estabelecer um método semi-automatizado de amplificação de DNA para a triagem universal de bactérias em concentrados de plaquetas. Concentrados de plaquetas foram contaminados com suspensões de cinco bactérias diferentes, Staphylococcus aureus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus epidermidis, Enterobacter cloacae e Serratia marcescens, em 1 e 10 unidades formadoras de colônia (UFC)/mL, simulando a contaminação que ocorre durante a doação de sangue. Os concentrados de plaquetas foram armazenados à temperatura ambiente sob agitação durante 5 dias e alíquotas de 1 mL foram colhidas a cada 24 horas. A presença de bactérias foi investigada por PCR em tempo real e pelo ensaio eBDS (Enhanced Bacterial Detection System, PALL) como um método de referência. O DNA foi extraído no sistema automatizado MagNA Pure 96 (Roche). A amplificação por PCR em tempo real foi realizada com um conjunto de iniciadores universais e sonda alvo do gene de 16S RNAr em paralelo a um alvo de DNA mitocondrial como controle interno. A mistura de amplificação foi tratada com etídio-monoazida (EMA) seguido por fotoativação, para eliminar a contaminação com DNA bacteriano em reagentes. Com o PCR em tempo real foi possível detectar a presença de todas as espécies bacterianas testadas com uma concentração inicial de 10 UFC/mL 24 horas após a contaminação, com exceção de Staphylococcus hominis. Além disso, detectou-se a presença das bactérias Staphylococcus aureus, Serratia marcescens e Enterobacter cloacae com uma concentração inicial de 1 UFC/mL. Durante o período de estudo foram realizados 26.728 testes eBDS, com 9 resultados positivos. 800 amostras foram testadas simultaneamente pelo eBDS e PCR em tempo real, apenas uma das amostras contaminadas estava entre as testadas por ambos os testes. A incidência da contaminação bacteriana de CPs foi de 1:2.969, semelhante a outros trabalhos. Os resultados do teste molecular podem ser obtidos em 4 horas. O ensaio de PCR em tempo real pode ser uma boa alternativa aos métodos convencionais de cultura na triagem de contaminação bacteriana em concentrados de plaquetas, permitindo a detecção de bactérias, mesmo com uma quantidade inicial baixa de microrganismos, apresentando boa sensibilidade e resultados rápidos. / Among cases of transfusion transmission of infectious agents, bacterial contamination ranks first in the number of events, morbidity and mortality. This occurs mainly by transfused platelets, which are stored at room temperature and under constant agitation what favors bacterial growth. Automated culture is adopted by some blood banks for screening of bacterial contamination, but this is expensive and has a relatively long turnaround time. Recently, some groups have evaluated the use of molecular amplification methods such as real-time PCR based on the highly conserved 16S rRNA gene; this allows a single pair of \'universal\' primers/probe to detect a very broad range of bacteria. The aim of our work was to establish a semi-automated high-throughput DNA amplification method for universal screening of bacteria in platelet concentrates. Platelet concentrates were spiked with suspensions of Staphylococcus aureus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus epidermidis, Enterobacter cloacae and Serratia marcescens to 1 and 10 colony-forming units (CFU)/mL, to simulate contamination occurring during blood donation or processing. The platelet concentrates were stored at room temperature under agitation for 5 days and 1 mL aliquots were drawn every 24 hours. The presence of bacteria was investigated by real-time PCR and by the eBDS assay (Enhanced Bacterial Detection System, PALL) as a reference method. DNA was extracted by using a Large Volume kit in the MagNA Pure 96 (Roche) system. Real-time PCR amplification was performed with a set of universal primers and probe targeting the 16S rRNA gene. Co-amplification of human mitochondrial DNA served as an internal control. The amplification mixture was treated with ethidium monoazide (EMA) followed by photoactivation to eliminate contamination with spurious bacterial DNA in reagents. By the real-time PCR it was possible to detect the presence of all bacterial species tested with an initial concentration of 10 CFU/mL 24 hours after contamination of platelet concentrates, except for Staphylococcus hominis. The PCR assay also detected the presence of bacteria Serratia marcescens and Enterobacter cloacae with an initial concentration of 1 CFU/mL. During the study period, 26.728 eBDS tests were performed, with 9 positive results. Eight hundred samples were tested simultaneously by eBDS and real-time PCR, only one of the contaminated samples was among those evaluated by both methods. The incidence of bacterial contamination on platelets concentrates was 1: 2.969, similar to other reports. The results of the molecular test could be obtained in 4 hours. The real-time PCR assay may be a good alternative to conventional culture methods in the screening of bacterial contamination of platelet concentrates, enabling bacterial detection even with a low initial concentration of microorganisms, whilst offering good sensitivity and a fast turnaround time.

Introdução: Dos arbovírus transmitidos no Brasil, os Flavivirus apresentam destaque por causarem o maior número de infecções e doenças no homem e pela gravidade das doenças que provocam. A cidade de São Paulo possui áreas verdes, representadas por parques municipais em que existem lagos, aves e mamíferos. Esses locais são frequentados pela população e podem servir de refúgio para mosquitos que infestam a área urbana. Alguns trabalhos revelam a ocorrência de espécies de mosquitos conhecidas como vetoras de Flavivirus em tal cidade, o que pode favorecer o aparecimento de casos e transmissão de doenças causadas por este tipo de vírus. No entanto, a presença de Flavivirus infectando tais artrópodes não é conhecida. Objetivo: Identificar presença de Flavivirus em mosquitos (Diptera: Culicidae) provenientes de áreas verdes da cidade de São Paulo. Método: Sete parques municipais localizados em diferentes regiões da cidade foram selecionados para o estudo. Foram realizadas coletas de mosquitos mensais em cada parque no período de março de 2011 e fevereiro de 2012. As armadilhas utilizadas foram: aspirador, Shannon e CDC-CO2. Os mosquitos foram transportados para o laboratório em gelo seco, identificados em mesa fria e agrupados em \"pools\" de até 10 fêmeas não ingurgitadas, segundo espécie, data e local de coleta. Fêmeas ingurgitadas foram armazenadas individualmente. As amostras foram submetidas à extração de ácidos nucleicos, seguida de RT-PCR em tempo real para amplificação de fragmento de aproximadamente 200pb do gene NS5 de Flavivirus. Amostras positivas foram encaminhadas para sequenciamento e análises filogenéticas. Resultados: Dentre as 5.213 fêmeas não ingurgitadas (818 pools) e as 778 fêmeas ingurgitadas coletadas, ocorreu presença de onze gêneros de Culicídeos, sendo mais frequentes Culex e Aedes. Dezenove pools de fêmeas não ingurgitadas obtiveram resultado positivo para Flavivirus. Análises filogenéticas mostraram presença de RNA relacionado à Aedes flavivirus (AEFV) em dois pools de Aedes e à Culex flavivirus (CxFV) nos demais pools, todos de Culex. Conclusões: CxFV e AEFV estão presentes em mosquitos dos gêneros Culex e Aedes, respectivamente, coletados em parques municipais da cidade de São Paulo. Embora flavivírus patogênicos ao homem não tenham sido encontrados no presente trabalho, recomenda-se vigilância de flavivírus nas áreas estudas, visto que elas possuem presença de mosquitos vetores e hospedeiros vertebrados, ou seja, elementos necessários para a transmissão destes vírus. / Introduction: Among the arboviruses transmitted in Brazil, Flavivirus are noteworthy once they cause the largest number of infections and diseases in humans and also because they can cause serious illnesses. In the city of São Paulo there are green spaces, represented by city parks in which lakes, birds and mammals are found. The population visits those places, which can also be a refuge for mosquitoes that infect the urban area. Some studies reveal the occurrence of mosquitoes species known to be vectors of Flavivirus in this city, what can contribute to the emergence of cases and transmission of diseases caused by this kind of virus. However, the presence of Flavivirus infecting those arthropods is not known. Objective: To Identify infection by Flavivirus in mosquitoes (Diptera: Culicidae) collected in São Paulo\'s city parks. Method: Seven city parks located in different places of the city were selected for the study. Monthly mosquito collections were carried out in each park from March 2011 to February 2012. The traps employed were aspirator, Shannon and CDC-CO2. The mosquitoes were transported to the laboratory on dry ice. Identification was performed in a chill table. Up to 10 non-engorged females were pooled according to specie, date and place of collection. Engorged females were stored individually. Nucleic acids were extracted and submitted to real time RT-PCR that amplifies a 200pb fragment of NS5 gene of Flavivirus. Positive samples were sequenced and phylogenetic analyses were performed. Results: Eleven genus of Culicidae were found among the 5,213 non engorged females (818 pools) and the 778 engorged females. Culex and Aedes were the most frequent collected genus. Nineteen non engorged female pools had positive results for the presence of Flavivirus RNA. Phylogenetic analyses showed the RNA found was related to Aedes flavivirus (AEFV) in two pools of Aedes and to Culex flavivirus (CxFV) in the other pools, all of them consisting of Culex. Conclusion: CxFV and AEFV are present in mosquitoes Culex and Aedes, respectively, collected in São Paulo\'s city parks. Flavivirus of medical importance were not detected. Although, once there are species of mosquitoes that can act as vectors of pathogenic Flavivirus and vertebrate hosts, which are required for the transmission cycle of those virus, surveillance is recommended in the studied areas.

O presente estudo tem como principal objetivo o emprego da reação em cadeia da polimerase (PCR) na elucidação da etiologia dos derrames pleurais dos pacientes com suspeita de pleurite tuberculosa, comparando-o com as técnicas diagnósticas disponíveis na atualidade. O diagnóstico da tuberculose pleural costuma ser feito por meio dos dados clínicos e radiológicos, teste tuberculínico, exames bioquímicos, microbiológicos, e citológicos do líquido pleural e da histopatologia de fragmento de pleura obtido por punção-biópsia. Ainda assim estes métodos apresentam muitas limitações, dentre as quais a baixa sensibilidade e o longo período necessário para a confirmação do diagnóstico. Estudamos 58 amostras de 45 pacientes. Destes, 16 pacientes tiveram diagnóstico clínico ou laboratorial confirmado de tuberculose, totalizando 22 amostras. Consideramos como caso de tuberculose todos os pacientes com baciloscopia, cultura ou histopatológico positivos no líquido pleural ou outro material biológico, ou que tenham apresentado melhora clínica após a introdução do tratamento empírico. Das 22 amostras com o diagnóstico de tuberculose, a PCR foi positiva em 6 amostras de 6 pacientes. A reação foi positiva em 1 amostra de um paciente em que o diagnóstico de tuberculose foi descartado. A sensibilidade, especificidade e os valores preditivo positivo e negativo nos 16 pacientes com diagnóstico de tuberculose foram 31,3%, 96,6%, 83% e 71% respectivamente. A PCR, apesar de ter apresentado uma baixa sensibilidade, demonstrou uma especificidade ótima em relação aos métodos convencionais. Está técnica pode ter utilidade como método complementar às técnicas disponíveis, na tentativa de obter um diagnóstico mais precoce e preciso nos casos de tuberculose pleural. / The present study evaluates the use of the polimerase chain reaction (PCR) to confirm the etiology of pleural effusions in patients with suspicion of pleural tuberculosis, comparing it to the current available techniques. The diagnosis of pleural tuberculosis is made through the combination of clinical data, radiologic findings, biochemical, microbiological and cytological examination of the pleural fluid and by the pathology of pleural fragment obtained by biopsy. However, these methods present a lot of limitations, including a low sensitivity and a long incubation period to confirm the diagnosis by culture. We studied 58 samples of 45 patients with pleural effusion. Of these, 16 patients had clinical diagnosis or confirmed by laboratory, in a total of 22 samples. We defined as case of tuberculosis all patients with culture or positive pathology in the fluid pleural or other biological material and those with clinical improvement after empirical treatment. Of the 22 samples with the tuberculosis diagnosis PCR was positive in 6 samples of 6 patients. The reaction was positive in a sample of a patient whose diagnosis of tuberculosis was later discarded. The sensitivity, specificity, positive predictive value and negative predictive value in the 16 patients with tuberculosis diagnosis were 31,3%, 96,6%, 83% and 71% respectively. In spite of having presented a low sensitivity, PCR specificity was greater than the conventional methods. This technique can be useful as an additional method to the available techniques, in the attempt of obtaining a more precocious and precise diagnosis in the cases of pleural tuberculosis.

As formas sintomáticas de toxoplasmose são um grave problema de saúde pública e ocorrem em cerca de 10 a 20% das pessoas infectadas. Com o objetivo de melhorar o diagnóstico molecular de toxoplasmose sintomática em pacientes brasileiros, este estudo avaliou o desempenho da PCR em tempo real (qPCR) na detecção do DNA de T. gondii testando dois conjuntos de iniciadores moleculares (B1 e REP-529) para diagnóstico molecular. A metodologia foi testada em 807 amostras clínicas com diagnóstico clínico conhecido, ELISA e PCR convencional (cPCR) em um período de 9 anos. Todas as amostras foram de pacientes com suspeita clínica de diferentes formas da toxoplasmose. De acordo com a curva mínima de limite de detecção (no CT), o REP-529 apresentou maior sensibilidade para detectar DNA de T. gondii do que B1. Ambos os conjuntos de iniciadores moleculares foram avaliados retrospectivamente usando o DNA de 515 amostras clínicas diferentes. Os 122 pacientes com resultado negativo na PCR em tempo real, provavelmente por terem infecção crônica, demonstraram alta especificidade (REP-529, 99,2% e B1, 100%). Das 393 amostras com ELISA positivo (IgG), 146 apresentaram diagnóstico clínico de toxoplasmose e cPCR positivo. As sensibilidades de REP-529 e B1 foram de 95,9% e 83,6%, respectivamente. A comparação dos desempenhos do REP-529 e B1 foi analisada prospectivamente em 292 amostras. Assim, a partir de um total de 807 amostras de DNA analisadas, 217 (26,89%) apresentaram PCR positivo, pelo menos em um conjunto de iniciadores e com toxoplasmose sintomática confirmada pelo diagnóstico clínico. O REP-529 foi positivo em 97,23%, enquanto o B1 amplificou apenas 78,80%. Depois de comparar várias amostras em um laboratório brasileiro de referência, este estudo concluiu que o conjunto de iniciadores REP-529 apresentou melhor desempenho do que B1. Essas observações foram baseadas após o uso de casos com diagnóstico clínico definido, ELISA e cPCR. / Symptomatic forms of toxoplasmosis are a serious public health problem and occur in around 10-20% of the infected people. Aiming to improve the molecular diagnosis of symptomatic toxoplasmosis in Brazilian patients, this study evaluated the performance of real time PCR (qPCR) in detecting T. gondii DNA testing two primer sets (B1 and REP-529) for molecular diagnosis. The methodology was assayed in 807 clinical samples with known clinical diagnosis, ELISA, and conventional PCR (cPCR) results in a 9-year period. All samples were from patients with clinical suspicion of several features of toxoplasmosis. According to the minimum detection limit curve (in CT), REP-529 had greater sensitivity to detect T. gondii DNA than B1. Both primer sets were retrospectively evaluated using 515 DNA from different clinical samples. The 122 patients without toxoplasmosis (with negative real-time PCR) provided high specificity (REP-529, 99.2% and B1, 100%). From the 393 samples with positive ELISA (IgG), 146 had clinical diagnosis for toxoplasmosis and positive cPCR. REP-529 and B1 sensitivities were 95.9% and 83.6%, respectively. Comparison of REP-529 and B1 performances was further analyzed prospectively in 292 samples. Thus, from a total of 807 DNA analyzed, 217 (26.89%) had positive PCR with, at least one primer set and with symptomatic toxoplasmosis confirmed by clinical diagnosis. REP-529 was positive in 97.23%, whereas B1 amplified only 78.80%. After comparing several samples in a Brazilian referral laboratory, this study concluded that REP-529 primer set had better perform than B1 one. These observations were based after using cases with defined clinical diagnosis, ELISA, and cPCR.

Os papilomavírus humanos (HPVs) oncogênicos são importantes agentes na etiologia do câncer ginecológico e atualmente tem sido relacionados também a algumas lesões cancerizáveis e a alguns tipos de cânceres de boca. Com o objetivo de avaliar a relação entre os HPVs e um tipo de lesão cancerizável de boca que acomete os lábios chamada queilite actínica crônica (QAC), foram avaliados e considerados aptos para a pesquisa 29 pacientes portadores de QAC. A reação em cadeia pela polimerase (PCR) foi utilizada para detectar a presença do HPV em amostras de tecido fresco, provenientes de lábios doentes onde todos os casos apresentaram resultados negativos. A QAC ocorreu em 100% nos indivíduos da raça branca, em 19 homens e 10 mulheres e na idade média de 56,14 anos. Foram avaliados também os aspectos clínicos e histológicos da QAC sendo encontrados 14 casos de atipia epitelial discreta (48,27%), 10 casos de atipia epitelial moderada (34,49%) e 5 casos de atipia epitelial severa (17,24%). Através de análise estatística concluímos que clinicamente a presença de áreas leucoplásicas e o tempo de evolução da lesão superior a 5 anos estão diretamente relacionados aos casos de atipias epiteliais mais graves. O hábito de fumar e de beber parecem contribuir, mas não obtiveram resultados estatisticamente significativos ao aparecimento da QAC. / The oncogenic human papillomaviruses (HPVs) are important agents in the etiology of gynecological cancer and have been recently related to some premalignant lesions and to some types of mouth cancer. In order to evaluate the relation between HPVs and one type of precancerous lesion that affects the lips called chronic actinic cheilitis (CAC), 29 CAC patients were assessed and considered eligible for the study. The polymerase chain reaction (PCR) was used to detect the presence of HPV in fresh tissue samples of affected lips. All results were negative. All CAC patients were Caucasian, 19 males and 10 women, mean age of 56.14 years. The clinical and histological aspects of CAC were also assessed - there were 14 cases of discreet (48.27%), 10 cases of moderate (34.49%) and 5 cases of severe epithelial atypia (17.24%). By statistical analysis we concluded that, clinically, the presence of leukoplastic areas and progression of the lesion for over five years are directly related to more severe epithelial atypia. Smoking and drinking habits seem to contribute to the condition but achieved no statistical significance regarding onset of CAC.

As infecções sistêmicas causadas por Candida spp. representam importante causa de morbidade e mortalidade em pacientes pediátricos internados em unidades de cuidados intensivos. A utilização de fármacos imunodepressores em pacientes submetidos a transplantes, antibioticoterapia prolongada, nutrição parenteral, presença de cateter venoso central, entre outros fatores, contribuem para o aumento na freqüência destas infecções oportunísticas. Embora Candida albicans permaneça como a espécie mais freqüentemente isolada de episódios de candidemia, tem ocorrido aumento do número de infecções causadas por espécies não albicans. Os métodos convencionais de cultivo apresentam sensibilidade limitada, além de demandar tempo prolongado para a identificação das espécies infectantes. A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) requer pequenos volumes de sangue para análise, situação ideal para crianças gravemente enfermas, propiciando diagnóstico rápido e identificação precisa das espécies de Candida. Este estudo teve como objetivos padronizar técnicas de PCR de dupla amplificação, para identificar cinco espécies de Candida em amostras de sangue de pacientes pediátricos com risco de desenvolver candidemias, e comparar os resultados com as hemoculturas. Foram analisadas amostras de sangue de 80 pacientes pediátricos internados na Unidade de Terapia Intensiva do Instituto da Criança do Hospital das Clínicas da FMUSP, alocados em dois grupos: 58 pacientes que apresentavam duas ou mais condições predisponentes que elevam o risco de infecção fúngica (Grupo 1); e 22 pacientes em condições clínicas de menor gravidade e risco mais baixo, que foram estudados para avaliação da freqüência de resultados falso-positivos por PCR (Grupo 2). A primeira amplificação identificou fragmento da região ITS do DNA ribossômico, e a segunda etapa amplificou fragmentos espécie-específicos para C.albicans, C.glabrata, C.parapsilosis, C.tropicalis e C.krusei. Para as amostras com detecção de Candida spp. somente por PCR, foram realizadas restrições enzimáticas e seqüenciamentos, para a confirmação da especificidade dos amplificados. A concordância entre os resultados das hemoculturas e das PCR foi avaliada pelo teste de McNemar, com nível de significância de 5%. As hemoculturas foram positivas em 15,5% dos pacientes do grupo 1, enquanto as amplificações por PCR detectaram DNA de Candida spp. em 25,9% dos casos, incluindo todos os pacientes com culturas positivas. Houve concordância na identificação das espécies em 88,9% dos casos. Em dois pacientes, a PCR identificou mais de uma espécie infectante, o que não ocorreu pelas hemoculturas. Nos seis casos em que somente a PCR detectou Candida spp. nas amostras de sangue, as restrições enzimáticas e os seqüenciamentos confirmaram a especificidade das amplificações. No grupo 2, as hemoculturas foram negativas em todos os 22 casos, e a PCR detectou C.glabrata em um paciente, cujos amplificados, após seqüenciamento, apresentaram 98% de homologia com o protótipo. O teste de McNemar mostrou que a discordância encontrada entre os métodos é estatisticamente significante e favorece a PCR (p = 0,031). Os resultados do presente estudo demonstraram que a técnica de PCR apresentou maior poder de detecção de Candida spp. em amostras de pacientes com risco de desenvolver candidemia, quando comparada às hemoculturas. A PCR foi ainda capaz de detectar mais de uma espécie infectante na mesma amostra de sangue / Disseminated candidiasis is an important cause of morbidity and mortality in immunocompromised and critically ill pediatric patients. Increased use of immunosupressive drugs, indwelling catheters, broad-spectrum antibiotics, parenteral nutrition and other predisposing conditions have contributed to the increment of Candida bloodstream infections. Although Candida albicans remains the leading species, a growing number of nonalbicans isolates has been reported. Laboratory diagnosis of candidemia is troublesome due to the lack of blood cultures sensitivity. Detection of Candida DNA by polymerase chain reaction (PCR) in tiny blood volumes may provide a more rapid and reliable candidemia detection in critically ill children. The present study aimed at standardizing nested-PCR amplifications for identification of five Candida species, comparing results with those obtained by blood cultures. Eighty patients admitted to the pediatric intensive care unit of the Instituto da Criança do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo were divided into two groups: 58 patients presenting with two or more predisposing conditions to develop candidemia (Group 1), and 22 patients with lower risk, enrolled to establish the frequency of PCR false-positive results (Group 2). Nested amplifications were targeted to Candida ITS sequence, the first round yielding a gender specific fragment, and the second round identified five Candida species corresponding to C. albicans, C. tropicalis, C. glabrata, C. parapsilosis and C. krusei. When PCR positive results were not confirmed by blood cultures, enzymatic restriction and DNA sequencing were performed. Agreement between both methods was assessed by the McNemar test, adopting a level of significance of 5%. Blood cultures were positive in 15.5% of group 1 patients, whereas nested-PCR identified Candida species in 25.9%, including all culture positive patients. PCR was 88.9% concordant with blood cultures species identification, but only the molecular technique identified dual candidemia in two patients. Amplification products of six patients with negative blood cultures submitted to enzymatic restriction and sequencing analysis showed high degree of homology with Candida reference strains, confirming the specificity of PCR. Blood cultures were negative in all patients of group 2, but PCR detected C.glabrata in one case whose amplification products resulted in 98% of homology with the reference strain. The McNemar test showed disagreement between both methods, favoring PCR (p=0.031). In the present study, PCR was more sensitive to detect Candida species in comparison to blood cultures, being also able to identify dual candidemia

Louis, Tong Kwok-leung. / Thesis (M.Phil.)--Chinese University of Hong Kong, 2000. / Includes bibliographical references (leaves 121-130). / Abstracts in English and Chinese. / ABSTRACT --- p.I / ACKNOWLEDGEMENTS --- p.III / LIST OF CONTENTS --- p.IV / LIST OF TABLES --- p.VIII / LIST OF FIGURES --- p.X / ABBREVIATIONS --- p.XII / GENERAL ABBREVIATIONS --- p.XII / VARIOUS NOMENCLATURES OR ABBREVIATIONS FOR SRSVS --- p.XIII / OBJECTIVES OF THE STUDY --- p.XIV / Chapter CHAPTER 1 --- INTRODUCTION --- p.1 / Chapter 1.1 --- HISTORICAL PERSPECTIVE --- p.2 / Chapter 1.2 --- CLINICAL FEATURES OF HUMAN SRSV INFECTION --- p.10 / Chapter 1.3 --- EPIDEMIOLOGY --- p.12 / Chapter 1.4 --- PHYSICAL CHARACTERISTICS OF SRSV --- p.14 / Chapter 1.5 --- STABILITY OF NORWALK VIRUS --- p.15 / Chapter 1.6 --- DIAGNOSTIC TOOLS FOR SRSVS --- p.15 / Chapter 1.7 --- GENOMIC ORGANIZATION OF SRSVS --- p.16 / Chapter 1.8 --- MOLECULAR TECHNOLOGIES --- p.19 / Chapter CHAPTER 2 --- MATERIALS --- p.20 / Chapter 2.1 --- FAECAL SAMPLES FROM 1986 TO 1992 --- p.21 / Chapter 2.2 --- OTHER FAECAL SAMPLES FROM 1995 TO 1998 --- p.21 / Chapter 2.3 --- AGE GROUPS OF ALL THE SAMPLES --- p.21 / Chapter CHAPTER 3 --- METHODS --- p.23 / Chapter 3.1 --- EXTRACTION OF RNA FROM PATIENT STOOL OR VOMIT SAMPLES --- p.24 / Chapter 3.2 --- REVERSE TRANSCRIPTION - POLYMERASE CHAIN REACTION (RT-PCR) FOR SRSVS --- p.25 / Chapter 3.2.1 --- Principle of RT-PCR assay for SRSV --- p.25 / Chapter 3.2.2 --- Reverse transcription (cDNA Synthesis) --- p.26 / Chapter 3.2.3 --- Polymerase chain reaction --- p.26 / Chapter 3.2.4 --- Electrophoresis (in the PCR product room) --- p.31 / Chapter 3.2.5 --- Controls for PCR assay --- p.32 / Chapter 3.2.6 --- Interpretation of SRSV polymerase gene PCR --- p.32 / Chapter 3.3 --- RT-PCR USING INOSINE CONTAINING PRIMERS FOR THE CAPSID REGIONS --- p.34 / Chapter 3.3.1 --- RT-PCR for the capsid region of SRSV genome --- p.34 / Chapter 3.3.2 --- Interpretation of SRSV capsid gene PCR --- p.36 / Chapter 3.4 --- SOLID PHASE IMMUNE ELECTRON MICROSCOPY FOR THE DETECTION OF SRSV --- p.37 / Chapter 3.5 --- OPTIMIZATION OF CONDITIONS FOR SRSV RT-PCR --- p.37 / Chapter 3.5.1 --- Titration of primers --- p.37 / Chapter 3.5.2 --- Titration of MgCl2 --- p.38 / Chapter 3.5.3 --- "Titration ofdNTPs, MgCl2 and Taq polymerase (pH 9.0)" --- p.38 / Chapter 3.6 --- SPECIFICITY OF SRSV RT-PCR --- p.38 / Chapter 3.7 --- PURIFICATION OF PCR PRODUCTS PRIOR TO CLONING …… --- p.38 / Chapter 3.8 --- CLONING OF THE PURIFIED DNA INTO pGEM-T EASY VECTOR --- p.39 / Chapter 3.8.1 --- Introduction --- p.39 / Chapter 3.8.2 --- Sequence of the pGEM-T Easy Vector --- p.42 / Chapter 3.8.3 --- Ligation --- p.44 / Chapter 3.8.4 --- Transformation of competent bacterial cells --- p.44 / Chapter 3.8.5 --- Small-scale preparations of plasmid DNA --- p.45 / Chapter 3.8.6 --- Purification of miniprep using QIAprep Miniprep --- p.45 / Chapter 3.8.7 --- Restriction analysis of small-scale preparations of plasmid DNA --- p.45 / Chapter 3.9 --- CYCLE SEQUENCING OF CLONED SRSV AMPLICONS --- p.46 / Chapter 3.9.1 --- Targets for Sequencing --- p.46 / Chapter 3.9.2 --- Procedures of cycle sequencing --- p.46 / Chapter 3.9.3 --- Gel electrophoresis --- p.48 / Chapter 3.9.4 --- Sequencing conditions --- p.49 / Chapter 3.10 --- SEQUENCE ANALYSIS --- p.49 / Chapter CHAPTER 4 --- REAGENTS AND BUFFERS --- p.51 / Chapter 4.1 --- REAGENTS AND BUFFERS FOR RNA EXTRACTION --- p.52 / Chapter 4.2 --- REAGENTS AND BUFFERS FOR REVERSE TRANSCRIPTION (cDNA SYNTHESIS) --- p.52 / Chapter 4.3 --- REAGENTS AND BUFFERS FOR PCR --- p.53 / Chapter 4.4 --- GEL ELECTROPHORESIS OF PCR PRODUCTS --- p.53 / Chapter 4.5 --- PURIFICATION OF PCR PRODUCTS --- p.54 / Chapter 4.6 --- REAGENTS FOR CLONING THE DNA INSERT INTO pGEM-T EASY VECTOR --- p.54 / Chapter 4.6.1 --- "pGEM-T Easy Vector System (Promega Corporation, USA)" --- p.54 / Chapter 4.6.2 --- Isopropylthio-β-D-galactoside (IPTG) stock solution --- p.54 / Chapter 4.6.3 --- X-Gal --- p.54 / Chapter 4.6.4 --- Luria-Bertani (LB) medium --- p.55 / Chapter 4.6.5 --- LB plates with ampicillin --- p.55 / Chapter 4.6.6 --- LB plates with ampicillin/IPTG/X-Gal --- p.55 / Chapter 4.6.7 --- SOC medium --- p.55 / Chapter 4.6.8 --- Mini-prep purification --- p.56 / Chapter 4.6.9 --- Mini-prep analysis --- p.56 / Chapter 4.6.9.1 --- Lambda DNA-Hind IIIφX-174 DNA-Hae III Digest --- p.56 / Chapter 4.6.9.2 --- Not I --- p.58 / Chapter 4.7 --- REAGENTS AND BUFFERS FOR CYCLE SEQUENCING --- p.58 / Chapter 4.7.1 --- SequiTherm EXCEĹёØ II Long-Rea´dёØ DNA Sequencing Kit-AL´FёØ --- p.58 / Chapter 4.7.2 --- Sequencing primers --- p.59 / Chapter 4.8 --- REAGENTS FOR SEQUENCING GEL CASTING --- p.59 / Chapter CHAPTER 5 --- RESULTS --- p.61 / Chapter 5.1 --- RESULTS OF RT-PCR OPTIMIZATION --- p.62 / Chapter 5.1.1 --- Magnesium chloride and pH of PCR reaction buffer --- p.62 / Chapter 5.1.2 --- Concentration of primers --- p.64 / Chapter 5.1.3 --- "Titration of dNTPs, MgCl2 and Taq polymerase (pH 9.0)" --- p.65 / Chapter 5.2 --- RESULT OF SENSITIVITY TEST --- p.66 / Chapter 5.3 --- RESULTS OF SPECIFICITY TEST --- p.67 / Chapter 5.4 --- RESULTS OF THE PCR USING INOSINE CONTAINING POL PRIMERS --- p.70 / Chapter 5.5 --- RESULTS OF PCR USING INOSINE CONTAINING CAPSID PRIMERS --- p.73 / Chapter 5.6 --- RESULTS OF SOME SAMPLES RETESTED BY SPIEM --- p.75 / Chapter 5.7 --- RESULTS OF SPORADIC OUTBREAKS --- p.77 / Chapter 5.7.1 --- A sporadic outbreak in 1996 --- p.77 / Chapter 5.7.2 --- Sporadic outbreak in a kindergarten in 1997 --- p.79 / Chapter 5.7.3 --- Sporadic outbreak at a hotel in 1998 --- p.79 / Chapter 5.7.4 --- Application of the RT-PCR to contaminated shellfish --- p.80 / Chapter 5.8 --- RESULTS OF MINI PREP ANALYSIS WITH NOT I DIGESTION --- p.85 / Chapter 5.9 --- RESULT OF ELECTROPHEROGRAM OF A SELECTED SPECIMEN FROM THE AUTOMATIC SEQUENCING --- p.86 / Chapter 5.9 --- RESULT OF ELECTROPHEROGRAM OF A SELECTED SPECIMEN FROM THE AUTOMATIC SEQUENCING --- p.86 / Chapter 5.10 --- RESULTS OF ALL TRIMMED DNA SEQUENCES --- p.87 / Chapter CHAPTER 6 --- DISCUSSION --- p.112 / REFERENCES --- p.122 / APPENDIX --- p.131 / APPENDIX I: Electron micrograph of SRSV particles --- p.132 / APPENDIX II: Confirmation for specificity test --- p.133 / APPENDIX III: Sequencing amplicons using capsid primers --- p.135 / APPENDIX IV: Sequencing amplicons (outbreak) using pol primers --- p.136 / APPENDIX V: Electropherogram (direct sequencing) --- p.138 / APPENDIX VI: Other RT-PCR results using pol primers --- p.139 / APPENDIX VII: Results of RT-PCR using capsid primers --- p.149 / APPENDIX VIII: Mini prep analysis --- p.158