Les papillomavirus sont de petits virus à ADN double brin qui infectent les cellules de l’épithélium de la peau et des muqueuses d’une variété de vertébrés causant des lésions bénignes telles des verrues. Certains de ces virus sont également associés au développement de lésions malignes, notamment le cancer du col utérin. La protéine régulatrice E2 des papillomavirus est impliquée dans diverses fonctions contribuant à l’établissement de l’infection par ces virus. Entre autre, E2 régule la transcription des gènes viraux, participe à l’initiation de la réplication de l’ADN viral en s’associant à l’hélicase virale E1 et est responsable du maintien et de la ségrégation de l’épisome viral au cours de la division cellulaire. Toutes ces activités sont attribuables à la capacité de E2 à s’associer au génome viral et à interagir avec des protéines virales et cellulaires. De plus, ces fonctions sont elles-mêmes régulées par des modifications post-traductionnelles de la protéine E2. Plusieurs études ont été réalisées afin de découvrir les mécanismes de régulation des fonctions de E2 mais le rôle exact des différents domaines de E2 dans ces contrôles reste à être défini. En premier lieu, nous nous sommes intéressés à l’interaction entre E2 et Brd4(L) qui avait été définie comme étant essentielle à la ségrégation de l’épisome. Plusieurs caractéristiques associées à la protéine Brd4(L) telles que sa capacité à lier les lysines acétylées des histones, son interaction avec le complexe Mediator et sa participation à l’activation de la transcription en formant un complexe avec pTEFb, nous ont permis d’émettre l’hypothèse que l’interaction E2-Brd4(L) est nécessaire à l’activité transcriptionnelle de E2. Nous avons démontré que la protéine Brd4(L) interagit avec le domaine de transactivation de E2 de divers types de papillomavirus. De plus, cette interaction implique les résidus de E2 essentiels à son activité transcriptionnelle. Ainsi, ces résultats proposent que l’association E2-Brd4(L) serve à la régulation de la transcription des gènes viraux. Dans un second temps, nos recherches se sont concentrées sur l’existence d’une interface de dimérisation au sein du domaine de transactivation de E2 et de son implication dans les activités transcriptionnelles et réplicatives de la protéine. Nos études ont aussi mis en évidence que l’intégrité de la structure de ce domaine contribue au bon fonctionnement de la réplication du génome viral. Cette découverte suggère que la dimérisation de E2 peut réguler l’initiation de la réplication et propose l’existence d’un niveau de régulation additionnel impliquant l’état de la structure quaternaire de la protéine E2 et une modulation de l’interaction entre E1 et E2 à cette étape du cycle viral. Finalement, l’étude de l’instabilité de la protéine E2 nous a permis de définir une région importante dans le domaine flexible de la protéine, nécessaire à sa dégradation par le protéasome. De plus, la présence de résidus conservés localisés dans ce domaine, sont associés à la dégradation et portent la signature d’un signal de localisation nucléaire de type PY-NLS, suggérant que la stabilité de la protéine E2 est régulée par sa localisation au sein de la cellule. Ces études démontrent l’existence de nouvelles stratégies de régulation des activités transcriptionnelle et réplicative de la protéine E2 des papillomavirus. La compréhension de ces mécanismes nous permet de mieux cerner les étapes favorisant l’établissement et la progression du cycle viral et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques contre les infections aux papillomavirus. / Papillomaviridae is a family of small double-stranded DNA viruses known as papillomaviruses (PV) which infect skin and mucosal epithelial cells where they cause benign lesions such as warts. A subset of these viruses is associated with the development of malignant lesions and is the causal agent of cervical cancer. Papillomavirus E2 regulatory protein is involved in several functions leading to the establishment of the viral infection. These activities include the regulation of viral genes transcription, it participation to the initiation of viral DNA replication by recruiting the viral helicase E1, and to the maintenance and segregation of the viral episome during cellular division. All these functions are associated to the ability of E2 to bind specifically the viral genome, to interact with viral and cellular proteins and to acquire post-translational modifications. The first article of this thesis led to the identification of Brd4(L) as the major protein associated to E2 protein of different papillomavirus types. This interaction involves the amino acids associate to the transcription function of E2. The protein Brd4(L) was identified originally as a factor that maintains epigenetic memory by it interaction with acetylated histones during mitosis. This association with the chromatin, it interaction with Mediator complex and it participation to the cellular transcription by recruiting pTEFb complex allowed us to propose that the interaction between Brd4 and E2 is essential to the regulation of viral gene transcription. The second part of this work based on previous characterization of the transactivation domain dimerization interface; investigate the role of this surface in the transcriptional and replicative activities of E2. Our studies demonstrated that the integrity of the TAD dimerization interface may contribute to the DNA replication activity of E2. This discovery suggests that the dimerization interface may regulate the viral DNA replication by the redox state of the E2 protein. A fine characterization of this interface may provide new aspect of the interaction between E1 and E2 in the context of viral cycle. Finally, the third section of this thesis define a region of E2 protein associated to it degradation by the proteasome. This study also demonstrates that the stability of E2 is related to its cellular localization and suggests that the highly conserved residues found in this region may represent a PY-NLS nuclear localization signal signature. This thesis shows the existence of different approaches to regulate the transcriptional and the replicative activities as well as the stability of the papillomavirus E2 protein to favor the establishment and the progression of viral cycle.

L’ARN polymérase II (ARNPII), l’enzyme responsable de la transcription des ARN messagers, procède au décodage du génome des organismes vivants. Cette fonction requiert l’action concertée de plusieurs protéines, les facteurs généraux de la transcription, par exemple, formant un réseau d’interactions protéine-protéine, plusieurs étant impliquées dans la régulation de l’ARNPII à différents niveaux. La régulation de la transcription a été largement étudiée durant les quatre dernières décennies. Néanmoins, nous en connaissons peu sur les mécanismes qui régulent l’ARNPII avant ou après la transcription. Dans la première partie de cette thèse, nous poursuivons la caractérisation du réseau d’interactions de l’ARNPII dans la fraction soluble de la cellule humaine, travail qui a débuté précédemment dans notre laboratoire. Ce réseau, développé à partir de la méthode de la purification d’affinité en tandem couplée à la spectrométrie de masse (AP-MS) et à des méthodes d’analyses bioinformatiques, nous amène une foule d’informations concernant la régulation de l’ARNPII avant et après son interaction avec la chromatine. Nous y identifions des protéines qui pourraient participer à l’assemblage de l’ARNPII telles des chaperonnes et les protéines du complexe R2TP/prefoldin-like ainsi que des protéines impliquées dans le transport nucléocytoplasmique. Au centre de ce réseau se trouvent RPAP4, une GTPase qui semble se positionner à l’interface entre ces protéines régulatrices et l’ARNPII. Nous avons donc entamé l’étude la fonction de RPAP4, ce qui nous a menés à la conclusion que RPAP4 est essentielle à l’import nucléaire de l’ARNPII au noyau, où elle exerce sa fonction. Nous avons également montré que les motifs G et GPN sont essentiels à la fonction de RPAP4. Le traitement des cellules avec le bénomyl nous montre aussi que la fonction de RPAP4 et l’import nucléaire de l’ARNPII requièrent l’action des microtubules. La deuxième partie de la thèse s’intéresse à une autre protéine positionnée au centre du réseau, RPAP2. Cette dernière partage plusieurs interactions avec RPAP4. Elle est aussi essentielle à la localisation nucléaire de l’ARNPII et interagit directement avec celle-ci. RPAP4 et RPAP2 étant toutes deux des protéines cytoplasmiques qui font la navette entre le noyau et le cytoplasme, nous présentons des évidences que RPAP4 est impliquée dans l’export nucléaire de RPAP2 pour permettre à celle-ci d’être disponible dans le cytoplasme pour l’import de l’ARNPII dans le noyau. Dans la troisième partie de la thèse, nous étudions plus en profondeur les modifications post-traductionnelles de RPAP4, ce qui nous aide à mieux comprendre sa propre régulation et sa fonction auprès de l’ARNPII. RPAP4 est phosphorylée en mitose par la MAP kinase ERK5. Cette phosphorylation favorise l’interaction entre RPAP4 et RPAP2, ce qui empêche RPAP2 d’interagir avec l’ARNPII pendant la mitose, prévenant du même coup, son interaction avec la chromatine pendant cette phase du cycle cellulaire où la transcription est presque inexistante. / RNA polymerase II, the enzyme responsible for transcription of messenger RNA, decodes the genome of living organisms. This function requires the concerted action of several proteins, including transcription factors, which form a protein-protein interaction network. Many of them are implicated in the regulation of RNAPII transcription. Although regulation of transcription has been largely studied during the last four decades, little is known about mechanisms that regulate RNAPII prior and after the transcription reaction. In the first part of this thesis, we continue the characterization of the RNAPII interaction network of RNAPII in the soluble fraction of the human cell. This network, developed using tandem affinity purification method coupled with mass spectrometry (AP-MS) and bioinformatic analysis, provides a wealth of information about RNAPII regulation prior and after its interaction with chromatin for transcription. We identified proteins that can be involved in RNAPII assembly, including chaperones and the cochaperone complex R2TP prefoldin-like, and proteins involved in nucleocytoplasmic shuttling. RPAP4 is a GTPase that occupies a central position in this network being at the interface between these regulatory proteins and RNAPII. We therefore started to study the function of RPAP4, which lead us to conclude that RPAP4 is essential for RNAPII nuclear import. We also report that G domains and the GPN motif are essential for RPAP4 function. Treatment of the cells with benomyl suggests that microtubules are required for RPAP4 function and RNAPII nuclear import. The second part concerns another protein found in the network that is also centrally positioned in the network, called RPAP2. RPAP2 shares many interactions with RPAP4. This protein is also essential for the nuclear import of RNAPII as it interacts directly with it. RPAP4 and RPAP2 being cytoplasmic proteins that shuttle between the cytoplasm and the nucleus, we show evidences that RPAP4 is implicated in RPAP2 nuclear export to make it available for RNAPII nuclear import. In the third part, we study RPAP4 post-translational modifications, which help us to understand its own regulation and its function with RNAPII. RPAP4 is phosphorylated in mitosis by the MAP kinase ERK5. This phosphorylation promotes the interaction between RPAP4 and RPAP2. It prevents RPAP2 and RNAPII interaction and RNAPII chromatin localization in mitosis where transcription is mostly nonexistent.

Le cancer de la prostate (CaP) est devenu un véritable problème de santé publique dans les pays industrialisés. L'hormonothérapie reste le traitement de première ligne le plus efficace dans les cancers avancés mais il n'empêche pas la progression vers un stade androgéno-indépendant (AI), pour lequel la chimiothérapie s'avère peu efficace. Une des stratégies pour améliorer les thérapies actuelles consiste à cibler des gènes de survie surexprimés dans les CaPs AI afin de restaurer la sensibilité aux traitements du CaPs. Hsp27, protéine surexprimée dans ces cancers, à un effet cytoprotecteur qui engendre une résistance aux traitements. Elle est maintenant reconnue comme une cible thérapeutique importante. Rocchi et al. ont développé un oligonucléotide antisense (ASO) de deuxième génération (OGX-427) qui cible l'ARNm d'Hsp27. OGX-427 est actuellement en essai clinique phase II chez des patients atteints de CaPs au Canada et aux Etats-Unis. Mon projet de thèse a porté sur l'étude des mécanismes d'action d'Hsp27 impliqués dans l'évolution AI du CaP. Cette étude a pour but d'améliorer la sureté pharmacologique d'OGX-427, mais aussi d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques visant spécifiquement les cellules tumorales. Mes travaux de thèse ont montré que lors d'un stress cellulaire induit par hormonothérapie et/ou chimiothérapie, Hsp27 interagit avec le facteur eucaryotique d'initiation de la traduction eIF4E et le protège de sa dégradation par la voie ubiquitine/protéasome. Ceci maintient la synthèse protéique et engendre une survie cellulaire impliquée en partie dans l'effet cytoprotecteur médié par Hsp27. / Prostate cancer (PC) has become a real public health issue in industrialized countries, mainly due to patients' relapse by castration-resistant (CR) disease after androgen ablation. One strategy to improve current therapies in advanced PC involves targeting genes that are activated by androgen withdrawal, either to delay or prevent the emergence of the CR phenotype. Hsp27 is over-expressed in this cancer and has been shown to play a cytoprotective role leading to treatments resistance. This protein is now considered as promising therapeutic target. Rocchi, P. et al. developed and patented a second generation antisens oligonucleotides (ASO) targeting Hsp27 that has been licensed (OGX-427) and phase II clinical trials are currently in process in PC in Canada and USA. My PhD project focused on the study of Hsp27 action mechanisms involved in CRPC progression. The present study aims to improve pharmacological safety of OGX-427 and to identify new therapeutic targets specific of CRPC cells. The results of my PhD have shown that during cell stress induced by hormone- and/or chemotherapy, Hsp27 interacts with eukaryotic translation initiation factor eIF4E and protects it from degradation by the ubiquitin/proteasome pathway. This maintains protein synthesis and leads to cell survival, partly involved in the cytoprotection mediated by Hsp27. Our work therefore concerned the characterization of the interaction site between Hsp27 and eIF4E in order to identify potential inhibitors of this interaction that could delay CRPC progression.

Les invertases de plantes (Invs) hydrolysent de manière irréversible le saccharose en fructose et glucose. En fonction de leur pH optimum et de leur localisation subcellulaire, les Invs sont classées en trois groupes : alcaline et neutre (A/N-Inv), vacuolaire (VI) et de paroi (CWI). Le but de notre étude a été de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans les régulations post-traductionnelles d'une VI de Solanum lycopersicum (VINV). L'ADNc codant pour VINV a été cloné et exprimé dans le système hétérologue Pichia pastoris. Après purification, la caractérisation biochimique a été réalisée et a montré des résultats comparables à ceux obtenus précédemment pour d'autres Invs. La structure tridimensionnelle de VINV a été résolue par cristallographie aux rayons X à 2,75 Å et il s'agit de la première structure d'une VI décrite jusqu'ici. Des expériences de mutagénèse dirigée ont permis d'identifier certains acides aminés impliqués dans la catalyse : le nucléophile, le catalyseur acide/base, le stabilisateur d'état de transition et un résidu qui module le pKa du catalyseur acide/base. Par ailleurs, la régulation de l'activité de VINV a été étudiée. La N-glycosylation de VINV recombinante semble être importante pour la stabilité de la structure. De plus, l'activité VINV peut aussi être modulée par un inhibiteur protéique spécifique. Une approche de génomique fonctionnelle a été utilisée, et un inhibiteur d'invertase vacuolaire putatif (SolyVIF) de S. lycopersicum a été identifié dans la banque de données des Solanacées. L'ADNc codant pour SolyVIF a été cloné et exprimé dans le système hétérologue Escherichia coli Rosetta gami (DE3). / Plant invertases (Invs) hydrolyze irreversibly sucrose into fructose and glucose. Based on their pH optima and subcellular localization, Invs are categorized into three groups: alkaline and neutral invertase (A/N-Inv), vacuolar invertase (VI), and cell wall invertase (CWI). The goal of our study was to better understand mechanisms involved in the molecular regulation of a VI from Solanum lycopersicum (VINV) at post-translational levels. The VINV cDNA was cloned and heterologously expressed in Pichia pastoris. After purification, the biochemical characterization was performed and showed comparable results with those obtained previously for other characterized Invs. The three-dimensional structure of VINV was solved by X-ray crystallography to 2.75 Å resolution and it was the first structure of a plant VI described so far. Mutations experiments allowed to identify important amino acids: the nucleophile, the acid/base catalyst, the transition-state stabilizer and a residue that modulate pKa of the acid/base catalyst. Moreover, the regulation of VINV at different post-translational levels was studied. N-glycosylation of recombinant VINV seems to be important for structure stability. VINV activity can also be modulated by specific proteinaceous inhibitor. A functional genomics approach was used, and a putative vacuolar invertase inhibitor (SolyVIF) of S. lycopersicum was identified in the Solanaceae data bank. SolyVIF cDNA was cloned and heterologously expressed in Escherichia coli Rosetta gami (DE3). Recombinant protein was purified and characterized.

Les virus Nipah (NiV) et Hendra (HeV) sont des paramyxovirus zoonotiques appartenant au genre Henipavirus. Les paramyxovirus possèdent un génome ARN simple brin de polarité négative encapsidé par la nucléoprotéine (N) au sein d’une nucléocapside hélicoïdale. Cette dernière sert de substrat pour la transcription et la réplication, réalisées par la polymérase virale qui consiste en un complexe entre la protéine L et la phosphoprotéine (P). A l’aide d’approches biophysiques, j’ai établit une cartographie de l’interaction entre la région C-terminale désordonnée de N (NTAIL) et la région C-terminale de P (PXD) chez NiV, HeV et MeV. L’observation à l’échelle atomique par RMN a confirmé l’intervention d’un élément de reconnaissance moléculaire (MoRE) qui subit un repliement α-hélical au contact de PXD. J’ai également montré la capacité des domaines NTAIL et PXD des henipavirus à former des complexes hétérologues soulignant leur proximité structurale. L’interaction NTAIL-PXD, cruciale pour le recrutement de la polymérase virale constitue une cible idéale pour des approches antivirales. Ainsi, un test de criblage à haut débit par HTRF a été mis en place dans le but d’identifier des inhibiteurs. Enfin, une approche structurale a révélé une organisation trimérique de la protéine P de NiV et HeV en solution. La résolution de la structure cristalline de la région de tétramérisation de P du virus de la rougeole montre la présence d’une région désordonnée à proximité du site putatif de recrutement de L. Collectivement, ces résultats représentent une étape clé vers l’élucidation du l’impact fonctionnel de l’oligomérisation de la protéine P sur le cycle réplicatif des paramyxovirus. / Nipah (NiV) and Hendra (HeV) viruses are zoonotic paramyxoviruses that belong to the Henipavirus genus. Paramyxoviruses possess a single-stranded negative-sense RNA genome that is encapsidated by the nucleoprotein (N) into a helical nucleocapsid. This latter is the substrate for both transcription and replication that are carried out by the polymerase, consisting of a complex between the large protein (L) and the phosphoprotein (P). Using various biophysical approaches, I was able to map the interaction between the C-terminal disordered region of N (NTAIL) and the C-terminal region of P (PXD) in NiV, HeV and MeV. Atomic resolution description of the HeV NTAIL-PXD interaction by NMR confirms the involvement of a molecular recognition element (MoRE) of α−helical nature in binding to PXD. I also showed that Henipavirus NTAIL-PXD form heterologous complexes, involving a structural similarity. As this interaction is crucial for the recruitment of the viral polymerase, it is a promising target for antiviral approaches. This prompted me to set up a protein-protein interaction (PPI) assay based on the HTRF technology to identify inhibitors. Finally, I provided the first experimental evidence of a trimeric organization of P proteins in NiV and HeV. We also solved the crystal structure of two different forms of MeV P tetramerization domain who unveiled the presence of a disordered region located near the putative L-binding site and reveal significant structural variations in coiled-coils organization. Collectively, these results represent a key step towards the elucidation of the functional impact of P protein oligomerization on the replicative cycle of paramyxoviruses.

Le cancer de la prostate (CaP) représente la deuxième cause de mortalité par cancer chez l'homme. La suppression androgénique (castration-thérapie) demeure la seule thérapie efficace du CaP avancé du fait de son caractère castration-sensible. Cependant, elle n'empêche pas la progression castration-résistante (CR) de la maladie dans les 1 à 3 ans après le début du traitement hormonal. Récemment, l'implication d'Hsp27 (Heat shock protein 27) dans l'échappement thérapeutique des CaPs a été montrée et un oligonucléotide antisens inhibiteur d'Hsp27, OGX-427, est en cours d'évaluation clinique II/III pour le traitement des CaPs CR. Afin de comprendre le rôle d'Hsp27 dans le mécanisme de résistance à la castration, nous avons réalisé le criblage de l'ensemble des protéines partenaires d'Hsp27 par double hybride. Mes travaux de thèse ont permis d'identifier une nouvelle protéine cliente d'Hsp27, TCTP (translationally controlled tumor protein) dont l'expression est indétectable dans les cellules normales. J'ai également montré que la progression CR des CaPs corrélait avec une surexpression de TCTP, une perte de P53 et que l'inhibition de TCTP par un oligonucléotide antisens restaurait l'expression de P53. Cette étude suggère, pour la première fois, un lien direct entre P53 et la sensibilité à la castration des CaPs. De plus, l'étude de l'interactome d'Hsp27 a mis en évidence son implication dans de nouvelles fonctions telles que la réparation de l'ADN ou l'épissage alternatif des ARNm. L'ensemble de ces travaux ont permis de mieux comprendre les mécanismes d'action d'Hsp27 dans la progression CR des CaPs et de développer de nouvelles approches thérapeutiques. / Prostate cancer (PC) is the second most common cause of cancer-related mortality in men in the Western world. Androgen ablation (castration-therapy) is usually the initial therapy in patients with advanced or metastatic disease. Unfortunately, the disease gradually progresses to a metastatic castration-resistant (CR) state, which remains incurable. Recently, the involvement of Hsp27 (Heat Shock Protein 27) in CR progression has been identified and an oligonucleotide antisense (OGX-427), inhibitor of Hsp27 is currently in phase II/III clinical trials to treat CRPC. In order to understand Hsp27 mechanisms of action in CR progression, we started to screen for Hsp27 partner proteins by using two-hybrid system. My PhD work has reported that Translationally Controlled Tumor Protein (TCTP) was a new Hsp27 protein partner that mediated Hsp27 cytoprotection in CRPC and that TCTP expression was absent in normal prostate tissues. We have further found that CR progression correlated with TCTP overexpression, the loss of P53 and that TCTP silencing using an antisense was able to restore P53 expression and function. This study suggests for the first time that castration-sensitivity is directly linked to P53 expression. In addition, we revealed exciting new aspects of the Hsp27 involvement in essential metabolic and cellular processes such as DNA repair and mRNA splicing. In summary, my PhD results have provided an enriched understanding of Hsp27 mechanisms of cytoprotection contributing to CRPC progression and opened a new promising field of research for multi-target therapeutic approaches.

Le complexe NADPH oxydase est un élément essentiel de l’immunité inné. Présent dans les cellules phagocytaires (neutrophile), sa fonction est de produire massivement, dans le phagosome, des anions superoxyde et générer ainsi des espèces encore plus réactives de l’oxygène qui vont détruire acides nucléiques, lipides et protéines des bactéries phagocytées. Le cœur membranaire catalytique du complexe NADPH oxydase est constitué d’un hétérodimère membranaire, le cytochrome b₅₅₈ (Cyt b₅₅₈). Après activation de celui-ci par les partenaires protéiques cytosoliques p47phox, p67phox, p40phox et Rac, une succession de réactions de transferts d’électron de part et d’autre de la membrane a lieu au sein du Cyt b₅₅₈ pour aboutir à la réduction du dioxygène de manière très contrôlée. Afin de mieux comprendre cette régulation, nous nous sommes d’abord intéressés aux stéreoisomères trans de l’acide arachidonique, activateur naturel de cet enzyme (cis), sur le fonctionnement de la NADPH oxydase et avons abordé cette étude parallèlement sur du Cytb₅₅₈ d’origine bovine présent dans des membranes de neutrophiles et dans des membranes de levures exprimant le Cytb₅₅₈ de manière hétérologue. Nous avons montré que la géométrie joue un rôle important sur l’activation du complexe enzymatique. Dans un deuxième temps, afin d’étudier le rôle de l’environnement membranaire sur le fonctionnement de la NADPH oxydase, nous avons déterminé les propriétés cinétiques et thermodynamiques de l’activité NADPH oxydase du Cytb₅₅₈ recombinant exprimé en levures, purifié, puis reconstitué en liposomes de composition lipidique variée. Après comparaison avec ces mêmes propriétés obtenues pour le Cytb₅₅₈ dans les membranes plasmiques et du réticulum endoplasmique de levures, nous avons montré que l’activité NADPH oxydase très sensible à la température peut être modulée par la composition et l’état physique de la membrane. / NADPH oxidase complex is a major actor of both antimicrobial host defense and inflammation by generating highly regulated superoxide anion, rapidly converted into reactive oxygen species (ROS). The NADPH oxidase complex consists of a heterodimeric integral membrane flavocytochrome b₅₅₈ and three cytosolic components p67phox, p47phox and p40phox, and the small GTP binding protein Rac. In response to a cellular stimulus, cytosolic proteins are recruited to the phagosomal membrane where they are assembled with the Cytb₅₅₈ to form the active NADPH oxidase. The aim of the work was to better understand the modulation of superoxide anion production by this enzyme. For this purpose, we performed experiments with both bovine neutrophil membranes and yeast membranes expressing the bovine recombinant Cytb₅₅₈. We first investigated the effect of the trans-isomerization of the cis-arachidonic acid, the activator of NADPH oxidase in vitro and showed that specific geometry of the activator plays an important role in the activation of the complex. We also studied the role of the membrane environment on the functioning of NADPH oxidase and determined the kinetics and thermodynamics of NADPH oxidase activity depending on the lipid composition of Cytb₅₅₈ proteoliposomes. Comparison with these properties obtained with recombinant Cytb₅₅₈ embedded into endoplasmic reticulum and plasma membranes, we showed that the NADPH oxidase activity is highly temperature dependent and can be modulated by the lipid environment and the physic state of the membrane.

Les petites protéines G Arf ont besoin d'un facteur d'échange nucléotidique (GEF) afin de passer de leur forme inactive liée au GDP à leur forme active liée au GTP. GBF1 est la GEF pour Arf1 qui assure, notamment, le recrutement du complexe manteau COPI impliqué dans le transport entre le Golgi précoce et le réticulum endoplasmique. Il a été récemment montré que GBF1 est impliqué dans la livraison de l'Adipose TriGlycéride Lipase (ATGL) sur les corps lipidiques (LDs). ATGL est une enzyme qui catalyse l'hydrolyse des triglycérides en diglycérides. Les travaux présentés dans cette thèse ont eu pour objectif d'étudier et de caractériser l'interaction entre GBF1 et la lipase ATGL. Par des expériences de co-immunoprécipitation dans les cellules de mammifère, les domaines des deux protéines impliquées dans l'interaction ont été identifiés. Par des expériences de pulldown utilisant les protéines exprimées chez E. coli, j'ai montré que ces interactions sont directes. Afin d'approfondir l'étude de l'interaction entre GBF1 et ATGL, j'ai construit des outils permettant l'étude biochimique de GBF1 en purifiant plusieurs de ses domaines. J'ai tout d'abord cherché à mettre au point un test d'activité pour GBF1 afin de tester l'influence de protéines partenaires, dont ATGL, sur son activité. Malgré la purification de différents fragments de GBF1 contenant le domaine Sec7, aucun n'a présenté une activité avec Arf1Δ17 en solution. Le domaine N-terminal de la protéine, avec et sans une mutation empêchant une interaction intramoléculaire, ainsi que les domaines HDS1 et HDS2 de GBF1 ont également été purifiés / Small G proteins Arf require assistance from a Guanine nucleotide exchange factor (GEF) in order to switch between GDP- and GTP-bound forms. GBF1 is the Arf1 GEF that mediates COPI coat complex recruitment to early secretory pathway membranes. COPI is a protein that coats vesicles transporting proteins from the cis side of the Golgi complex back to the rough endoplasmic reticulum. GBF1 was recently shown to mediate delivery of Adipose TriGlyceride Lipase (ATGL) to the surface of lipid droplets (LDs). ATGL is an enzyme catalyzing the initial step in triglyceride hydrolysis in LDs. Thus, the aim of this work was to study interactions between GBF1 and ATGL. By co-immunoprecipitation experiments in mammalian cells, the domains of two proteins involved in the interaction have been identified. By pulldown assays using proteins expressed in bacteria, I showed that these interactions are direct. To further study of the GBF1-ATGL interaction, I developed tools for the biochemical study of GBF1, by purifying several of its domains. I first tried to develop a kinetic essay for GBF1 to test the influence of interacting partners, including ATGL, on its activity. Despite the purification of various GBF1 fragments containing the Sec7 domain, none have activity with Arf1Δ17 in solution. The N-terminal domain of the protein, with and without a mutation disrupting an intramolecular interaction, and the HDS1 and HDS2 domains of GBF1 were also purified.

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Les particules ribonucléoprotéiques (RNP) à boîtes C/D et H/ACA sont impliquées dans la maturation des UsnRNA et des précurseurs des ARNr. L'assemblage de ces RNP dans les cellules est un processus complexe faisant intervenir de nombreux facteurs cellulaires dont NUFIP, commun aux deux RNP, et NAF1, spécifique aux RNP à boîtes H/ACA. Le complexe de Survie des Motoneurones (SMN) est essentiel à la survie cellulaire et est nécessaire à l'assemblage d'une autre RNP, les UsnRNP, composants des spliceosomes. Un déficit en protéine SMN conduit à une pathologie grave, l'amyotrophie spinale. Plusieurs études suggèrent que le complexe SMN puisse également jouer un rôle dans l'assemblage des RNP à boîtes C/D et H/ACA. Dans le but d'obtenir de plus amples informations, nous avons testé si des interactions existent entre les constituants du complexe SMN et i) les protéines associées aux RNP matures, ainsi que ii) les autres facteurs d'assemblage déjà connus. Ainsi, par une approche de double hybride chez la levure, nous avons observé des interactions fortes entre NAF1 et les protéines Gemin3 et Gemin8 du complexe SMN. Comme la protéine coeur GAR1 des RNP à boîte H/ACA interagit avec la protéine SMN, ces données suggèrent que le complexe SMN participe à l'échange de NAF1 par GAR1, qui est une étape clé de la biogenèse des RNP à boîtes H/ACA. De plus, nous avons mis en évidence des interactions entre Gemin3/NUFIP, Gemin4/NUFIP et Gemin6/NUFIP. L'étude de cette dernière interaction a été approfondie. Nous avons montré que l'interaction est directe, qu'elle existe dans les cellules de mammifères à la fois dans le cytoplasme et le noyau, et nous avons défini les domaines de chaque protéine nécessaires à l'interaction, en collaboration avec l'équipe d'E. Bertrand (IGM Montpellier). Ces résultats ouvrent de larges perspectives quant à un lien fonctionnel entre le complexe SMN et NUFIP dans l'assemblage des RNP à boîtes C/D et H/ACA, mais aussi dans l'assemblage de la snRNP U4 et dans le mécanisme de traduction localisée dans les cellules / Box C/D and H/ACA ribonucleoparticles (RNPs) are required for UsnRNA and ribosomal RNA maturation. Their assembly in cells is a complex process, which implicates numerous cellular factors, such as NUFIP, a common assembly factor, and NAF1, which is a specific factor for H/ACA box RNP assembly. The Survival of Motoneurons (SMN) complex is essential for cell survival and is required for the assembly of another class of RNPs, the UsnRNPs, which are essential components of the splicing machinery. Decreased levels of the SMN protein lead to a severe disease, the spinal muscular atrophy. Several studies led to the proposal that the SMN complex also plays a role in the assembly of box C/D and H/ACA RNPs. In order to obtain more information, we analyzed whether some interactions may exist between components of the SMN complex and i) core proteins of mature RNPs, or ii) factors already known to be involved in the assembly. Using a yeast two-hybrid approach, we observed strong interactions between NAF1 and the SMN complex components, Gemin3 and Gemin8. Since the core H/ACA protein GAR1 interacts with the SMN protein, our data suggest that the SMN complex participates to the exchange of NAF1 by GAR1, which is a crucial step of H/ACA box RNP biogenesis. Furthermore, we discovered strong interactions between Gemin3/NUFIP, Gemin4/NUFIP and Gemin6/NUFIP. Concerning the Gemin6/NUFIP interaction, we showed that is direct, that it exists in both compartments in mammalian cells and we defined domains of both proteins necessary for the interaction in collaboration with the E. Bertrand team (IGM Montpellier). These results open new perspectives concerning functional links between the SMN complex and NUFIP in box H/ACA and C/D RNP assembly, but also in U4 snRNP assembly and in the mechanism of localized translation