Memoria para optar el título de Bioquímico / La presencia de asimetrías neuroanatómicas y funcionales en el cerebro de vertebrados es un rasgo ampliamente conservado que juega un papel importante en el comportamiento animal. El desarrollo diferencial de las mitades izquierda y derecha del cerebro se observa desde estados tempranos de la embriogénesis, lo que sugiere una regulación genética. Se ha descrito que la vía de señalización comandada por el factor de crecimiento TGFβ Nodal está involucrada en el establecimiento de asimetría de órganos internos en vertebrados. En pez cebra y medaka, los genes efectores de la vía Nodal, como el factor de transcripción pitx2c, se expresan en forma asimétrica a la izquierda del cerebro, precediendo el desarrollo de asimetrías neuroanatómicas. En pez cebra estas asimetrías incluyen al núcleo habenular y al complejo pineal. Al respecto, se sabe que el núcleo habenular izquierdo es más grande que el núcleo habenular derecho y que el órgano parapineal se localiza en la izquierda del diencéfalo. Estudios preliminares indican que el pez teleósteo medaka presenta un desarrollo de asimetrías neuroanatómicas similares a aquellas del pez cebra. De esta forma pez cebra y medaka son herramientas genéticas que nos permitirán comenzar a descifrar los mecanismos del desarrollo que participan en el establecimiento de las asimetrías neuroanatómicas en vertebrados. El objetivo de esta tesis fue determinar si las asimetrías neuroanatómicas de pez cebra y medaka se correlacionan con diferencias en la tasa de proliferación celular entre las habénulas izquierda y derecha, y si estas diferencias podrían estar controladas por el factor de transcripción pitx2c. Para el primer objetivo se realizaron experimentos de inmunoflurorescencia indirecta contra histona H3 fosforilada. Para el segundo objetivo, se midió la expresión de pitx2c mediante hibridaciones in situ sucesivas. Al respecto, en medaka, el ensayo contra histona H3 fosforilada muestra que existe una diferencia estadísticamente significativa en el número de células en proliferación entre ambas habénulas, a modo que el núcleo izquierdo presenta mayor número de éstas. Los resultados obtenidos sugieren la existencia de una asimetría izquierda/derecha en la tasa de proliferación celular, que es mayor para la mitad izquierda de la habénula. En pez cebra no fue posible realizar este ensayo, debido a que no se logró encontrar un marcador habenular que delimitara esta región en el embrión completo. En esta búsqueda se logró identificar un gen denominado cxcr4b, como un marcador de la zona más anterior de la habénula, donde su expresión muestra una clara tendencia a la asimetría. Por otro lado, se observó que tanto en pez cebra y en medaka, pitx2c se expresa unilateralmente en el epitálamo, específicamente en el lado izquierdo, desde estadios muy tempranos del desarrollo hasta estadios tardíos. La expresión más tardía no había sido descrita y está a favor de un posible papel de pitx2c en la morfogénesis asimétrica cerebral. Finalmente, se pudo establecer una correlación espacial y temporal entre la expresión de pitx2c y las asimetrías en la proliferación celular en la habénula de medaka, ya que los precursores habenulares izquierdos expresan pitx2c en el momento donde se observan las asimetrías en proliferación celular. Estos hallazgos deben ser en el futuro corroborados con experimentos de ganancia y pérdida de función de pitx2c / Neuroanatomical and functional asymmetries of the brain are conserved among vertebrates and play important roles in animal behaviour. Differences between the right and left sides of the brain have been described at early developmental stages, suggesting a genetic regulation of asymmetry. The Nodal pathway is one of many signalling pathways involved in the establishment of organ asymmetry in vertebrates. In zebrafish and medaka, effectors of the Nodal signaling pathway, such as the transcription factor pitx2c, are asymmetrically expressed in the left side of the brain, preceding the development of neuroanatomical asymmetries. Genetic studies in zebrafish have reported asymmetries within the epitalamic habenular nuclei and pineal complex. It is known that the left habenular nucleus is larger than the right nucleus, and that the parapineal organ is located on the left side of the diencephalon. Preliminary data indicate that medaka, a teleost similar to zebrafish, shows a similar pattern of neuroanatomical asymmetries in the brain. Therefore, zebrafish and medaka have emerged as genetic tools that will facilitate our understanding of the developmental basis of brain asymmetry. The aim of this thesis was to investigate whether the development of neuroanatomical asymmetries is associated with a differential rate of cell proliferation between the left and right habenular nuclei in zebrafish and medaka. In this thesis we also investigated whether differences in cell proliferation correlate with asymmetric expression of the transcription factor pitx2c. The first aim was approached using indirect immunofluorescence against phosphorylated histone H3. For the second aim, the pattern of expression of pitx2 was determined through in situ hibridization. The antibody essay against phosphorylated histone H3 in medaka revealed a difference in the number of proliferating cells within the habenulae, the left nucleus showing a larger amount of proliferating cells. These results suggest an asymmetric pattern of cell proliferation, in favor of the left habenular nucleus. It was not possible to perform the same assay in zebrafish due to the lack of an habenular marker that would allow us to circumscribe this region in the whole embryo. In this research, we were able to identify cxcr4b as a marker of the anterior habenular region, where its expression was clearly asymmetric. pitx2c was expressed unilaterally in the left epitalamic region of zebrafish and medaka, from early to late developmental stages. The late expression of pitx2c, which was not described before, supports a possible role of pitx2c during asymmetric morphogenesis of the brain. Finally, a spatial and temporal correlation was established between pitx2c expression and asymmetries in cellular proliferation in the habenulae of medaka. Precursors of the left habenular nucleus express pitx2c at the same time when asymmetries in cell proliferation are observed. These findings must be investigated further using pitx2c gain and loss of function experiments

Presentada a la Universidad de Chile para optar al Grado de Doctor en Farmacología / El cáncer de mama es el cáncer más frecuentemente diagnosticado y la principal causa de muerte en mujeres en el mundo. Este cáncer es una enfermedad heterogénea compuesta por varios sub-tipos biológicamente distintos, en los cuales la participación del metabolismo en la proliferación celular permanecen pobremente entendido. Además, las células tumorales exhiben una alta capacidad de remodelar su metabolismo frente a cambios en la disponibilidad de sustratos o algún estrés metabólico, siendo una respuesta adaptativa que promueve la sobrevida celular. Sin embargo, la participación del metabolismo mitocondrial en la proliferación y la inducción de un remodelamiento metabólico mediante la inhibición farmacológica de la cadena transportadora de electrones (CTE) para obtener efectos anti-proliferativos permanecen escasamente explorados en células de cáncer de mama. Los resultados sugieren que las líneas celulares de cáncer de mama, comparadas con las células no-tumorales, presentan diferencias en el metabolismo mitocondrial, exhibiendo reducida capacidad de reserva y funcionando su CTE en su máxima velocidad. Además, las células de cáncer de mama exhiben diferentes dependencias sobre la disponibilidad de glucosa y glutamina para mantener la proliferación y frente a la privación de glucosa, pueden remodelar la organización bioenergética hacia el metabolismo mitocondrial. De forma interesante, estos datos sugieren que el funcionamiento de la CTE en células tumorales podría ser esencial para funciones celulares y que su bloqueo podría tener efectos anti-tumorales selectivos. A partir de una serie de compuestos con estructura química de tipo quinona/hidroquinona, se identificó un compuesto (Cpd.7) con efecto anti-proliferativo selectivo hacia células de cáncer de mama murinas y humanas. Cpd. 7 fue identificado como un inhibidor no-competitivo de la actividad del complejo I, con un sitio de unión putativo en el brazo hidrofóbico cercano al sitio de unión de ubiquinona. Este compuesto inhibió la respiración mitocondrial dependiente del complejo I, disminuyó la razón NAD+/NADH, produjo despolarización mitocondrial, afectando solo a tiempos tempranos los niveles de ATP. En células tumorales, Cpd. 7 produjo un selectivo remodelamiento metabólico hacia un fenotipo glicolítico dependiente de AMPK, siendo un mecanismo de sobrevida. De forma interesante, la disponibilidad de sustratos y la flexibilidad metabólica exhibida por células tumorales son factores que determinan el efecto de Cpd. 7, variando entre un efecto citotóxico o anti-proliferativo. Cpd. 7 afecta selectivamente la proliferación de células de cáncer de mama, induciendo detención del ciclo celular y senescencia. Este efecto es debido los cambios en la razón NAD+/NADH producida por la inhibición de la respiración mitocondrial, alterando la síntesis de amino ácidos (especialmente aspartato), los cuales son requeridos como precursores para la síntesis de nucleótidos durante la proliferación. En conclusión, en este trabajo se demuestra que la inhibición de la CTE a nivel del complejo I por pequeñas moléculas produce efectos anti-proliferativos, los cuales son mediados por la inducción de un selectivo remodelamiento metabólico en células de cáncer de mama / Breast cancer is the most frequently diagnosed cancer and the leading cause of death from cancer in women worldwide. This cancer is a heterogeneous disease comprised of several biologically distinct sub-types, in which the participation of the metabolism in the proliferation remain poorly understood. In addition, cancer cells exhibit a high capacity to remodel the metabolism in response to changes in the substrate availability or some metabolic stress, being an adaptive response that promote the cell survival. However, the participation of mitochondrial metabolism in the proliferation and the induction of a metabolic remodeling though the pharmacologic inhibition of the electron transport chain (ETC) to obtain anti-proliferative effect remains scarcely explored in breast cancer cells. Results suggest that the cell lines of breast cancer, compared to the non-tumoral cells, show differences in the mitochondrial metabolism, exhibiting reduced spare capacity and a high ETC activity. Moreover, breast cancer cells exhibit different dependence on glucose and glutamine availabilities to maintain the proliferation and under glucose deprivation, they can remodel the bioenergetic organization toward the mitochondrial metabolism. Interestingly, these data suggest that the ETC function in breast cancer cells may be essential for cellular functions and blocking may have selective anti-cancer effects. From a series of new compounds with chemical structure with quinone/hydroquinone scaffold, it was identified a compound (Cpd.7) with selective anti-proliferative effect toward murine and human breast cancer cells. Cpd. 7 was identified as a non-competitive inhibitor of complex I activity with a putative binding site in the hydrophobic arm next the binding site of ubiquinone. This compound inhibited the Complex I-dependent mitochondrial respiration, decreased the NAD+/NADH ratio, induced mitochondrial deporalization, affecting the ATP levels only at short time of exposition. In cancer cells, Cpd. 7 induced a selective metabolic remodeling toward a AMPK-dependent glycolytic phenotype, being a survival mechanism. Interestingly, the substrate availability and metabolic flexibility exhibited by breast cancer cells are determinants of the anti-cancer effect of Cpd.7, ranging from cytotoxic and anti-proliferative effects. Cpd. 7 selectively affects the proliferation of breast cancer cells, inducing cell cycle arrest and senescence. This effect occurs due changes in the NAD+/NADH ratio produced by the inhibition of the mitochondrial respiration, altering the amino acid synthesis (especially aspartate), which are required as precursors in the nucleotide synthesis during the proliferation. In conclusion, this work shows that the inhibition of ETC function at complex I level by small molecules produces anti-proliferative effects, which are mediated by the induction of a selective metabolic remodeling in breast cancer cells / Fondecyt; Fondap

Las enfermedades neurodegenerativas de la retina, como la Retinitis Pigmentosa (RP), se caracterizan por la pérdida de las neuronas fotorreceptoras por apoptosis, que conduce a la ceguera. Pese a la extensa investigación realizada no se ha podido avanzar en su tratamiento; sin embargo, la posibilidad de regeneración neuronal y la identificación de células progenitoras multipotentes (stem cells) en la retina (Reh y col., 1998; Tropepe y col., 2000), permiten proponer la combinación de dos enfoques simultáneos para el tratamiento de estas enfermedades: impedir la apoptosis de los fotorreceptores y estimular la proliferación de progenitores neuronales para restaurar las neuronas perdidas. La aplicación de este nuevo enfoque requiere un conocimiento a nivel molecular de los mecanismos de regulación del ciclo celular y de aquellos que posibilitan inducir la diferenciación de progenitores indiferenciados en el tipo neuronal deseado. En el laboratorio de Neurobiología del INIBIBB se ha establecido que dos factores tróficos participan activamente en la regulación del ciclo celular de neuroblastos precursores de fotorreceptores: el Factor Neurotrófico Derivado de la Glia (GDNF), que aumenta el número de precursores multipotentes y estimula el ciclo celular, y el Acido Docosahexaenoico (DHA) que induce la salida del ciclo celular de los fotorreceptores y estimula su diferenciación (Rotstein y col., 1996; Rotstein y col., 1997; Rotstein y col., 1998; Politi y col., 2001a; Politi y col., 2001b; Insua y col., 2003). Esto indicaría que en conjunto, ambos factores tróficos estarían actuando para definir el número final de fotorreceptores en la retina, a través del control de la proliferación, diferenciación y supervivencia. Trabajos realizados en el laboratorio nos han permitido establecer por primera vez que la ceramida actúa como segundo mensajero en neuronas de retina de rata, activando la apoptosis inducida por estrés oxidante (German y col., 2006b). Determinamos también que el DHA disminuye los niveles de ceramida para proteger a los fotorreceptores de dicho estrés, modulando la actividad y/o niveles de la glucosil ceramida sintetasa. Estos hallazgos sugieren que otras enzimas de esta vía, y por consiguiente otros esfingolípidos bioactivos podrían intervenir en el control de la supervivencia, proliferación y diferenciación neuronales. La esfingosina-1-fosfato (S1P) es un esfingolípido con importantes funciones biológicas; actúa como molécula señal extra e intracelular, regulando procesos biológicos críticos, como la proliferación, diferenciación, y supervivencia. La ceramida-1-fosfato (C1P) es otro esfingolípido cuyas funciones como regulador de la supervivencia y proliferación celular han sido descubiertas recientemente. La información existente sobre el rol de la S1P y C1P en el sistema nervioso y en la retina es muy escasa. Por ello fueron objetivos centrales de este trabajo de tesis investigar si la S1P y la C1P tienen un papel regulatorio en la proliferación y diferenciación neuronal en la retina. Existen numerosos modelos animales de las enfermedades neurodegenerativas de la retina que posibilitan evaluar los mecanismos moleculares involucrados en la degeneración, así como terapias para el tratamiento de las mismas. El ratón rd1 es uno de los animales más usados como modelo de estas enfermedades, ya que presenta una pérdida selectiva, irreversible y rápida de los fotorreceptores. Por estos motivos, elegimos este modelo para estudiar el proceso de degeneración in vitro de los fotorreceptores y el efecto del DHA sobre dicho proceso. El hallazgo de que los fotorreceptores de ratones rd degeneran por apoptosis durante el desarrollo temprano in vitro, y la reciente identificación en nuestro laboratorio de la ceramida y la esfingosina como mediadores claves en la apoptosis inducida por daño oxidante o por ausencia de factores tróficos de los fotorreceptores de retina de rata (German y col., 2006b; Abrahan y col., 2009a), nos llevaron a investigar también si estos esfingolípidos tendrían un papel en la apoptosis de los fotorreceptores rd durante el desarrollo temprano in vitro. El sistema de cultivo in vitro utilizado en nuestro laboratorio posibilita obtener cultivos neuronales puros enriquecidos en neuronas fotorreceptoras y amacrinas a partir de retinas de ratas y ratones de 0 a 2 días de nacidos, y mantenerlas por una a dos semanas en medio químicamente definido. La utilización de estos cultivos permitió analizar los mecanismos moleculares que rigen la proliferación, diferenciación y supervivencia de las neuronas fotorreceptoras y la modulación de dichos procesos por diversos factores. Uno de los objetivos de este trabajo de tesis fue evaluar los efectos de la S1P sobre la proliferación de progenitores de fotorreceptores. Utilizando cultivos neuronales de retina de ratas de día 0, determinamos que la S1P aumentó diversos parámetros indicadores del avance del ciclo celular, como la incorporación de BrdU y la cantidad de figuras mitóticas observadas, lo que sugiere que promueve la proliferación de los progenitores de fotorreceptores en cultivo. Analizamos además el papel de la S1P en la diferenciación de los fotorreceptores, una vez avanzado el desarrollo in vitro. Utilizando inmunocitoquímica y Western Blot establecimos que la S1P promovió la expresión de dos proteínas específicas de este tipo celular, la opsina, que forma parte del pigmento visual, y la periferina, proteína de los discos de los segmentos externos. La estimulación de la expresión de opsina y periferina fue independiente del transporte retículo endoplasmático-Golgi, ya que no se vio afectado por el tratamiento con Brefeldina A (BFA), que bloquea dicho transporte. La S1P también estimuló la formación de rudimentos de los segmentos externos, denominados procesos apicales, y promovió la localización de opsina y periferina en dichas estructuras, proceso bloqueado por la BFA. Estos resultados indican que la S1P tendría una acción a nivel transcripcional, sobre la expresión de opsina y periferina, no alterada por el agregado de BFA, pero su efecto sobre la formación de los procesos apicales requeriría del tráfico de estas proteínas al extremo de los cilios para su localización en los segmentos externos. Investigamos después si la S1P podría actuar como mediadora de los efectos de diversos factores tróficos sobre los fotorreceptores. En otros tipos celulares, se ha establecido que distintos factores tróficos aumentan los niveles de la S1P. Nuestro hallazgo previo de que el DHA modula la actividad de la glucosil ceramida sintetasa y la similitud de los efectos ejercidos por la S1P con los de GDNF y DHA nos llevó a investigar si estos factores tróficos podrían modular los niveles de la S1P para ejercer sus acciones en las neuronas fotorreceptoras. Determinamos que tanto el GDNF como el DHA requieren de un aumento en los niveles de S1P para producir sus efectos. La inhibición de la esfingosina quinasa 1 (SphK1), enzima involucrada en la síntesis de S1P, con un inhibidor competitivo, el DHS, bloqueó los efectos del GDNF y del DHA sobre la proliferación y diferenciación de las neuronas fotorreceptoras. Evaluamos entonces a través de qué mecanismos el GDNF y DHA afectaban la síntesis de S1P. Para ello, investigamos su efecto en la expresión de la SphK1, mediante inmunocitoquímica y Western Blot. Demostramos que ambos factores tróficos aumentaron la expresión de la enzima y promovieron su localización en la membrana plasmática, mecanismo promovido por otros factores tróficos para activar a esta enzima (Toman y col., 2004). Los resultados obtenidos indican que la S1P sería un mediador de los efectos de los factores estudiados, para promover la proliferación y diferenciación de los fotorreceptores. Otro de los objetivos de este trabajo de tesis fue evaluar los efectos de la C1P en las neuronas fotorreceptoras de retina. El agregado de C1P a los cultivos neuronales obtenidos utilizando retinas de ratas de día 0 generó un aumento en la proliferación de los progenitores de fotorreceptores. Observamos también que la C1P promovió la diferenciación de estas neuronas a tiempos más avanzados del desarrollo in vitro, estimulando la expresión de opsina y periferina, favoreciendo la formación de procesos apicales y promoviendo la localización de dichas proteínas en los mencionados procesos. Estos efectos de la C1P son muy semejantes a los establecidos para la S1P, e indican que también la C1P podría estar implicada en la regulación del desarrollo de las neuronas fotorreceptoras. Otro de los objetivos de mi trabajo de tesis fue investigar el avance del proceso de degeneración in vitro de los fotorreceptores de ratones rd1 y el efecto del DHA sobre dicho proceso, comparándolo con el desarrollo de fotorreceptores obtenidos de retinas de ratones salvajes (wt). Determinamos que los fotorreceptores de ambas cepas murinas sufren un proceso de degeneración similar, con un aumento progresivo en la apoptosis. Esta apoptosis ocurre por la vía mitocondrial, ya que se observó una disminución en el número de fotorreceptores que presentaron depolarización mitocondrial. El DHA tuvo un efecto protector sobre los fotorreceptores de los ratones rd, disminuyendo la progresión de la apoptosis de los fotorreceptores durante el desarrollo temprano in vitro. En los fotorreceptores wt se observó un comportamiento similar. Investigamos también el proceso de diferenciación de los fotorreceptores en ambas cepas y el efecto del DHA sobre dicho proceso. Determinamos que a medida que trascurrió el tiempo de cultivo se evidenció un aumento en los parámetros de diferenciación de los fotorreceptores rd. El DHA estimuló esta diferenciación aumentando la expresión de opsina, la formación de procesos apicales y promoviendo la localización de esta proteína en dichos procesos. Un efecto semejante fue observado en los fotorreceptores wt. Investigamos también la posible participación de la ceramida como mediador en la apoptosis de los fotorreceptores rd. Inhibiendo la síntesis de ceramida con Fumonisina B1 determinamos que el bloqueo de dicha síntesis previno la muerte de los fotorreceptores, disminuyendo su apoptosis. Este resultado sugiere que el aumento en los niveles endógenos de ceramida sería necesario para la activación de la apoptosis de los fotorreceptores rd. Para discernir si la ceramida y/o el producto de su hidrólisis, la esfingosina, actúan como disparadoras de esta muerte, evaluamos el efecto de un inhibidor de la ceramidasa alcalina, el MAPP, sobre dicha muerte. Establecimos que, al contrario de lo que ocurre en la rata, la inhibición de la síntesis de esfingosina no disminuyó la apoptosis de los fotorreceptores, sino que por el contrario, generó un ligero aumento en dicha apoptosis. Estos resultados permiten proponer que la ceramida, y no la esfingosina, sería un mediador clave en la activación de la apoptosis de los fotorreceptores rd. En conclusión, los principales resultados obtenidos en este trabajo de tesis son:  La S1P estimula la proliferación de neuroblastos progenitores de fotorreceptores de rata en cultivo.  La S1P promueve la diferenciación de las neuronas fotorreceptoras in vitro, incrementando los niveles de expresión de proteínas de los segmentos externos y estimulando la formación de procesos apicales.  La formación de los procesos apicales inducida por la S1P y el DHA requiere del tráfico de opsina y periferina al extremo de los cilios para su localización en los segmentos externos.  El GDNF y el DHA aumentan la expresión de la SphK y promueven su localización en la membrana plasmática, incrementando su actividad para generar un aumento en los niveles de S1P.  La S1P actúa como un mediador esencial para los efectos del GDNF y DHA sobre los fotorreceptores.  La C1P estimula la proliferación de los progenitores de fotorreceptores.  La C1P promueve la diferenciación de las neuronas fotorreceptoras en cultivo.  El DHA incrementa la supervivencia de las neuronas fotorreceptoras de ratones rd y wt durante el desarrollo temprano in vitro.  El DHA estimula la diferenciación de las neuronas fotorreceptoras de ratones rd y wt.  La apoptosis de los fotorreceptores de ratones rd ocurre durante el desarrollo temprano in vitro requiere de la síntesis de ceramida pero no de la de su metabolito esfingosina. / Neurodegenerative diseases of the retina, such as Retinitis Pigmentosa (RP), are characterized by the apoptosis of photoreceptors, leading to blindness. In spite of extensive research, treatments for these pathologies are still lacking; the accomplished knowledge about neuronal regeneration and the identification of stem cells in the retina (Reh y col., 1998; Tropepe y col., 2000), let us propose the combination of two simultaneous strategies in order to restore lost neurons: to stop photoreceptor apoptosis and stimulate neuronal progenitors proliferation. This approach requires a comprehensive knowledge on the molecular mechanisms that control cell cycle, and the subsequent differentiation of neuronal progenitors into the required neuronal type. It has been established in our Laboratory of developmental neurobiology in the INIBIBB that two trophic factors actively participate in cell cycle regulation of photoreceptor progenitors: Glial Derived Neurotrophic Factor (GDNF), which promotes multipotent progenitors proliferation; and docosahexaenoic acid (DHA), which induces photoreceptor cell cycle exit and promotes their differentiation (Rotstein y col., 1996; Rotstein y col., 1997; Rotstein y col., 1998; Politi y col., 2001a; Politi y col., 2001b; Insua y col., 2003). Therefore, both trophic factors would define the final number of retinal photoreceptors, through the regulation of their proliferation, differentiation and survival. Previous work from our laboratory established that ceramide acts as a second messenger in oxidative stress-induced apoptosis in rat retinal neurons (German y col., 2006b). We also determined that DHA decreases ceramide levels to protect photoreceptors from this stress, modulating the activity and/or levels of glucosylceramide sinthase. These findings suggest that other enzymes and bioactive sphingolipids could also participate in the regulation of neuronal survival, proliferation and differentiation. Sphingosine-1-phosphate (S1P) is a sphingolipid with important biological functions; it acts as an extra- and intra-cellular signaling molecule, regulating critical biological processes such as proliferation, differentiation and survival. Ceramide-1-phosphate (C1P) is another sphingolipid whose functions as a survival and proliferation regulator have been recently discovered. However, information regarding the roles of S1P and C1P in the Central Nervous System and in the retina, in particular, is very scarce. Hence, a purpose of this work was to investigate the roles of S1P and C1P in retinal neuronal proliferation and differentiation. There are many animal models of retinal neurodegenerative diseases that allow studying the molecular mechanisms involved in degeneration and also evaluate possible therapeutic treatments. The rd1 mice are among the most popular animal models used for these purposes, since they present a selective, irreversible and rapid loss of photoreceptors. Hence, we chose the rd mice model to study photoreceptor degeneration in vitro and the effect of DHA on this process. The finding that rd photoreceptors degenerate by apoptosis during early development in vitro and our recent identification that ceramide and sphingosine act as mediators of oxidative stress- or lack of trophic factors- induced photoreceptor apoptosis in rat retina (German y col., 2006b; Abrahan y col., 2009a), prompted us to investigate if these sphingolipids might have a role in rd photoreceptor apoptosis during early development in vitro. The in vitro culture system used in our laboratory allow us obtain pure neuronal cultures enriched in photoreceptor and amacrine neurons, from 0 to 2 days old- rat and mouse retinas, in which cells survive up to two weeks in a chemically defined medium. This culture system provided a useful tool to analyze the molecular mechanisms regulating photoreceptor neurons proliferation, differentiation and survival, and investigate the role of diverse factors on these processes. One of the purposes of this thesis was to evaluate S1P effects on the proliferation of photoreceptor progenitors. Using PN0 rat retinal neuronal cultures we determined that S1P increased several markers of cell cycle progression, such as BrdU uptake and the amount of mitotic figures, suggesting that S1P promotes proliferation of photoreceptor progenitors in culture. We also analized the role of S1P in photoreceptor differentiation. Using immunocytochemistry and Western Blot we established that S1P promoted the expression of two photoreceptor specific proteins, opsin, which forms the visual pigment; and peripherin, a structural protein of outer segment discs. Enhancement of opsin- and peripherin- expression was independent of endoplasmatic reticulum-Golgi transport, since it was not affected by Brefeldin A (BFA), which blocks this transport. S1P also stimulated the formation of rudimentary outer segments, named apical processes, and promoted opsin and peripherin localization in these structures, a process that was blocked by BFA. These results indicate that S1P might act at the transcriptional level to promote both opsin and peripherin expression, which is not altered by BFA, but its effect on apical processes formation, would require the traffic of these proteins to the end of the cilia, to build outer segments. In different cell types, several trophic factors have been shown to increase S1P levels. Our recent finding showing that DHA modulates glucosylceramide synthase activity (German y col., 2006b), and the similarity of S1P effects with those of GDNF and DHA, led us to investigate if these trophic factors could modulate S1P levels to signal their actions in photoreceptor neurons. We determined that GDNF and DHA required an increase in S1P levels to produce their effects. The inhibition of Sphingosine kinase 1 (SphK1), the enzyme involved in S1P synthesis, with a competitive inhibitor, DHS, blocked GDNF and DHA effects on proliferation and differentiation of photoreceptors, respectively. Then we evaluated through which mechanisms GDNF and DHA affected S1P synthesis. For this purpose, we investigated their effects on SphK1 expression by immunocitochemistry and Western Blot. We demonstrated that both trophic factors increased SphK1 expression and promoted its localization on plasma membrane, a mechanism already demonstrated for other trophic factors to enhance SphK1 activity (Toman y col., 2004). These results suggest that S1P is a mediator of GDNF and DHA to promote photoreceptors proliferation and differentiation. We also evaluated C1P effect on retinal photoreceptors. C1P addition to neuronal cultures from PN0 retinas generated an increase in the proliferation of photoreceptor progenitors. We also observed that C1P promoted photoreceptor differentiation at later time of development in vitro, stimulating opsin and peripherin expression, favoring apical processes formation, and promoting the localization of these proteins in these apical processes. C1P effects are similar to those established for S1P, and suggest that C1P could also be implicated in the development of photoreceptors. One of the purposes of my thesis work was to investigate the progression of the degeneration process in rd1 mouse photoreceptors in vitro and the effect of DHA on this process, and compare it with what occurs in photoreceptors from wild type (wt) mice. We determined that photoreceptors from both animal strains suffer a similar degeneration process, with a progressive increase in apoptosis. This apoptosis occurs through the mitochondrial pathway, since less photoreceptors preserving their mitochondrial membrane potential were observed as their time in vitro increased. DHA had a protective effect on rd photoreceptors, decreasing apoptosis progression during early development in vitro; a similar effect was observed in wt photoreceptors. We also investigated photoreceptor differentiation in both mouse strains and the effect of DHA supplementation on this process. We established that during an increase in rd photoreceptors differentiation parameters was observed with time in culture. DHA stimulated this differentiation: it increased opsin expression, promoted the formation of apical processes and the localization of opsin in these structures. A similar effect was observed in wt photoreceptors. We also investigated the involvement of ceramide as a mediator of apoptosis in rd photoreceptors. By inhibiting ceramide synthesis with Fumonisin B1 we determined that blocking this synthesis prevented photoreceptor death, decreasing apoptosis. This result suggests that an increase in ceramide endogenous levels would be necessary to trigger apoptosis in rd photoreceptors. To discern if ceramide by itself or together with its metabolite sphingosine were responsible for this death, we evaluated the effect of an alkaline ceramidasa inhibitor, MAPP. We established that inhibiting sphingosine synthesis did not decrease photoreceptor apoptosis, as it occurs in rat photoreceptors; on the contrary, this inhibition slightly increased cell death. These results let us propose that ceramide, and not sphingosine, might be a key mediator of apoptosis in rd photoreceptors. The most important results obtained in this thesis are: S1P stimulates the proliferation of rat photoreceptor progenitors in culture.  S1P promotes photoreceptor differentiation in vitro, increasing the expression of outer segment- proteins and stimulating the formation of apical processes.  Formation of apical processes induced by S1P and DHA required the traffic of opsin and peripherin to the end of the cilia, for them to be further localized in the developing outer segments.  GDNF and DHA increase SphK expression and promote its translocation to the plasma membrane, increasing its activity to produce S1P.  S1P acts as an essential mediator for GDNF and DHA effects on photorreceptors.  C1P stimulates proliferation of photoreceptor progenitors.  C1P promotes differentiation of photoreceptors in culture.  DHA increases the survival of rd and wt photorreceptors during early development in vitro.  DHA stimulates differentiation of rd and wt photorreceptors.  Induction of apoptosis in rd photoreceptors during early development in vitro requires ceramide synthesis but not of its metabolite sphingosine.

Memoria para optar al título de Químico / En este trabajo se informa la síntesis y caracterización de una serie de acilhidroquinonas lipofílicas, portadoras de un átomo de bromo o del catión trifenilfosfonio en el fragmento acílico, características que permiten una mayor incorporación a las mitocondrias. Para la síntesis de acilhidroquinonas se utilizó el reordenamiento de Fries, donde se usa un ácido de Lewis fuerte como el BF3.2H2O y como reaccionantes, diversos ácidos carboxílicos sustituidos con un átomo de bromo terminal e hidroquinona. En una segunda etapa se lleva a cabo la formación de las sales de fosfonio a partir de las nuevas acilhidroquinonas, mediante la sustitución del átomo de bromo con trifenilfosfina. Estos compuestos fueron caracterizados espectroscópicamente mediante resonancia magnética nuclear (1H y 13C). Interesantemente, una de las sales de fosfonio mostró una alta actividad de inhibición de la proliferación celular, frente a células de tumores mamarios humanos metastásicas (MDA MB231) y no metastásicas (MCF7) / The aim of this thesis is the synthesis of a series of lipophilic acylhidroquinones which exhibits in their structures a bromine atom or the cation triphenylphosphonium at the acylic fragment, to target them to mitochondria. Fries rearrangement, wherein a strong Lewis acid such as BF3.2H2O was used, starting from hydroquinone and carboxylic acids bearing a bromine atom in their structures was performed. In a second stage, the phosphonium salts derivatives were obtained by reaction of bromoacyl hidroquinones with triphenylphosphine. These compounds were characterized spectroscopically by NMR (1H and 13C), one of the phosphonium salts showed an interesting antitumor activity against metastatic cells from human breast tumors (MDA MB231) and non-metastatic (MCF7) / FONDECYT

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La calreticulina (CRT) es una proteína chaperona del retículo endoplásmico, que está ampliamente distribuida en las células eucariotas. Diversos estudios in vitro e in vivo han demostrado que la CRT tiene un importante rol en la cicatrización de heridas cutáneas y diversos procesos asociados con la reparación cutánea, como la proliferación y migración celular. La CRT está constituida por tres dominios distintos, estructural y funcionalmente hablando, donde el dominio P y C contienen sitios de interacción con calcio y el dominio N contiene una secuencia de señal dirigida al retículo endoplásmico. Asimismo, se sabe que el dominio "N" es el responsable del efecto antiangiogénico y antitumoral descrito para ésta proteína, y el subdominio "S" de la inhibición de la vía clásica del sistema del complemento humano. Sin embargo, no han sido determinados aún los dominios específicos de CRT implicados en el proceso de cicatrización de heridas. El objetivo principal de esta memoria de título fue analizar los dominios responsables de la proliferación y migración celular, lo cual se realizó comparando el efecto de Calreticulina de Trypanosoma cruzi recombinante (rTcCRT) con dos de sus dominios (N y S), en cicatrizaciones de heridas in vitro, con fibroblastos dérmicos de ratas. rTcCRT completa indujo un mayor porcentaje de migración celular en comparación a los dominios N y S. Por otro lado, los dominios N y N+S indujeron mayor aumento en el número de células viables. Estos resultados sugieren que el dominio N-terminal de rTcCRT es el que estimula proliferación celular y el dominio C, es el posible responsable de la inducción de migración celular generada por rTcCRT. / Calreticulin (CRT) is a chaperone protein of the endoplasmic reticulum, which is widely distributed in eukaryotic cells. Various studies in vitro and in vivo have shown that CRT plays an important role in wound healing and various processes associated with skin repair, such as wound cell proliferation and migration. CRT is comprised of three distinct structural and functionally speaking domains, where P and C domain contain calcium interaction sites and N domain contains a signal sequence to the endoplasmic reticulum. It is also known that the "N" domain it is responsible for the anti-angiogenic and antitumor effect described for this protein, and "S" subdomain of the inhibition of classical pathway of human complement system. However, they have not yet been determined CRT specific domains involved in the wound healing process. The main aim of this research was to analyze the responsible domains for cell proliferation and migration, this was done comparing the effect of the recombinant Trypanosoma cruzi Calreticulin (rTcCRT) and their two domains, N and S, in scarring wounds in vitro, with rat dermal fibroblasts. Complete rTcCRT showed a higher percentage of cell migration compared to N and S domains. On the other hand, N and N+S domains induced grater increase in the number of viable cells. These results suggest that the N-terminal domain stimulates cell proliferation and C-domain, is possible responsible for the induction of cell migration by rTcCRT. / Financiamiento: Proyecto Fondecyt 11130257.

Los receptores de neurotransmisores son elementos clave en la comunicación neuronal. Conforman proteínas integrales de membrana especializadas que median respuestas de tipo excitatoria y/o inhibitoria. Estos receptores, junto a enzimas y proteínas que modulan el metabolismo del neurotransmisor, constituyen verdaderos sistemas organizados para una transmisión de la información correcta y eficaz. Los recep-tores de neurotransmisores pertenecientes a la familia Cys-loop, son canales iónicos activados por ligando. A esta familia pertenecen los receptores nicotínicos de acetilcolina (AChRn), los receptores ionotrópicos de GABA, los receptores de sero-tonina tipo 3 (5HT3), los receptores de glicina (Gly-R) y los receptores de zinc. Estos receptores también han sido identi-ficados en otros tejidos, por ejemplo epitelio respiratorio, pán-creas, endotelio y células inmunes. Existen trabajos que pos-tulan que estos sistemas no-neuronales ejercen una actividad moduladora de procesos celulares tales como diferenciación, migración y proliferación. Sin embargo la función de estos sistemas aún no está completamente esclarecida. El objetivo de esta tesis es identificar y caracterizar dos sistemas de neurotransmisores en linfocitos humanos: el sistema colinér-gico y el sistema GABAérgico. En primer lugar determinamos la participación del AChRn α7 durante la activación de linfocitos T estimulados con un mitógeno (PHA). Establecimos que durante este proceso aumenta la producción del neurotrans-misor ACh, así como también los niveles de ARN mensajero (ARNm) y de proteína del receptor α7. Además, demostramos que la modulación de dicho receptor por agonistas y anta-gonistas específicos, inhibe y potencia la proliferación de estas células, respectivamente. En segundo lugar caracteri-zamos la presencia de un sistema GABAérgico completo en linfocitos humanos, similar al descripto en neuronas. Deter-minamos la presencia de enzimas y proteínas que llevan a cabo la síntesis, transporte y catabolismo del neurotransmisor GABA, así como también la presencia y actividad de transpor-tadores de membrana y de receptores ionótropicos de GABA. Al evaluar este sistema durante el proceso de activación, observamos que existe un aumento tanto de los componentes GABAérgicos como de la actividad de los transportadores y receptores, respecto a las células no estimuladas. También observamos que la activación de los receptores por el propio neurotransmisor o por agonistas específicos como muscimol, provoca una disminución de la proliferación inducida por el mitógeno. Por último, evaluamos la propiedad de plasticidad de estos receptores no neuronales, utilizando como estímulo la exposición a GABA. Se observaron cambios en la expresión del ARNm y en las proteínas de las subunidades de los recep-tores. Se determinó que durante la exposición al neurotrans-misor se activa la vía de Akt. Esta proteína fosforila las subunidades de los receptores de GABA ocasionando una mayor expresión de los mismos en membrana. Estos cambios se corroboraron al detectar un mayor porcentaje de células que responden electrofisiológicamente a la aplicación de GABA. El trabajo desarrollado en esta tesis aporta nuevos datos acerca de las propiedades y funciones de los sistemas neuro-nales presentes en linfocitos. Nuestros resultados podrían ser de gran utilidad para el diseño de nuevos tratamientos farma-cológicos que actúen sobre estos sistemas, presentando nuevas alternativas en la modulación de la respuesta inmune. / Neurotransmitter receptors are key elements in neuronal communication. They are transmembrane proteins specialized in mediating both excitatory and/or inhibitory responses. These receptors, as well as the enzymes and proteins that are responsible for neurotransmitter metabolism, form orga-nized systems for an efficient and appropriate neuronal transmission. Neurotransmitter receptors that belong to the Cys-loop family are ligand-gated ion channels. Nicotinic acetylcholine receptors (nAChR), ionotropic GABA receptors, serotonin type 3 receptors (5HT3), glycine receptors (Gly-R) and zinc receptors are members of this family. The presence of these receptors has been reported in non-neuronal tissues, such as respiratory epithelium, pancreas, endothelium and immune cells. Previous studies have proposed that these non-neuronal systems are involved in different cellular processes like migration, differentiation and proliferation. However, little is known about their functional role. The aim of this thesis is to identify and characterize two neurotransmitter systems in human lymphocytes: the cholinergic system and the GABAer-gic system. Firstly, we have determined the participation of the α7 nAChR in mitogen (PHA)-induced T cell activation. We have established that ACh synthesis as well as a7 messenger RNA (mRNA) and receptor levels increase during lymphocyte activation. We have also demonstrated that α7 nAChR modu-lation by specific agonist and antagonist drugs, inhibits and stimulates lymphocyte proliferation, respectively. Secondly, we have characterized the presence of a complete, neuronal-like GABAergic system in human lymphocytes. We have determined the presence of enzymes and proteins responsible for the synthesis, transport and degradation of the neuro-transmitter GABA, and the presence of membrane transporters and ionotropic GABA receptors. We have also observed an increase in these GABAergic elements and in their activity during lymphocyte activation. In addition, we have detected a decrease in mitogen-induced proliferation produced by the activation of ionotropic GABA receptors with GABA and the specific agonist, muscimol. Finally, we have studied the plas-ticity of these non-neuronal receptors during GABA exposure. We have detected changes in the mRNA and protein levels of GABA receptor subunits. We have also observed an increase in the activation of the Akt pathway during GABA incubation, which leads to GABA receptor subunit phosphorylation, resul-ting in a higher receptor expression in the cell membrane. These changes correlate with the detection of a higher number of cells showing electrophy-siological activity during GABA exposure. Findings from these Ph. D. thesis provide new data about the properties and functions of the neurotrans-mitter systems present in immune cells. Our results could be useful tools for the design of new pharmacological treatments targeting on these systems, to finally introduce alternatives for the modulation of the immune response.

Doctora en Bioquímica / Autor no autoriza el acceso a texto completo de su documento hasta diciembre de 2015 / El endometrio es un tejido que requiere de la acción de los esteroides para su correcta función; de modo que patologías que alteren la concentración de esteroides inducen fallas en la fisiología endometrial, como es el caso del Síndrome de Ovario Poliquístico (PCOS). Los endometrios de mujeres con PCOS (PCOSE) presentan un incremento de los procesos de proliferación celular, caracterizados por altos niveles de proteínas ciclina D1, Ki67 y disminución de p27. En este contexto, se sabe que los estrógenos generan efectos pro-proliferativos en el tejido endometrial. Los esteroides pueden ser originados por la metabolización intratisular (origen intracrino) desde precursores como la DHEAS que son convertidos en esteroides con actividad estrogénica y/o androgénica. Para esto se requiere que los precursores sulfatados ingresen a las células a través de transportadores de las familias OATPs y OATs. Además, se necesita la expresión y actividad de enzimas que metabolizan los esteroides. Previamente, hemos reportado que en PCOSE existe un incremento en la metabolización de DHEA a androstenediol, un metabolito con actividad estrogénica. En el presente trabajo se propuso como objetivo general evaluar si el ingreso a la célula de esteroides sulfatados a través de transportadores y su metabolización intracelular está alterado en endometrio de mujeres con PCOS. Además, establecer si esto genera altas concentraciones intracelulares de esteroides que permitan el incremento del proceso de proliferación celular. Para ello, se propuso dos modelos, uno ex vivo y un modelo in vitro con células de la línea T-HESC, St-T1b y células endometriales obtenidas desde cultivo primario. Para el primer objetivo específico se determinó que existe un incremento de los niveles de androstenediol en PCOSE al compararlo con controles (CE) (p=0,002). Además, se evaluó la actividad de la enzima 3β-hidroxiesteroide deshidrogenasa (HSD) en los tejidos en estudio, no detectándose diferencias significativas. En el segundo objetivo específico se analizó la expresión y actividad de los transportadores OATP-B, D y E, y OAT4 en el modelo ex vivo e in vitro, por western blot, RT-PCR convencional y ensayo de captación de DHEAS. En el modelo in vitro se utilizó estímulos con androstenediol, testosterona y estradiol. Se determinó que los niveles proteicos de los transportadores OATP-B y OATP-E están incrementados en PCOSE versus CE (p=0,049 y p=0,007, respectivamente). Los ensayos in vitro de la actividad de transportadores nos permitieron determinar que existe un menor ingreso de DHEAS en células estimuladas con testosterona (p=0,02). Los niveles proteicos de OATP-E se ven disminuidos con los estímulos de androstenediol y testosterona (p=0,04 y p=0,04, respectivamente). El tercer objetivo tenía la finalidad de determinar si altas concentraciones de esteroides (androstenediol, testosterona y estradiol) por 48 h modifican los procesos de proliferación celular en células de la línea T-HESC y St-T1b. Para esto se utilizó las técnicas de western blot, inmunocitoquímica y citometría de flujo. Se determinó que estímulos con estradiol y androstenediol incrementan los niveles de ciclina D1 (p<0,05) y disminuyen los niveles del represor de ciclo celular p27 (p<0,05); además, androstenediol aumenta el porcentaje de núcleos positivos a Ki67 en células St-T1b (p=0,05). Por otro lado, el estímulo con testosterona por 48 h disminuye los niveles de Ki67 y de ciclina D1, e incrementa los de p27 (p<0,05). Sin embargo, estos estímulos no modifican el porcentaje de células en las distintas fases del ciclo celular, evaluado por citometría de flujo. Finalmente, con el cuarto objetivo se evaluó los posibles mecanismos involucrados que generarían los cambios en las moléculas reguladoras del ciclo celular dadas en el modelo in vitro. Para eso, mediante la técnica de western blot, se evaluó las vías de MAPK (ERK1/2) y PI3K/Akt, además se utilizó inhibidores de estas vías, antagonistas de receptores de estrógenos y andrógenos, y un inhibidor de RNA polimerasa II. Se determinó que androstenediol es capaz de incrementar los niveles de fosforilación de ERK1/2 y de Akt con los estímulos de 48 h (p<0,05), pero no así con estímulos de 20 min. Por otro lado, testosterona por 48 h disminuye la activación de la vía PI3K-Akt (p<0,05). La utilización de antagonistas de receptores de estrógenos (ICI 182,780 y MPP dihidrocloruro), nos permitió determinar que el efecto sobre p27 y ciclina D1 sería a través del receptor de estrógenos (ER) α (p<0,05). Adicionalmente, los cambios en las fosforilaciones desaparecen cuando está presente un inhibidor de la RNA polimerasa II (α-amanitina) (p<0,05), por lo que probablemente requiere de la transcripción de alguna o algunas proteína/s que permitan los cambios observados en los reguladores del ciclo celular. Para determinar si se requiere las vías de PI3K/Akt ó MAPK (ERK1/2), se utilizó inhibidores de PI3K (LY-194,002) y MEK1/2 (U-0126). La presencia de LY-194,002 inhibe los cambios dados por androstenediol en ciclina D1 y p27 (p<0,05), mientras que U-0126 evita solo el incremento de ciclina D1 dado por androstenediol (p<0,05). Por lo tanto, la fosforilación de Akt sería relevante para la modulación de ambas vías reguladoras del ciclo, mientras que la fosforilación de ERK1/2 sería necesaria solo para ciclina D1. El presente trabajo propone diversas metodologías para caracterizar a través de qué mecanismo se genera el incremento en la proliferación celular presente en PCOSE y el rol que tiene la intracrinología en estas alteraciones, donde androstenediol tendría un rol relevante. Los resultados obtenidos en los estudios in vitro nos permiten concluir que androstenediol potenciaría la proliferación celular, actuando como un estrógeno en nuestro modelo, a través del ER α, y que río abajo se activen las vías de MAPK (ERK1/2) y PI3K-Akt. Esto explicaría, en parte, la desregulación del proceso proliferativo ocurrido en PCOSE y la fisiopatología de la hiperplasia y adenocarcinoma endometrial de alta prevalencia en las mujeres con este síndrome / The endometrium is a tissue that requires the action of steroids for its adequate function; therefore, pathologies altering the concentration of steroids induced endometrial physiology failures, as seen in polycystic ovary syndrome (PCOS). Previous reports have indicated that the endometrium of women with PCOS (PCOSE) show increased cell proliferation processes, characterized by high levels of cyclin D1 protein, Ki67 and p27 decreased. In this context, it is known that estrogens enhance proliferation of endometrial tissue. The intratisular steroid metabolism (intracrine) from precursors such as DHEAS could convert into steroids with oestrogenic and/or androgenic activity. This requires sulfated precursors entering the cells through transporters OATs and OATPs families. Furthermore, expression and activity of steroid metabolizing enzymes is needed. We have previously reported in PCOSE an increased DHEA metabolism to androstenediol, a metabolite with estrogenic activity. In this work, it was proposed as a general objective to evaluate whether DHEAS entry the cell via sulfated steroid transporters and if intracellular metabolism is altered in the endometrium of women with PCOS. Furthermore, to establish whether this generates high intracellular concentrations of steroids that could allow the increased in the cell proliferation process. To achieve this, we proposed two models, an ex vivo and an in vitro cell line model of T-HESC and St-T1b and also, endometrial cells obtained from primary cultures. The results of the first specific objective show a significative increase in PCOSE androstenediol levels compared to controls (EC) (p=0.002). Moreover, no significant differences were detected in the activity of the enzyme 3β-HSD in the tissues under study. In the second objective, the expression and activity of transporters OATP-B, D and E, and OAT4 was tested in the model ex vivo and in vitro, western blot, RT-PCR and conventional DHEAS uptake assay. In the in vitro model, stimuli with androstenediol, testosterone and estradiol were used. It was determined that the protein levels of the transporters OATP-B and OATP-E are increased in CE versus PCOSE (p=0.049 and p=0.007, respectively). In vitro activity of transporters assays allowed us to determine that there is less uptake of DHEAS in testosterone stimulated cells (p=0.02). Protein levels of OATP-E are diminished with androstenediol and stimuli of testosterone (p=0.04 and p=0.04, respectively). The third objective aimed to determine whether high levels of steroid (androstenediol, testosterone and estradiol) for 48 h modified the cell proliferation process in T-HESC and St-T1b cell lines. To achieve this purpose, western blot, immunocytochemistry and flow cytometry techniques were used. It was determined that estradiol and androstenediol stimuli increase levels of cyclin D1 (p<0.05) and lower levels of the cell cycle repressor p27 (p<0.05); additionally, androstenediol increases the percentage of positive nuclei for Ki67 in St-T1b cells (p=0.05). On the other hand, stimulation with testosterone for 48 h affected negatively the levels of Ki67 and Cyclin D1 and positively p27 levels (p<0.05). However, these stimuli do not modify the percentage of cells in the different phases of the cell cycle assessed by flow cytometry. Finally, the fourth objective evaluated some possible mechanisms involved in changes in cell cycle regulatory molecules given in the in vitro model. For this, MAPK (ERK1/2) and PI3K/Akt levels and activity were evaluated by Western blotting. We used inhibitors of these pathways, estrogens and androgens receptors antagonists, and an inhibitor of RNA polymerase II. Androstenediol was able to increase the levels of ERK1/2 and Akt phosphorylation with the stimulus of 48 h (p<0.05), but not with stimuli of 20 min. Moreover, 48 h-testosterone stimulation decreased the activation of the PI3K-Akt (p<0.05) pathway. The use of estrogen receptor antagonists (ICI 182,780 and MPP dihidrocloruro), allowed us to determine that the effect on p27 and cyclin D1 would be through the estrogen receptor α (p<0.05). Additionally, those changes in phosphorylation disappeared when an inhibitor of RNA polymerase II (α-amanitin) was used (p<0.05). These data indicate requirement of transcription or some protein/s that allow the observed changes in cell cycle regulators. To determine whether PI3K/Akt or MAPK (ERK1/2) is required, PI3K (LY-194.002) and MEK1/2 (U-0126) inhibitors were used. The presence of LY-194.002 inhibits changes given by androstenediol in cyclin D1 and p27 (p<0.05), while U-0126 only prevents the increase of cyclin D1 given androstenediol (p<0.05). Therefore, the phosphorylation of Akt could be relevant for both modulation cycle regulatory pathways, while phosphorylation of ERK1/2 would be required only for cyclin D1. This paper proposes several methods to characterize the mechanism involved in the increased cell proliferation observed in PCOSE, where intracrinology has a role in these alterations, particularly androstenediol could have a significant role. The results obtained in the in vitro studies allow us to conclude that androstenediol could enhance cell proliferation, acting as an estrogen in our model, through estrogen receptor α, where MAPK (ERK1/2) and PI3K-Akt pathways are activated. This could explain, in part, the deregulation occurred in PCOSE proliferative process and the pathophysiology of high prevalence of endometrial hyperplasia and adenocarcinoma in women with this pathology / Conicyt Fondecyt

En el presente trabajo se evaluó la capacidad antiproliferativa, anticolesterogénica y los efectos sobre el metabolismo lipídico de dos isoprenoides de 10 carbonos, linalool (monoterpeno alcohol lineal) y 1,8-cineole (monoterpeno cíclico con grupo éter), sobre células HepG2 (procedentes de un hepatocarcinoma humano) como modelo de célula hepática y A549 (provenientes de adenocarcinoma de pulmón humano) como tipo celular extra-hepático. Se analizaron los mecanismos de acción involucrados y los efectos del tratamiento combinado de ambos monoterpenos entre sí o de cada monoterpeno con simvastatina (una estatina modelo) evaluando los posibles efectos sinérgicos de cada interacción. La actividad de los isoprenoides naturales sobre la colesterogénesis y proliferación celular se concentra en la vía del mevalonato (VM), una vía metabólica muy compleja indispensable para la homeostasis celular. Esto se debe a que la VM no solo es la vía de síntesis del colesterol, sino que además provee intermediarios fundamentales para la prenilación de proteínas de la superfamilia Ras, proteínas reguladoras de la proliferación y supervivencia celular. Durante el desarrollo de este trabajo se determinó la viabilidad y proliferación celular por los métodos de MTT, rojo neutro y recuento celular. En todos los casos, tanto los monoterpenos como la simvastatina inhibieron la proliferación celular, mientras que las combinaciones de a pares entre monoterpenos y cada uno de ellos con simvastatina mostraron un efecto sinérgico en dicha inhibición. Se estudió la distribución de las poblaciones en el ciclo celular, apoptosis por diferentes metodologías y la localización subcelular de Ras, a diferentes concentraciones. Tanto linalool como 1,8-cineole arrestaron el ciclo celular, principalmente en G0/G1 mientras que linalool también indujo apoptosis en células HepG2. Al combinar los compuestos se observó en gran parte de los casos una interacción sinérgica sobre la inducción de apoptosis. Linalool disminuyó los niveles de Ras en membrana plasmática y los aumentó en citosol, mientras que al combinase con simvastatina, la inhibición de la traslocación a membrana fue levemente potenciada. A través de experimentos de incorporación de 14C-acetato en lípidos en condiciones donde la proliferación no se encuentra afectada, se demostró que linalool y 1,8-cineole inhibieron la VM, probablemente a diferentes niveles. Esto resultó en una reducción de la colesterogénesis y una acumulación de intermediarios y/u otros productos finales de la vía. Las concentraciones efectivas en la inhibición de la síntesis de colesterol fueron considerablemente inferiores a las necesarias para ejercer efecto antiproliferativo, sobre todo para 1,8-cineole. En ciertos casos, los tratamientos aumentaron la incorporación de colesterol exógeno. Ambos monoterpenos afectaron la incorporación de acetato en lípidos neutros, fosfolípidos y ácidos grasos, cada uno de manera diferente. La combinación de ambos isoprenoides entre sí, o de cada uno con simvastatina, inhibió sinérgicamente la síntesis de colesterol. A bajas concentraciones linalool y 1,8-cineole bloquearon etapas específicas de la colesterogénesis mientras que a concentraciones elevadas provocaron una inhibición de la enzima 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductasa (HMGCR), enzima limitante de la velocidad de la VM. El agregado de mevalonato exógeno fue incapaz de revertir la inhibición de la proliferación promovida por ambos compuestos, lo que demuestra que la inhibición de HMGCR por sí sola no es responsable de tal efecto y refuerza la hipótesis de la inhibición a nivel de la prenilación de proteínas como principal mecanismo antiproliferativo. Los resultados obtenidos durante el desarrollo de esta tesis contribuyen a un mejor entendimiento de la acción de linalool y 1,8-cineole sobre la VM aportando conocimiento sobre los posibles mecanismos involucrados en su actividad anticolesterogénica y antiproliferativa. También sugieren el potencial uso de estos compuestos como una alternativa natural para ser utilizados en terapias contra cáncer y/o enfermedades cardiovasculares, ya sea solos, combinados entre sí o con estatinas.

La hormona paratiroidea (PTH) es un importante mediador de la remodelación ósea y actúa junto al calcitriol (1α,25(OH)2vitamina D3), como regulador esencial de la homeostasis del calcio y fósforo. El péptido relacionado con la hormona paratiroidea (PTHrP) es una poli hormona que tiene un papel importante en el desarrollo del feto y en la homeostasis de tejidos adultos actuando principalmente en forma parácrina. Puede ser expresada y secretada por varios tumores y es responsable de la hipercalcemia humoral maligna, siendo éste un signo de mal pronóstico en las neoplasias malignas. Al momento de comenzar este Trabajo de Tesis había poca información acerca del rol de PTHrP actuando como factor parácrino sobre células derivadas del cáncer colorrectal (CCR). En el presente Trabajo se evidencia que PTHrP es capaz de inducir un aumento en la proliferación celular de dos líneas celulares derivadas de CCR, las células Caco-2 y las células HCT116. Además, este efecto inducido por la hormona está modulado por las cascadas de señalización PKC, Src, Akt, ERK MAPK y β-catenina. Se observó que en las células tumorales intestinales la hormona mediante ERK MAPK desencadena el aumento de la expresión y/o activación por fosforilación de CREB/ATF-1, c-myc y ciclina D1, que son moléculas relevantes en la proliferación celular. Acorde con lo observado in vitro, los experimentos desarrollados en el modelo murino revelan que la administración continua de la hormona en forma intra-tumoral modula la expresión de los marcadores claves en la progresión del CCR ERK, ciclina D1 y CREB/ATF-1. Tanto las células tumorales intestinales normales como aquellas que sobre-expresan PTHrP responden a la acción de las hormonas calciotrópicas PTH y calcitriol, al menos a nivel transcripcional, disminuyendo la expresión de PTHrP. PTHrP no sólo favorece la activación de vías mitogénicas y la proliferación de las células Caco-2 y HCT116, sino que también es capaz de disminuir la sensibilidad de estas células al Irinotecán (que es una droga comúnmente utilizada para la quimioterapia del CCR) mediante las vías de ERK MAPK y β-catenina. Este trabajo aporta información original respecto al rol del análogo tumoral de PTH en células tumorales intestinales y los mecanismos moleculares involucrados en la respuesta hormonal de estas células tanto in vitro como in vivo. Además, profundiza el conocimiento respecto de los mecanismos moleculares modulados por las hormonas calciotrópicas PTH y calcitriol en células tumorales intestinales. Un aporte de este Trabajo de Tesis es que al elucidar las vías de señalización que regulan los procesos inducidos por PTHrP y que favorecen la proliferación y/o quimiorresistencia, se podrían generar estrategias terapéuticas alternativas en el tratamiento del CCR cuya finalidad es inhibir la expresión de PTHrP o su mecanismo de acción en estas células tumorales. / Parathyroid hormone (PTH) is an important mediator of bone remodeling and acts together with calcitriol (1α, 25 (OH)2vitamin D3), as an essential regulator of calcium and phosphorus homeostasis. The parathyroid hormone related peptide (PTHrP) is a poly hormone that has an important role in the development of the fetus and in the homeostasis of adult tissues acting mainly through paracrine pathways. It can be expressed and secreted by several tumors and is responsible for malignant humoral hypercalcemia, which is a sign of poor prognosis in malignant neoplasms. When this Thesis Work started, there was little information about the role of PTHrP acting as a paracrine factor on cells derived from colorectal cancer (CRC). In the present work it is demonstrated that PTHrP is able to induce an increase in the cellular proliferation of two cell lines derived from CRC, Caco-2 cells and HCT116 cells. In addition, this effect is modulated by PKC, Src, Akt, ERK MAPK and β-catenin. It was observed that in the intestinal tumor cells, the hormone triggers the increase of the expression and/or activation by phosphorylation of CREB/ATF-1, c-myc and cyclin D1, which are relevant molecules in the cell proliferation, through ERK MAPK. In agreement with the observed in vitro, the experiments developed in the murine model revealed that the continuous administration of the hormone in an intra-tumoral manner modulates the expression of ERK, cyclin D1 and CREB / ATF-1, which are key markers in the progression of CRC. Both, normal intestinal tumor cells and those that over-express PTHrP respond to the action of the calcitropic hormones PTH and calcitriol, at least at the transcriptional level, by decreasing the expression of PTHrP. PTHrP not only activates mitogenic pathways and induces the proliferation of Caco-2 and HCT116 cells, but it is also capable of decreasing the sensitivity of these cells to Irinotecan (which is a drug commonly used for CRC chemotherapy) through ERK MAPK and β-catenin pathways. This work provides original information about the role of the tumor analog of PTH in intestinal tumor cells and the molecular mechanisms involved in the hormonal response of these cells, both in vitro and in vivo. In addition, this work expands the knowledge regarding the molecular mechanisms modulated by the calcitropic hormones PTH and calcitriol in intestinal tumor cells. The contribution of this Thesis work is that by elucidating the signaling pathways that regulate the processes induced by PTHrP and that contribute to the proliferation and/or chemoresistance, alternative therapeutic strategies could be generated in the treatment of CRC whose purpose is to inhibit the expression of PTHrP or its mechanism of action in these tumor cells.

La terapia celular es una novedosa y prometedora herramienta para la medicina futura, que nos permite reparar, reemplaza o restaurar tejidos u órganos dañados usando una variedad de tipos celulares. Este tipo de terapia requiere un gran número de células en animales grandes o grandes lesiones, y este requisito es uno de los principales obstáculos a la hora de llevar a cabo dichas aplicaciones. Las células mesenquimales estromales de tejido adiposo (hAMSC) son excelentes candidatas para hacer terapia celular. La necesidad de expandirlas en cultivo para obtener el número adecuado de células, requiere de tiempos de cultivo en algunos casos crítico para ciertas aplicaciones. El tiempo de duplicación medio de las hAMSC puede variar entre 2-6 dias, dependiendo de las condiciones de cultivo. En condiciones estándar, se requiere aproximadamente 75 días de cultivo para generar 1010 células. En esta tesis, se han probado condiciones de cultivo que mejoran la producción de grandes números de hAMSC. Se ha llevado a cabo un estudio comparativo de las hAMSC crecidas en su medio estándar DMEM, respecto a las hAMSC crecidas en EGM-2 (FP-MSC, fast proliferating MSCs). De forma reproducible, el medio EGM-2 confiere a las hAMSCs un fenotipo de gran capacidad proliferativa, lo cual nos permite reducir el tiempo requerido para obtener grandes cantidades de células seguras, sin perder sus propiedades de pluripotencialidad. Este trabajo recoge un extenso análisis comparativo en ambas condiciones de cultivo, que incluye estudios a nivel de proliferación in vitro, paramétros relacionados con las propiedades mesenquimaloides (perfil inmunofenotípico y capacidad de diferenciación a diferentes linajes), perfil de expresión génica y potencial oncogénico. Los datos recogidos de la experimentación in vitro, apuntan a estas células como una alternativa en el uso de hAMSC en terapias celulares. Las FP-MSC fueron probadas en dos tipos de terapias: anti-tumoral y regenerativa. La terapia anti-tumoral mediada por las FP-MSC portadoras de un gen suicida, no produjo ninguna mejora con respecto a las hAMSC crecidas en su medio estándar. Sin embargo, en el ámbito de la regeneración cardiaca, las FP-MSC mostraron una sutil mejora con respecto a las hAMSC. Ambos tipos celulares fueron capaces de diferenciarse al linaje endotelial y miocárdico, sin embargo, a nivel de función cardiaca las FP-MSC tiende a presentar ciertas mejoras en lo que se refiere a densidad vascular y fracción de eyección en comparación con las hAMSC. Si a esto, le sumamos sus características in vitro asociadas al crecimiento en EGM-2, podemos decir que estas células parecen una interesante y novedosa opción para el tratamiento en la regeneración de tejidos dañados. Podemos decir que se abre un amplio campo donde poder aplicarlas, ya que podemos obtener grandes cantidades de células autólogas para tratamientos terapéutico en un periodo de tiempo muy breve; pudiéndolas utilizar como sustitutas de las hAMSC u otro tipo de mesenquimal, o en combinación con otro tipo celular para tener un efecto sinérgico, y mejorar el resultado terapéutico. / Cell therapy is emerging as a promising strategy for future medicine, to repair, replace or restore damaged tissues or organs using a variety of cell sources. Adipose tissue is an important source of adult multipotent stem cells (AMSCs) due to their abundance and ease of isolation with relatively little trauma for the patient, and their similarity to those of their bone marrow counterparts. However, to obtain reasonable numbers of AMSCs for tissue engineering applications, in particular for regeneration in large animals or for large lesions; ex vivo expansion of AMSCs is required. AMSCs have a doubling time that could vary between 2-6 days depending on culture conditions. In standard culture conditions, approximately 75 days would be required to generate 1010 cells, a prohibitive delay for some therapeutic processes. In the current work we perform a comparative study of DMEM grown AMSCs with EGM-2 grown fast proliferating AMSCs (FP-MSCs). By using a reproducible and reliable methodology, this culture medium allowed us to reduce the time required to obtain large numbers of safe cells without losing their pluripotent properties. We have analysed in both culture conditions the parameters that characterize MSCs (specific immunophenotype and multilineage differentiation), as well as proliferative capacity, genetic stability, gene expression profile, oncogenic potential. Moreover, we also compared their capacity as a therapeutic agent against tumors and for myocardium repair. Our results indicate that paracrine effects of FP-MSCs applied in combination with scaffolds over acute myocardium infarcts may promote myocardium revascularization.