L’objectif général de cette thèse a été d’étudier le potentiel de billes à base de molécules d’α-cyclodextrine et d’huile de soja, pour l’administration orale de principes actifs peu solubles dans l’eau.Nous avons tout d’abord vérifié qu’il était possible d’encapsuler dans les billes des molécules actives (la progestérone et l’indométacine) autres que les rétinoïdes et le diazépam, avec une teneur élevée et un rendement de fabrication satisfaisant. L’étude du comportement des billes nues lyophilisées, en termes de stabilité et de libération dans des milieux digestifs simulés, nous a permis de proposer un mécanisme de libération de la molécule encapsulée qui se déroule en plusieurs étapes: i) hydratation des billes, ii) dissolution de la matrice hydrophile d’α-cyclodextrine, iii) libération de gouttelettes d’huile contenant le principe actif puis de la fraction dissoute dans l’huile par un phénomène de partage, iiii) fragmentation des billes fragilisées et libération totale de l’huile. La présence de sels biliaires dans le milieu, accélère à la fois la libération et la quantité dissoute, en fragilisant les billes et en réduisant la valeur du coefficient de partage du principe actif entre l’huile et le milieu digestif. Nous avons montré in vitro et in vivo qu’il est possible de moduler la libération d’un principe actif à partir d’une même formulation de départ, en jouant sur l’organisation du système (émulsion sèche, billes nues, billes coquées par un nouvel ajout d’α-cyclodextrine sur les billes nues). Les études in vivo chez le rat ont révélé que l’émulsion sèche se comporte comme une forme à libération immédiate, les billes coquées comme une forme à libération prolongée et les billes nues comme une forme à libération intermédiaire. Enfin, la libération du principe actif encapsulé peut également être modulée en modifiant le mode de séchage des billes. Comparativement à la lyophilisation, le séchage à l’étuve modifie les propriétés des billes en augmentant leur résistance dans les milieux digestifs simulés et prolonge la libération de la molécule encapsulée. / The general aim of this thesis was the study of the potential of beads, made of α-cyclodextrin and soybean oil, for the oral delivery of poorly water soluble drugs. We have first verified that it was possible to encapsulate in beads, active molecules (progesterone and indomethacin), other than retinoid and diazepam, with a high drug loading and a satisfying yied. The study of the behaviour of freeze-dried naked beads, in terms of stability and drug release in simulated gastro-intestinal fluids, allowed to propose a mechanism for the release of the encapsulated drug, involving several steps: i) hydration of the freeze-dried beads, ii) dissolution of α-CD hydrophilic matrix, iii) release of oily droplets containing the active drug and then of the fraction of drug dissolved in oil, following a partition phenomenon, iiii) fragmentation of the weakened beads and at last the total release of oil. The presence of bile salts in the medium accelerates both the release and the dissolved amount, by weakening the beads and reducing the partition coefficient value of the active molecule between oil and digestive medium.We have shown in vitro as well as in vivo that it is possible to modulate the release of a model drug from the same initial formulation, according to the degree of organization of the system (dry emulsion, naked beads, coated beads obtained by an additional amount of α-cyclodextrine to the preformed naked beads). In vivo studies in rats have highlighted that dry emulsion behaves as a fast release formulation, the coated beads as a sustained release formulation and the naked beads as an intermediate one. Finally, the release of the encapsulated drug can also be modulated by modifying the drying method of the beads. Compared to freeze-drying, oven-drying modifies the properties of the beads by increasing their resistance in simulated gastro-intestinal fluids and sustaining the release of the encapsulated drug.

Neste trabalho foram realizados estudos de reações de bio-oxidação dos esteroides Progesterona e 17α-Etinilestradiol por fungos de ambiente marinho. Para a Progesterona foi feita uma triagem de reações com os caldos enzimáticos e as massas miceliais dos fungos Aspergillus sydowii CBMAI 934, Aspergillus sydowii CBMAI 935, Penicilium oxalicum CBMAI 1185 e Penicilium citrinum CBMAI 1186. Para as reações envolvendo os fungos A. sydowii CBMAI 935, P. oxalicum CBMAI 1185 e P. citrinum CBMAI 1186 os produtos majoritários observados foram os metabólitos Testosterona e Testololactona, produtos de oxidação da Progesterona promovida por enzimas do tipo Baeyer-Villiger monoxigenases. Para as reações envolvendo o fungo A. sydowii CBMAI 934 foram observados produtos de hidroxilação da Progesterona em carbonos do núcleo esteroidal não ativados eletronicamente, sendo produtos de oxidação da Progesterona promovida por enzimas do citocromo P-450. Da triagem foram selecionados os fungos A. sydowii CBMAI 934 e A. sydowii CBMAI 935 para executar reações de bio-oxidação em quintuplicatas (32ºC, 130 rpm, pH 7,4) utilizando o caldo enzimático e a massa micelial para isolamento e caracterizações espectroscópicas (RMN, EMAR e IV) e polarimétricas dos produtos majoritários. Após 14 dias de reação com o caldo enzimático do fungo A. sydowii CBMAI 934 foi isolado a 7,15-di-Hidroxiprogesterona com 13 % de rendimento em massa. Contudo não foi possível determinar com exatidão a configuração relativa dos grupos hidroxilas. Já para a reação com a massa micelial do fungo A. sydowii CBMAI 934 após 14 dias de reação foi isolado o produto 15β-Hidroxiprogesterona com 58% de rendimento em massa. Após 7 dias de reação com o caldo enzimático do fungo A. sydowii CBMAI 935 foram isolados os produtos Testosterona e Testololactona com rendimentos em massa de 24% e 36%, respectivamente. A Testololactona também foi isolada da reação com a massa micelial do fungo A. sydowii CBMAI 935 após 7 dias com rendimento em massa de 87%. Para o 17 α-Etinilestradiol foi feita uma triagem com os mesmos fungos utilizados na triagem das reações com a Progesterona, exceto com o fungo A. sydowii CBMAI 934. Após 7 dias de reação e nas mesmas condições das reações com a Progesterona, não foram observados produtos de biotransformação do 17 α-Etinilestradiol. Este estudo envolvendo a bio-oxidação da Progesterona mostra o potencial de biotransformação de fármacos esteroidais no meio ambiente. / In this work was performed bio-oxidation studies of steroids progesterone and 17α-ethynylestradiol by marine-derived fungi. For progesterone was performed a reactions screening with culture broth and micelia from Aspergillus sydowii CBMAI 934, Aspergillus sydowii CBMAI 935, Penicilium oxalicum CBMAI 1185 e Penicilium citrinum CBMAI 1186. For reactions using A. sydowii CBMAI 935, P. oxalicum CBMAI 1185 e P. citrinum CBMAI 1186 the majoritarian products obtained were testosterone and testololactone, products from progesterone oxidation by Baeyer-Villiger mono-oxygenases enzymes. For reactions using A. sydowii CBMAI 934 was observed hydroxylation products from progesterone in carbons of progesterone by eletronic factors. The enzymes than promoted the hydroxylation of the progesterone were of citochrome P-450 group. From screening was selected A. sydowii CBMAI 934 and A. sydowii CBMAI 935 for quintuplicate bio-oxydations (32ºC, 130 rpm, pH 7,4) using the culture broth and micelia for isolation and spectroscopicals caracterizations (NMR, HRMS and IR) and polarimetrics of majoritary products. After 14 days, the reaction with culture broth from A. sydowii CBMAI 934 was isolated 7,15-dihydroxyprogesterone with 13% yield. But, the configurations of hydroxy groups were not possible to determine. Already for reaction with micelia from A. sydowii CBMAI 934 was isolated 15β-hydroxyprogesterone with 58% yield. After 7 days the reaction with culture broth from A. sydowii CBMAI 935 was isolated the testosterone and testololactone with 24% and 36% yields, respectively. The Testololactone also was isolated from reaction with micelia from A. sydowii CBMAI 935 after 7 days with 87% yield. For 17α-ethynylestradiol was performed a screening with same fungi used in reaction screening with Progesterone, except the A. sydowii CBMAI 934. After 7 days in same condictions of reactions with Progesterone, It was not observed products from 17α-ethynylestradiol. This study involving the bio-oxidation from Progesterone showed the potential of biontrasnformations steroidal drugs in environment.

A perimenopausa é caracterizada como o período de transição da vida reprodutiva para a não reprodutiva em mulheres, e inicia-se com o aparecimento dos sintomas clínicos, prolongandose até um ano após a última menstruação. Esta fase é caracterizada pela ocorrência de ciclos menstruais irregulares, alterações na produção hormonal, bem como por mudanças comportamentais, neuroendócrinas e metabólicas, sendo o período de maior vulnerabilidade a desordens afetivas quando comparado às outras fases da vida. Apesar dos diversos estudos desenvolvidos acerca das manifestações destes sintomas durante a perimenopausa, ainda pouco se sabe a respeito das modificações na atividade do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HPA) e da resposta ao estresse. O reagente químico diepóxido de 4-vinilciclohexeno (VCD) acelera o processo natural de atresia folicular, possibilitando estudos desta fase da vida reprodutiva. Assim sendo, sua aplicação em roedores constitui um excelente modelo experimental capaz de simular em animais o que ocorre durante a perimenopausa. Assim, os objetivos deste trabalho foram avaliar, neste modelo animal de perimenopausa: 1) as respostas endócrinas (corticosterona e progesterona) e neuroniais (atividade das subdivisões parvocelulares medial e posterior - PaMP e PaPo do núcleo paraventricular do hipotálamo (PVN) e do locus coeruleus - LC) ao estresse de contenção e 2) a influência da terapia hormonal sobre estas respostas. Para tanto, ratas Wistar receberam injeções subcutâneas de Óleo ou VCD por 15 dias consecutivos, a partir do 28° dia de vida. Ao redor do 56º ao 66º dia do início da administração de Óleo ou VCD, as ratas dos grupos a serem estressados receberam implantes subcutâneos de um pellet contendo placebo (PL), estradiol (E2), progesterona (P4) ou estradiol+progesterona (E2P4). O estresse de contenção foi aplicado por 30 minutos entre 09:00h e 10:00h na fase do diestro, ou 20 dias após o início da terapia hormonal (grupos VCD+E2, VCD+P4 e VCD+E2P4), de 75 a 85 dias após o início da administração de VCD/Óleo. O sangue foi coletado imediatamente (0min) e 60min após o final do estresse, quando os animais foram anestesiados e perfundidos para obtenção do tecido cerebral e posterior estudo imunohistoquímico das áreas de interesse. As concentrações basais de corticosterona foram semelhantes entre os grupos Óleo e VCD não estressadas. Contudo, asecreção de corticosterona em resposta ao estresse das ratas em periestropausa foi 72% menor que a do grupo controle. As concentrações basais de progesterona das ratas em periestropausa foram menores do que aquelas das ratas controles, mas o aumento da secreção deste hormônio induzido pelo estresse agudo por contenção não foi diferente entre os grupos. Centralmente, nas subdivisões PaMP e PaPo do PVN, assim como no LC, o número de neurônios c-Fos positivos expressos não foi diferente entre ratas VCD e óleo e o estresse aumentou de maneira semelhante o número de neurônios ativados em ambos os grupos. A secreção de corticosterona de animais em periestropausa tratados com estradiol, associado ou não à progesterona, foi ainda mais atenuada. Por outro lado, nas ratas tratadas com progesterona, as concentrações de corticosterona após o estresse mostraram-se mais elevadas que as do grupo VCD estressado sem tratamento hormonal. Todos os grupos tratados com hormônios aumentaram a secreção de progesterona em resposta ao estresse, no entanto esta resposta foi amplificada pelo estradiol. Nenhum dos tratamentos hormonais modificou a atividade neuronial após o estresse na PaMP, embora todos tenham atenuado esta resposta na PaPo. No LC, todos os tratamentos bloquearam o aumento de atividade neuronial induzida pelo estresse. Uma hora após o final do estresse, as concentrações de corticosterona e progesterona retornaram aos níveis basais observados nas ratas não estressadas. No entanto, nos grupos tratados com estradiol, os níveis de progesterona não retornaram aos basais, sendo estes níveis significantemente maiores após o fim do estímulo. Em conjunto, nossos resultados demonstram que na periestropausa, embora a secreção de progesterona em resposta ao estresse esteja preservada, a capacidade da adrenal em secretar corticosterona está reduzida. Esta redução parece não estar associada à deficiência central no funcionamento do eixo HPA (PVN) ou do sistema simpático central (LC), mas sim, a disfunções na esteroidogênese adrenal, que foram parcialmente corrigidas pela progesterona exógena. A diminuição da atividade neuronial do LC pelos esteróides ovarianos sugere uma possível atenuação do tônus simpático por estes hormônios. Ainda, a capacidade de recuperação pós-estresse da secreção de corticosterona e de progesterona se mostrou preservada neste modelo experimental. / Perimenopause is characterized as the period of transition from reproductive to nonreproductive life in women, and begins with the onset of clinical symptoms, lasting up to one year after the last menstrual period. This phase is characterized by irregular menstrual cycles, alterations in hormonal production, as well as by behavioral, neuroendocrine and metabolic changes, and increased vulnerability to affective disorders when compared to other phases of life. Despite the various studies on the manifestations of these symptoms during perimenopause, little is known about the changes in hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis activity and the response to stress. The chemical reagent diepoxide 4-vinylcyclohexene (VCD) accelerates the natural process of follicular atresia, enabling studies of this phase of reproductive life. Therefore, its application in rodents constitutes an excellent experimental model capable of simulating in animals what occurs during perimenopause. Thus, the objective of this study was to evaluate, in an animal model of perimenopause: 1) the endocrine responses (corticosterone and progesterone) as well as the neuronal response (parvocellular subdivisions of PVN, medial- PaMP) and posterior-PaPO and locus coeruleus - LC) to restraint stress and 2) the influence of hormonal therapy on these responses. Female Wistar rats received subcutaneous injections of Oil or VCD for 15 consecutive days, from the 28th day of life. Around the 56th to 66th day of the onset of Oil or VCD administration, the rats of the groups to be stressed received subcutaneous implants of a pellet containing placebo (PL), estradiol (E2), progesterone (P4) or estradiol + progesterone (E2P4 ). Restraint stress was applied for 30 minutes between 09:00 and 10:00 in the diestrus phase, or 20 days after the onset of hormonal therapy (VCD + E2, VCD + P4 and VCD + E2P4 groups), from 75 to 85 days after starting VCD / Oil administration. The blood was collected immediately (0min) and 60min after the end of stress, when the animals were anesthetized and perfused to take the brain for immunohistochemistry of PVN and LC. Basal corticosterone concentrations were similar between the non-stressed Oil and VCD groups. However, corticosterone secretion in response to stress was 72% lower than that of the control group. The basal progesterone concentrations of periestropausal rats were lower than those of the control rats, but the increase in the secretion of this hormone induced by stress was not different between thegroups. Centrally, in the PaMP and PaPO subdivisions of PVN as well as LC, the number of c-Fos positive neurons expressed was not different between VCD and Oil rats and the stress increased similarly the number of activated neurons in both groups. Corticosterone secretion from estradiol-treated periestropause rats, associated or not with progesterone, was further attenuated. On the other hand, in rats treated with progesterone, post-stress corticosterone concentrations were higher than those in the stressed VCD group without hormonal treatment. All groups treated with hormones increased progesterone secretion in response to stress, however this response was amplified by estradiol. None of the hormone treatments modified neuronal activity after stress in PaMP, although all hormone treatment attenuated this response in PaPo. In the LC, all treatments blocked the increase of neuronal activity induced by stress. One hour after the end of stress, corticosterone and progesterone concentrations returned to the baseline levels observed in the non-stressed rats. However, in the estradioltreated groups, progesterone levels did not return to the basal levels, these levels being significantly higher after the end of the stimulus. Taken together, our results demonstrate that in periestropause, although progesterone secretion in response to stress is preserved, the ability of the adrenal to secrete corticosterone is reduced. This reduction appears not to be associated with a central deficiency in HPA axis (PVN) or central sympathetic (LC) function, but rather to dysfunctions in adrenal steroidogenesis, which have been partially corrected by exogenous progesterone. The reduction of neuronal LC activity by ovarian steroids suggests a possible attenuation of sympathetic tone by these hormones. Furthermore, the post-stress recovery capacity of corticosterone and progesterone secretion seems to be preserved in this experimental model.

Introdução: A endometriose é uma doença ginecológica comum caracterizada pela presença de estroma e/ou glândula endometrial fora da cavidade uterina, e que não possui sua etiopatogenia bem estabelecida. A transição epitélio-mesênquima (TEM) é um processo que consiste em uma série de mudanças no fenótipo de células epiteliais que fazem com que estas células assumam características de células mesenquimais. Assim como observado na TEM, as células endometriais no contexto da endometriose apresentam capacidade migratória, invasibilidade e elevada resistência à apoptose. As moléculas de adesão têm adquirido crescente relevância na TEM, pois relacionam-se à perda de adesão célula-célula com o aumento da invasão e metástase. O objetivo deste estudo foi investigar a expressão de marcadores relacionados com a TEM na endometriose superficial, ovariana e profunda. Pacientes e Métodos: Foram selecionadas 103 mulheres que preenchiam os critérios de inclusão estabelecidos, constituindo 2 grupos de estudo independentes entre si: 18 mulheres com endometriose peritoneal, ovariana e profunda concomitantes; 85 mulheres com endometriose ovariana e/ou profunda, dividido em 44 mulheres com endometriose ovariana e 41 com endometriose intestinal. Através de reações de imunoistoquímica, a expressão proteica dos marcadores e-caderina, n-caderina, betacatenina, receptor de estrogênio e receptor de progesterona foram avaliados nos tecidos de interesse em cada grupo de estudo. Além dos locais de doença, as mulheres foram avaliadas quanto à relação com a fase do ciclo e à classificação histológica da doença. Resultados: As lesões de endometriose de ovário mostraram uma menor expressão de n-caderina em comparação às lesões de intestino e peritônio (p=0,032). O receptor de estrogênio e receptor de progesterona se mostraram significativamente menos expressos no componente epitelial da doença de ovário do que no epitélio da endometriose de peritônio e intestino (p=0,002; p=0,48). A expressão da n-caderina apresentou uma correlação direta com a expressão do receptor de estrogênio no estroma da endometriose de intestino (p=0,036). Conclusão: Estes resultados sugerem que a transição epitélio-mesênquima esteja envolvida na etiopatogenia da endometriose, demonstrando que a doença de ovário se comporta de maneira diferente da doença superficial e da doença infiltrativa profunda, sendo a n-caderina um importante fator envolvido neste processo possivelmente influenciada pela ação do estrogênio / Background: Endometriosis is a common gynecological disease defined as the presence of ectopic endometrial glands and stroma outside the uterine cavity, and its pathogenesis is not well established. The epithelial to mesenchymal transition (EMT) is a process consisting of a series of changes in the phenotype of epithelial cells that make these cells assume the characteristics of mesenchymal cells. As observed in the EMT, endometrial cells in the context of endometriosis have the capacity of migration, invasiveness and high resistance to apoptosis. . The adhesion molecules have become progressively relevant in EMT, in view of the cell-to-cell adhesion loss, with increased invasion and metastasis. The goal of this study was to investigate the expression of markers related to EMT in superficial, ovarian and deep endometriosis. Patients and Methods: 103 women were selected who met the inclusion criteria, constituting two independent study groups: 18 women with peritoneal, ovarian and deep concomitant endometriosis, 85 women with ovarian and / or deep endometriosis, divided in 44 women with ovarian endometriosis and 41 with intestinal endometriosis. Through immunohistochemical reactions, the protein expression of e-cadherin, ncadherin, beta-catenin, estrogen receptor and progesterone receptor markers were evaluated in tissues of interest in each study group. In addition to the sites of the disease, menstrual phase and histological classification (well-differentiated, undifferentiated, mixed pattern and stromal) of the disease were recorded. Results: The ovarian endometrisis showed less n-cadherin marker than lesions of the peritoneum and bowel (p=0,032). Ovarian endometriosis also showed markedly decreased expression of estrogen and progesterone receptors in epithelial cells, compared with peritoneal and deep endometriosis (p=0,002; p=0,48). The expression of N-cadherin showed a direct correlation with estrogen receptor expression in the stroma of bowel endometriosis (p = 0.036). Conclusion: These results suggest that epithelial to mesenchymal transition involved in the pathogenesis of endometriosis, demonstrating that the ovary disease behaves differently disease than peritoneal and deep disease, so that the n-cadherin is an important factor involved in this process, possibly influenced by the action of estrogen

Apesar do estudo exaustivo do transporte mucociliar nasal, ainda há dados controversos sobre a influência direta dos hormônios sexuais femininos nesse mecanismo. O presente estudo teve por objetivos: 1. avaliar o transporte mucociliar nasal de sacarina nos sexos masculino e feminino, comparando-o nas fases folicular, periovulatória e lútea de ciclos ovarianos consecutivos e 2. identificar a expressão e a localização dos receptores para estrógeno e progesterona na mucosa nasal humana em conchas nasais inferiores de indivíduos dos sexos masculino e feminino na idade reprodutiva. O transporte mucociliar nasal de sacarina foi avaliado prospectivamente em 14 voluntários não fumantes, sem queixas nasais, com idades entre 15 e 30 anos (7 homens e 7 mulheres, com média de idade 23,5 anos). Nas mulheres, o transporte mucociliar nasal de sacarina foi medido nas fases folicular, periovulatória e lútea durante dois ciclos ovarianos consecutivos (em cinco casos) ou três ciclos consecutivos (em dois casos). Nos homens, o transporte mucociliar nasal de sacarina foi avaliado em medidas repetidas aleatoriamente três vezes (em dois casos) ou seis vezes (em cinco casos). A expressão dos receptores para estrógeno e progesterona na mucosa nasal humana foi avaliada por método imunohistoquímico, de modo retrospectivo, em conchas nasais inferiores conservadas em formaldeído e fixadas na parafina, arquivadas após a cirurgia de turbinectomia parcial da concha inferior a que foram submetidos 20 pacientes da mesma faixa etária dos voluntários (10 pacientes do sexo masculino e 10 do sexo feminino, com idades entre 15 e 33 anos, média de idade 22,1 anos). Para a imuno-histoquímica utilizaram-se anticorpos monoclonais de camundongo contra receptores para estrógeno (clone 6F11, Novocastra) e para progesterona (clone 16, Novocastra) separadamente. Não houve diferenças significativas no transporte mucociliar nasal de sacarina entre as fases folicular, periovulatória e lútea em ciclos ovarianos consecutivos, nem entre os sexos (p=0,08). Entretanto, considerando-se apenas o primeiro ciclo ovariano, o transporte mucociliar nasal de sacarina foi mais rápido durante a fase folicular (p=0,03). Os receptores para estrógeno e progesterona foram encontrados no citoplasma das glândulas serosas da lâmina própria exclusivamente no sexo masculino (6/10 homens e 3/10 homens respectivamente). Concluindo, o estrógeno e a progesterona não influenciaram as medidas repetidas do transporte mucociliar nasal de sacarina em indivíduos sem queixas nasais. Contudo, os receptores para estrógeno e progesterona foram encontrados nas glândulas seromucosas da lâmina própria no sexo masculino, indicando que ambos os hormônios poderiam agir diretamente sobre a produção do muco nasal. / Although nasal mucociliary clearance has been thoroughly studied, there is controversial evidence that it is directly influenced by female sex hormones. This study focused on: 1. evaluating saccharin nasal mucociliary transport in both sexes and during the follicular, periovulatory and luteal phases of consecutive ovarian cycles, and 2. identifying the expression and localisation of estrogen and progesterone receptors in human nasal mucosa from inferior turbinates of patients in reproductive age. Saccharin nasal mucociliary transport was prospectively evaluated in 14 nonsmoking healthy volunteers aged 15 to 30 years (7 males and 7 females, mean age 23.5 years) who had no nasal complaints. In females, saccharin nasal mucociliary transport was measured in the follicular, periovulatory and luteal phases during two consecutive ovarian cycles (five cases) or three consecutive cycles (two cases). In males, the saccharin nasal mucociliary transport was randomly repeated three times (two cases) or six times (five cases). Estrogen and progesterone receptor expression in human nasal mucosa was retrospectively assessed by immunohistochemistry in archival, formalin-fixed, paraffin-embedded inferior nasal conchae from 20 patients submitted to partial inferior turbinectomy whose ages were matched to their of the volunteers (10 male and 10 female patients aged 15 to 33 years, mean age 22.1 years). Immunohistochemistry used mouse monoclonal antibodies against estrogen receptor (6F11 clone, Novocastra) and progesterone receptor (16 clone, Novocastra) separately. There were no significant differences in saccharin nasal mucociliary transport among follicular, periovulatory and luteal phases in consecutive ovarian cycles, nor between sexes (p=.08). Even though, considering the first ovarian cycle only, saccharin nasal mucociliary transport was faster during the follicular phase (p=.03). Estrogen and progesterone receptors were found in the cytoplasm of serous glands of the lamina propria exclusively in males (6/10 males and 3/10 males respectively). In conclusion, estrogen and progesterone did not influence repeated measures of saccharin nasal mucociliary transport in males and females with no nasal complaints. Nevertheless, estrogen and progesterone receptors were found in seromucous glands of the lamina propria in males, indicating that both hormones might act directly over nasal mucus production

Neste trabalho foram realizados estudos de reações de bio-oxidação dos esteroides Progesterona e 17α-Etinilestradiol por fungos de ambiente marinho. Para a Progesterona foi feita uma triagem de reações com os caldos enzimáticos e as massas miceliais dos fungos Aspergillus sydowii CBMAI 934, Aspergillus sydowii CBMAI 935, Penicilium oxalicum CBMAI 1185 e Penicilium citrinum CBMAI 1186. Para as reações envolvendo os fungos A. sydowii CBMAI 935, P. oxalicum CBMAI 1185 e P. citrinum CBMAI 1186 os produtos majoritários observados foram os metabólitos Testosterona e Testololactona, produtos de oxidação da Progesterona promovida por enzimas do tipo Baeyer-Villiger monoxigenases. Para as reações envolvendo o fungo A. sydowii CBMAI 934 foram observados produtos de hidroxilação da Progesterona em carbonos do núcleo esteroidal não ativados eletronicamente, sendo produtos de oxidação da Progesterona promovida por enzimas do citocromo P-450. Da triagem foram selecionados os fungos A. sydowii CBMAI 934 e A. sydowii CBMAI 935 para executar reações de bio-oxidação em quintuplicatas (32ºC, 130 rpm, pH 7,4) utilizando o caldo enzimático e a massa micelial para isolamento e caracterizações espectroscópicas (RMN, EMAR e IV) e polarimétricas dos produtos majoritários. Após 14 dias de reação com o caldo enzimático do fungo A. sydowii CBMAI 934 foi isolado a 7,15-di-Hidroxiprogesterona com 13 % de rendimento em massa. Contudo não foi possível determinar com exatidão a configuração relativa dos grupos hidroxilas. Já para a reação com a massa micelial do fungo A. sydowii CBMAI 934 após 14 dias de reação foi isolado o produto 15β-Hidroxiprogesterona com 58% de rendimento em massa. Após 7 dias de reação com o caldo enzimático do fungo A. sydowii CBMAI 935 foram isolados os produtos Testosterona e Testololactona com rendimentos em massa de 24% e 36%, respectivamente. A Testololactona também foi isolada da reação com a massa micelial do fungo A. sydowii CBMAI 935 após 7 dias com rendimento em massa de 87%. Para o 17 α-Etinilestradiol foi feita uma triagem com os mesmos fungos utilizados na triagem das reações com a Progesterona, exceto com o fungo A. sydowii CBMAI 934. Após 7 dias de reação e nas mesmas condições das reações com a Progesterona, não foram observados produtos de biotransformação do 17 α-Etinilestradiol. Este estudo envolvendo a bio-oxidação da Progesterona mostra o potencial de biotransformação de fármacos esteroidais no meio ambiente. / In this work was performed bio-oxidation studies of steroids progesterone and 17α-ethynylestradiol by marine-derived fungi. For progesterone was performed a reactions screening with culture broth and micelia from Aspergillus sydowii CBMAI 934, Aspergillus sydowii CBMAI 935, Penicilium oxalicum CBMAI 1185 e Penicilium citrinum CBMAI 1186. For reactions using A. sydowii CBMAI 935, P. oxalicum CBMAI 1185 e P. citrinum CBMAI 1186 the majoritarian products obtained were testosterone and testololactone, products from progesterone oxidation by Baeyer-Villiger mono-oxygenases enzymes. For reactions using A. sydowii CBMAI 934 was observed hydroxylation products from progesterone in carbons of progesterone by eletronic factors. The enzymes than promoted the hydroxylation of the progesterone were of citochrome P-450 group. From screening was selected A. sydowii CBMAI 934 and A. sydowii CBMAI 935 for quintuplicate bio-oxydations (32ºC, 130 rpm, pH 7,4) using the culture broth and micelia for isolation and spectroscopicals caracterizations (NMR, HRMS and IR) and polarimetrics of majoritary products. After 14 days, the reaction with culture broth from A. sydowii CBMAI 934 was isolated 7,15-dihydroxyprogesterone with 13% yield. But, the configurations of hydroxy groups were not possible to determine. Already for reaction with micelia from A. sydowii CBMAI 934 was isolated 15β-hydroxyprogesterone with 58% yield. After 7 days the reaction with culture broth from A. sydowii CBMAI 935 was isolated the testosterone and testololactone with 24% and 36% yields, respectively. The Testololactone also was isolated from reaction with micelia from A. sydowii CBMAI 935 after 7 days with 87% yield. For 17α-ethynylestradiol was performed a screening with same fungi used in reaction screening with Progesterone, except the A. sydowii CBMAI 934. After 7 days in same condictions of reactions with Progesterone, It was not observed products from 17α-ethynylestradiol. This study involving the bio-oxidation from Progesterone showed the potential of biontrasnformations steroidal drugs in environment.

Made available in DSpace on 2016-08-10T10:38:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 KLEBER SANTIAGO FREITAS E SILVA.pdf: 1080005 bytes, checksum: 9dfcb821b9cd1574718e2442cabc533b (MD5) Previous issue date: 2013-02-18 / In healthy women, a great number of intra and extracellular controls prevent the attachment and proliferation of ectopic endometrial cells. In endometriosis, abnormalities in those controls can lead to the survival of endometrial cells and consequently their attachment to the peritoneal cavity and disease progression. Endometrial cells with genetic polymorphisms respond to local signals, and they proliferate instead of undergoing apoptosis. The products of these abnormal cells stimulate the invasion of tissues and induce an inflammatory response. The disease has a complex trait and it is related to several factors such as genetic, immunological and environmental. This study examined six polymorphisms presented by six different genes (p53; Estrogen Receptor β; Progesterone receptor; GSTM1; GSTT1; CYP1A1). We obtained the polymorphic genotype frequencies from the same 50 patients for all genes and we analyzed them using the Fisher's Exact Test or G Test. First we analyzed the genes in a group of two and subsequently in a group of three. We found significant association between polymorphisms in six pairs of genes (p53-Erβ with frequency 5.9 times higher in the experimental group; p53-GSTM1, 2.39 times higher; p53-CYP1A1 with 65.5% of the patients with the polymorphism; ERβ-PROGINS 3.0 times higher in the experimental group; GSTM1-PROGINS and GSTT1-CYP1A1 both with 31.25% of the patients with the polymorphism). Positive results were found in 15 situations when genes were analyzed in a group of three; the most significant result corresponding to the polymorphisms of the genes p53, Erβ e GSTM1 with 20% of the patients carrying these polymorphisms; PROGINS, Erβ e GSTM1 with 18% and p53, Erβ e PROGINS with 12%. The results support the idea that the presence of polymorphisms in more than one endometriosis-related gene can lead to the onset of the disease and its progression. Studies should aim at these genes in order to understand the relationship among them more clearly and the possibility of developing new diagnostic techniques based on molecular markers of these genes. / Controles intra e extracelulares impedem a implantação e a proliferação de células endometriais ectópicas nas mulheres saudáveis. Anormalidades em quaisquer desses controles levam à sobrevida dessas células, implantação e a consequente progressão da Endometriose. Células endometriais com polimorfismos genéticos respondem a sinais locais e se proliferam não sofrendo apoptose. Os produtos dessas células anormais estimulam a invasão de tecidos e induzem respostas inflamatórias. A doença é complexa e relacionada a fatores como o genético, o imunológico e o ambiental. Este trabalho analisou seis polimorfismos de seis diferentes genes (p53; Receptor β de estrógeno; Receptor de progesterona; GSTM1; GSTT1; CYP1A1). As frequências dos genótipos polimórficos foram obtidas das mesmas 50 pacientes para todos os genes e analisadas pelo Teste Exato de Fisher ou Teste G. Os genes foram analisados dois a dois e posteriormente três a três. Resultados significativos foram encontrados para seis pares de genes (p53- REβ com frequência de polimorfismo 5,9 vezes maior no grupo endometriose; p53-GSTM1 com frequência 2,39 vezes maior; p53-CYP1A1 com 65,5% das pacientes com endometriose apresentando os polimorfismos; REβ-PROGINS com frequência 3,0 vezes maior; GSTM1-PROGINS e GSTT1-CYP1A1, ambos com 31,25% das pacientes do grupo endometriose apresentando os polimorfismos). Em 15 situações quando os genes foram analisados três a três o p foi menor que 0,05. Os polimorfismos de maior frequência foram dos genes p53, REβ e GSTM1 com 20% das pacientes com endometriose apresentando esses polimorfismos; PROGINS, REβ e GSTM1 com 18% e p53, REβ e PROGINS com 12%. Esses resultados corroboram a ideia de que a presença de polimorfismos em mais de um gene relacionado à endometriose pode levar ao aparecimento e deselvolvimento da doença. Estudos devem ser direcionados a esses genes na tentativa de compreender mellhor a relação entre eles e o possível desenvolvimento de novas técnicas de diagnóstico baseada nos marcadores moleculares desses mesmos genes.

Apesar do estudo exaustivo do transporte mucociliar nasal, ainda há dados controversos sobre a influência direta dos hormônios sexuais femininos nesse mecanismo. O presente estudo teve por objetivos: 1. avaliar o transporte mucociliar nasal de sacarina nos sexos masculino e feminino, comparando-o nas fases folicular, periovulatória e lútea de ciclos ovarianos consecutivos e 2. identificar a expressão e a localização dos receptores para estrógeno e progesterona na mucosa nasal humana em conchas nasais inferiores de indivíduos dos sexos masculino e feminino na idade reprodutiva. O transporte mucociliar nasal de sacarina foi avaliado prospectivamente em 14 voluntários não fumantes, sem queixas nasais, com idades entre 15 e 30 anos (7 homens e 7 mulheres, com média de idade 23,5 anos). Nas mulheres, o transporte mucociliar nasal de sacarina foi medido nas fases folicular, periovulatória e lútea durante dois ciclos ovarianos consecutivos (em cinco casos) ou três ciclos consecutivos (em dois casos). Nos homens, o transporte mucociliar nasal de sacarina foi avaliado em medidas repetidas aleatoriamente três vezes (em dois casos) ou seis vezes (em cinco casos). A expressão dos receptores para estrógeno e progesterona na mucosa nasal humana foi avaliada por método imunohistoquímico, de modo retrospectivo, em conchas nasais inferiores conservadas em formaldeído e fixadas na parafina, arquivadas após a cirurgia de turbinectomia parcial da concha inferior a que foram submetidos 20 pacientes da mesma faixa etária dos voluntários (10 pacientes do sexo masculino e 10 do sexo feminino, com idades entre 15 e 33 anos, média de idade 22,1 anos). Para a imuno-histoquímica utilizaram-se anticorpos monoclonais de camundongo contra receptores para estrógeno (clone 6F11, Novocastra) e para progesterona (clone 16, Novocastra) separadamente. Não houve diferenças significativas no transporte mucociliar nasal de sacarina entre as fases folicular, periovulatória e lútea em ciclos ovarianos consecutivos, nem entre os sexos (p=0,08). Entretanto, considerando-se apenas o primeiro ciclo ovariano, o transporte mucociliar nasal de sacarina foi mais rápido durante a fase folicular (p=0,03). Os receptores para estrógeno e progesterona foram encontrados no citoplasma das glândulas serosas da lâmina própria exclusivamente no sexo masculino (6/10 homens e 3/10 homens respectivamente). Concluindo, o estrógeno e a progesterona não influenciaram as medidas repetidas do transporte mucociliar nasal de sacarina em indivíduos sem queixas nasais. Contudo, os receptores para estrógeno e progesterona foram encontrados nas glândulas seromucosas da lâmina própria no sexo masculino, indicando que ambos os hormônios poderiam agir diretamente sobre a produção do muco nasal. / Although nasal mucociliary clearance has been thoroughly studied, there is controversial evidence that it is directly influenced by female sex hormones. This study focused on: 1. evaluating saccharin nasal mucociliary transport in both sexes and during the follicular, periovulatory and luteal phases of consecutive ovarian cycles, and 2. identifying the expression and localisation of estrogen and progesterone receptors in human nasal mucosa from inferior turbinates of patients in reproductive age. Saccharin nasal mucociliary transport was prospectively evaluated in 14 nonsmoking healthy volunteers aged 15 to 30 years (7 males and 7 females, mean age 23.5 years) who had no nasal complaints. In females, saccharin nasal mucociliary transport was measured in the follicular, periovulatory and luteal phases during two consecutive ovarian cycles (five cases) or three consecutive cycles (two cases). In males, the saccharin nasal mucociliary transport was randomly repeated three times (two cases) or six times (five cases). Estrogen and progesterone receptor expression in human nasal mucosa was retrospectively assessed by immunohistochemistry in archival, formalin-fixed, paraffin-embedded inferior nasal conchae from 20 patients submitted to partial inferior turbinectomy whose ages were matched to their of the volunteers (10 male and 10 female patients aged 15 to 33 years, mean age 22.1 years). Immunohistochemistry used mouse monoclonal antibodies against estrogen receptor (6F11 clone, Novocastra) and progesterone receptor (16 clone, Novocastra) separately. There were no significant differences in saccharin nasal mucociliary transport among follicular, periovulatory and luteal phases in consecutive ovarian cycles, nor between sexes (p=.08). Even though, considering the first ovarian cycle only, saccharin nasal mucociliary transport was faster during the follicular phase (p=.03). Estrogen and progesterone receptors were found in the cytoplasm of serous glands of the lamina propria exclusively in males (6/10 males and 3/10 males respectively). In conclusion, estrogen and progesterone did not influence repeated measures of saccharin nasal mucociliary transport in males and females with no nasal complaints. Nevertheless, estrogen and progesterone receptors were found in seromucous glands of the lamina propria in males, indicating that both hormones might act directly over nasal mucus production

Le récepteur de la progestérone (PR) est un acteur majeur du développement de la glande mammaire. Dans les cellules épithéliales normales, PR est exprimé sous deux isoformes PRA (94 kDa) et PRB (116 kDa) de façon équimolaire. Il est établi que celles-ci ont un impact important sur le développement des cancers du sein, mais leurs rôles dans l’évolution métastatique reste très mal connus. Le ratio d’expression PRA/PRB étant souvent déséquilibré dans les tumeurs mammaires, nous avons analysé le turnover des deux isoformes. Nous avons démontré que PRA et PRB sont les cibles de modifications post-traductionnelles dirigées par les MAPK qui tendent à stabiliser l’une ou l’autre isoforme de manière sélective. Ainsi, Erk1/2 (p42/44) inhibe la dégradation de PRB tandis que la p38 stabilise PRA. Il en résulte que le ratio PRA/PRB varie de façon importante en fonction des signalisations extracellulaires impliquant les facteurs de croissance et les cytokines inflammatoires souvent exacerbés dans les cancers. Pour mieux étudier les effets différentiels de PRA et PRB, nous avons établi un modèle cellulaire original exprimant de manière bi-inductible l’une ou l’autre isoforme de PR, à partir de la lignée cellulaire MDA-MB 231 provenant d’une métastase de cancer du sein. En étudiant les variations induites par PRA ou PRB sur le transcriptome de ces cellules, nous avons identifié les gènes cibles spécifiques de ces isoformes. Parmi-eux se trouvent de nombreux gènes impliqués dans les cancers, notamment agissant sur la prolifération, la survie et la motilité cellulaires comme uPA et PAI-1. De plus, en analysant la migration cellulaire, nous avons mis en évidence un effet pro-migratoire de PRB particulièrement important en absence d’hormone. En recherchant la cause de ces effets, nous avons découvert que PRB était colocalisé et interagissait avec la kinase d’adhésion focale (FAK) qu’il active au niveau des points d’adhésion focaux. Ces travaux soulignent l’incidence du ratio PRA/PRB et du statut du ligand sur les métastases du cancer du sein, aussi bien au niveau de la sélectivité transcriptionnelle que celui des régulations non génomiques impactant la migration cellulaire. Nous suggérons la possibilité de cibler les tumeurs mammaires par des antagonistes sélectifs de PR et des inhibiteurs des voies de signalisation des MAPK ou de FAK. / Progesterone receptor (PR) is a major actor of mammary gland development. PR is equally expressed as two main isoforms PRA (94 kDa) and PRB (116kDa) in the mammary gland epithelium. However, breast cancer progression has been associated with abnormalities of their expression ratio through undefined mechanisms. In this study, using a stably transfected cell line, we showed that PRA and PRB stabilizations are differentially regulated by Erk1/2 (p42/44) and p38 MAPKs respectively, leading to strongly influence PRA/PRB ratio. These results highlight the impact of growth factors and inflammatory cytokines on PRA/PRB imbalance in cancer cells. To study the differential effect of PR isoforms, we established an original bi-inducible cell line expressing either PRA and/or PRB. By analyzing variations induced by PRA and PRB on such cell transcriptomes, we identified the isoform-specific targets genes by DNA microarrays. Most of them are implicated in cancers, notably acting on cell proliferation, survival and motility. Furthermore, focusing our studies on cell migration, we showed that PRB acts as a pro-migratory factor particularly powerful in the absence of ligand. We discovered that PRB colocalized and interacted with the focal adhesion kinase (FAK) that was activated in focal adhesion points. Our results highlight the impacts of both PRA/PRB ratio and ligand status on metastatic evolution, in the contexts of transcriptional regulation as well as non-genomic events. We suggest the possibility to target mammary tumors by PR-selective antagonists and/or inhibitors of MAPK and FAK signalings.

Les stéroïdes sexuels ne sont pas impliqués uniquement dans la reproduction, ils sont également actifs dans le système nerveux où ils exercent des effets neuroprotecteurs. La mitochondrie a un rôle central dans la synthèse de l’énergie cellulaire et le contrôle du stress oxydant. Ces fonctions mitochondriales seraient une cible potentielle des effets des stéroïdes sexuels dans le cerveau. Deux approches ont été développées au cours de ce travail de thèse : une approche physiologique avec l’étude de l’influence des stéroïdes endogènes sur la fonction mitochondriale cérébrale et une approche thérapeutique en utilisant le modèle expérimental de l’ischémie cérébrale et du traitement par la progestérone. Pour analyser l’influence des stéroïdes endogènes, nous avons comparé le fonctionnement de la phosphorylation oxydative (consommation d’oxygène ou « respiration » et activités enzymatiques) ; le niveau du stress oxydant (pool de glutathion mitochondrial et inactivation oxydative de l’aconitase mitochondriale) et les taux cérébraux de stéroïdes dans des groupes de souris mâles et femelles soit jeunes adultes intactes ou gonadectomisées (3 mois) ; soit âgées (20 mois). Nous avons montré que la respiration NADH-dépendante est plus importante et que le stress oxydant mitochondrial est moins important chez les femelles que chez les mâles jeunes. Cette différence n’existe plus chez les souris âgées et est abolie après ovariectomie mais pas après orchidectomie, ce qui démontre l’influence des stéroïdes ovariens. Les taux cérébraux importants de prégnènolone et de progestérone chez les souris jeunes femelles par rapport aux jeunes mâles pourraient être impliqués dans le dimorphisme sexuel observé.Les modifications de la respiration mitochondriale induites par l’ischémie cérébrale sont également différentes entre les mâles et les femelles dans notre modèle. La respiration NADH-dépendante est diminuée dans les deux sexes, mais la respiration FADH2-dépendante est diminuée spécifiquement chez les femelles. Le stress oxydant mitochondrial est augmenté dans les deux sexes. L’administration de progestérone permet de restaurer la respiration FADH2-dépendante chez les femelles et la respiration NADH-dépendante ainsi que le pool de glutathion mitochondrial dans les deux sexes. Ce travail a permis de mettre en évidence des différences de fonctionnement mitochondrial cérébral chez les souris mâles et femelles jeunes et d’identifier la phosphorylation oxydative et le stress oxydant mitochondrial comme cibles d’action des effets neuroprotecteurs de la progestérone lors de l’ischémie cérébrale. / Besides the reproduction control, sex steroids also act on nervous system and exert neuroprotective effects. The mitochondria are centrally involved in cellular energy synthesis and oxidative stress regulation and constitute a potential target of steroids effects on brain. The aim of our study was twofold: (1) to study the influence of endogenous steroids on brain mitochondrial function in physiological conditions ; (2) to determine the effects of progesterone on mitochondrial function when used as therapeutic agent in an experimental model of cerebral ischemia. To analyze the influence of endogenous sex steroids, the oxidative phosphorylation system (oxygen consumption or “respiration” and enzymatic activities) and mitochondrial oxidative stress (glutathione pool and mitochondrial aconitase oxidative inactivation) were analyzed in brain mitochondria of young adult male and female mice (3-month-old), intact and after gonadectomy, and of aged male and female mice (20-month-old). Our results showed that young adult females have lower oxidative stress and a higher NADH-linked respiration rate as compared to young adult males. This sex difference was suppressed by ovariectomy but not by orchidectomy and no longer existed in aged mice. Concomitant analysis of brain steroids suggest that the major male/female differences in brain pregnenolone and progesterone levels may contribute to the sex differences observed in brain mitochondrial function.We have also shown that the decrease of brain mitochondrial respiration induced by ischemia is different according to sex in our experimental model. The NADH-linked respiration decreased after ischemia in males and female but a decrease of FADH2-linked respiration only occurred in females. Ischemia induced oxidative damages in both males and females. Progesterone restored NADH-linked respiration in both sexes and FADH2-linked respiration in females. Progesterone also preserved mitochondrial glutathione pool in both sexes. Our findings point to a sex difference in brain mitochondrial function of young male and female mice and identify the oxidative phosphorylation system and the mitochondrial oxidative stress as targets of the neuroprotective effects of progesterone.