La richesse de la peau en cellules présentatrices d'antigènes fait de ce tissu un site prometteur pour la vaccination. Des différences dans les réponses humorales et cellulaires induites par voie transcutanée et intradermique, en comparaison des voies conventionnelles, sont observées in vivo chez l'Homme. Ces observations mettent en évidence la mauvaise compréhension des mécanismes immunitaires induits dans la peau. Un modèle ex vivo d'explant de peau humaine nous a permis d'étudier les évènements précoces de l'immunité innée induits suite à l'administration d'un antigène par voie cutanée. Nous avons mis en évidence un nouveau mécanisme induit en réponse à une stimulation par des agonistes de TLRs. Nous montrons que la production de la cytokine IL- 32 par les kératinocytes contribue à l'activation des cellules de Langerhans. Une analyse protéomique des modifications induites dans le micro-environnement cutané, suite à l'administration intradermique d'un vaccin Influenza, nous a permis d'établir une signature de la réponse inflammatoire cutanée. Nous observons l'expression de protéines impliquées dans l'immunité cutanée mais également dans l'adhésion cellulaire, le métabolisme des glucides et des lipides. Enfin, nous avons observé la capacité de la méthode de rupture de la barrière cutanée « Cyanoacrylate Skin Surface Stripping » (CSSS), utilisée par la voie transcutanée, à induire la surexpression de cytokines et chimiokines cruciales pour la mise en place d'une réponse immunitaire cutanée. Ces données sont importantes pour l'amélioration de la compréhension des mécanismes immunitaires induits dans la peau et pour la mise en place de nouvelles stratégies vaccinales. / Skin richness in immune cells in antigen presenting cells make the skin a promising site for vaccination strategies. Differences in humoral and cellular responses induced in vivo were observed in humans, between studies using intradermal and transcutaneous vaccine administration compared to conventional routes. Theses results highlight that immune molecular mechanism induced in the skin remains poorly understood. An ex vivo human skin explant model was used to analyze early immune events induced after cutaneous antigen administration. We have demonstrated, for the first time, the role of IL-32 produced by keratinocytes in Langerhans cell activation, after TLRs agonists skin cells stimulation. A proteomic analysis of modifications induced in skin microenvironment, after intradermal Influenza vaccine administration, showed the detection of new protein biomarkers from cells adhesion signalling and carbohydrates and lipids metabolism associated with known protein biomarkers from cutaneous inflammatory. In addition, we have observed the ability of the Cyanoacrylate Skin Surface Stripping (CSSS) method, a mild skin disruption method, to promote cytokines and chemokines overexpression by epidermal cells, which are crucial in cutaneous immune response establishment. Theses results allow the better comprehension in immune molecular and cellular mechanism induced in the skin and the development of new vaccination strategies.

La spectrométrie de masse est devenue un outil indispensable pour la recherche en protéomique, notamment grâce au développement récent de nouveaux spectromètres de masse comme l’Orbitrap et de nouvelles méthodes de dissociation. La stratégie « bottom-up » (analyse des mélanges de peptides protéolytiques) est la plus utilisée par son efficacement et sa simplicité par rapport à la stratégie top-down (analyse des peptides plus longs ou des protéines intactes), mais cette dernière permet une caractérisation plus complète des isoformes de protéines et des modifications post-traductionnelles.Les méthodes de dissociation utilisant des photons, comme la photodissociation dans le domaine ultra-violet (UVPD) et la dissociation multiphotonique infrarouge (IRMPD), ont reçu une grande attention comme approches alternatives aux méthodes de dissociation par collision. L'absorption du photon UV à haute énergie peut être « diluée » sur l'ensemble du peptide ou de la protéine et provoque une fragmentation étendue du squelette peptidique (liaisons C-C), tandis que les photons IR à faible énergie augmentent progressivement l'énergie interne et dissocient préférentiellement les liaisons amide (C-N) les plus labiles.Cette thèse est centrée sur le développement de méthodes et les applications pour une caractérisation structurale de biomolécules par des méthodes d'activation utilisant des photons. L'intérêt de combiner des photons infrarouges à faible énergie et des photons UV à haute énergie dans un spectromètre de masse Orbitrap, pour la caractérisation de petites protéines, a été évalué. En outre, la dissociation infrarouge multiphotonique a été implémentée dans un piège à ions électrostatique afin d’étendre les méthodes de fragmentation aux macromolécules de très haut poids moléculaires dans le domaine mégadalton. L'une des principales avancées de cette thèse a été d'adapter ces méthodes de spectrométrie de masse aux objets biomoléculaires, allant des petits peptides (dans la gamme de masse de kilodalton) à des fibres de protéines entières (dans la gamme de masse de mégadalton) / The structural characterization of proteins often required them to be fragmented into small units containing only few amino acids. In bottom-up approach, proteins are cleaved into small peptides by enzyme then these peptides are subjected to further fragmentation in a collision cell of a tandem mass spectrometer. However, in top-down approach, proteins can directly be dissociated (without enzyme) into small fragments by collision, electron and photon-driven dissociations. Photon-based activation methods including ultraviolet photodissociation (UVPD) and infrared multiphoton dissociation (IRMPD) have received great attention as an alternative to electron-driven and collision induced dissociation methods. Absorption of the high-energy UV photon is dispersed over the whole peptide or protein and stimulates extensive C?Ca backbone fragmentation while the low-energy IR photons gradually increases the internal energy and thus favorably dissociates the most labile amide (C?N) bonds. This thesis focuses on the method development and applications for characterizing biomolecules by photon-based activation methods. The interest of combining high-energy UV photons and low-energy IR photons in an Orbitrap mass spectrometer, for protein and post-translationally modified peptide characterization, has been evaluated. Moreover, infrared multiphoton dissociation has been implemented in a gated electrostatic ion trap to push forward the limit of fragmentation methods to large megadalton ions. One of the main breakthroughs in this thesis is the ability to adapt these method developments and applications to biomolecular objects ranging from small peptides (in kilodalton mass range) to entire protein fibrils (in megadalton mass range)

Le latex de Carica papaya est un milieu riche en cystéine protéinases. Celles-ci ont été régulièrement utilisées en cosmétique ou pour l’attendrissement de la viande. Mais ces protéines ont aussi un intérêt pharmaceutique. En effet, le latex est bien connu pour posséder une activité antifongique mais aussi une activité anthelminthique. Ces effets sont régulièrement attribués aux cystéine protéinases qui se trouvent en concentration importante dans le latex. Malgré ces concentrations importantes en protéinases, d’autres protéines restent actives dans ce milieu. C’est le cas de la glutamine cyclase, qui a été extraite intacte de ce milieu et cristallisée. Sa structure nous a révélé une architecture particulière en ‘’&61538;-propeller‘’ à cinq pales avec double fermeture. Cette structure lui confère sa très grande stabilité. <p>Les industries pharmaceutiques sont aussi à la recherche de protéines très stables et résistantes aux protéinases endogènes. Nous avons donc entrepris l’étude du protéome de Carica papaya afin de mettre en évidence d’autres protéines minoritaires relativement stables pouvant conférer au latex son activité anthelminthique. Cette analyse a permis la mise en évidence de différentes protéines appartenant à diverses familles des « pathogenesis related protéins » (PR-proteins): une &61538;-1,3 glucosidase, une analogue à la barwin, une thaumatine et deux chitinases.<p>Nous nous sommes particulièrement intéressés à ces deux dernières au cours de cette thèse. Une caractérisation de ces deux protéines a permis de montrer que celles-ci étaient bien deux protéines distinctes, identifiées comme chitinases majeure et mineure selon leur abondance dans le latex. Elles sont relativement stables et résistantes à la protéolyse. Une analyse de la séquence de la chitinase majeure a montré que celle-ci était homologue à la chitinase issue de l’orge et une analyse de sa structure révèle la présence d’une grande concentration en prolines localisées principalement dans les neuf boucles de sa structure. Cela pourrait expliquer sa grande résistance vis à vis des cystéine protéinases.<p>La cristallisation de cette même chitinase en présence de N-acétyl-glucosamine comme additif, a conduit à une structure contenant trois molécules de GlcNac, deux dans le centre actif de notre protéine et une participant au réseau cristallin. Aucune structure de chitinase n’avait encore pu être obtenue en co-cristallisation avec un substrat. A partir des deux GlcNac observés dans le centre actif, nous avons reconstruit un complexe chitinase/(GlcNac)4. L’analyse de ce complexe a permis de mettre en évidence de nouvelles interactions entre (GlcNac)4 et les acides aminés du centre actif ainsi que de confirmer le mécanisme de la famille GH 19.<p> Des tests préliminaires sur nématodes ont finalement confirmé l’activité anthelminthique du latex et montré que la chitinase pouvait aussi être un bon nématocide<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Il est maintenant admis que l’activité anti-tumorale du TNF implique une destruction de la vascularisation de la tumeur par induction d’apoptose des cellules endothéliales. Si le traitement au TNF en thérapie humaine permet des rémissions complètes, il n’est applicable qu’aux membres isolés de la circulation systémique car les doses requises de TNF sont létales pour le patient. Mettre en évidence les mécanismes qui contrôlent l’apoptose de la cellule endothéliale devrait permettre de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques favorisant l’effet thérapeutique du TNF tout en évitant le choc septique qu’il engendre.<p><p>Nous avons abordé cette question en utilisant le modèle de la cellule endothéliale d’aorte bovine (BAEC) stimulée au TNF afin d’étudier les mécanismes qui contrôlent le processus apoptotique et ce au cours des phases précoces de celui-ci.<p><p>D’une part, nous avons identifié par une approche pharmacologique au moins trois voies de contrôle négatif d’induction de mort cellulaire par le TNF dans les cellules endothéliales :la première faisant intervenir une des protéines kinases C, une seconde la PI3-kinase et une troisième la protéine kinase p38. Cette dernière semble spécifiquement activée par le TNF et pourrait donc constituer une nouvelle cible pharmacologique visant à sensibiliser les cellules endothéliales de la vascularisation de la tumeur à l’action apoptotique du TNF. <p>D’autre part nous avons mis en évidence et identifié par une approche protéomique au moins deux protéines montrant une rapide diminution de phosphorylation lorsque les cellules endothéliales sont stimulées par le TNF en présence de cycloheximide. Ces deux événements semblent en aval de l’activation d’une protéase de la famille des caspases. La première protéine est la sous-unité régulatrice de type II alpha (RIIα) de la protéine kinase A. Cependant, la relation entre cette déphosphorylation et le processus d’apoptose n’a pas pu être mise en évidence, une stimulation de l’activité PKA n’affectant pas l’induction d’apoptose des BAEC. La seconde est la protéine HDGF, connue pour être sur-exprimée dans certains cancers, mais dont la régulation par phosphorylation ainsi que son implication éventuelle lors du processus apoptotique n’avaient encore jamais été envisagées.<p><p>Enfin, nous avons voulu mettre en évidence le rôle potentiel de la protéine hnRNP K qui subit une modification post-traductionnelle précoce lors de l’apoptose des BAEC. Notre étude, menée après surexpression de la protéine étiquetée, suggère une modification autre qu’une dégradation. Cependant, il ne nous a pas été permis de lui attribuer un rôle puisque la surexpression de cette protéine n’affecte pas l’apparition de différents marqueurs associés à l’apoptose. / Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Cette étude a consisté en le développement et l’évaluation de nouvelles molécules pour la radiochimiothérapie concomitante. Ce travail a abouti à la conception de nouveaux agents chimiothérapeutiques duaux basés sur la combinaison covalente de deux radiosensibilisateurs: un inhibiteur de la PARP d’une part, et un alkylant de l’ADN (complexe de platine ou témozolomide) d’autre part. Les évaluations biologiques ont permis de mettre en évidence l’intérêt d’une molécule duale inhibiteur de la PARP/platine. Parallèlement à ce projet, le développement d’outils moléculaires pour l’étude d’inhibiteurs de la PARP a été entrepris. Ainsi, plusieurs sondes d’affinité ont été conçues pour une étude d’inhibiteurs de la PARP par protéomique chimique. Ce travail a permis de valider la spécificité d’une sonde d’affinité pour la PARP1 et la PARP2. Finalement, des molécules fluorescentes inhibitrices de la PARP ont été développées dans l’objectif d’un criblage d’inhibiteurs de PARP3 par anisotropie de fluorescence. / The main topic of this work was the development and biological evaluation of dual molecules for concomitant chemoradiotherapy. To this end, new dual chemotherapeutic agents were designed by linking covalently two radiosensitizers: a PARP inhibitor and an alkylating agent (platinum complex or temozolomide). This study led to an efficient PARP inhibitor/platinum dual molecule. A complementary approach was to develop affinity probes to study PARP inhibitors by a chemical proteomic method. This study permitted to validate the selectivity of an affinity probe for PARP1 and PARP2. Finally, fluorescent PARP inhibitor probes were synthesised and evaluated for a PARP3 screening by fluorescence anisotropy.

Ce travail a consisté en la synthèse d’outils chimiques et au développement de leurs applications biologiques. Dans un premier temps, des sondes pour l’étude de la Topoisomérase IIA humaine ont été synthétisées. Ces sondes ont alors été testées sur lysat cellulaire pour la capture des protéines présentant une affinité pour ces médicaments. Dans un second temps, un nouveau lien clivable en conditions non dénaturantes pour des applications en protéomique chimique a été developpé. Ainsi, après optimisation de la structure, il a été intégré au sein d’une sonde d’affinité pour évaluer sa capacité de capture et libération de la PARP 1. Enfin, la réaction de click entre un azoture et un cyclooctyne a été appliquée à l’élimination d’une drogue circulante dans le sang.Après l’étude cinétique de la réaction, l’activité biologique et la pharmacocinétique des différents composés ont été évaluées pour optimiser la réaction de click in vivo. / The main goal of this work was to synthesize chemical tools and to developp their biological applications. In the first part, probes for the study of Topoisomerase II via chemical proteomic were synthesized. They were then used for pulldown experiments on cell lysats. In a second part, a new cleavable linker in non denaturing conditions was developped for chemical proteomic applications. After optimisation of the structure, it was incorporated in an affinity probe and tested for the pulldown of PARP 1. Finally, a click chemistry reaction, the SPAAC, was used to provok the elimination of a circulating drug. After the study of the kinetic of the reaction, the biological activity and the pharmacokinetic of the different compounds were evaluated to optimise the click reaction in vivo.

La protéomique clinique est, depuis ses débuts, considérée comme une technique à fort potentiel pour la recherche de biomarqueurs des cancers. Cependant, cette quête reste à ce jour sur un constat d’échec. Ces dix dernières années, la communauté protéomiste a œuvré pour comprendre l’origine des biais et pour homogénéiser les résultats. Les objectifs de mon travail de thèse s’articulent, dans ce contexte, en deux parties : - La première partie décrit l’ensemble des développements méthodologiques réalisés en analyse protéomique pour la recherche de biomarqueurs.- La seconde partie est consacrée à l’application de ces développements sur trois projets : (i) La recherche de biomarqueurs à visée diagnostique dans le but d’améliorer la caractérisation des lymphomes des cellules B. (ii) L’étude des cellules souches cancéreuses des glioblastomes. (iii) La recherche de biomarqueurs prédictifs des rechutes du système nerveux central dans le cas de lymphomes diffus à grandes cellules B. / At first, clinical proteomics received great enthusiasm for the search of biomarkers from different pathologies. However, up to date, the biomarker quest dwells on a failure. These last ten years, the proteomics community has worked to understand the origins of the bias and and to homogenize the results in order to improve the confidence in the identifications and the proposals of biomarkers. In this context my PhD thesis is divided in two parts :- The first part describes the methodological developments done in order to obtain the most complete and confident proteome of one sample.- The second part is devoted to the results obtained on three different projects: (i) Diagnostic biomarkers search in order to better characterize B cells lymphoma and particularly marginal zone lymphoma. (ii) Glioblatoma stem cell study to propose new therapeutic targets. (iii) The search for predictive biomarkers of the central nervous system in the case of diffuse large B cell lymphoma.

Le développement actuel très rapide des différentes approches « omiques » génère un grand nombre de biomarqueurs potentiels, en particulier dans le domaine de la cancérologie.L’analyse protéomique par spectrométrie de masse a particulièrement bénéficié des progrès technologiques récents qui ont permis la mise au point de nouvelles approches quantitatives globales ou ciblées. Néanmoins, peu de biomarqueurs potentiels finissent par être concrètement utilisés en pratique clinique, nécessitant l’optimisation des différentes étapes de leur développement.Dans la continuité des travaux ayant abouti à l’identification de biomarqueurs diagnostiques dans les hémopathies lymphoïdes B, ce travail de thèse a permis le développement d’une méthode d’analyse protéomique ciblée pour la vérification et la validation de nouveaux biomarqueurs potentiels. La possibilité d’appliquer des stratégies quantitatives globales à un très grand nombre d’échantillons a pu être démontrée. L’application de ces stratégies quantitatives globales à du tissu ganglionnaire provenant de lymphomes agressifs a permis d’identifier des biomarqueurs potentiellement associés à une résistance au traitement. Enfin,le mode de préparation tube-gel, facilitant l’étude d’un grand nombre d’échantillons, a été validé pour la réalisation d’analyses protéomiques différentielles. / The current development of new « omics » technologies has led to the discovery of a large number of potential biomarkers, particularly in the field of oncology. Proteomics analysis bymass spectrometry have particularly benefited from these technological advances with the development of new global or targeted quantitative approaches. Nevertheless, only a few numbers of potential biomarkers are finally used in clinical practice, requiring further optimization of the development process. Following the initial identification of biomarkers in the diagnosis of lymphoid malignancies performed previously, this thesis has allowed the development of a targeted proteomics method that can be used for the validation of new potential biomarkers. The ability of analysing a large number of samples with a global quantitative approach has also been demonstrated. The application of these global quantitative strategies on lymph node tissue of aggressive lymphoma has permitted the identification of potential new biomarkers associated with chemorefractoriness. Lastly, a tube-gel protocol facilitating the analysis of a large number of samples has been validated for differential proteomics studies.

Les cheveux constituent un matériau de choix en archéométrie pour l’étude des civilisations anciennes. L’étude moléculaire de cheveux de momies et de leur protéome peut apporter de précieuses informations sur la composition, la préservation et l’environnement de la fibre. Une approche protéomique bottom-up dédiée à l’analyse en MS des protéines de cheveux de momies a été donc implémentée. Celle-ci a permis l’identification des protéines capillaires de cheveux anciens à partir de quantités minimales, ainsi que la caractérisation de leur état de conservation. Cette approche a été associée à une stratégie interdisciplinaire, intégrant également des analyses structurelles par FTIR, et élémentaires par SEM-EDS, XRF et PIXE. Enfin, le couplage direct TLC-MALDI-MS a été mis en place pour la caractérisation de systèmes biologiques et archéologiques, complexes et précieux. / Hair is an ideal material for the archaeometric study of past civilizations. Although it is rarely described, molecular study of hair and its proteome can provide precious clues on the ancient hair composition, its preservation state, as well as its environment. Here, we describe the implementation of a bottom-up proteomic approach for the mass spectrometry analysis of proteins from mummy hair. Through this approach, it was possible to identify the ancient hair proteins from a minimal initial amount of sample, and to characterize their molecular conservation state. This study was associated to an interdisciplinary project that also integrates structural analyses by FTIR and elemental analyses by SEM-EDS, XRF and PIXE. Finally, TLC-MALDI-MS hyphenation was implemented for the characterization of biological and archaeological systems, which are also complex and precious.

La thématique des maladies infectieuses représente un réel enjeu politique, économique et de santé publique. Les objectifs de mes travaux de thèse étaient de développer des approches protéomiques pour identifier, détecter, caractériser et/ou quantifier des protéines et de les appliquer à l’étude de maladies infectieuses pour lesquelles des données de protéomique pourraient ouvrir à de nouvelles approches thérapeutiques et/ou diagnostiques. Les stratégies d’identification et de détection des protéines développées pour l’étude de la maladie de Lyme ont permis de prouver la faisabilité du diagnostic par spectrométrie de masse et de proposer des protéines candidates-vaccin. Les stratégies de quantification mises en place pour l’étude de la toxoplasmose ont permis d’identifier et de quantifier un complexe protéique clef. Les stratégies de caractérisation du N-terminome pour l’étude du paludisme ont permis d’apporter des preuves expérimentales des processus de maturation et d’adressage des protéines. / Infectious diseases represent a real challenge in terms of politic, economic and public health. The purposes of my thesis works were to develop proteomic approaches able to identify, to detect, to characterize and/or to quantify proteins and to apply these approaches to the study of infectious diseases for which proteomic data cou Id open to new therapeutic and/or diagnostic strategies. Identification and specific detection strategies developed in the study of Lyme's disease allowed to prove the feasibility of diagnosis by mass spectrometry and to propose new vaccine-candidate proteins. Quantification strategies developed in the study of toxoplasmosis allowed us to identify and to quantify a key protein complex of the parasite. N-terminome characterization strategy developed in the study of malaria allowed us to bring experimental proofs of proteins processing and trafficking.