Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-09-13T16:56:22Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2092738 bytes, checksum: 991c21e0ecefbc7be1990a39f757c9bb (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-13T16:56:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2092738 bytes, checksum: 991c21e0ecefbc7be1990a39f757c9bb (MD5) Previous issue date: 2016-11-21 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Translationally controlled tumor protein (TCTP) é uma proteína amplamente distribuída em eucariotos. Ela está envolvida na regulação de processos básicos como progressão do ciclo celular, crescimento celular, proteção contra estresses e apoptose. Durante a infecção de tomateiro (Solanum lycopersicum) e Nicotiana benthamiana pelo potyvírus Pepper yellow mosaic virus ocorre aumento dos níveis de seu mRNA. Plantas silenciadas para TCTP acumulam menos vírus do que plantas selvagens, mostrando que esta proteína é importante para a infecção por potyvírus. Neste trabalho, o envolvimento da TCTP na infecção por potyvírus foi analisado detalhadamente utilizando-se o potyvírus Turnip mosaic virus (TuMV). Em plantas de N. benthamiana silenciadas para TCTP também ocorre uma diminuição no acúmulo do TuMV quando comparado com plantas não silenciadas. Além disso, plantas superexpressando TCTP de maneira transiente acumularam mais vírus do que plantas controle, confirmando o efeito positivo desta proteína na infecção por diferentes espécies de potyvírus. Para analisar a localização subcelular de TCTP no contexto da infecção, TCTP fusionada a GFP foi co-expressa com TuMV/6K2:mCherry. TCTP co-localiza-se com as vesículas replicativas e com estrutura a globular perinuclear tipicamente observada em células infectadas. O fracionamento de proteínas celulares demonstrou que TCTP está predominantemente na fração solúvel e uma pequena porção se associa com membranas, tanto em plantas sadias quanto em plantas infectadas. A co- localização com vesículas marcadas por 6K2 e a presença de TCTP em frações membranosas da célula sugerem um possível envolvimento desta proteína na replicação viral. Para verificar esta hipótese, protoplastos obtidos a partir de plantas silenciadas para TCTP foram infectados com TuMV e com o mutante TuMV VNN , o qual não é capaz de replicar-se. Os resultados demonstraram que o acúmulo de TuMV é reduzido em protoplastos silenciados, indicando que TCTP é necessária para a replicação. O acúmulo da proteína TCTP durante a infecção também foi avaliado. A infecção viral induz o aumento dos níveis de mRNA mas não de proteína, sugerindo que o mRNA que codifica TCTP atue na replicação. Desta forma, foi analisado se expressão de um RNA não traduzível de TCTP possui efeito sobre a infecção viral. Os resultados mostraram que apenas a expressão de um RNA traduzível é capaz de aumentar a infecção viral, indicando que a proteína TCTP, ou que a tradução se seu mRNA, é importante para a replicação viral. / The translationally controlled tumor protein (TCTP) is widely distributed among eukaryotes. It is involved in the regulation of basic processes such as cell cycle progression, cell growth, stress protection and apoptosis. During tomato (Solanum lycopersicum) and Nicotiana benthamiana infection by the potyvirus Pepper yellow mosaic virus, an increase of TCTP mRNA levels was observed. Plants silenced for TCTP accumulate fewer viruses than control plants, showing the importance of that gene for potyvirus infection. In this work, TCTP involvement in potyvirus infection was analyzed in details using the potyvirus Turnip mosaic virus (TuMV). N. benthamiana plants silenced for TCTP accumulated fewer viruses than non-silenced plants. In addition, plants overexpressing TCTP transiently accumulated more viruses than control plants, confirming that TCTP has a positive effect on infection by different potyviruses. To study TCTP subcellular localization in potyvirus infected plants, TCTP fused to GFP was co- expressed with TuMV/6K2:mCherry. Confocal analysis has shown that TCTP co- localizes with 6K2-tagged structures such as replicative vesicles and the perinuclear globular structure that is typically observed in potyvirus-infected cells. Cellular fractioning demonstrated that TCTP is mainly present in the soluble fraction but is also associated with membranes. The co-localization of TCTP with 6K2-tagged vesicles and its presence in cellular membranous fractions suggests a possible involvement of TCTP in virus replication. To test this hypothesis, protoplasts obtained from TCTP silenced plants were infected with TuMV and its mutant TuMV VNN , which is defective for replication. The results showed that TuMV accumulation is reduced in silenced protoplasts, indicating that TCTP is necessary for replication. TCTP accumulation during infection was also analyzed. Viral infection induces TCTP mRNA expression, but not protein accumulation, suggesting that the TCTP mRNA and not the protein has a role in viral infection. To check this, we expressed a non-translatable form of TCTP RNA in plants and analyzed its effect in virus accumulation. The results showed that only the expression of a translatable RNA resulting in protein production is able to increase virus infection, indicating that the protein and/or the translation of TCTP is important for potyvirus replication.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, 2007. / Submitted by Ruthléa Nascimento (ruthleanascimento@bce.unb.br) on 2015-10-05T16:20:07Z No. of bitstreams: 1 Dissert_Anelise Orilio.pdf: 2146597 bytes, checksum: 218ace7315aad0f1ee3fc2b4fd23b756 (MD5) / Approved for entry into archive by Ruthléa Nascimento(ruthleanascimento@bce.unb.br) on 2015-10-05T16:20:31Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissert_Anelise Orilio.pdf: 2146597 bytes, checksum: 218ace7315aad0f1ee3fc2b4fd23b756 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-05T16:20:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissert_Anelise Orilio.pdf: 2146597 bytes, checksum: 218ace7315aad0f1ee3fc2b4fd23b756 (MD5) / A mandioquinha-salsa é uma planta propagada vegetativamente e durante o seu cultivo sucessivo pode ocorrer o acúmulo de patógenos de infecção sistêmica como vírus, resultando em decréscimo da produção. No Brasil, é comum observar plantas de mandioquinha-salsa apresentando sintomas de mosaico, mosqueamento e deformação foliar, semelhantes a infecção por vírus. Evidências de ocorrência de vírus infectando esta cultura já foram relatadas, porém nenhum estudo de identificação e caracterização havia sido realizado. O objetivo do presente trabalho foi caracterizar biológica, sorológica e molecularmente um vírus isolado de mandioquinha-salsa e desenvolver técnicas para a sua detecção. Um isolado de vírus foi obtido a partir de mandioquinha-salsa coletada para estudo de micropropagação, denominado isolado C17, e que foi selecionado para a caracterização. Este vírus causa em Nicotiana benthamiana, hospedeiro usado para manutenção, sintoma de deformação foliar, bolhosidades e mosaico. O isolamento biológico foi realizado a partir do extrato da planta original de mandioquinha-salsa infectada em Chenopodium quinoa. Este isolado apresentou círculo de hospedeiros restrito e foi transmitido por afídeos de maneira não persistente. Partículas virais foram purificadas e análise ao microscópio eletrônico revelou partículas alongadas e flexuosas, típicas de espécies de Potyvirus. Em gel de poliacrilamida, a capa protéica apresentou uma proteína com peso molecular de aproximadamente 33 kDa, que em teste de Western blotting foi reconhecida especificamente pelo anti-soro policlonal produzido contra a proteína da capa do isolado C17. O anti-soro produzido em coelho a partir de partículas purificadas apresentou alta especificidade e sensibilidade. Amostras de campo do banco ativo de germoplasma de mandioquinha-salsa da Embrapa Hortaliças foram avaliadas por ELISA. A detecção foi positiva em 93 % das amostras, demonstrando a grande aplicabilidade do antisoro em testes diagnósticos de amostras do campo. A porção 3´ terminal do genoma do vírus (1,7 kb) foi clonada por RT- PCR e sequenciada em sequenciador automático. A análise da seqüência nucleotídica do fragmento clonado revelou uma fase aberta de leitura incompleta (sem o códon de iniciação) que codifica uma parte da proteína NIb (polimerase viral) e capa protéica (CP), seguida de uma região 3´ não traduzida (3’ UTR). A sequência nucleotídica da CP e da 3' UTR apresentou baixa porcentagem de identidade com seqüências de outros potyvírus depositados em bancos de dados públicos. A maior porcentagem de identidade nucleotídica da CP foi de 63 % para Araujia mosaic virus e da seqüência de aminoácidos foi de 60 % para Narcissus late season yellows virus (NLSYV). A análise filogenética confirmou o agrupamento do C17 com o NLSYV e sugeriu que estes podem ter evoluído de um ancestral em comum. De acordo com o critério molecular para demarcação de espécies de Potyvirus, 82 % e 76 % de identidade na comparação da seqüência de aminoácidos e nucleotídeos da CP, respectivamente, o isolado C17 de mandioquinha-salsa pode ser considerado como uma nova espécie de vírus pertencente ao gênero Potyvirus, e o nome Arracacha mottle virus é proposto. Com o intuito de desenvolver uma ferramenta de detecção mais sensível que a sorologia, primers específicos foram desenhados e avaliados. Um par de primers mostrou excelentes resultados de especificidade e sensibilidade, sendo recomendados para o uso em testes de detecção em situações de necessidade de alta sensibilidade. A seqüência da região 3’ terminal genômica deste vírus foi bastante distinta dos demais potyvírus, portanto a clonagem do genoma para sequenciamento completo foi realizada. Utilizou-se a estratégia de RT-PCR com primers desenhados em regiões conservadas do genoma dos potyvírus mais próximos. Um total de dez clones foram obtidos, o que corresponde a 90% do genoma do vírus. A seqüência nucleotídica destes clones estão sendo determinados por primer walking. Até o momento, 70 % da seqüência de nucleotídeos do genoma já foi determinada. Este é o primeiro relato de identificação e caracterização de vírus infectando mandioquinha-salsa no Brasil. ________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Arracacha plant is vegetatively propagated and during its continuous cultivation accumulation of systemic pathogens, such as viruses, can occur resulting in decreased production. In Brazil, it is common to observe arracacha plants with symptoms of mosaic, mottling and leaf deformation, similar to virus infection. Evidences of virus occurrence have been reported, but their identification and characterization were not carried out. The objective of this study was to characterize at the biological, serological and molecular level a virus isolated from arracacha, and to develop detection techniques. The virus isolate was obtained from an arracacha plant collected for micropropagation studies. This isolate was named C17, and selected for characterization. This virus caused in Nicotiana benthamiana plants, the maintenance host, symptoms of leaf deformation, blistering and mosaic. Biological isolation was conducted from the extract of the original arracacha plant inoculated in Chenopodium quinoa leaves. This isolate had a narrow host range and was transmitted by aphids in a non-persistent manner. Viral particles were purified and EM analysis revealed flexuous and filamentous particles, typical of Potyvirus species. A SDSPAGE revealed a coat protein of ca. 33 kDa, which was specifically recognized by the C17 polyclonal antiserum by Western blotting. This antiserum was produced in rabbits from purified particles, and was shown to be highly specificic and sensitive. Samples of the germplasm bank of arracacha of Embrapa Hortaliças were tested by ELISA. A total of 93% were positive for the presence of C17, demonstrating the applicability of this antiserum in diagnostic tests in field collected samples. The 3’ genomic portion of the virus genome (1,7 kb) was cloned by RT-PCR and sequenced in an automated sequencer. Nucleotide sequence analysis of the cloned fragment showed a partial ORF (without the start codon) encoding the 3’ portion of the NIb protein (viral polymerase), and the coat protein (CP), followed by a 3' untranslated region (3'UTR). The CP and 3’ UTR nucleotide sequence shared low identity with other potyvirus sequences in public databases. The highest nucleotide identity was 63 % with Araujia mosaic virus (ArjMV), while the highest amino acid identity (60 %) with Narcissus late season yellows virus (NLSYV). The phylogenetic analysis confirmed the clustering of C17 isolate with NLSYV and suggested that they may have evolved from a common ancestral. According to the species demarcation criterion for Potyvirus species (82% and 76% identity of CP amino acid and nucleotide sequence, respectively), C17 isolate can be considered as a novel virus belonging to the Potyvirus genus. The name Arracacha mottle virus is proposed. In order to develop a detection tool more sensitive than serology, specific primers were designed and evaluated for the use in RT-PCR. One primer pair showed excellent specificity and sensitivity results and is recommended for application in detection tests when high sensitivity is needed. The sequence of the 3' terminal end of this virus was quite different from other potyviruses, hence complete genome cloning was attempted. The strategy used was based on RT-PCR with primers designed towards conserved regions of the potyvirus genome. A total of ten partial clones were obtained, which corresponded to 90% of the viral genome. Inserts of these clones are being sequenced by primer walking. To date, 70% of the nucleotide sequence has already been determined. This is the first report of the identification and characterization of a virus infecting arracacha in Brazil.

Submitted by MARCOS ROBERTO RIBEIRO JUNIOR (marcosrrjr@gmail.com) on 2018-05-08T22:29:14Z No. of bitstreams: 1 Dissertação MRRJ.pdf: 1724799 bytes, checksum: 037c8e4ad5333c640f804b844d4e1c8f (MD5) / Approved for entry into archive by Maria Lucia Martins Frederico null (mlucia@fca.unesp.br) on 2018-05-09T11:47:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 ribeiro junior_mr_me_botfca.pdf: 1584829 bytes, checksum: 17f199c24c786ad5706005cd000ce73f (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-09T11:47:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ribeiro junior_mr_me_botfca.pdf: 1584829 bytes, checksum: 17f199c24c786ad5706005cd000ce73f (MD5) Previous issue date: 2018-02-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A partir do ano de 2016, anormalidades foram observadas em campos de produção de rúcula (Eruca sativa) no interior do estado de São Paulo, região de Botucatu. As plantas acometidas apresentavam mosaico, redução drástica no crescimento e deformação foliar, sintomas típicos da infeção por vírus. Associadas as essas plantas, também foram observadas altas populações de pulgões/afídeos e de plantas daninhas, como nabiça (Raphanus raphanistrum) e nabo forrageiro (Brassica rapa) apresentando sintomas de mosaico. Inicialmente, as plantas foram submetidas ao teste de ELISA indireto usando um antissoro para potyvirus, em seguida foi realizada a extração de RNA total e RT-PCR, utilizando as amostras ELISA-positivas. A sequência correspondente à região codificadora para a proteína capsidial foi obtida e o vírus foi identificado como Turnip mosaic virus (TuMV). Posteriormente outros campos de produção de folhosas foram visitados no Estado de São Paulo (região de Bragança Paulista e Mogi-Mirim) e o TuMV foi novamente identificado em rúcula, porém também em alface (Lactuca sativa) e acelga (Beta vulgaris subsp. vulgaris). Analises biológicas e moleculares agruparam ambos os isolados de TuMV no grupo Brassica-Raphanus (BR), que inclui isolados infectando espécies de Brassica e Raphanus. É apresentado aqui o primeiro relato de TuMV naturalmente infectando rúcula, alface e acelga no Brasil. De acordo com a análise filogenética, pelo menos duas introduções diferentes de isolados de TuMV ocorreram no Brasil, correspondendo aos tipos basal-BR e world-B, infectando Brassica/Raphanus e Brassica, respectivamente. / Abnormalities have been observed in rocket (Eruca sativa) fields in Botucatu, Sao Paulo state, Brazil since 2016. Symptoms of mosaic, reduction in foliar growth and deformation, typical symptoms of virus infection were observed in rocket plants. Associated to these plants we also found high populations of aphids, as well as raphanus weeds (Raphanus raphanistrum) and forage turnip (Brassica rapa) with mosaic symptoms. Initially, the plants were submitted to indirect ELISA using a potyvirus antiserum, and then total RNA extraction and RT-PCR were performed using the ELISA-positive samples. The complete coat protein sequence was obtained and the virus was identified as Turnip mosaic virus (TuMV). Later, other fields were visited in Sao Paulo state (cities of Bragança Paulista and Mogi-Mirim) and TuMV was again identified not only in rocket, but also in lettuce (Lactuca sativa) and chard (Beta vulgaris subsp. vulgaris). Biological and molecular analysis grouped both TuMV isolates in the Brassica-Raphanus (BR) clade, which includes isolates infecting Brassica and Raphanus species. Here is the first report of rocket, lettuce and chard naturally infected with TuMV in Brazil. According to the phylogenetic analysis, at least two different introductions of TuMV isolates occurred in Brazil, corresponding to the basal-BR and world-B types, infecting Brassica/Raphanus and Brassica, respectively.

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O objetivo do trabalho foi estudar uma forma alternativa para o controle do endurecimento dos frutos do maracujazeiro, pela produção de plantas transgênicas contendo o gene da proteína capsidial do Passionfruit woodness virus - PWV. O vetor de expressão foi construído utilizando-se os plasmídeos pCambia 2300 e pCambia 2301, que contêm o gene de seleção nptII, para resistência ao antibiótico canamicina. O plasmídeo pCambia 2301 contém também o gene repórter uidA (GUS). Os plasmídeos foram introduzidos em Agrobacterium tumefaciens, estirpes EHA 105 e LBA 4404, pelo método do choque térmico. Os explantes para transformação genética constituíram-se de discos de folhas jovens (6 mm de diâmetro), das variedades IAC 275 e IAC 277, coletados de plantas mantidas em sob fotoperíodo de 16 h luz, a 27 °C. Os explantes foram inoculados com suspensão bacteriana (5x108 UFC/mL) por 20 min e transferidos para placa de Petri contendo o meio de cultura MS + thidiazuron (TDZ - 0,25 mg/L) + nitrato de prata (AgNO3 - 4 mg/L) + acetoseringona (1 µM/L). O co-cultivo foi realizado à temperatura de 24 °C, em ausência de luz, por um período de 3 dias. Para seleção e regeneração de plantas os explantes foram transferidos para meio de cultura de seleção MS + TDZ (0,25 mg/L) + AgNO3 (4 mg/L) + canamicina (100 mg/L) + cefotaxime (500 mg/L). A incubação foi realizada a 27 °C, em ausência de luz, por um período de 4 - 6 semanas. As gemas adventícias desenvolvidas foram transferidas para o meio de cultura MSM + 10% de água de coco e incubadas sob fotoperíodo de 16 h de luz. A transformação genética foi identificada pelo teste histoquímico GUS e por PCR. Obteve-se um total de 22 plantas PCR positivas. Destas, 8 foram analisadas por Southern blot para confirmação da integração do transgene. A transcrição e expressão do transgene foram analisadas por Northern e Western blot, respectivamente. As plantas transgênicas avaliadas foram multiplicadas e inoculadas com 3 diferentes estirpes do PWV. A linhagem T2 apresentou resistência a infecção dos três isolados utilizados. / The main purpose of this work was to study an alternative way to control the Passionfruit woodiness virus - PWV through the production of transgenic plants which contained the Passionfruit woodness virus coat protein gene. The binary vector was built by using pCambia 2300 and pCambia 2301 plasmids, which contain the selection gene nptII. The pCambia 2301 plasmid also contains the reporter gene uidA (GUS). The plasmids were introduced into Agrobacterium tumefaciens, EHA 105 and LBA 4404 strains, via thermal shock method. The explants for the genetic transformation were young leaf disks (6 mm of diameter) of IAC 275 and IAC 277 varietys, extracted from plants kept under 16 h photoperiod, at 27 °C. The explants were inoculated with a bacterial suspension (5x108 UFC/mL) for 20 min and then transferred to Petri dishes containing cocolture medium MS + thidiazuron (TDZ - 0,25 mg/L) + silver nitrate (AgNO3 - 4 mg/L) + acetosyringone (1 µM/L). The co-culture was performed at 24 °C t, in the dark, for a three-day period. For the selection and regeneration of plants, the explants were transferred to the selection culture medium MS + TDZ (0,25 mg/L) + AgNO3 (4 mg/L) + kanamycin (100 mg/L) + cefotaxime (500 mg/L). The incubation was performed at 27 °C, in dark, for 4 - 6 weeks. The adventitious buds developed were then transferred to the culture medium MSM + 10% coconut water and kept incubated under 16 h photoperiod. The genetic transformation was identified through GUS and PCR tests. There were 22 PCR positive plants. Out of those, 8 were Southern blot analyzed for the confirmation of transgenc integration. The transgene transcription and expression were determined by Northern and Western blot respectively. The transgenic plants were then multiplied and inoculated with 3 different strains of PWV, and the line 2 showed resistance to the three strains used.

No Brasil, doenças causadas pelo Papaya ringspot virus - type Watermelon (PRSV-W) e Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) reduzem a produção e a qualidade dos frutos de abobrinha-de-moita (Cucurbita pepo) e melancia (Citrullus lanatus), assim como em outras cucurbitáceas. O objetivo deste trabalho foi a obtenção de plantas transgênicas de abobrinha-de-moita e melancia resistentes ao PRSV-W e ao ZYMV. Um sistema eficiente de regeneração in vitro é necessário para a obtenção de plantas transgênicas. O sistema de organogênese in vitro de abobrinha-de-moita foi desenvolvido utilizando como explantes a região basal do cotilédone e um segmento do hipocótilo obtidos a partir de sementes germinadas in vitro. Os explantes foram cultivados em meio de cultura MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962), suplementado com diferentes concentrações de BAP (benzilaminopurina). A indução de gemas adventícias foi mais eficiente nas concentrações de 1,0 e 1,25 mg/L de BAP. Este protocolo foi usado para regenerar plantas em experimentos de transformação genética de abobrinha-de-moita cv. Caserta e melancia cv. Crimson Sweet, via Agrobacterium tumefaciens. O vetor binário pCAMBIA2201, contendo fragmentos dos genes da proteína capsidial do ZYMV e do PRSV-W, numa construção gênica do tipo hairpin e o gene de seleção nptII, sob controle do promotor 35S, foi usado nos experimentos de transformação genética. Após 2 dias de co-cultivo, em meio de cultura MS, suplementado com BAP (1 mg/L), os explantes foram transferidos para meio de cultura de seleção, suplementado com BAP (1 mg/L), timentin (400 mg/L) e canamicina (100 mg/L) e cultivados por 3 a 4 semanas, sob fotoperíodo de 16 horas de luz. Plantas regeneradas foram analisadas por PCR, usando primers específicos para detecção dos fragmentos dos genes da proteína capsidial do PRSV-W e ZYMV. Foram utilizados 1050 explantes de abobrinha-de-moita e de 973 explantes de melancia, resultando em 36 e 59 plantas PCR positivas, respectivamente. A eficiência de transformação foi de 3,4% para abobrinha-de-moita e 6,1% para melancia. Plantas PCR positivas foram aclimatizadas, gradualmente, em sala de luz e transferidas para casa-de-vegetação. Pela análise de Southern blot foi confirmada a integração dos fragmentos dos genes da proteína capsidial do ZYMV e PRSV-W em 3 plantas de abobrinha-de-moita. Depois de desenvolvidas, flores femininas foram polinizadas manualmente e sementes foram coletadas de frutos maduros. Plantas R1 de abobrinha-de-moita e melancia foram inoculadas com o PRSV-W e o ZYMV por meio de Myzus nicotianae virulíferos. Não foram identificadas, até o momento, plantas resistentes aos patógenos em estudo / Diseases caused by the potyviruses Papaya ringspot virus - type Watermelon (PRSV-W) and Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) significantly reduce the yield and fruit quality of zucchini squash (Cucurbita pepo), watermelon (Citrullus lanatus), as well as other cucurbit crops in Brazil. The purpose of this work was to obtain zucchini squash and watermelon transgenic plants resistant to PRSV-W and ZYMV. An efficient in vitro regeneration system which can be associated with the protocol is necessary to obtain transgenic plants. In vitro organogenesis system was successfully developed using comprised of distal region of hypocotyl and the base of cotyledon of a germinated seed. The explants were cultured in MS medium (MURASHIGE; SKOOG, 1962), supplemented with different concentraction of BAP (benzylaminopurine). The induction of adventitious buds was more efficient at concentrations of 1.0 and 1.25 mg.L-1 BAP. This protocol was used to regenerate plants from genetic transformation experiments with zucchini squash cv. Caserta and watermelon cv. Crimson Sweet via Agrobacterium tumefaciens. For transformation, the binary vector pCAMBIA 2201, containing sequences of the coat protein coding regions of ZYMV and PRSV-W in a hairpin construct and the nptII gene, driven by 35S promoter was used. After 2 days of co-culture in MS medium supplemented with BAP (1.0 mg.L-1), explants were transferred to the MS selection culture medium, supplemented with BAP (1.0 mg.L-1), timentin (400 mg.L-1) and kanamycin (100 mg.L-1), and incubated for 3 to 4 weeks at 27 oC, under 16 h photoperiod. Regenerated plants were analyzed by PCR, using specific pairs of primers for the detection of the coat protein gene segments of PRSV-W and ZYMV. A total of 1,050 zucchini squash and 973 watermelon explants were used in the transformation experiments, resulting in 36 and 59 PCR positive plants, respectively. The genetic transformation efficiency was 3.4% for zucchini squash and 6.1% for watermelon. The PCR positive plants were slowly acclimatized in the culture room and transferred to the greenhouse for further growth. Southern blot analysis confirmed the genome integration of the the ZYMV and PRSV-W coat protein gene fragments in three zucchini squash plants which survived the acclimatization step. Later in development, female flowers were were manually pollinated and seeds were collected from mature fruits. R1 transgenic zucchini squash and watermelon plants were inoculated with PRSV-W and ZYMV by means of viruliferous Myzus nicotianae. Resistant plants were not yet observed among the R1 plants available

Les protéines sont des acteurs majeurs dans les processus moléculaires et cellulaires d’un organisme. La remise en question des modalités associées aux fonctions de ces macromolécules a récemment été apportée par le concept de désordre intrinsèque. Celui-ci définit l’absence (transitoire ou permanente) de structure tridimensionnelle de certaines protéines ou régions protéiques comme étant directement liée à leurs fonctions. Chez les virus à ARN, les propriétés des protéines ou régions désordonnées semblent associées aux capacités de ces micro-organismes à détourner la machinerie cellulaire de l’hôte en interagissant avec de multiples partenaires, et à s’adapter aux nombreuses contraintes auxquelles ils doivent faire face en tant que parasites obligatoires. Ce travail porte sur les potyvirus, figurant parmi les pathogènes de plantes les plus dommageables étudiés à ce jour. L'objectif de cette thèse a été d’explorer les fonctions associées au désordre intrinsèque dans le cycle infectieux des potyvirus ainsi que dans le processus d’adaptation. Notre approche a ainsi démontré que : i) le désordre est ubiquitaire chez le genre Potyvirus ; ii) les régions de désordre conservées chez plusieurs protéines de potyvirus semblent être associées à leur(s) fonction(s) pendant l'infection ; iii) les régions désordonnées sont généralement associées à moins de contraintes évolutives, suggérant ainsi leur implication dans les processus adaptatifs des potyvirus ; iv) les régions prédites comme désordonnées semblent privilégier l’apparition de mutations et donc la capacité d’un virus à accumuler de la diversité génétique au cours de l'évolution sur son hôte naturel ; v) ce travail a permis de corréler le taux en désordre de la protéine viral genome-linked (VPg) du Potato virus Y à sa capacité à s’adapter à la résistance récessive pvr23 du piment. / Proteins are essential actors involved in a majority of molecular and cellular processes. The features associated with the functions of these macromolecules have been recently questioned with the emergence of the intrinsic disorder concept. It defines the transitory or permanent lack of 3D structure in some proteins or regions as directly related to their functions. Among RNA viruses, the properties of disordered proteins may be linked to the ability of these microorganisms to hijack the host machinery by interacting with multiple partners, as well as to adapt to the multiple constraints they must face as obligatory parasites. This work focuses on the Potyvirus genus, which includes some of the most damaging plant pathogens studied to date. The goal of this thesis was to explore the functions associated with intrinsic disorder in the infectious cycle of this viral genus as well as in its process of adaptation. Our studies have shown that i) intrinsic disorder is ubiquitous in potyviruses; ii) intrinsically disordered regions (IDR) of some of potyviral proteins are likely to be associated with important functions for the viral cycle ; iii) IDR are generally less evolutionary constrained, suggesting an adaptive potential of these regions ; iv) predicted IDR seem to favor the appearance of mutations and therefore virus ability to accumulate genetic diversity during its evolution in natural host ; v) an experimental disorder modulation within the Viral genome-linked (VPg) protein has been demonstrated as positively correlated with the adaptive ability of the Potato virus Y to overcome the pvr23 recessive resistance in pepper.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Passion fruit (Passiflora edulis) and cowpea (Vigna unguiculata) are important crops of economical impact for the Northeast of Brazil. Fruit woodiness is an important virus disease of passion fruit, caused by Passionfruit woodiness virus (PWV) and Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV), both from the genus Potyvirus. CABMV is also responsible for important disease on cowpea. The present research had the objective to study and compare the biological, serological and molecular properties of isolates of CABMV obtained from passion fruit (CABMV-P Pet, CABMV-P Gua, CABMV-P Sb and CABMV-P Uba) and from cowpea (CABMV-C Fort and CABMV-C Bv). CABMV-C Fort and CABMV-C Bv were purified from infected cowpea cv. Pitiuba systemically infected. The obtained purified preparations presented concentrations of 16.4 mg of virus per mL (CABMV-C Bv) and 15.9 mg of virus per mL (CABMV-C Fort). Both purified virus preparations were used for rabbit immunizations to produce polyclonal antisera with reactive titers of 1:128.000 in PTA-ELISA. Electrophoresis analyses of the virus purified preparations revealed the presence of only one capsidial protein with molecular weight of 34 kDa for both virus isolates. Parts of the genomes, corresponding to the coat protein gene (cp), from the virus isolates obtained from cowpea and from passion fruit were amplified by RT-PCR. The philogenetic analyses of the amplified cDNA fragments grouped with the CABMV isolates sequences deposited in the GenBank, according to their original host. Based on the biological, serological and molecular results, the virus isolates studied were classified into two biotypes: Biotype Cowpea (CABMV-C) including CABMV-C Bv and CABMV-C Fort obtained from cowpea, and biotype Passion fruit (CABMV-P) including CABMV-P Pet, CABMV-P Gua, CABMV-P Sb and CABMV-P Uba obtained from passion fruit. Source of immunity to CABMV-C Bv and CABMV-C Fort was identified in cowpea and the genotype was designate Lab-Poty. Studies of virus interaction in cowpea demonstrated strong synergistic effect among CABMV-C, Cucumber mosaic virus (CMV) and Cowpea severe mosaic virus (CPSMV). / O maracujazeiro (Passiflora edulis) e o feijoeiro caupi (Vigna unguiculata) sÃo culturas de elevada importÃncia econÃmica para o Nordeste brasileiro. Entre as viroses que se manifestam no maracujazeiro, destaca-se o endurecimento dos frutos causado por Passionfruit woodiness virus (PWV) e Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV), ambos pertencentes ao gÃnero Potyvirus, sendo o CABMV responsÃvel por importante doenÃa do feijoeiro caupi. A presente pesquisa teve como objetivo estudar e comparar as propriedades biolÃgicas, sorolÃgicas e moleculares de isolados de CABMV obtidos de maracujazeiro (CABMV-P Pet, CABMV-P Gua, CABMV-P Sb e CABMV-P Uba) e isolados obtidos de feijoeiro caupi (CABMV-C Fort e CABMV-C Bv). Os isolados CABMV-C Fort e CABMV-C Bv foram purificados a partir de plantas de feijoeiro caupi cv. Pitiuba sistemicamente infetadas. As preparaÃÃes purificadas obtidas apresentaram concentraÃÃes de 16,4 mg de vÃrus por mL (CABMV-C Bv) e 15, 9 mg de vÃrus por mL (CABMV-C Fort), as quais foram usadas na imunizaÃÃo de coelhos, para a produÃÃo de antissoros policlonais, com tÃtulo de 1:128.000 em PTA-ELISA. AnÃlises eletroforÃtica das preparaÃÃes virais revelaram uma Ãnica proteÃna capisidial com peso molecular de 34 kDa. Partes do genoma correspondente ao gene da capa protÃica (cp) dos isolados virais obtidos de feijoeiro caupi e de maracujazeiro foram amplificadas por RT-PCR. AnÃlises filogenÃticas dos fragmentos dos cDNA amplificados se agruparam com sequencias de isolados do CABMV depositadas no GenBank, de acordo com os hospedeiros originais. Com base nos resultados de estudos biolÃgicos, sorolÃgicos e moleculares, os isolados virais estudados foram classificados em dois biÃtipos: BiÃtipo Cowpea (CABMV-C) incluindo CABMV-C Bv and CABMV-C Fort obtidos de feijoeiro caupi e biÃtipo Passion fruit (CABMV-P) incluindo CABMV-P Pet, CABMV-P Gua, CABMV-P Sb e CABMV-P Uba obtidos de maracujazeiro. Fontes de imunidade a CABMV-C Bv e CABMV-C Fort foi identificada em feijoeiro caupi e o genÃtipo foi designado de Lab-Poty. Estudos de interaÃÃo viral em feijoeiro caupi, mostraram forte sinergismo entre CABMV-C, Cucumber mosaic virus (CMV) e Cowpea severe mosaic virus (CPSMV).

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de NÃvel Superior / Plant virus identification and characterization can be achived by several methods based in the biological, morphological, cytological, serological and molecular virus properties. The molecular properties have been used with frequency for vÃrus identification and characterization and the reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) has constituted an efficient and precise method for researches with RNA plant viruses. On the other hand, the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is the most used serological method for virus detection in plant tissues. A techncal innovation developed for plant virus identification represents a great technological development and support for plant virus research. A new approach involving virus particle immune precipitation to be used for RNA amplification by RT-PCR named IP-RT-PCR was sucessefuly used for amplification of RNA fragments from five virus species from the genera Comovirus, Cucumovirus, Potyvirus and Sobemovirus. Considering that the immune biological Companies have developed several DAS-ELISA kits, but neither of them produce and commercialize PTA-ELISA kits, a simple and practical PTA-ELISA kit was developed and validated for plant virus detection. The second part of the research had the objective to study, comparatively, the biological, serological and molecular properties of four plant virus isolates obtained from naturally infected Passiflora edulis (PWV-PET and PWV-GUA) and from naturally infected Vigna unguiculata (CABMV-BV and CABMV-FOR) with the objective to elucidate the identity of the causal agent of passion fruit woodiness in Brazil. In host range studies onle Canavalia ensiformes and Macroptilium lathyroides were infected by virus isolates obtained from cowpea and from passion fruit. The isolate PWV-GUA was purified from systemically infected M. lathyroides plants and the virus purified preparation (18.24 mg of virus.ml-1) was used for rabitt immunization for polyclonal antiserum production, which showed a title of 1:128,000 in PTA-ELISA. The electrophoresis analysis of the purified virus showed a unique capsidial protein with 34 kDA. Plant virus interaction studies in C. ensiformis indicated unilateral cross protection between PWV-GUA and CABMV-FOR. On the other hand, the isolate PWV-PET did not cross protect passion fruit plants against PWV-GUA. Filogenetic analysis of nucleotiode sequencies from cDNA fragments corresponding to coat protein (CP) genes amplified by IP-RT-PCR from the genomic virus isolates compared with virus sequencies from the Genbank grouped according to the host specifities. Based on the biological, serological and mainly molecular results, the virus isolates studied were classified into two biotypes: Biotype CABMC-C (Cowpea) to include isolates obtained from cowpea that do not infect passion fruit, and biotype CABMV-P (Passion fruit) to include the virus isolates responsible for the passion fruit woodiness in Brazil. / A identificaÃÃo e a caracterizaÃÃo de vÃrus de planta podem ser realizadas por vÃrios mÃtodos envolvendo propriedades morfolÃgicas, biolÃgicas, citolÃgicas, moleculares e sorolÃgicas. As tÃcnicas moleculares tÃm sido usadas com frequencia para identificaÃÃo e caracterizaÃÃo de vÃrus, e a tÃcnica de âreverse transcription polymerase chain reactionâ (RT-PCR) tem se constituÃdo em mÃtodo eficiente e preciso para pesquisas com vÃrus de planta com genoma de RNA. De outra parte, a tÃcnica de enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) constitui o mÃtodo sorolÃgico mais usado para detecÃÃo de vÃrus em tecidos vegetais. Uma inovaÃÃo tecnolÃgica desenvolvida nesta pesquisa para diagnose de vÃrus de planta representa grande avanÃo tecnolÃgico e suporte para pesquisa em virologia vegetal. A inovaÃÃo envolvendo a imunoprecipitaÃÃo (IP) de partÃculas de vÃrus para uso na RT-PCR denominada de IP-RT-PCR foi usada com sucesso para amplificaÃÃo de fragmentos de RNA de cinco espÃcies de vÃrus dos gÃneros Comovirus, Cucumovirus, Potyvirus e Sobemovirus. Considerando que kits de DAS-ELISA tÃm sido produzidos e comercializados por companhias de imunobiologicos, mas nenhuma companhia produz kits de PTA-ELISA, um kit simples e prÃtico de PTA-ELISA foi desenvolvido e validado para detecÃÃo de vÃrus de planta. A segunda etapa da pesquisa teve como objetivo estudar as propriedades biolÃgicas, sorolÃgicas e moleculares de isolados de vÃrus do gÃnero Potyvirus obtidos de maracujazeiro (Passiflora edulis) (PWV-PET e PWV-GUA) e isolados de Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV-FOR e CABMV-BV) obtidos de feijoeiro caupi (Vigna unguiculata), visando elucidar a identidade do agente causal do endurecimento dos frutos do maracujazeiro no Brasil. Em estudos de gama de plantas hospedeiras, somente Canavalia ensiformis e Macroptilium lathyroides foram infetadas por isolados obtidos de maracujazeiro e de feijoeiro caupi. O PWV-GUA foi purificado a partir de plantas de M. lathyroides sistemicamente infetadas e a preparaÃÃo viral purificada (18,24 mg de vÃrus.ml-1) foi usada para imunizaÃÃo de coelho com a produÃÃo de antissoro policlonal com tÃtulo de 1:128.000 em PTA-ELISA. AnÃlise eletroforÃtica da preparaÃÃo viral purificada revelou uma Ãnica proteÃna capisidial com peso molecular de 34 kDa. Experimentos de interaÃÃo entre os isolados virais em C. ensiformis indicaram proteÃÃo unilateral entre PWV-GUA e CABMV-FOR. De outra parte, o isolado PWV-PET nÃo protegeu plantas de maracujazeiro contra a super infecÃÃo de PWV-GUA. AnÃlises filogenÃticas das seqÃÃncias dos fragmentos de cDNA correspondentes Ãs capas protÃicas (CP), amplificados a partir dos genomas dos isolados virais de maracujazeiro e de feijoeiro caupi por IP-RT-PCR, agruparam-se com as seqÃÃncias de isolados virais de referidas culturas depositadas no GenBank, apresentando um agrupamento em funÃÃo da especificidade de hospedeiros. Com base nos resultados dos estudos biolÃgicos, sorolÃgicos e, sobretudo moleculares, os isolados virais estudados foram classificados em dois biÃtipos: BiÃtipo CABMV-C (Cowpea) incluindo os isolados obtidos de feijoeiro caupi e biÃtipo CABMV-P (Passion fruit) para incluir os isolados responsÃveis pelo endurecimento dos frutos do maracujazeiro no Brasil.

No Brasil, doenças causadas pelo Papaya ringspot virus - type Watermelon (PRSV-W) e Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) reduzem a produção e a qualidade dos frutos de abobrinha-de-moita (Cucurbita pepo) e melancia (Citrullus lanatus), assim como em outras cucurbitáceas. O objetivo deste trabalho foi a obtenção de plantas transgênicas de abobrinha-de-moita e melancia resistentes ao PRSV-W e ao ZYMV. Um sistema eficiente de regeneração in vitro é necessário para a obtenção de plantas transgênicas. O sistema de organogênese in vitro de abobrinha-de-moita foi desenvolvido utilizando como explantes a região basal do cotilédone e um segmento do hipocótilo obtidos a partir de sementes germinadas in vitro. Os explantes foram cultivados em meio de cultura MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962), suplementado com diferentes concentrações de BAP (benzilaminopurina). A indução de gemas adventícias foi mais eficiente nas concentrações de 1,0 e 1,25 mg/L de BAP. Este protocolo foi usado para regenerar plantas em experimentos de transformação genética de abobrinha-de-moita cv. Caserta e melancia cv. Crimson Sweet, via Agrobacterium tumefaciens. O vetor binário pCAMBIA2201, contendo fragmentos dos genes da proteína capsidial do ZYMV e do PRSV-W, numa construção gênica do tipo hairpin e o gene de seleção nptII, sob controle do promotor 35S, foi usado nos experimentos de transformação genética. Após 2 dias de co-cultivo, em meio de cultura MS, suplementado com BAP (1 mg/L), os explantes foram transferidos para meio de cultura de seleção, suplementado com BAP (1 mg/L), timentin (400 mg/L) e canamicina (100 mg/L) e cultivados por 3 a 4 semanas, sob fotoperíodo de 16 horas de luz. Plantas regeneradas foram analisadas por PCR, usando primers específicos para detecção dos fragmentos dos genes da proteína capsidial do PRSV-W e ZYMV. Foram utilizados 1050 explantes de abobrinha-de-moita e de 973 explantes de melancia, resultando em 36 e 59 plantas PCR positivas, respectivamente. A eficiência de transformação foi de 3,4% para abobrinha-de-moita e 6,1% para melancia. Plantas PCR positivas foram aclimatizadas, gradualmente, em sala de luz e transferidas para casa-de-vegetação. Pela análise de Southern blot foi confirmada a integração dos fragmentos dos genes da proteína capsidial do ZYMV e PRSV-W em 3 plantas de abobrinha-de-moita. Depois de desenvolvidas, flores femininas foram polinizadas manualmente e sementes foram coletadas de frutos maduros. Plantas R1 de abobrinha-de-moita e melancia foram inoculadas com o PRSV-W e o ZYMV por meio de Myzus nicotianae virulíferos. Não foram identificadas, até o momento, plantas resistentes aos patógenos em estudo / Diseases caused by the potyviruses Papaya ringspot virus - type Watermelon (PRSV-W) and Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) significantly reduce the yield and fruit quality of zucchini squash (Cucurbita pepo), watermelon (Citrullus lanatus), as well as other cucurbit crops in Brazil. The purpose of this work was to obtain zucchini squash and watermelon transgenic plants resistant to PRSV-W and ZYMV. An efficient in vitro regeneration system which can be associated with the protocol is necessary to obtain transgenic plants. In vitro organogenesis system was successfully developed using comprised of distal region of hypocotyl and the base of cotyledon of a germinated seed. The explants were cultured in MS medium (MURASHIGE; SKOOG, 1962), supplemented with different concentraction of BAP (benzylaminopurine). The induction of adventitious buds was more efficient at concentrations of 1.0 and 1.25 mg.L-1 BAP. This protocol was used to regenerate plants from genetic transformation experiments with zucchini squash cv. Caserta and watermelon cv. Crimson Sweet via Agrobacterium tumefaciens. For transformation, the binary vector pCAMBIA 2201, containing sequences of the coat protein coding regions of ZYMV and PRSV-W in a hairpin construct and the nptII gene, driven by 35S promoter was used. After 2 days of co-culture in MS medium supplemented with BAP (1.0 mg.L-1), explants were transferred to the MS selection culture medium, supplemented with BAP (1.0 mg.L-1), timentin (400 mg.L-1) and kanamycin (100 mg.L-1), and incubated for 3 to 4 weeks at 27 oC, under 16 h photoperiod. Regenerated plants were analyzed by PCR, using specific pairs of primers for the detection of the coat protein gene segments of PRSV-W and ZYMV. A total of 1,050 zucchini squash and 973 watermelon explants were used in the transformation experiments, resulting in 36 and 59 PCR positive plants, respectively. The genetic transformation efficiency was 3.4% for zucchini squash and 6.1% for watermelon. The PCR positive plants were slowly acclimatized in the culture room and transferred to the greenhouse for further growth. Southern blot analysis confirmed the genome integration of the the ZYMV and PRSV-W coat protein gene fragments in three zucchini squash plants which survived the acclimatization step. Later in development, female flowers were were manually pollinated and seeds were collected from mature fruits. R1 transgenic zucchini squash and watermelon plants were inoculated with PRSV-W and ZYMV by means of viruliferous Myzus nicotianae. Resistant plants were not yet observed among the R1 plants available