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Das Ziel dieser Arbeit war zunächst in der Methodenoptimierung eines bereits grundlegend etablierten Protokolls zur Isolierung und Kultur equiner endometrialer Epithel (EEZ) und Stromazellen (ESZ) (BUSCHATZ 2007) zu sehen. Zudem wurde die Entwicklung weiterer Möglichkeiten des Handlings angestrebt (Passagierung, Kryokonservierung). So sollten den Zellen optimierte Rahmenbedingungen in vitro geboten werden, welche den Verhältnissen im Organismus weitgehend nahe kommen. Im Anschluss daran wurden die Zellen in vitro hinsichtlich ihrer morphologisch-funktionellen Charakteristika untersucht und die Befunde vergleichend zu den Gegebenheiten in situ betrachtet. Besonderes Augenmerk galt dabei der Expression von Progesteron- (PR) und Östrogenrezeptor-α (ERα) und von Inhibin-α. Wären vergleichbare Konstellationen in vitro und in vivo anzutreffen, könnte ein solches Kultursystem als Modell zum Studium interzellulärer Wechselwirkungen oder pathogenetischer Abläufe am Endometrium dienen. Voraussetzung hierfür wäre jedoch eine fortgeschrittene zelluläre Differenzierung, wie sie beispielsweise durch die Expression von Inhibin-α und der Steroidhormonrezeptoren angezeigt wird. Es wurden transzervikale Uterusbioptate und vollständige Uteri euthanasierter Stuten für die Zellaufreinigung sowie die vergleichende histologische Untersuchung gewonnen. Einer mechanischen und enzymatischen Dissoziation des Gewebes folgte die Separation beider Zellarten durch Filtration, Dichtegradientenzentrifugation und Differenzialadhärenz. Die Kultur erfolgte in wasserdampfgesättigter Raumluft bei 37 °C in 5 % CO2-Atmosphäre. Als Kulturmedium diente DMEM/Ham´s F-12 unter Zusatz von 2,5 % fötalem Kälberserums und diverser Additive. Es wurde eine morphologische Charakterisierung der Zellen während der Kultur vorgenommen und zudem ERα, PR und Inhibin-α an allen Kulturen und Gewebeproben immunhistologisch bestimmt. Das Ablösen der Zellen zur Passagierung erfolgte mit Trypsin-EDTA (ESZ) bzw. Alfazyme® (EEZ). Entsprechend abgelöste Zellen wurden zudem in DMSO-haltigem Nährmedium kryokonserviert. Die Kultivierung von EEZ und ESZ gelang sowohl bei Verwendung transzervikaler Uterusbioptate als auch bei Uteri euthanasierter Pferde. Zudem konnten alle physiologischerweise bei der Stute auftretenden Zyklusstände (Anöstrus, Interöstrus, Östrus) sowie ein gravider Uterus kultiviert werden. Die Konfluenz wird von EEZ nach 4 bis 16 d und von ESZ innerhalb von 7 bis 18 d erreicht, wobei Zellen aus ursprünglich proliferativen endometrialen Funktionszuständen tendenziell eher konfluent sind als sekretorisch aktive. Während der Kultur kann eine eindeutige morphologische Unterscheidung beider Zellarten voneinander erfolgen. ESZ besitzen eine spindelige, teils sternförmige, insgesamt „fibroblastenartige“ Gestalt. EEZ sind in zwei morphologischen Subtypen anzutreffen. Der monomorphe Zelltyp „A“ stellt kleine, polygonale Zellen mit regulären und regelmäßigen Zellgrenzen dar. Zelltyp „B“ ist größer, pleomorph, ebenfalls polygonal, mehrkernig und besitzt unregelmäßige, schlecht erkennbare Zellgrenzen. Subkultivierungen waren bis zu 20 (ESZ) bzw. 24 mal (EEZ) möglich. Zudem konnten beide Zellarten in flüssigem Stickstoff gelagert (kryokonserviert) und danach erfolgreich kultiviert werden. Weiterhin gelang der Nachweis von Inhibin-α im Uterus des Pferdes. Hierbei wurde eine zyklische Dynamik in der Expression festgestellt (stärkere Expression während der sekretorischen Phase), welche als Hinweis für eine sekretorische Differenzierung der EEZ anzusehen ist. Ebenfalls konnte dieses Protein in kultivierten EEZ und in viel geringerem Maße auch in den ESZ gefunden werden. Darüber hinaus war erstmalig der Nachweis von PR und ERα in beiden Zellarten in vitro möglich. Insgesamt ist die Expression dieser drei für uterines Gewebe essentiellen Rezeptoren/Proteine in kultivierten EEZ und ESZ als Hinweis für eine fortgeschrittene Differenzierung anzusehen, welche mit der vorgestellten Methode der Isolierung und Kultur auch erreicht werden konnte. Im Hinblick auf die Wachstumsgeschwindigkeit in vitro fanden sich zudem Hinweise auf eine Beibehaltung der ursprünglich im Gewebeverband erlangten zellulären Differenzierung, welche sich bei der Expression von ERα, PR bzw. Inhibin-α allerdings nicht nachvollziehen ließ. Abschließend betrachtet, deuten die vorliegenden Ergebnisse somit auf eine partielle Beibehaltung in situ erlangter endometrialer Funktionen und Spezifika hin, welche als Grundlage für weitere Arbeiten an endometrialen Zellkulturen des Pferdes anzusehen sind.

Premenstrual depressive symptoms and mood swings affect 3-8% of women in fertile age. The female hormones are believed to be the cause. Progesterone is well studied, but estrogen is not, and either are other causes such as intimate partner violence and chronic stress. The aim in this thesis was to investigate the influence of hormones as well as psychological aspects on the most common problems among women seeking care for premenstrual symptoms. In a cross-sectional study, four groups of women were included: ongoing users of oral contraceptives, with or without adverse mood symptoms and previous users, with or without experience of adverse mood. Depression and anxiety were significantly more common in both groups with reported adverse mood, in comparison with their control groups with no adverse mood. Self-reported PMS was significantly more common in those women who reported adverse mood, however, there was no difference in prospectively defined PMS or PMDD between the two groups of previous users. In a RCT with 25 women completing the study, GnRH treatment were tested in combination with two different HRT add-back doses of estradiol, in combination with progesterone and placebo. The higher dose of estrogen 1.5 mg in combination with progesterone induced significantly more pronounced symptoms than in combination with placebo. The lower dose, 0.5 mg gave less symptom recurrence in combination with progesterone. Exposure to violence was investigated among PMDD patients, healthy controls and gynecological patients. Among the participating women, gynecological patients, reported physical and/or emotional abuse significantly more often than did PMDD patients, as well as healthy controls. Chronic stress was investigated with diurnal cortisol, and low-dose dexamethasone test.  There was no difference in diurnal secretion of cortisol between PMDD patients and controls. No difference in the degree of dexamethasone suppression was found between PMDD patients and controls. According to the results from these studies, the main symptom provoking factor in women with PMDD appears to be the estradiol and progesterone fluctuations across the menstrual cycle, whereas chronic stress and intimate partner violence appears to be less relevant.

A diabetes mellitus canina (DMC) é uma doença multifatorial e de crescente incidência nas últimas décadas. Apesar do quadro diabético no cão estar associado à perda da capacidade de secreção de insulina para manutenção da glicemia, alguns mecanismos associados a esta perda de função ainda não são bem conhecidos. Acredita-se que o processo possa estar envolvido com exaustão de células beta secundário a hiperglicemia crônica, especialmente nos casos onde há antagonismos hormonais presentes, ou quando fatores de risco ambientais parecem estar envolvidos. O objetivo deste trabalho foi avaliar em uma população de cães diabéticos atendidos entre 2004 e 2011, através de diferentes desenhos de estudos retrospectivos, qual o papel que diferentes fatores de risco (FR) ao desenvolvimento de DMC tiveram nestes casos, incluindo-se também uma revisão bibliográfica sobre as inter-relações entre ciclo estral e DMC. Em um estudo retrospectivo inicial em busca de casos de remissão de diabetes secundário a resolução de condições relacionadas à progesterona, foi caracterizada seis pacientes em remissão após castração, sendo que em três delas o fator progesterona-dependente presente foi piometra, e nos outros três casos os fatores foram diestro, gestação e síndrome do ovário remanescente. O segundo trabalho buscou a criação de um questionário (QSTo) para avaliação da exposição à diferentes FR, ou de proteção, ao desenvolvimento de DMC, bem como a sobrevida (SV) destes pacientes após o diagnóstico. O QSTo foi aplicado em donos de 110 cães com DMC diagnosticados entre 2004 e 2011, não incluindo cães com Cushing ou hipotireoidismo. A sensibilidade (SE), especificidade (ESP) e Kappa (K), das respostas foram determinadas comparando-as com prontuários médicos padronizados das primeiras consultas. Obteve-se concordância média por questão de 95% (65 a 100%), todas com K > 0.81 (p ≤ 0,001), exceto para as questões que avaliaram histórico de sobrepeso (0.57) e diestro (0,38), com concordância média por QSTo de 92% (72 a 100%), SE média 86,1% (44 - 100%), e ESP média 98,1% (93 - 100%). Na aplicação do QSTo, 58 pacientes (53%) já haviam morrido, sendo que 5 (4,5%) viveram poucos dias (1 a 5), e outros 6 (6,6%) viveram 1 a 3 semanas após o diagnóstico, com uma SV média de 24,4 (1 a 120) e moda 3 meses para os demais. A média de SV dos pacientes vivos na aplicação do QSTo foi de 31,8 meses (11 a 96). Assumiu-se o QSTo como boa ferramenta na avaliação da exposição à FR para DMC, sendo diestro e sobrepeso mais sujeitos a vieses nas respostas. Na análise de SV fica claro que as primeiras semanas após diagnóstico são mais críticas. No terceiro trabalho, foi realizado um estudo caso-controle, incluindo os mesmos 110 casos, e um grupo controle de 136 animais pareados por raça, sexo, idade e local de atendimentos. Após aplicação do QSTo em ambos grupos, as respostas foram dicotomizadas para avaliar exposição ou não-exposição ao FR em estudo com a criação de 2 modelos estatísticos. 1) ModMF: machos e fêmeas sem incluir FR relacionados ao ciclo estral. 2) ModF: só fêmeas (81 casos e 104 controles) com todos os FR em estudo. Após análise de regressão logística univariada condicional (RLUC) para selecionar FR potenciais associados à DMC, ofereceu-se aos modelos multivariados (MMV) as variáveis com um valor de p < 0,20, construídos com seleção forward das variáveis de menor critério de informação Akaike na RLUC, seguida de eliminação backward das com valor de p ≥ 0,05. No ModMF dieta desbalanceada (OR 4,85 - IC 95% 2,2-10,7), e sobrepeso (OR 3,5 – IC 95% 1,6-7,5), foram associadas (p ≤ 0,01) à DMC. Por fim, um último trabalho relatando um relato de caso de descompensação de diabetes em decorrência de doença periodontal ativa é apresentado. O conjunto de resultados aqui apresentados permite a criação de estratégias de prevenção contra DMC, bem como de melhor controle dos pacientes em tratamento, ao apontar fatores de risco como inflamação, sepse, diestro, alimentação desequilibrada e sobrepeso como importantes fatores de risco associados à doença, apesar de que em muias destas situações os mecanismos não estarem elucidados. / Canine diabetes mellitus (CDM) is a multifactorial disease with a crescent incidence in the last decades. Despite diabetic state in the dog is associated with loss of insulin secretion ability for controlling glucose homeostasis, some mechanisms associated with this beta cell loss of function are still unknown. It is believed that some process may be associated with beta cell exhaustion secondary to chronic hyperglycemia, especially in those cases where hormonal imbalances or environmental risk factors seems to be involved. The aim of this work was evaluate in a diabetic dog population attended between 2004 and 2011, by means of different retrospective studies designs, which role different risk factors (RF) to CDM development may have played in those cases. A bibliographic review on interactions between estrus cycle and CDM was also included. An initial retrospective study searching for CDM remission cases secondary to resolution of progesterone-related conditions. In the second paper we create a questionnaire (QSTe) to evaluate exposition to different RF, or protection factors, against CDM development, as well as survival (SV) of those patients after diagnosis. The QSTe was applied to owners of 110 diabetic dogs diagnosed between 2004 and 2011, not including cushing´s or hypothyroid dogs. The sensibility (SE), specificity (SPE) and Kappa (K) for the answers were determined by comparing them with standardized medical records from the first veterinary visit. The mean concordance by question was 95% (65 to 100%), all of them with K > 0.81 (p ≤ 0,001), except for overweight (0.57) and diestrus (0.38) questions, with a 92% mean concordance for questionnaire (72 to 100%), mean SE of 86.1% (44 to 100%), and mean SPE of 98.1% (93 to 100%). When the QSTe was applied, 58 patients (53%) were already dead. From those, 5 (4.5%) lived only few days (1 to 5), and other 6 (6.6%) lived only 1 to 3 weeks after CDM diagnosis, with a mean SV of 24.4 (1 to 120) and mode 3 mo to the other ones. The mean SV time for those patients alive at the time QSTe was applied was of 31.8 (11 to 96) mos. We assumed the QSTe was a good tool for evaluation to exposition to RF for CDM. By the way, diestrus and overweight were more prone to biases in the answers. In the SV analysis, it became clear that the first weeks after diagnosis were more critical for the patient. In the third paper it was preformed a matched case-control study, including the same 110 CDM cases, and a control group made of 136 non-diabetic dogs matched by breed, sex, age and local where the dog was first saw. After answered the QSTe by all owners from both groups, the answers were dichotomized in order to evaluate exposition, or non-exposition to the RF in study, followed by the creation of two statistical models. 1) ModMF: males and females without inclusion of RF related to estrus cycle. 2) ModF: just females (81 cases and 104 controls) with all RF in study. After a conditional univariate logistic regression analysis (CULR) to select potential RF associated with CDM, were offered to the multivariate models (MVM) only those variables with a P-value < 0.2. The MVMs were built by forward selection step-by-step of the variables with lowest AIC (Akaike information criterion) at the CULR, followed of step-by-step backward elimination of variables with P-value ≥ 0.05. In the ModMF, unbalanced diet (OR 4.85 – 95%CI 2.2 – 10.7) and overweight (OR 3.5 – 95%CI 1.6 – 7.5) were associated (P ≤ 0.01) to CDM. In the ModF the following variables were associated with CDM (P < 0.04): diestrus (OR 5.5 – 95%CI 1.9 – 16.3), table scraps (OR 3.6 – 95%CI 1.1 – 12.3), unbalanced diet (OR 4.1 – 95%CI 1.9 – 12.7) and overweight (OR 3.9 – 95%CI 1.2 – 12.6). Those results allow creation of preventive strategies against CDM once are pointing out nutrition, overweight and diestrus as important RF associated to the disease. At the end, one last paper reporting a case report of CDM discompensation secondary to an active periodontal disease is presented. The conjunction of evidences pointed out here allow the creation of preventive strategies against CDM development, as well as strategies for better control of patients already diabetic, once RF as inflammation, sepsis, diestrus, unbalanced diet and overweight were pointed out as important RF associated with insulin resistance, despite the fact the in some of those situations, the mechanism behind overt CDM are not completely understood.

Hibiscus tiliaceus L. (Malvaceae) é usado popularmente em desordens do pós-parto. O extrato metanólico de flores de H. tiliaceus apresentou atividade antidepressiva-like nos testes de nado forçado e de suspensão da cauda, ambos são amplamente usados como modelos animais preditivos da atividade antidepressiva. Além disso, o extrato demonstrou uma tendência de aumento do tempo gasto nos braços abertos no labirinto em cruz elevado. Considerando que o extrato de H. tiliaceus, que contém fitoesteróis como o estigmasterol, o stigmastadienol e o stigmastadienone, pode ser útil no tratamento ou prevenção da depressão pós-parto relacionadas à retirada crônica de altos níveis de hormônios associados à gestação. Nosso objetivo foi avaliar o efeito de extratos de H. tiliaceus em modelo animal de depressão pós-parto e ansiedade. Utilizamos ratas Wistar fêmeas submetidas ao modelo de depressão pós-parto induzido por hormônios (estradiol e progesterona), administrados por via subcutânea. Após período gestacional induzido, os animais receberam água, veiculo ou extrato de H. tiliaceus nas doses de 100 e 400mg/kg, via oral (gavagem). No período pós-parto, as ratas foram submetidas a testes comportamentais de nado forçado, o labirinto em cruz elevado e de preferência claro-escuro como modelos preditivo de depressão e ansiedade. Foi obsevado um aumento no tempo de imobilidade associado a uma diminuição na tentativa de fuga, no teste do nado forçado, em animais submetidos ao modelo de depressão pós-parto comparado ao grupo controle, sugerindo que este modelo é capaz reproduzir sintomas de depressão pós-parto. Não houve diferença significativa nos testes de ansiedade entre os animais submetidos ao modelo de depressão pós-parto comparado aos controles. A administração de extrato metanólico de H. tiliaceus não foi capaz de alterar o comportamento relacionado à depressão e ansiedade em ratas Wistar. / Postpartum affective disorders are rarely modeled. The depressive-like behavior of hormone withdrawal following hormone-simulated "pregnancy" was described in Long-Evans and Sprague Dawley rats. Our aim was to evaluate the validity of hormone withdrawal following hormonesimulated "pregnancy" method in Wistar rats as a model of depression and/or anxiety. Recently, it was demonstrated an antidepressant-like profile of methanol extract of Hibiscus tiliaceus L., a plant used in postpartum disorders, in adult male Swiss albino mice, then, we also investigated the antidepressant and anxiolytic-like activities of the methanol extract of H. tiliaceus flowers using this animal model of postpartum disorder. Ovariectomized rats received daily injections of the vehicle or hormones (estradiol and progesterone) to simulate the 23-day gestational period in the rat. Days 24-27 were considered the ''post-partum'' period, where the methanolic extract of H. tiliaceus or vehicle were administered by gavage. Rats were submitted to forced swimming, elevated plus-maze test and lightdark box tests. Rats submitted to ''post-partum depression model'' increased the immobility time in forced swimming. The methanolic extract of H. tiliaceus administration did not alter the immobility time in the forced swim test. In the light-dark box test, rats submitted to post-partum depression model showed decreases in number of rearing in dark compartment. In conclusion, our data indicate that Wistar rats may be an adequate model postpartum affective disorders, showing ''depressive-like'' symptoms in the forced swim test without any anxiogenic effect. Besides, we could suggest that decrease on number of rearing in the dark compartment may indicate the motivational state.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:05Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-12-31 / O carcinoma da mama é a neoplasia maligna mais freqüente entre as mulheres com grande impacto na mortalidade. Os estudos de quimioprevenção primária com tamoxifeno têm gerado boas expectativas e consideradas taxas de sucesso. Doses menores do tamoxifeno apresentam eficácia semelhante à dose padrão, com redução de custos e efeitos adversos. Estudou-se a imunorreação do anticorpo monoclonal Ki-67 (MIB-1) e a positividade dos receptores de estrogênio (1D5) e progesterona (PgR 636) no carcinoma de mama de mulheres tratadas com 10 mg de tamoxifeno por um período de 14 dias. Realizou-se estudo prospectivo, randomizado, com 38 mulheres, divididas em dois grupos: Grupo A: N = 20 (Grupo controle - sem medicação) e Grupo B: N = 18 (tamoxifeno 10 mg/dia por 14 dias). Todas as pacientes assinaram termo de consentimento previamente aprovado pelas duas instituições (Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina e Hospital Materno Infantil de Goiânia-GO). A seguir foram submetidas à biópsia incisional e, após 14 dias, foi obtida nova amostra do tecido tumoral durante o tratamento cirúrgico definitivo. A positividade foi avaliada quantitativamente, contando-se no mínimo 1.000 células para cada lâmina. Para a análise estatística dos dados, foi utilizado o teste não paramétrico de Wilcoxon, fixandose α em 5%. Os dois grupos (A e B) foram considerados homogêneos em relação às variáveis de controle. No grupo A (controle) não houve redução estatisticamente significativa da positividade do Ki-67 (MIB-1) (p=0,627), e dos receptores de estrogênio (1D5) (p=0,296) e progesterona (PgR 636) (p=0,381). No grupo B (tamoxifeno 10 mg/dia) a porcentagem média de núcleos corados pelo Ki-67 (MIB-1) foi 24,7% antes e 10,4% após. Para o receptor de estrogênio (1D5), 59,5% antes e 25,9% após e para o receptor de progesterona (PgR 636), 59,3% e 29,6%, respectivamente. Houve redução significativa para os três marcadores (p<0,001). O tamoxifeno reduziu significativamente a positividade do anticorpo monoclonal Ki-67 (MIB-1), receptor de estrogênio (1D5) e receptor de progesterona (PgR 636) no epitélio mamário de pacientes com carcinoma, tratadas com tamoxifeno na dose de 10 mg por 14 dias. / Breast carcinoma is the most common malignancy among women, and it has a major impact on mortality. Studies of primary chemoprevention with tamoxifen have generated high expectations and considerable success rates. The efficacy of lower doses of tamoxifen is similar to that seen with the standard dose of the drug, and there is a reduction in medical care costs and adverse effects. The immune reaction to monoclonal antibody Ki-67 (MIB-1) and the expression of estrogen receptors (1D5) and progesterone receptors (PgR 636) in breast carcinoma were studied in patients treated with 10 mg of tamoxifen for a period of 14 days. A prospective randomized clinical trial was conducted with 38 patients divided into two groups: Group A: N = 20 (control group–without medication) and Group B: N = 18 (tamoxifen/10 mg/day for 14 days). All patients signed an informed consent term previously approved by both institutions (UNIFESP-EPM and Hospital Materno Infantil, Goiânia-GO). Patients underwent incisional biopsy before treatment and 14 days later a sample of tumor tissue was obtained during surgical treatment. Positivity was quantitatively assessed, counting at least 1.000 cells per slide. For statistical data analysis, a Wilcoxon non-parametric test was used, and α was set at 5%. Both groups (A and B) were considered homogeneous regarding control variables. In Group A (control), there was no statistically significant reduction in Ki-67 (MIB-1) (p=0.627), estrogen receptor (1D5) (p=0.296) and progesterone receptor positivity (PgR 636) (p=0.381). In Group B (tamoxifen 10 mg/day), the mean percentage of nuclei stained by Ki- 67 (MIB-1) was 24.7% before and 10.4% after tamoxifen treatment. Mean percentage of nuclei stained by estrogen receptor (1D5) was 59.5% before and 25.9% after tamoxifen treatment. Mean percentage of nuclei stained by progesterone receptor (PgR 636), was 59.3 before and 29.6% after tamoxifen treatment. A statistically significant reduction was found with the three markers (p<0.001). Tamoxifen significantly reduced monoclonal antibody Ki-67 (MIB-1), estrogen receptor (1D5) and progesterone receptor positivity (PgR 636) in the breast epithelium of patients with carcinoma, treated with a 10 mg dose of tamoxifen for 14 days. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

A hiperplasia adrenal congênita (HAC) é um grupo de doenças hereditárias causadas por uma deficiência em uma das enzimas necessárias para a síntese de cortisol no cortex adrenal. Mais de 95% de todos os casos de HAC são devidos a 21-Hidroxilase (21-OHD). Existem 3 formas principais, duas com manifestações clínicas no período neonatal, a forma mais grave perdedora de sal (HAC-PS) e a forma virilizante simples (HAC-VS). Além da perda salina, o excesso de andrógenos leva à virilização de recém nascidas femininas. As formas neonatais são chamadas de clássicas, atividade enzimática da 21-OH bastante reduzida, de < 2% na HAC-PS e de 2-10% na HAC-VS. A forma parcial de início tardio é chamada de HAC não clássica (HAC-NC) e a principal manifestação na infância é a adrenarca precoce. Nesta forma a atividade da 21-OH é de 20-60%. Os programas de triagem para HAC visam, principalmente, ao diagnóstico precoce da forma clássica perdedora de sal, mais grave e potencialmente letal. No Brasil, a triagem pública é realizada no Estado de Goiás desde 1997 e em Santa Catarina desde 2001. No Rio Grande do Sul (RS) foi implantada em maio de 2014 na fase IV do Programa Nacional de Triagem Neonatal. A inclusão da HAC trouxe consigo muitos desafios e a exigência de um fluxo de triagem e diagnóstico bem estruturados. O diagnóstico precoce é crucial para prevenir o óbito de lactentes por insuficiência adrenal. Dosa-se, em papelfiltro, a 17OH progesterona (17-OHP). Elevações podem ocorrer em recém-nascidos sem HAC (falso-positivos), devido a situações de estresse perinatal e por prematuridade. Após avaliação dos dados do primeiro ano de triagem para HAC neste estudo, a mediana da idade da coleta nos casos diagnosticados foi de 8 dias (4.25-15.75). Dos 8 casos diagnosticados de maio de 2014 a abril de 2015, 6 casos com forma perdedora de sal (incluindo 1 caso de óbito por coleta tardia do TP aos 38 dias de vida). A incidência encontrada em nosso meio no primeiro ano foi de 1:13.551 casos. Com a estratégia do uso de pontos de corte estratificados pelo peso de nascimento18, o índice total de resultados positivos em nosso meio foi de 0,5% da amostra avaliada (“n” total de 514 bebês), sendo mais frequente em recém nascidos com menos de 2000g de peso ao nascer. Além da confirmação clínica e laboratorial, o genótipo é importante, além de confirmar, para estabelecer gravidade da doença e também para ratificar o diagnostico dos falsos positivos na ausência de uma mutação do gene CYP21A2. Um dos casos confirmados de HAC-PS foi associado a múltiplas malformações e craniossinostose severa, suscitando a hipótese de um a associação com defeito de FGFR2. A correlação genótipo- fenótipo na avaliação dos casos em dois anos da triagem alcançou um alto nível de concordância de 87%. Diagnosticada, portanto, de forma assertiva a HAC forma clássica, instituise a terapia glicocorticóide para as formas virilizante simples e acrescenta-se mineralocorticóide para as formas perdedoras de sal. A triagem neonatal é um importante programa de saúde populacional e visa ao diagnóstico precoce de uma patologia com potencial risco à vida pela perda de sal, além de permitir adequada atribuição de sexo nas meninas com virilização genital e à saúde da criança. Estabelecer os fluxos adequados de triagem e manejo, além de ampliar o conhecimento sobre a HAC, com o reconhecimento dos desfechos e tratamentos adequados é essencial para minimizar as possíveis complicações nesta população de maior vulnerabilidade. / Congenital adrenal hyperplasia (CAH) is a group of inherited diseases caused by a deficiency in one of the enzymes required for the cortisol synthesis by the adrenal cortex. More than 95% of all CAH cases are due to 21-hydroxylase (21-OHD). There are 3 forms, two with neonatal clinical manifestation: salt-wasting CAH (SW-CAH\) and the simple virilizing form (HAC-VS). In addition to salt loss, androgens excess lead to the virilization of female newborn. Neonatal forms are defined as classical CAH. The 21-OHD enzymatic activity in SWCAH is less than <2% and in the SV-CAH 2-10%. A late-onset form, with partial enzymatic defect (20-60%) is called non-classical HAC (NC-CAH) and the main manifestation in childhood is early adrenarche. In Brazil, public health screening has been conducted in the State of Goiás since 1997 and in te Sate of Santa Catarina since 2001. In Rio Grande do Sul (RS) it was implemented in May 2014, in phase IV of the National Neonatal Screening Program. The inclusion of CAH in the local screening program brought many challenges and the need of a well structured screening and diagnosis flowchart. Early diagnosis is crucial to prevent infant death due to adrenal insufficiency. Around de world, the screening programs for CAH main purpose is the early diagnosis of the more severe classical forms, especially SW-CAH. The cortisol precursor 17OH progesterone (17-OHP) is the main disease marker and is measured on filter paper. Elevations may occur in infants without CAH (false positive) due to perinatal stress and prematurity. Of newborns screened in the first year, median age of collection in diagnosed cases was 8 days (4.25-15.75) and 8 patients were diagnosed with CAH (four males, four females). The incidence of CAH in the state was 1:13,551. Six cases were identified as classic salt-was-ting CAH and two were cases of virilizing CAH. The overall rate of positive results was 0.5% (n = 514 infants). The number of false positive results was higher among newborns with birth weight < 2,000 g. In addition to clinical and laboratory confirmation, the genotype is important to confirme 21-OH deficiency, to establish disease severity and also in the absence of a mutation of the CYP21A2 gene to more precise exclude the diagnosis of suspected false positives. One of the confirmed cases of SW-CAH was associated with multiple malformations and severe craniosynostosis, raising the hypothesis of an association with FGFR2 mutation. A high genotype- phenotype correlation of 87% was found in the cases after two years of screening. Once the classic CAH is diagnosed, glucocorticoid therapy is instituted and mineralocorticoid is added for SW-CAH. CAH neonatal screening is an important population health program and aims to the early diagnosis of a pathology with a potential risk due to salt loss crisis. The early detection of cases also allows to adequate sex assignment in girls with genital virilization. Establishing adequate screening flows, proper diagnosis and management, in addition to increase knowledge about the disease, with the appropriate recognition of outcomes and treatments is essential to minimize complications in this population of greater vulnerability.

The efficiency of superovulation protocols with different levels of progesterone in dairy cows was evaluated on the ovulated follicles rate. Twenty five high producing female were distributed in control group (n = 5), and four treatments with progesterone device (CIDR). Used CIDR for 4 and 5 days, new CIDR for 4 and 5 days (n=5 in each treatment). All cows received a pre synchronization with prostaglandin F2α (PGF) and GnRH. On Day 10 of the estrous cycle started the follicle stimulating hormone (FSH) treatment in nine decreasing doses for 4.5 days. Two applications of PGF were also used along with the 5th and 6th FSH injection. Ovaries were evaluated daily by transrectal ultrasonography to determine the start of the second follicular wave, evaluation of recruitment, follicles growth, also for monitoring the ovulation. Superovulation with used CIDR 4 resulted in a higher ovulation rate between 36-60h after device removal (94.9%, P <0.0001) compared to the control group (49.5%), used CIDR 5 (68.3%), new CIDR 4 (52.8%), or new CIDR 5 (70.6%). Thus, artificial insemination could be performed within 24-36h after removal the used 4 days CIDR. The number of follicles in control cows (38 ± 9.27) was similar (P=0.739) to used CIDR 4 (31.4 ± 6.8), new CIDR 4 (31 ± 4.6), used CIDR 5 (33.4 ± 8.4), or new CIDR 5 (38.6 ± 10.6). Our finds supported the hypothesis that low levels of exogenous progesterone during superovulation were sufficient to allow pulses of luteinizing hormone to enable ovulation induction. / Protocolos de superovulação com diferentes concentrações de progesterona foram avaliados sobre o percentual de folículos ovulados em vacas leiteiras de alta produção. Vinte e cinco fëmeas foram distribuídas em grupo controle (não tratadas; n=5) e quatro tratamentos com uso de dispositivos intravaginais de progesterona (CIDR): CIDR novo ou usado, por 4 ou 5 dias (n=5 em cada tratamento). Todas as vacas receberam prostaglandina F2α (PGF) e GnRH via IM. No Dia 10 (D10) do ciclo estral iniciou o tratamento com hormônio folículo estimulante (FSH) em 9 doses decrescentes, por 4,5 dias. Concomitante com a 5ª e 6ª aplicação de FSH as vacas receberam PGF. Os ovários foram avaliados diariamente por ultrassonografia transretal para determinar o início da segunda onda folicular, o recrutamento e crescimento dos folículos, bem como o monitoramento das ovulações. O CIDR usado por 4 dias resultou em maior percentual de folículos ovulados entre 36 e 60h após a remoção do dispositivo (94,9%; P<0.0001) comparado ao controle (49,5%) e tratamentos: CIDR usado 5 (68,3%), CIDR novo 4 (52,8%) e CIDR novo 5 (70,6%). A inseminação artificial deste protocolo é recomendada entre 24 a 36h após a retirada do CIDR usado por 4 dias. O número de folículos das vacas controle (38±9,27), CIDR usado 4 (31,4±6,8), CIDR novo 4 (31±4,6), CIDR usado 5 (33,4±8,4) e CIDR novo 5 (38,6±10,6) foi similar (P=0.739). Confirma-se a hipótese de que baixo nível de progesterona exógena durante o tratamento com FSH permite pulsos de hormônio luteinizante suficientes para indução da ovulação.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The aim of this study was to evaluate the effect of fibroblast growth factor 10 (FGF10) on bovine oocyte meiotic resumption in an in vitro oocyte and follicular cells co-culture system. At first, an oil-free culture system able to maintain a stable osmolality of the medium without the negative interference of the oil was established. The maintenance of osmotic equilibrium confirms that fourwell plate with water in the central hole can be a feasible alternative to replace oil for scientific experimentation and embryo culture. The embryo development rate in the alternative system (near 30% blastocyst) was similar to that obtained in the conventional system (33% blastocyst). Afterwards, the role of FGF10 on bovine oocyte meiotic resumption was evaluated in a co-culture of oocytes and follicular cells in the presence of angiotensin II (10-11M AngII). All tested concentrations of FGF10 inhibited the resumption of meiosis induced by AngII (P ≤ 0.05). The highest germinal vesicle breakdown (GVBD) rate was observed when FGF10 was absent (45.3%). At concentrations of 10, 100, and 1000ng mL-1 FGF10, the rates of GVBD were 30.2, 29.6 and 27%, respectively. In a second experiment, oocytes were co-cultured with follicular hemisections to test if FGF10 (100ng mL-1) acts directly on COCs or through follicular cells to inhibit AngII (10-11M)-induced meiotic resumption. The AngII-induced GVBD (62.6%) was inhibited when FGF10 was added to in vitro co-culture system (37.8%; P ≤ 0.05). However, FGF10 did not affect meiotic resumption of COCs cultured without AngII in the presence or absence of follicular cells. The third experiment tested if FGF10 inhibits progesterone-induced meiotic resumption. The addition of FGF10 did not affect the meiotic resumption rate induced by progesterone (41.1% and 41.7% GVBD with and without FGF10, respectively; P ≥ 0.05). However, indomethacin (10μM) blocked (20.1% GVBD; P ≤ 0.05) progesterone positive effect suggesting that this steroid, like AngII, acts through cyclooxygenases pathway to induce meiotic resumption. Results show that FGF10 interacts with follicular cells to inhibit AngII but not progesterone-induced meiotic resumption of bovine oocytes. / O presente trabalho teve por objetivo averiguar o papel do fator de crescimento fibroblástico 10 (FGF10) no reinício da meiose de oócitos bovinos, utilizando um modelo in vitro de co-cultivo de oócitos e células foliculares. Em um primeiro estudo, foi estabelecido um sistema de cultivo capaz de manter a osmolalidade dos meios constante na ausência de óleo. A adição de água entre os poços de placas de cultivo foi eficiente na prevenção da evaporação dos meios sendo uma alternativa na experimentação científica e produção in vitro de embriões. Com este sistema, se obteve uma taxa média de 30% de desenvolvimento embrionário, resultado similar ao obtido no sistema convencional (33% blastocistos). Após o estabelecimento do sistema, avaliou-se a participação do FGF10 no reinício da meiose de oócitos bovinos e sua interação com a maturação nuclear induzida por angiotensina II (AngII; 10-11M) e progesterona (100ng mL-1). Todas as concentrações de FGF10 testadas foram eficientes na inibição do reinício da meiose induzido por AngII (P ≤ 0,05). As maiores taxas de rompimento de vesícula germinativa (RVG) foram observadas na ausência de FGF10 (45,3%). Nas concentrações de 10, 100, e 1000ng mL-1 de FGF10, as taxas de RVG foram 30,2, 29,6 e 27%, respectivamente. Após o estabelecimento da dose ideal, foi verificado que a adição de FGF10 (100ng mL-1) ao cultivo de complexos cumulus-oócitos acarretou em diminuição na taxa de reinício da meiose somente na presença de células foliculares e AngII (37,8% e 62,6% de RVG com e sem FGF10, respectivamente; P ≤ 0,05). A partir dos resultados dos experimentos anteriores, o terceiro experimento foi delineado para testar se o FGF10 é capaz de inibir o reinício da divisão meiótica induzido por progesterona. A adição de FGF10 não afetou a taxa de reinício da meiose induzida pela progesterona (41,1% e 41,7% de RVG com e sem FGF10, respectivamente; P ≥ 0,05). Entretanto, a adição de indometacina (10μM) bloqueou (20,1% de RVG; P ≤ 0,05) o efeito positivo da progesterona. Este bloqueio demonstra que a progesterona, assim como já foi demonstrado para AngII, utiliza a via das ciclooxigenases para induzir o reinício da meiose e este evento parece não ser regulado pelo FGF10. Os resultados demonstram que o FGF10 interage com as células foliculares para inibir o reinício da meiose estimulado pela AngII mas não pela progesterona.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:18Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-08-10Bitstream added on 2014-06-13T19:35:12Z : No. of bitstreams: 1 cortejunior_ao_me_araca.pdf: 654847 bytes, checksum: bc307df312fdd42315035ada00da030f (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Seis novilhas Nelore tiveram seus ciclos estrais acompanhados durante diferentes estações do ano (outono n=11; inverno n=8; primavera n=9; verão n=9) com exames ultrassonográficos diários para contar e mensurar folículos ≥3mm. Amostras de sangue foram colhidas a cada 12h para hormônio luteinizante (LH) e progesterona (P4), e a cada 3h do estro até a ovulação para caracterizar o pico de LH. Cinco novilhas ovariectomizadas receberam 17β-estradiol (2μg/kg/p.v.) em cada estação, e amostras de sangue foram colhidas depois disso a cada 3h para quantificação de LH. A diferença percentual mensal ( %) do peso não variou entre as estações. A concentração média de P4 no ciclo estral foi maior (p=0,001) e o número de folículos menor (p=0,001) durante o outono (2,5±0,2ng/mL; 7,8±0,1) e verão (2,9±0,3ng/mL; 6,8±0,2) comparado com o inverno (1,4±0,2ng/mL; 9,6±0,3) e primavera (1,6±0,2ng/mL; 9,7±0,3). Durante o inverno houve mais ciclos estrais com três (5 de 8) e durante o verão somente ciclos com duas ondas foliculares (p=0,009). Como a secreção de LH não variou, apesar da variação sazonal na concentração de P4, e como houve correlação negativa entre os valores máximos de P4 e a variação percentual do fotoperíodo (p=0,0056; r = -0,4465), uma variação sazonal na sensibilidade das células luteínicas ao LH precisa ser avaliada. Nas novilhas ovariectomizadas, a concentração circanual de LH sem o estímulo de estradiol foi significante (p=0,0214). A resposta de LH ao tratamento de estradiol foi menor no verão (0,8±0,2ng/mL vs 1,3±0,5ng/mL). Nós supomos que existe variação sazonal na sensibilidade hipotalâmica ao estradiol. / Six Nelore heifers had their estrous cycle followed during different seasons of the year (autumn n=11; winter n=8; spring n=9 and summer n=9) with daily ultrasonographic exams to count and measure follicles ≥3mm. Blood was collected every 12h for luteinizing hormone (LH) and progesterone (P4), and every 3h from estrus until ovulation to characterize the LH peak. Five ovariectomized heifers were injected with 17β-estradiol (2μg/kg/LW) every season and blood samples were collected thereafter at 3h intervals for LH quantification. The monthly body weight percentile difference ( %) did not vary between seasons. Average P4 concentration for the cycle was higher (p=0.001) and follicle number lower during autumn (2.5±.2ng/ml; 7.8±.1) and summer (2.9±.3ng/ml; 6.8±.2) (p=0.001) compared to winter (1.4±.2ng/ml; 9.6±.3) and spring (1.6±.2ng/ml; 9.7±.3). During winter there were more estrous cycles with three follicle waves (5 out of 8) and during summer only cycles with two follicular waves (p=0.009). As LH secretion did not vary despite seasonal variation in P4 concentration and as there was a negative correlation between higher P4 values and daily percentile variation of photoperiod ( %, p=0.0056; r= -0.4465), a seasonal variation in luteal cell sensitivity to LH needs to be evaluated. In the ovariectomized Nelore heifers, the LH circanual concentration without estradiol stimulus was significant (p=0.0214). The LH response to estradiol treatment was lower in summer (0.8±.2ng/ml vs 1.3±.5ng/ml). We hypothesize there exists seasonal variation in hypothalamic sensitivity to estradiol.