Les caspases forment une famille de protéases à cystéine impliquées dans divers processus comme Fapoptose et l’inflammation. Durant l'apoptose, une forme de mort cellulaire programmée, les caspases initiatrices (caspases 8, 9 et 10) activent par protéolyse les caspases exécutrices 3 et 7. Ces dernières cliveront par la suite divers substrats cellulaires pour ainsi mener au démantèlement contrôlé de la cellule qui est propre à l'apoptose. Durant mon doctorat, je me suis intéressé à l’implication de la caspase 7 durant l'apoptose, autant la façon dont elle est activée que la manière dont elle reconnait ses substrats. D’abord, j'ai voulu étudier l'implication des sites de clivage du connecteur interdomaine (CID) de la caspase 7 dans son activation par les caspases initiatrices et les déterminants primaires sous-jacents impliqués dans cette activation. Cette étude a révélé l'importance de la localisation du site de clivage dans le CID de la caspase 7 pour une activation adéquate par les caspases initiatrices. La mutagénèse de ces sites nous a permis de constater que la séquence des sites chez la caspase 7 était presque optimale pour son activation par les caspases 8 et 9 et qu’il contient des déterminants importants pour l'activité enzymatique de la caspase 7. Mes travaux soulignent également l’importance de la longueur du CID pour l’activité pré-clivage de la caspase 8, mais pas de la caspase 7. En somme, ces travaux ont permis d’éclaircir l’importance des sites de clivage de caspase 7 pour sa reconnaissance par les caspases initiatrices et pour son activité catalytique. Ces travaux ont fait l'objet du premier article de cette thèse. Puis, je me suis intéressé à la reconnaissance de certains substrats de la caspase 7 par des sites de reconnaissance situés à l'extérieur de la pochette de liaison du substrat, les exosites. J'ai identifié un exosite situé dans le domaine N-terminal de la caspase 7 qui est principalement contenu dans une séquence polybasique de quatre résidus lysine (K38-41). Cet exosite améliore le clivage des protéines poly(ADP ribose) polymérase 1 (PARP-1) et p23 sans toutefois changer l’activité catalytique basale de la caspase 7. Il est transférable sur la caspase 3 et est capable de lier PARP-1 seul. Cet exosite est également utilisé lors de l'apoptose pour favoriser le clivage de certains substrats par la caspase 7. L’existence de ce site explique les différentes activités catalytiques des caspases 7 et 3 sur des substrats apoptotiques précis. En somme, ces travaux constituent la première démonstration de l'existence d'exosites chez les caspases. Mes travaux ont donc permis de mieux comprendre la caspase 7, autant les mécanismes de son activation que ceux qu’elle utilise pour choisir ces substrats apoptotiques.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Caspase-7 is a member of a family of cysteine proteases that includes apoptotic initiators (caspases-8, -9 and -10) and executors (caspases-3, -6 and -7). During apoptosis, executioner caspases are cleaved by initiator caspases either by the extrinsic (death receptors) or by the intrinsic (mitochondrial) pathway of caspase activation. Caspase-7 is an obligate dimer in the cell and cleavage of the interdomain connector (IDC), which split the catalytic domain in two subunits, at either site 1 or site 2 allows the conversion of the enzyme from the zymogen (inactive) state to the active state through a conformation switch that leads to the creation of a substrate binding pocket and the catalytic site. During caspase-7 activation, a 23-residue N-terminal peptide is also cleaved. Consequently, caspase-7 displays different N-terminal residues from those of its zymogen. This can change the stability of caspase-7 according to the N-end rule, which relates the half-life of a protein with the residue presented at its N-terminus. This degradation pathway controls the ubiquitination of the protein based on the N-terminus. To replicate the different forms of caspase-7 produced during its activation process in a controlled manner, a TEV protease cleavage site [ENLYFQ[arrow down](S/A)] was strategically inserted to mimic the different possibilities of IDC cleavage: 1) cleavage at site 1 only, 2) cleavage at site 2 only, or 3) a double cleavage. This was done in order to obtain the N-terminal residues normally presented during the cleavage of caspase-7. These constructions have been also optimized to preserve the proteolytic activity of the enzyme with as little change as possible to the length of the IDC. These constructs were cleaved by TEV protease in vitro and in cellulo and allowed the activation of apoptosis. Furthermore, the cellular half-life of caspase-7 seems to be changed by its cleavage. In conclusion, we have developed an interesting tool for the study of caspase-7.

Au cours de cette thèse, nous nous sommes intéressés à l’implication de la kallicréine-12 (KLK12), une protéase à sérine, dans la cancérogenèse pulmonaire. La KLK12 est connue comme étant surexprimée dans les tumeurs pulmonaires non à petites cellules mais son rôle dans la cancérogenèse n’est pas clairement établi. Nos travaux ont permis de lui attribuer un effet proangiogénique vis-à-vis des cellules endothéliales pulmonaires. En effet, la KLK12 peut stimuler la migration des cellules endothéliales pulmonaires en modifiant l’architecture de la matrice extracellulaire. D’autre part, elle est impliquée dans la régulation de la biodisponibilité de facteurs de croissance associés à l’angiogenèse tels que le Platelet-derived growth factor-B. De plus, nos travaux ont permis d’identifier une possible régulation de l’expression de la KLK12 par l’hypoxie, ce qui expliquerait sa surexpression dans les tumeurs pulmonaires et conforterait son implication dans l’angiogenèse. La confirmation in vivo des mécanismes d’action de la KLK12 pourrait permettre d’envisager son utilisation comme cible thérapeutique afin de réguler la néoangiogenèse tumorale. / In this thesis, we studied the involvement of the serine protease kallikrein-12 (KLK12), in lung carcinogenesis. The KLK12 is known to be overexpressed in non-small cell lung cancer but its role in carcinogenesis is not clearly established. Our work shows that it possesses a proangiogenic effect on pulmonary endothelial cells. Indeed, KLK12 stimulates lung endothelial cells migration notably by modulating the extracellular matrix architecture. On the other hand, KLK12 regulates the bioavailability of growth factors associated with angiogenesis such as plateletderived growth factor-B. In addition, our work has identified a possible regulation of the expression of KLK12 by hypoxia, which would explain its overexpression in lung tumors and would reinforce its involvement in angiogenesis. The confirmation in vivo of these mechanisms could help consider KLK12 as a therapeutic target for regulating tumor angiogenesis.

La malignité des astrocytomes est établie sur base de critères morphologiques définis au sein de la classification de l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS). Ce système de gradation, qui s’échelonne de I à IV, constitue actuellement l’outil pronostique le plus fiable. Par facilité, les cliniciens regroupent les astrocytomes de grade I (astrocytomes pilocytiques) et les astrocytomes diffus de grade II sous le terme d’« Astrocytomes de bas-grade » par opposition aux astrocytomes de haut-grade, constitués des astrocytomes anaplasiques (grade III) et des glioblastomes (GBM ; grade IV). Cette terminologie conduit à des prises en charge cliniques inadéquates car elle englobe des tumeurs très différentes en terme d’agressivité : les astrocytomes de grade I, majoritairement non infiltrants, non évolutifs et indolents et les astrocytomes diffus de grade II, toujours infiltrants et évolutifs, progressant systématiquement en astrocytomes de haut-grade et entraînant le plus souvent le décès prématuré du patient. Bien que ces tumeurs soient définies par la classification de l’OMS comme des entités clinicopathologiques distinctes, peu de données sont disponibles dans la littérature pour expliquer leurs particularités biologiques et la pratique quotidienne montre que les différencier peut être difficile. Le but des études entreprises au cours de ce travail de thèse est d’apporter une contribution à la compréhension des mécanismes de tumorigenèse qui différencient l’astrocytome de grade I des astrocytomes diffus (grade II-IV), de manière à identifier des voies biologiques qui permettraient, au moins en partie, d’expliquer ces différences de comportement. Au cours de la première partie de ce travail, nous avons caractérisé les profils d’expression génomique des astrocytomes de grade I et de grade II, en comparant les données d’expression de gènes (évaluées par des technologies de micropuces d’ADN) de travaux publiés entre 2000 et 2005. L’expression des gènes identifiés a été validée par des analyses de RT-PCR quantitative sur une série indépendante d’astrocytomes de grade I, II et IV. Les fonctions biologiques des protéines codées par chacun de ces gènes ont fait l’objet de recherches bibliographiques détaillées afin de proposer un modèle permettant d’approcher les différences de comportement de ces tumeurs. Cette analyse nous a permis d’identifier TIMP4 (tissue inhibitor of metalloproteinases 4) et IGFBP2 (insulin-like growth factor binding protein 2) comme gènes candidats pour améliorer la caractérisation biologique et clinique des astrocytomes de grade I par rapport aux astrocytomes diffus. TIMP4 et IGFBP2 codent respectivement pour un inhibiteur endogène des métalloprotéinases matricielles (MMPs) et une protéine de liaison capable d’inhiber l’action des « insulin-like growth factors » (IGFs, dont IGFI et IGFII), des facteurs impliqués dans la croissance et la migration des astrocytes normaux et tumoraux. Sur base de la surexpression de TIMP4 et d’IGFBP2 dans les astrocytomes de grade I, en comparaison aux astrocytomes diffus de grade II, nous avons posé l’hypothèse suivante : « L’absence d’agressivité des astrocytomes de grade I, en comparaison aux astrocytomes diffus (grade II-IV) pourrait en partie être liée à l’inhibition par TIMP-4 de la protéolyse des complexes IGFBP2-IGFII au sein de ces tumeurs ». Cette protéolyse, qui diminue l’affinité d’IGFBP2 pour IGFII, pourrait contribuer à libérer IGFII dans la matrice extracellulaire (MEC), favoriser la liaison d’IGFII à son récepteur IGF-IR et stimuler la croissance et la migration des cellules astrocytaires tumorales. Pour tester cette hypothèse, nous avons réalisé différentes analyses biochimiques afin i) de caractériser les actions protéolytiques de MMP-2, MMP-9 et MT1-MMP sur le complexe IGFBP2-IGFII, ii) d’identifier la libération d’IGFII lors du clivage de ce complexe, et iii) d’étudier l’action inhibitrice de TIMP-4. A l’aide d’un modèle cellulaire in vitro (lignée astrocytaire tumorale LN229), nous avons ensuite observé l’influence de la protéolyse du complexe IGFBP2-IGFII sur la croissance et la motilité cellulaire. Cette étude a montré : (1) la protéolyse du complexe IGFBP2-IGFII par MMP-9, (2) l’inhibition partielle de cette protéolyse par TIMP-4, (3) la libération d’IGFII résultant de cette protéolyse et (4) les effets stimulants de la libération d’IGFII sur la croissance et la motilité des cellules LN229. Cette étude souligne le rôle important de la protéolyse des complexes IGFBP2-IGFII dans l’agressivité des astrocytomes diffus. Elle confirme les effets stimulants propres d’IGFII, d’IGFBP2 et de MMP-9 sur la motilité et/ou la croissance des cellules astrocytaires tumorales. Enfin, elle identifie un rôle inhibiteur potentiel de TIMP-4 sur la protéolyse du complexe IGFBP2-IGFII, qui pourrait contribuer à expliquer le caractère plus indolent des astrocytomes de grade I en comparaison aux astrocytomes diffus. Au cours de la troisième partie de ce travail, nous avons caractérisé l’expression de TIMP-4 et de son récepteur potentiel, la tétraspanine CD63, sur une série de 471 gliomes, dont 354 astrocytomes de grade I à IV par la méthode d’immunohistochimie quantitative appliquée aux « tissue-microarrays ». Pour chaque patient, les variables cliniques suivantes ont été collectées : âge, localisation tumorale et multifocalité, comportement infiltrant de la tumeur, étendue de la résection chirurgicale, grade histologique, type de traitement adjuvant, et suivi, évalué en termes de récidive tumorale et de durée de survie spécifiquement liée à la tumeur. Cette troisième étude confirme la surexpression de TIMP-4 dans les astrocytomes de grade I, en comparaison aux astrocytomes diffus de grade II, et montre que CD63 suit un profil d’expression similaire. Par conséquent, nous proposons l’utilisation de la co-expression TIMP-4/CD63 comme un nouveau marqueur diagnostique de l’astrocytome pilocytique de grade I dans la prise en charge anatomo-pathologique des « Astrocytomes de bas-grade ». Cette étude souligne également l’intérêt d’utiliser TIMP-4 et CD63 pour différencier le phénotype astrocytaire du phénotype oligodendroglial des gliomes diffus. Enfin, ce travail identifie CD63 et le profil de co-expression TIMP-4/CD63 comme nouveaux marqueurs pronostiques indépendants associés à une évolution défavorable des astrocytomes diffus et des oligoastrocytomes. Ce travail nous a donc permis, à partir de données de micropuces d’ADN, d’identifier TIMP4 et IGFBP2 comme gènes d’intérêt dans l’étude des astrocytomes. A partir de ces deux gènes, nous avons posé une hypothèse visant à expliquer le caractère non infiltrant des astrocytomes de grade I. Les tests in vitro menés dans le cadre de cette hypothèse confirment l’intérêt des protéines TIMP-4, IGFBP2 et IGFII dans la tumorigenèse des astrocytomes. Enfin, la caractérisation clinique de l’expression de TIMP-4 et de CD63, son récepteur potentiel, valide l’intérêt clinique que ces protéines représentent pour la prise en charge des patients porteurs d’un gliome. Il reste toutefois la nécessité d’approfondir nos connaissances sur les voies de signalisation utilisées par TIMP-4 et/ou CD63. Ces recherches permettraient de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à améliorer le traitement de ces tumeurs et ainsi pallier au pronostic sombre des patients porteurs de gliomes diffus.

Le cytochrome b6f est un complexe majeur de la chaîne photosynthétique oxygénique de par son activité quinol:plastocyanine oxydoréductase, qui contribue à la formation d'ATP via un transfert d'électrons couplé à un transfert de protons. La présence d'un hème c particulier lié par une seule liaison covalente, l'hème ci, au sein du site de réduction de quinone Qi du cytochrome b6f constitue une différence notable en comparaison avec son homologue de la chaîne respiratoire, le cytochrome bc1. Un cytochrome b6f dépourvu d'hème ci est dégradé, sa faible accumulation ne permet pas une croissance photosynthétique. Cette observation a donné lieu à une recherche de suppresseurs permettant une plus grande accumulation de cytochrome b6f dont la fonction même altérée, serait suffisante pour assurer une croissance photosynthétique. Cette approche génétique de recherche de suppresseur a été entreprise chez Chlamydomonas reinhardtii. Ce travail de thèse a permis l'isolation et la caractérisation d'un mutant de la protéase FtsH1 (mutation R420C qui affecterait l'activité ATPasique). Le mutant ftsh1-1 s'est révélé être un outil puissant pour l'étude fonctionnelle de complexes mutés autrement dégradés. Une approche multidisciplinaire combinant expériences de génétique, biochimie, physiologie et biophysique a démontré notamment que : (i) le mutant QiKO, dont le complexe b6f est dépourvu des hèmes bh et ci, peut pousser de manière phototrophique malgré un Q-cycle cassé, (ii) l'absence d'hème ci lié covalemment, pour le mutant Rccb2, génère une photosensibilité exacerbée en présence d'oxygène, ce qui sous-tend un rôle pour l'hème ci dans un environnement riche en oxygène, (iii) la protéase FtsH exerce un contrôle qualité global des complexes majeurs photosynthétiques.

Les protéases à sérine transmembranaires de type II (TTSP) forment une famille d'enzymes protéolytiques nouvellement identifiée dont les rôles physiologiques restent encore peu connus. Ces enzymes seraient, entre autres, impliqués dans la formation des tissus et leur dérégulation est reliée à de nombreux types de cancers. Récemment, une fonction essentielle dans la régulation de l'homéostasie du fer a été attribuée à l'un de ses membres, la matriptase-2 (TMPRSS6). Cet enzyme exerce ce rôle en contrôlant l'expression de l'hepcidine, une hormone importante dans la régulation du fer. Afin de mieux comprendre cette fonction de la matriptase-2, dans ce travail nous avons comparé ses propriétés enzymatiques à celles de trois autres TTSP ainsi qu'analyser son mécanisme de régulation fonctionnel. Nous démontrons que la matriptase-2 possède des préférences de substrats distinctes. Sa spécificité a été comparée à celles de la matriptase, de l'hepsine et de DESC1 en utilisant des peptides-substrats à fluorescence séquestrée. La séquence des peptides utilisés est basée sur la région P4 à P4' de la séquence d'activation de la matriptase (RQARTWGG). Les positions P4, P3, P2 et PI' ont été substituées par des acides aminés de natures différentes (non-polaire, aromatique, acide et basique) alors que la position PI a été fixée à Arg. Des quatre TTSP étudiées, la matriptase-2 est la plus permissive alors que la matriptase est la plus discriminante. DESC1 possède une préférence similaire à celle de la matriptase, mais avec une tendance pour les petits acides aminés non-polaires (Ala) en PI'. En présence de serpines, seulement AT III démontre une activité d'inhibition robuste. La matriptase-2 ainsi que l'hepsine et DESC1 sont aussi fortement inhibées en présence de PAI-1 et de [alpha][indice inférieur 2]-AP. La matriptase-2 est aussi la seule à présenter une inhibition par certains des substrats. Nous démontrons aussi l'importance de la régulation de la matriptase-2 à la membrane plasmique dans le contrôle de l'expression de l'hepcidine. Nous rapportons que la matriptase-2 subit une internalisation constitutive dans les cellules HEK293 transfectées ainsi que dans deux lignées cellulaires hépatiques humaines, les HepG2 et les hépatocytes primaires, tous les deux exprimant la matriptase-2 endogènement. La matriptase-2 marquée à la surface cellulaire est internalisée puis détectée dans des vésicules contenant de la clathrine et la protéine AP-2 pour ensuite se retrouver dans les endosomes précoces puis les lysosomes. L'internalisation de la matriptase-2 dépend de résidus spécifiques situés dans la portion amino-terminale de sa queue cytoplasmique, comme le démontre [i.e. démontrent] les résultats de la mutagénèse dirigée de ces résidus. Les cellules qui expriment ces mutants produisent des niveaux significativement diminués d'hepcidine comparées à celles exprimant la forme sauvage car les formes mutantes s'accumulent à la surface cellulaire et clivent davantage l'hémojuvéline.

Le cytochrome b6f est un complexe majeur de la chaîne photosynthétique oxygénique de par son activité quinol:plastocyanine oxydoréductase, qui contribue à la formation d’ATP via un transfert d’électrons couplé à un transfert de protons. La présence d’un hème c particulier lié par une seule liaison covalente, l’hème ci, au sein du site de réduction de quinone Qi du cytochrome b6f constitue une différence notable en comparaison avec son homologue de la chaîne respiratoire, le cytochrome bc1. Un cytochrome b6f dépourvu d’hème ci est dégradé, sa faible accumulation ne permet pas une croissance photosynthétique. Cette observation a donné lieu à une recherche de suppresseurs permettant une plus grande accumulation de cytochrome b6f dont la fonction même altérée, serait suffisante pour assurer une croissance photosynthétique. Cette approche génétique de recherche de suppresseur a été entreprise chez Chlamydomonas reinhardtii. Ce travail de thèse a permis l’isolation et la caractérisation d’un mutant de la protéase FtsH1 (mutation R420C qui affecterait l’activité ATPasique). Le mutant ftsh1-1 s’est révélé être un outil puissant pour l’étude fonctionnelle de complexes mutés autrement dégradés. Une approche multidisciplinaire combinant expériences de génétique, biochimie, physiologie et biophysique a démontré notamment que : (i) le mutant QiKO, dont le complexe b6f est dépourvu des hèmes bh et ci, peut pousser de manière phototrophique malgré un Q-cycle cassé, (ii) l’absence d’hème ci lié covalemment, pour le mutant Rccb2, génère une photosensibilité exacerbée en présence d’oxygène, ce qui sous-tend un rôle pour l’hème ci dans un environnement riche en oxygène, (iii) la protéase FtsH exerce un contrôle qualité global des complexes majeurs photosynthétiques. / Central in oxygenic photosynthesis, the cytochrome b6f complex, couples electron transfer to proton translocation across the thylakoid membrane via its quinol:plastocyanin oxidoreductase activity, contributing to ATP formation. Cytochrome b6f complex differs from its respiratory homolog, the bc1 complex, by the presence of an additional heme, heme ci located within the quinone reduction site Qi and attached by a unique thioether bond. Mutants lacking heme ci show low accumulation of partially functional b6f complex and, hence, cannot grow phototrophically. This grounded a screen for suppressor mutations that would restore higher accumulation of b6f complexes whose function, even if compromised, would sustain phototrophic growth.The genetic suppressor approach undertook in Chlamydomonas reinhardtii during this PhD thesis led to the isolation and characterisation of the ftsh1-1 protease mutant (mutation R420C which should affect ATP hydrolysis). The mutant ftsh1-1 proved to be a versatile tool for the functional study of otherwise degraded proteins. The combination of genetic, biochemical, physiological and biophysical experiments demonstrated notably that: (i) a QiKO mutant, whose b6f complexes are devoid of both bh and ci hemes, can grow phototrophically despite a broken Q-cycle, (ii) the absence of covalently bound heme ci, in the Rccb2 mutant, triggers photosensivity enhanced in the presence of O2 supporting a role for heme ci in oxygen rich environment, (iii) FtsH is involved in the maintenance of the main photosynthetic complexes.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La chymase est une protéase à sérine issue des mastocytes des tissus conjonctifs, dont l’isoforme chez la souris est la protéase mastocytaire-4 (mMCP-4). Elle clive la Big endothéline 1 (Big ET-1) en ET-1 (1-31), qui doit ensuite être clivée en ET-1 par la néprilysine (NEP) pour être biologiquement active. L’inhibition de la chymase montre l’importance de cette voie dans l’activité de la Big ET-1 exogène chez la souris. La chymase est aussi impliquée dans le développement des lésions athérosclérotiques et de leur rupture dans les modèles animaux et dans l’infarctus du myocarde chez l’humain. Dans des modèles expérimentaux de cette complication, l’inhibition pharmacologique de la chymase améliore la survie, les paramètres hémodynamiques cardiaques et le remodelage ventriculaire. Le but de notre étude était de confirmer le rôle spécifique de la mMCP-4 dans la synthèse de l’ET-1, la progression de l’athérosclérose et les conséquences de l’infarctus du myocarde chez la souris. Nous avons donc évalué l’impact de la répression génétique de la mMCP-4 dans la souris C57BL/6 (souris mMCP-4[indice supérieur -/-]). Les souris mMCP-4[indice supérieur -/-] montrent une réponse hémodynamique diminuée à la Big ET-1 exogène. La production d’ET-1 et d’ET-1 (1-31) plasmatique est diminuée chez la souris mMCP-4[indice supérieur -/-]. Celle-ci exprime aussi des taux endogènes pulmonaires d’ET 1 réduits. Les souris mMCP-4[indice supérieur -/-] affichent également une réduction de l’étendue des lésions athérosclérotiques à un stade précoce de la pathologie dans l’aorte de la souris athérosclérotique, la souris déficiente pour l’apolipoprotéine E (ApoE[indice supérieur -/-]). L’antagoniste mixte des récepteurs de l’endothéline, le macitentan, réduit aussi l’étendue des lésions dans les stades plus avancés de la pathologie. La répression de la mMCP-4 améliore les signes de stabilité de l’athérome avancé dans l’artère brachiocéphalique plus efficacement que le macitentan. Enfin, les souris mMCP-4[indice supérieur -/-] soumises à une ligature permanente de l’artère coronaire antérieure descendante gauche montrent une survie nettement supérieure à celle leurs congénères de type sauvage. L’histochimie montre que le remodelage et l’amincissement aigus sont moins importants dans les ventricules de souris mMCP-4[indice supérieur -/-], les protégeant contre la rupture de la paroi libre du ventricule affectant toutes les souris WT qui n’ont pas complété l’étude de survie. L’imagerie par tomographie par émission de positrons (TEP) révèle que les ventricules gauches cardiaques des souris mMCP-4[indice supérieur -/-] sont moins dilatés, leur fraction d’éjection est mieux conservée et la zone infarcie est moins grande. L’analyse glycoprotéomique indique que l’apolipoprotéine A1 est augmentée par la répression de la mMCP 4, qui diminue aussi les niveaux pulmonaires d’ET-1 24 h après l’infarctus. En conclusion, nos résultats montrent un rôle important de la mMCP-4 dans la synthèse de l’ET-1, le développement des lésions athérosclérotiques et les dommages causés par l’infarctus du myocarde chez la souris.