Thesis advisor: Gregory R. Chiklis / Thesis advisor: Kathleen Dunn / In molecular diagnostics, the polymerase chain reaction (PCR) is used to amplify small amounts of nucleic acids found in patient samples, allowing for detection of diseases within hours of infection. This early detection allows medical professionals to diagnose and treat patients with greater success. It is crucial that internal controls, such as NATtrol™-treated microorganisms, are used in these PCR assays to avoid false-negative results and ensure accurate diagnosis of patients. NATtrol™ treatment renders microorganisms non-infectious while leaving them fully intact with their complete RNA or DNA genomes. Therefore, NATtrol™-treated microorganisms can be used in PCR as full-process internal controls that are spiked into patient samples and co-extracted and co-amplified within the sample. If the spiked NATtrol™ control returns expected results on the test, then the patient sample result can also be trusted. Here, we performed studies to validate the use of NATtrol™-treated MS2 virus as a universal full-process internal molecular control. In these studies, a quantitative, real-time, reverse-transcription PCR (qRT-PCR) assay was performed on the Roche LightCycler 480 instrument. Studies included working range validation, limit of detection, within-run precision, between-run precision, real-time stability, freeze-thaw (transport) stability, and open-vial (use-life) stability. All studies demonstrated the precision and stability of the MS2 NATtrol™ molecular control. / Thesis (BS) — Boston College, 2014. / Submitted to: Boston College. College of Arts and Sciences. / Discipline: College Honors Program. / Discipline: Biology Honors Program. / Discipline: Biology.

Orientador: Carlos Ducatti / Coorientador: Juliana Célia Denadai / Banca: Antonio Celso Pezzato / Banca: Dirlei Antonio Berto / Banca: Maria Márcia Pereira Sartori / Banca: Luiz Carlos Demattê Filho / Resumo: Objetivou-se rastrear a presença de subprodutos de origem animal na alimentação de frangos de corte de granjas comerciais por meio da metodologia dos isótopos estáveis de carbono e nitrogênio (δ13C e δ15N), no músculo peitoral e mucosa intestinal, assim como iniciar um banco de dados de valores bromatológicos e isotópicos dos ingredientes da ração de maior interesse na avicultura de corte. Foram amostradas aleatoriamente oito aves (machos) semanalmente de sete granjas de diferentes empresas avícolas dentro do Estado de São Paulo para obtenção das amostras de músculo peitoral e mucosa intestinal. Nos mesmos dias de coletas foram retiradas três amostras aleatórias de ração, adquiridas dos comedouros de cada granja. Para o banco de dados foram amostrados os ingredientes milho, soja, farelo de soja e farinhas de origem animal dos departamentos de recepção e controle de qualidade dos ingredientes das fabricas de ração visitadas. Todas as amostras foram submetidas à análise de espectrometria de massa de razão isotópica, sendo que a ração também foi avaliada quanto à presença de DNA de origem animal por PCR. Os dados isotópicos das amostras foram submetidos à análise de variância em cada idade de coleta, sendo complementados pelo teste de Tukey, e o conjunto de todos os dados foram avaliados pelas análises multivariadas de componentes principais e discriminante linear. Foi possível verificar pela análise de PCR na ração que somente as empresas D e F utilizaram ração estritamente vegetal ao longo do período de criação das aves. Houve diferença entre os valores isotópicos da ração, músculo peitoral e mucosa intestinal das aves das empresas D e F em relação às demais, sendo esta mais definida para o δ15N dos sete aos 42 dias de idade. Esse mesmo resultado foi obtido pelas análises multivariadas. Portanto, foi possível diferenciar as empresas que ... / Abstract: The aim of this study was to trace the presence of animal by-products in commercial broiler farms feed using the methodology of stable isotope ratios of carbon and nitrogen (δ13C and δ15N) in the pectoral muscle and intestinal mucosa, and start a database of bromatological and isotopic values of feed ingredients with greatest interest in poultry production. Eight male birds were sampled randomly week-by-week in seven broiler farms of different poultry companies in the São Paulo State to obtain samples of pectoral muscle and intestinal mucosa. Were taken on the same day of sampling three random samples of feed, acquired from feeders of each commercial broiler unit. For the database were sampled corn, soybean, soybean meal and animal by-products obtained from reception and quality control departments of visited feed factories. All samples were analyzed using isotope ratio mass spectrometry, and feed was also evaluated for the presence of animal DNA by PCR analysis. The isotopic data of the samples were submitted to analysis of variance in each age collection, complemented by Tukey test, and the set of all data were analyzed by multivariate analysis of major and linear discriminant components. It was verified by PCR analysis in feed that only D and F companies used strictly vegetable diet throughout the period of raising birds. There was difference between isotopic values of feed, pectoral muscle, and intestinal mucosa of birds from D and F companies compared with others, which is most definitely for the δ15N from seven to 42 days old. The same result was obtained by multivariate analysis. Therefore, it was possible to differentiate the companies that used strictly vegetable diet from the others, demonstrating the ability to trace the presence of animal by-products in commercial broiler farms feed using the methodology of stable isotopes / Doutor

O neuroblastoma é o tumor sólido extra-cranial mais comum e mortal da infância, sendo o tempo de sobrevida nos casos mais agressivos ainda muito curto. Uma das esperanças nesses casos é que os estudos moleculares possam fornecer informações sobre os genes ou as vias moleculares que governam a patogênese dos neuroblastomas. Pois, há poucos genes como o MYCN, que foi descrito por estar diretamente ligado ao neuroblastoma. A amplificação deste oncogene ocorre em pouco mais de 25% dos neuroblastomas e é considerada como o mais importante marcador de prognóstico nestes tumores, sendo fortemente relacionada aos estádios avançados da doença e falha no tratamento. Outros genes do amplicon do MYCN, incluindo o DDX1 \"DEAD box polypeptide 1 gene\" e o NAG \"neuroblastoma-amplified gene\", estão sendo observados por se apresentarem co-amplificados com o MYCN. Entretanto, a importância deste fenômeno no prognóstico ainda é desconhecida. Os objetivos deste trabalho foram determinar qual o melhor método para estudar a amplificação dos genes MYCN, DDX1 e NAG, além de esclarecer a importância da coamplificação dos genes DDX1 e NAG no prognóstico. Procedimento: O número de cópias dos genes MYCN, DDX1 e NAG foi determinado por PCR em Tempo Real e PCR convencional em 100 neuroblastomas primários. Os dados da PCR em Tempo Real foram analisados por quantificação absoluta e relativa. Os resultados da PCR convencional foram analisados por eletroforese em gel de agarose, medindo a intensidade das bandas formadas no gel no sistema Kodak. A relevância da amplificação gênica como marcador de prognóstico foi avaliada em 74 pacientes, dos quais nós obtivemos o acompanhamento clínico. Resultados: Nos 74 casos estudados, ambos os métodos demonstraram que a amplificação do MYCN estava associada com os estádios mais avançados da doença. A análise das curvas de sobrevida livre de progressão confirmou que pacientes com ausência de amplificação do MYCN apresentavam maior tempo de sobrevida. Nós também analisamos a amplificação do DDX1 nas mesmas amostras incluindo aquelas com ausência de amplificação de MYCN. Não foi encontrada nenhuma relação entre a co-amplificação com idade ao diagnóstico ou tempo de sobrevida. Conclusões: Os métodos aplicados para calcular o número de cópias dos genes na PCR em Tempo Real mostraram-se equivalentes. A PCR em Tempo Real apresentou maior acurácia nos resultados quando comparada à PCR convencional. A análise da sobrevida não demonstrou relação entre a amplificação dos genes DDX1 e/ou NAG com piora no prognóstico. / Neuroblastoma is the most common and deadly extra-cranial solid childhood tumor. Survival rates for aggressive neuroblastomas are still disappointingly low. One of the hopes is that molecular studies will provide insights into the genes and molecular pathways that govern neuroblastoma pathogenesis. However, at present only a few genes as MYCN have been directly linked to neuroblastoma. MYCN oncogene amplification, occurring in up to 25% of neuroblastomas, has been considered the most important prognostic factor, strongly correlating to advanced stage disease and treatment failure. Another genes in the MYCN amplicon, including the DEAD box polypeptide 1 (DDX1) gene, and neuroblastoma-amplified gene (NAG gene), have been found to be frequently co-amplified with MYCN in NB. But the prognostic significance of the coamplification remains unclear. The aims of this study were to evaluate which is the best method to study the gene amplification of those three genes MYCN, DDX1 and NAG, as well as clarify the prognostic significance of the co-amplification or DDX1 and NAG with MYCN. Procedure: The gene copy numbers of MYCN, DDX1, and NAG were determined by the real-time quantitative polymerase chain reaction and conventional polymerase chain reaction in 100 primary NBs. Real-Time data were analyzed by absolute and relative quantification. For conventional PCR, samples were electrophoresed on a 2% agarose gel and the intensity of each band evaluated by Kodak image software. To evaluate of the prognostic significance of the gene amplification we had only 74 cases in witch we could analyze the follow-up. Results: In all 74 cases, both methods demonstrated that MYCN amplification was associated mainly with advanced cancer stages, and the analysis of overall survival confirmed that patients without MYCN amplification had a cumulative survival significantly higher than patients with oncogene amplification. We also studied DDX1 and NAG amplification for all NB samples even that without MYCN amplification. No relationship between any gene co-amplification status and disease stage, age at diagnosis, or overall survival was found. Conclusions: The two methods used to calculate gene copy number for Real Time PCR assay shown to be equivalent. Real Time PCR assay shown to be more accurate to study gene amplification than conventional PCR assay. Survival analysis pointed out that DDX1 and/or NAG amplification has no additional adverse effect on prognosis.

O vírus respiratório sincicial humano (HRSV) é principal agente causador de infecções do trato respiratório inferior em crianças e lactentes. Um diagnóstico rápido e preciso evitaria o uso desnecessário de antibióticos, nos casos em que a infecção é viral. A reação em cadeia da polimerase após transcrição reversa (RT-PCR) e o ensaio de imunofluorescência indireta (IFI) são considerados ferramentas importantes na detecção do HRSV, pela alta sensibilidade e especificidade. Visando simplificar e minimizar os riscos de contaminação freqüentes, em duas etapas, foi padronizada uma reação em tubo único para detecção do HRSV em amostras clínicas. Aspirados de nasofaringe de 226 crianças de 0-5 anos de idade, com doença respiratória, atendidas no Hospital Universitário da Universidade de São Paulo (HU-USP), foram testados por imunofluorescência indireta, RT semi Nested PCR e RT-PCR em tubo único. Cento e duas amostras (45,1%) foram positivas em pelo menos uma das técnicas e 75 (33,2%) em todas. Três (1,3%) amostras foram positivas por IFI e RT semi Nested PCR, 1 (0,4%) foi positiva por IFI e RT-PCR em tubo único, 5 (2,2%) amostras foram positivas somente por IFI, 2 (0,9%) somente por RT semi Nested PCR e 16 (7,1%) amostras foram positivas pela RT semi Nested PCR e RT-PCR em tubo único. A RT-PCR em tubo único mostrou ser uma técnica rápida, sensível e específica, e o uso combinado de dois métodos aumenta a detecção do HRSV. / Respiratory Syncytial Virus is the main cause of acute lower respiratory tract infection (ALTRs) in infants, elderly and immunodepressed patients. Rapid diagnosis of Respiratory Syncytial Virus (RSV) infection is necessary to efficient treatment, avoiding the unnecessary use of antibiotics and determining patient isolation requirements. The reverse trancriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) and indirect immunofluorescence assay (IFA) methods have been referred as important tools for virus detection considering the high sensitivity and specificity, respectively of such methods. In order to maximize the simplicity and minimize the risk of sample cross-contamination by two steps RT-PCR, we developed a RT-PCR using a single-tube to detect HRSV in clinical samples. Nasopharyngeal aspirates (Nas) of 226 patients with acute respiratory illness, ranging 0-5 years old, were collected at the University of São Paulo Hospital (HU-USP) in São Paulo city. Samples were tested by indirect immunofluorescence assay, RT semi Nested PCR and single-tube RT-PCR. One hundred two (45,1%) of the 226 samples were positive at least by one of the three methods tested and 75 (33,2%) were positive by all methods. Three (1,3%) samples were positive only by IFI and RT semi Nested PCR, 1 (0,4%) sample were positive only by IFI and RT-PCR single-tube, 5 (2,2%) were positive only by IFI, 2 (0,9%) were positive only by RT semi Nested PCR and 16 (7,1) were positive only RT semi Nested PCR and RT-PCR single-tube. RT-PCR single-tube, showed to be fast, sensitive and specific for diagnosis of RSV and the combined use of both methods enhanced HRSV detection.

As amostras sangüíneas de 108 pacientes com diagnóstico clínico e laboratorial de Fibrose Cística foram analisadas com o objetivo de padronizar uma PCR clássica e uma PCR- ASO para a detecção da mutação delta F508. Dos 108 pacientes analisados, 23 eram homozigotos para a deleção delta F508 (21,29%), 50 eram heterozigotos (46,29%), e 35 não portadores (32,40%). Ambas as PCR apresentaram reprodutibilidade de 100%, e houve concordância absoluta entre os resultados deste estudo e aqueles dos laboratórios de referência. Concluímos que as padronizações propostas foram bem sucedidas, e recomendamos que os pacientes sejam testados com as duas técnicas, o que, encarece a investigação laboratorial, porém, aumenta significativamente o grau de confiabilidade dos resultados / Blood samples were drawn from 110 clinically and laboratory diagnosed Cystic Fibrosis patients in order to standardize one classical amplification and one ASO-PCR for detecting the delta F508 mutation. Twenty-four of 110 patients (21,8%) were homozygous for the delta F508 deletion, 51 were heterozygous, and the remaining 35 (31,8%) were non-carriers. Both PCR techniques presented with 100% reproducibility, and there were no discrepancies between our results and those from the reference laboratories. We concluded that the 2 amplification systems were successfully standardized in this study, and recommended that all patients should be tested by both techniques in order to increase reliability, albeit the increment of laboratory costs

A Lawsonia intracellularis é uma bactéria intracelular obrigatória que causa Enterite Proliferativa em vários animais, como suínos, cervos, ratos, hamsters, cobaios, coelhos, ovinos, eqüinos, raposas, cães, furões, primatas não humanos, emas e avestruzes. Atualmente não há relatos da ocorrência do agente ou dos sinais clínicos de sua infecção em aves comerciais (Gallus gallus domesticus). O presente estudo reporta a detecção através da reação em cadeia pela polimerase (PCR) de Lawsonia intracellularis em matrizes pesadas de diferentes idades provenientes de quatro linhagens de aves comerciais. Dentre os 100 suabes de fezes colhidos a partir de fragmentos intestinais, 34% foram positivos para a detecção do agente pela PCR. O agente foi encontrado com maior freqüência em aves de 80 semanas de idade apresentando ou não quadro diarréico. Os fragmentos intestinais das aves cujas fezes foram positivas para detecção de Lawsonia intracellularis foram submetidos ao exame histopatológico e na maioria das lesões analisadas foi observada enterite necrótica crônica proliferativa. Apesar das lesões serem sugestivas de infecção por Lawsonia intracellularis pela coloração de Warthin-Starry, a presença do patógeno no interior dos enterócitos ou células glandulares não foi observada. Esses resultados poderiam levar a novas pesquisas sobre a importância da Lawsonia intacellularis na avicultura do Brasil e do mundo. / Lawsonia intracellularis is an obligate intracellular bacterium responsible for proliferative enteritis in many animals, such as swine, deers, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits, ovine, horses, foxes, dogs, ferrets, no human primats, emus and ostrichs. Currently there is no reports about the occurrence of this agent or clinical signs of its infection in chickens (Gallus gallus domesticus). The present study reports the detection of Lawsonia intracellularis at different ages of broiler breeder in four avian commercials lineages by Polymerase Chain Reaction (PCR). Of 100 faecal swabs collected from intestinal fragments, 34% were positive for Lawsonia intracellularis detection by PCR. The agent was more frequently found in chickens of 80 weeks of age presenting or not diarrhea. The intestinal fragments which faeces were positive for Lawsonia intracellularis PCR detection were submitted to histopathological exam and in the most analysed lesions were observed proliferative necrotic cronic enteritis. Although the lesions were suggestive of L. intracellularis infection by Warthin-Starry staining, the presence of the pathogen inside of enterocytes or gland cells was not observed. This results could lead to new researches about the mean of Lawsonia intacellularis in broiler industry of Brazil and the world.

Os pacientes infectados pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) freqüentemente apresentam alterações digestivas, sendo o esôfago um alvo comum de lesões estruturais. A etiologia infecciosa é a mais freqüente neste grupo de pacientes. Múltiplos agentes já foram implicados como causadores de lesões esofágicas. As infecções virais são uma das principais causas de tais lesões, sendo os vírus mais implicados o citomegalovirus (CMV) e o vírus herpes simples (HSV). Muitas lesões ulceradas permanecem sem diagnóstico etiológico, mesmo após exaustiva investigação, sendo denominadas úlceras idiopáticas ou aftosas. Os métodos de diagnóstico usuais são demorados e pouco sensíveis. Assim, nosso estudo tem como principal objetivo estudar o papel do método da reação em cadeia da polimerase (PCR) no diagnóstico destas lesões. Durante o período de outubro de 1996 a outubro de 1997, foram estudados 79 pacientes HIV-positivos, que foram submetidos ao exame de endoscopia digestiva alta por indicação clínica. Estes foram submetidos a 89 exames endoscópicos, sendo colhidas 96 biópsias, as quais foram armazenadas em nitrogênio líquido (50) ou em freezer a –70oC (46). O DNA foi extraído usando método baseado na lise hipotônica, digestão com proteinase K, extração com fenol-clorofórmio e precipitação em etanol. Uma quantidade fixa foi usada para amplificação em ciclador térmico, utilizando primers específicos para CMV, Herpesvirus, HPV, HIV, Haemophilus ducreyi, Treponema pallidum e as micobactérias M. tuberculosis, M. avium e M. intracellulare. O produto final foi submetido a uma eletroforese em gel de agarose e corado com brometo de etídeo. A endoscopia não revelou alterações esofágicas em 26 exames (29,2%). As alterações observadas foram monilíase esofágica em 33 exames (37,1%), úlceras em 22 (24,7%); esofagite em 10 (11,2%) e áreas lugol-negativas em 9 (10,1%). A PCR resultou positiva para o CMV em 19 amostras (19,8%), para o Herpes em 4 (4,2%), para o HPV em 17 (17,7%), para o HIV em 37 (38,5%) e para o H. ducreyi em 3 (3,1%). Nenhuma amostra foi positiva para o T. pallidum e para micobactérias. No estudo de 29 amostras de 22 úlceras esofágicas a PCR detectou o CMV em 9 amostras (31%), o Herpes em 3 (10,3%), o HPV em 6 (20,7%), o HIV em 19 (65,5%) e o H. ducreyi em 2 (6,9%) e em 8 (36,4%) não foi detectado nenhum agente. O CMV foi detectado com freqüência nas úlceras esofágicas, sendo difícil diferenciar se havia infecção ativa ou latente. O HIV teve uma incidência elevada nas biópsias de úlceras, o que pode sugerir um possível papel etiológico deste agente em tais lesões. O HPV foi o terceiro agente mais freqüente, mas não foi possível caracterizá-lo como causador de lesões esofágica ulceradas. A PCR apresentou potencial para tornar-se um método útil na investigação das lesões esofágicas em pacientes infectados pelo HIV. / Patients infected by Human Immunodeficiency Virus (HIV) usually present digestive abnormalities and the esophagus is a common target of structural lesions. Infections are the most frequent cause of esophageal lesions in these patients. Several agents were already implied in this process. Viral infections are one of the main causes of such lesions and cytomegalovirus (CMV) and herpes simplex virus (HSV) were the most involved agents. Many ulcerated lesions persist without etiologic diagnosis even after exhaustive investigation, being denominated idiopathic or aphthous ulcers. The usual diagnostic methods are difficult and have low sensitivity. Thus, the main objective of our study was to evaluate the role of the polimerase chain reaction (PCR) method in the diagnosis of these lesions. During the period of October of 1996 to October of 1997, 79 HIV-positive patients were studied. They were submitted to upper digestive endoscopies, which were indicated on clinical basis. These patients were submitted to 89 upper digestive endoscopies, being obtained 96 biopsies, which were stored in liquid nitrogen or in a 70oC freezer. DNA was extracted using a method based on hypotonic lyses, proteinase K digestion, extraction with phenol-chloroform and precipitation in ethanol. A fixed amount was used for amplification in thermal cycler, using specific primers for CMV, herpesvirus, human papillomavirus (HPV), HIV, Haemophilus ducreyi, Treponema pallidum, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium and Mycobacterium intracellulare. The final products were submitted to an electrophoresis in agarose gel and stained with ethidium bromide. The endoscopies did not reveal esophageal alterations in 26 exams(29,2%). The abnormalities observed were esophageal candidiasis in 33 exams (37,1%), ulcers in 22 (24,7%); esophagitis in 10 (11,2%) and lugol-negative areas in 9 (10,1%). The PCR was positive to CMV in 19 samples (19,8%), for Herpes in 4 (4,2%), for HPV in 17 (17,7%), for HIV in 37 (38,5%) and for the H. ducreyi in 3 (3,1%). No sample was positive for T. pallidum or micobacterium. In the study of the esophageal ulcers by PCR, CMV was detected in 9 samples (31%), Herpes in 3 (10,3%), HPV in 6 (20,7%), HIV in 19 (65,5%), H. ducreyi in 2 (6,9%) and any agent was detected in 8 samples (36,4%). CMV was frequently detected in esophageal ulcers, being difficult to differentiate between active and latent infections. The HIV had an elevated incidence in ulcer biopsies, which may suggest a possible etiologic role of this virus in such lesions. HPV was the third more frequent agent, but it was not possible to attribute the esophageal lesions to that virus. In conclusion, this study suggests that the PCR can be an useful method in the investigation of esophageal lesions in HIV infected patients.

O objetivo deste estudo foi avaliar a plataforma OpenArray para testes genéticos em doadores de sangue e determinar as frequências genotípicas e alélicas de alterações pontuais (SNPs) associadas à trombose venosa (G1691A e G20210A), à hiperhomocisteinemia (C677T, A1298C), e à hemocromatose hereditária (C282Y, H63D e S65C) na população de doadores de sangue de São Paulo, Brasil. Foram analisadas 400 amostras de sangue total coletadas de outubro a novembro de 2011. A detecção dos SNPs foi realizada utilizando a tecnologia de microarray em superfície sólida OpenArray. As amostras também foram analisadas utilizando a técnica de PCR em Tempo Real sistema FRET para comparação dos resultados e determinação da acurácia do sistema OpenArray. Observamos que houve 100% de concordância de resultados entre ambas as técnicas para todas as amostras, em todas as variantes pesquisadas, com exceção da mutação C282Y no gene HFE, a qual apresentou 99,75% de concordância. O resultado da amostra em questão foi posteriormente confirmado por sequenciamento direto (Sanger), que confirmou o resultado fornecido pelo método OpenArray. As frequências calculadas para cada SNP foram: FV G1691A 98,8% (G/G), 1,2% (G/A); FII G2021A 99,5% (G/G), 0,5% (G/A); MTHFR C677T 45,5% (C/C), 44,8% (C/T), 9,8% (T/T); MTHFR A1298C 60,3% (A/A), 33,6% (A/C), 6,1% (C/C); HFE C282Y 96%(G/G), 4%(G/A), HFE H63D 78,1%(C/C), 20,3% (C/G), 1,6% (G/G); e HFE S65C 98,1% (A/A), 1,9% (A/T). Esses resultados descrevem as frequências de SNPs associados a doenças e são importantes para aprimorar o conhecimento atual do perfil genético da população de doadores de sangue brasileiros, embora um estudo maior seja necessário para determinar com a maior acurácia a frequência das mutações pesquisadas. Além disso, observamos que a plataforma OpenArray, demonstrou alta taxa de concordância com o método de PCR em Tempo Real sistema FRET. / The aim of this study was to evaluate the OpenArray platform for genetic testing of blood donors and to assess the genotype frequencies of nucleotide-polymorphisms (SNPs) associated with venous thrombosis (G1691A and G20210A), hyperhomocysteinemia (C677T, A1298C), and hereditary hemochromatosis (C282Y, H63D and S65C) in blood donors from Sao Paulo, Brazil. We examined 400 blood donor samples collected from October to November 2011. The SNPs were detected using OpenArray technology. The blood samples were also examined using a real-time PCR-FRET system to compare the results and determine the accuracy of the OpenArray method. We observed 100% agreement in all assays tested, except HFE C282Y, which showed 99.75% agreement. The HFE C282Y assay was further confirmed through direct sequencing, and the results showed that OpenArray analysis was accurate. The calculated frequencies of each SNP were FV G1691A 98.8% (G/G), 1.2% (G/A); FII G2021A 99.5% (G/G), 0.5% (G/A); MTHFR C677T 45.5% (C/C), 44.8% (C/T), 9.8% (T/T); MTHFR A1298C 60.3% (A/A), 33.6% (A/C), 6.1% (C/C); HFE C282Y 96%(G/G), 4%(G/A), HFE H63D 78.1%(C/C), 20.3% (C/G), 1.6% (G/G); and HFE S65C 98.1% (A/A), 1.9% (A/T).Taken together, these results describe the frequencies of SNPs associated with diseases and are important to enhance our current knowledge of the genetic profiles of Brazilian blood donors, although a larger study is needed for a more accurate determination of the frequency of the alleles. Furthermore, the OpenArray platform showed a high concordance rate with standard FRET RT-PCR

A Brucella abortus causa diminuição da eficiência reprodutiva em bovinos e é também o agente de uma das zoonoses mais difundidas no mundo. A doença é alvo de programas de controle em muitos países e, no Brasil, seu combate foi melhor organizado a partir de 2001, com o lançamento de programa nacional pelo MAPA. O objetivo do presente estudo foi aperfeiçoar a detecção de B. abortus em homogeneizados de órgãos de fetos abortados por vacas infectadas. Assim, foram comparados diferentes protocolos de extração de DNA, visando à detecção de B. abortus pela PCR em amostras clínicas colhidas de fetos abortados ou bezerros oriundos de vacas experimentalmente desafiadas com B. abortus cepa 2308. Para tanto, foram construídos dois grupos padrão ouro com base na bacteriologia clássica, constituídos por: 32 pulmões (17 positivos ao isolamento), 26 baços (11 positivos ao isolamento), 23 fígados (8 positivos ao isolamento) e 22 linfonodos bronquiais (7 positivos ao isolamento). Todas essas amostras foram submetidas a três distintos protocolos de extração de DNA, seguidos do mesmo processo de amplificação com os primers B4 e B5. A análise dos resultados consolidados mostrou uma sensibilidade de 95% para o protocolo da proteinase K (PK), 86% para o do isotiocianato de guanidina (GT) e de 88% para o de Boom. Os valores encontrados de Sensibilidade para pulmão, baço, fígado e linfonodo foram, respectivamente, 100%, 100%, 100% e 71% (PK), 82%, 100%, 88% e 71% (GT) e 94%, 100%, 63% e 86% (Boom). No grupo dos animais dos quais não foi possível isolar brucellas (gold standard negativo), a PCR resultou positiva em 8 amostras para o protocolo de extração PK (4 pulmões, 1 fígado e 3 linfonodos), em 6 amostras para o protocolo de extração GT (1 pulmão, 3 fígados e 2 linfonodos) e em 37 amostras para o protocolo de extração Boom (10 pulmões, 10 baços, 10 fígados e 7 linfonodos). Esses resultados permitem afirmar que o protocolo de extração PK apresentou a melhor sensibilidade diagnóstica e que o protocolo de extração de Boom apresentou o melhor desempenho nas amostras onde o isolamento foi negativo. Dentre os órgãos estudados, o baço apresentou a maior probabilidade de detecção de B. abortus. Assim, a melhor estratégia para detecção de B. abortus em homogeneizados de órgãos de fetos abortados é a utilização do isolamento e da PCR em paralelo. / Infection by Brucella abortus diminishes the reproductive efficiency in bovines and it is also the agent of one of the most spread zoonosis in the world. In many countries control programs aim this disease, and in Brazil its combat was better organized since 2001 with the creation of the national program by the Ministry of Agriculture, Livestock and Supplies (MAPA). The objective of the present study was to improve the detection of B. abortus in aborted fetus homogenates from infected cows. For that reason, different DNA extraction protocols were compared, focusing the PCR detection of B. abortus in clinical samples collected from aborted fetus or calves obtained from cows experimentally defied with the 2308 B. abortus strain. Therefore, two gold standard groups were built based on classical bacteriology, formed by: 32 lungs (17 isolation positives samples), 26 spleens (11 isolation positives samples), 23 livers (8 isolation positives samples) and 22 bronchial lymph nodes (7 isolation positives samples). All samples were submitted to three distinct DNA extraction protocols, followed by the same amplification process with the primers B4 and B5. The analysis of the consolidated results showed a 95% sensibility for the proteinase K protocol (PK), 86 % for the guanidine isotiocianate (GT) and 88% for the Boom. The sensibility values obtained for lungs, spleen, liver and lymph node were, respectively, 100%, 100%, 100% and 71% (PK), 82%, 100%, 88% and 71% (GT) and 94%, 100%, 63% and 86% (Boom). In the group of animals in which it was not possible to isolate brucellas (negative gold standard), the PCR resulted positively in 8 samples for the PK extraction protocol (4 lungs, 1 liver and 3 lymph nodes), in 6 samples for the GT extraction protocol (1 lung, 3 livers and 2 lymph nodes) and in 37 samples for the Boom extraction protocol (10 lungs, 10 spleens, 10 livers and 7 lymph nodes). These results permit affirming that the PK extraction protocol showed the best diagnostic sensibility and that the Boom extraction protocol showed the best performance in negative isolation samples. Within the studied organs, the spleen showed the highest probability of B. abortus detection. Therefore, the best strategy for B. abortus detection in organs homogenates from aborted fetus is the utilization of isolation and in parallel, the PCR.

A taxa de infecção mínima (TIM) em flebotomíneos é uma informação útil para estudos epidemiológicos em leishmaniose. Quando estes estudos de campo contem grande número de insetos, a PCR é a indicada para caracterização por Leishmania nos vetores. Este estudo avaliou a PCR na identificação da (TIM) natural por Leishmania spp. em Lutzomyia longipalpis e, ao mesmo tempo, determinou as (TIM) por Leishmania spp em uma micro-região endêmica do Estado de São Paulo. Na primeira parte deste estudo, as avaliações do desempenho das PCRs convencional (cPCR) e em tempo real (qPCR) foram realizadas em 66 amostras de conteúdo intestinal de flebotomíneos utilizados no xenodiagnóstico (30 positivas e 36 negativas). O material contido nas lâminas foi transferido para tubos com solução salina estéril e congeladas a -20° C por cerca de 12 meses. Os marcadores moleculares utilizados foram RV1/RV2 para L. (L.) infantum na cPCR; e Linj31 para sub gênero (L.) (Leishmania) na qPCR. Das 30 amostras positivas, 20 (67%) e 21 (70%) foram positivas utilizando os marcadores RV1/RV2 e Linj31, respectivamente. Das 36 amostras negativas no xenodiagnóstico, 2 (5%) foram positivas em todos os marcadores moleculares. Na segunda parte foram analisados insetos capturados durante 2 a 3 noites/mês durante 11 meses (janeiro a novembro de 2012) usando 10 armadilhas automáticas de luz do tipo CDC ao redor de um canil em uma transição entre bairro periurbano e urbano de Dracena. As áreas de captura foram agrupadas em 3 zonas para determinar a TIM. Um total de 1.690 Lu. longipalpis foram capturadas durante o período estudado. Destes, 292 (17,25%) eram fêmeas de flebotomíneos e foram agrupadas em 165 pools (1 a 5 insetos) para extração de DNA e análise por PCR. Resultados positivos para L. (L.) infantum na cPCR e qPCR foram vistos em 7,28% (12/165) e 4,85% (8/165) das amostras, respectivamente. Estes dados confirmam que espécimes capturados na área de estudo estavam infectados por L. (L.) infantum. A TIM durante os 11 meses de capturas foi de 4,10% (292 fêmeas coletadas). Os ecótopos com TIM mais altos foram canil, galinheiro e casa 2. Flebotomíneos infectados estavam presentes nos locais de captura com abundância de hospedeiros. O maior número de pools positivos (6/93) foi obtido no galinheiro, todavia a maior TIM foi obtido em um domícilio (1/6) 16,67%. / The minimum infection rate (MIR) in sandflies is a useful information for epidemiological studies on leishmaniasis. When these field studies consider large numbers of insects, PCR is indicated for identification and characterization of Leishmania in the vectors. This study evaluated a PCR in the identification of natural (MIR) by Leishmania spp. in Lutzomyia longipalpis and, at the same time, determined MIR by Leishmania spp in a micro region endemic in São Paulo State . In the first part of this study, the performance evaluation of conventional PCR (cPCR) and real-time PCR (qPCR) were carried out on 66 intestinal contents samples of non-xenodiagnostic sandflies (30 positive and 36 negative). The material contained in the slides was transferred to tubes with sterile saline solution and frozen at -20 ° C for about 12 months. The molecular markers used were RV1 / RV2 for L. (L.) infantum in cPCR; E Linj31 for sub genus (L.) Leishmania on qPCR. From the 30 positive samples, 20 (67%) and 21 (70%) were positive using the RV1 / RV2 and Linj31 markers, respectively. From the 36 negative xenodiagnostic samples, 2 (5%) were positive in all molecular markers. In the second part, we analyzed insects captured during 2 to 3 nights / month for 11 months (January to November 2012) using 10 CDC automatic light traps around a kennel in a transition between urban and suburb of Dracena. Capture areas were grouped into 3 zones to determine MIR. A total of 1,690 Lu. longipalpis were captured during the study period. From these, 292 (17.25%) were female sand flies and were grouped into 165 pools (1 to 5 insects) for DNA extraction and PCR analysis. Positive results for L. (L.) infantum in cPCR and qPCR were seen in 7.28% (12/165) and 4.85% (8/165) of the samples, respectively. These data confirm that the specimens captured in the study area were infected by L. (L.) infantum. The MIR during the 11 months of captures was 4.10% (292 females collected). The highest MIR ecotopes were kennel, chicken coop and house 2. Infected sandflies were presented at capture sites with host abundance. The highest number of positive pools (6/93) was obtained in henhouse, however the highest MIR was obtained in a domicile (1/6) 16.67%.