L’analyse protéomique consiste en l’analyse qualitative et quantitative de l’ensemble des protéines exprimées dans une cellule ou tissu dans des conditions données (protéome). Les progrès instrumentaux en spectrométrie de masse et les avancées bioinformatiques des dernières années ont permis d’imposer ce domaine dans les sciences de la vie. Diverses stratégies protéomiques permettent ainsi, aujourd’hui, d’identifier et quantifier plusieurs centaines/milliers de protéines dans un échantillon complexe, ce qui permet classiquement de caractériser les états physiopathologiques. En revanche, la protéomique est un outil émergent en biologie évolutive. Ce domaine vise à comprendre les déterminants de la diversité des organismes présents sur Terre et de leur « fonctionnement », notamment leurs adaptations à certaines contraintes environnementales.L’objectif de cette thèse était d’étudier, de l’organe à l’écosystème, les variations protéomiques induites par des changements environnementaux, tout en adaptant les différentes étapes de l’analyse à chaque type d’échantillons, à chaque organisme, de la préparation d’échantillons à l’analyse des données. Grâce à la mise en place d’une stratégie de séquençage de novo quantitative originale, ces travaux de thèse ont été l’occasion d’étudier le rôle du tissu adipeux brun dans la protection contre l’obésité chez le campagnol, espèce dont le génome n’est pas séquencé. D’autres traits particuliers ont été explorés, tels que l’obésité réversible du microcèbe, ou encore les interactions entre socialité et longévité chez la fourmi. Les solutions logicielles envisagées ne permettant de quantifier de manière robuste des peptides identifiés par séquençage de novo à partir d’échantillons fractionnés, nous avons ainsi établi que le préfractionnement permet d’obtenir une meilleure couverture de protéome. En revanche, sans préfractionnement, le séquençage de novo produit un gain indéniable. Enfin, en étudiant le métaprotéome de communautés biotiques des sols alpins, nous avons mis en évidence l’intérêt de combiner protéomique et génomique, afin d’établir la banque de données protéiques la plus appropriée, mais aussi pour « valider » les données protéomiques. / Proteomics analysis corresponds to the qualitative and quantitative analysis of all proteins expressed in a cell or tissue under given conditions (proteome). Instrumental progresses in mass spectrometry and bioinformatics advances in recent years have allowed its establishment in life sciences. Diverse proteomics strategies thus allow identification and quantification of hundreds/thousands of proteins in complex samples, which classically allows physiopathological states to be characterized. However, proteomics is only emerging in the evolutionary biology field. This field aims at understanding the determinants of the diversity of organisms present on Earth and their “functioning”, including their adaptations to certain environmental constraints.The objective of this thesis was to study, from the organ to the eco-system, the proteomic variations induced by environmental changes, while adapting the different steps of the analysis to each type of sample, each organism, from sample preparation to data analysis. Through the introduction of an original quantitative de novo sequencing strategy, we studied the role of brown adipose tissue against obesity in a non-sequenced species: the vole. Other particular traits were explored, such as the reversible obesity of the grey mouse lemur or the interactions between sociality and longevity in the ant. The considered software solutions did not allow to robustly quantify peptides identified by de novo sequencing from fractionated samples, we thus determined that prefractionation allows for better proteome coverage. On the other hand, without prefractionation, de novo sequencing produces an undeniable gain. Finally, by studying the metaproteome of alpine soil biotic communities, we have highlighted the advantage of combining proteomics and genomics, in order to establish the most appropriate protein database and to “validate” proteomics data.

Les objectifs de mes travaux de thèse étaient de développer de nouvelles méthodes d’identification, de caractérisation et de quantification de protéines, mieux adaptées à la diversité des études en protéomique, ce dont la biologie a besoin aujourd’hui. L’analyse protéomique par spectrométrie de masse est apparue comme un outil précieux et pertinent pour évaluer la qualité de l’isolement d’un complexe spécifique, et pour guider les biologistes dans les choix de la stratégie à adopter. La stratégie de marquage de N-terminomique développée a permis de caractériser un processus de maturation biologique en déterminant précisément les sites d’activation de la protéine Perséphone par marquage spécifique des extrémités N-terminales. Ce travail a permis d’élucider un nouveau mécanisme fin de régulation dans l’immunité innée chez la drosophile. De nouveaux modes de marquages ont été mis au point et les familles chimiques des réactifs de marquage étudiés permettront d’adapter au mieux les études de quantifications protéomiques à la nature et aux contraintes des études biologiques à mener. / The aim of this work was to develop new methods for the identification, characterization and quantification of proteins best suited to a large diversity of proteomics studies, which is nowadays essential to biology. Our work has shown that proteomic analysis based on mass spectrometry can be a valuable and relevant tool to evaluate the isolation strategy efficiency set up for a specific complex and thus guide the biologists in their choice. The N-terminomic labeling strategy developed allowed us to describe a biological maturation process by determining precisely the Persephone protein activation sites using specific labeling of the successively generated N-terminal extremities. This work allowed elucidating a new regulation mechanism in the Drosophila innate immunity system. New chemical labeling reagents to target specific amino acids (cysteine, tyrosine and tryptophan) have been set up for fast mass-spectrometry based proteomics. These labeling strategies combined with proteomic tools will allow developing a robust and quantitative approach essential for biological studies.

Les récents progrès instrumentaux en spectrométrie de masse, notamment en terme de- rapidité de balayage et de résolution, ont permis l'émergence de l'approche « data independent acquisition» (DIA). Cette approche promet de combiner les points forts des approches « shotgun » et ciblées,mais aujourd'hui l'analyse des données DIA reste compliquée. L'objectif de cette thèse a été de développer des méthodes innovantes de spectrométrie de masse, et en particulier d'améliorer l'analyse des données DIA. De plus, nous avons développé une approche originale Top 3-ID-DIA, permettant à la fois un profilage complet des protéines de la cellule hôte (HCP) ainsi qu'une quantification absolue d'HCP clés dans les échantillons d'anticorps monoclonaux (mAb), au sein d'une même analyse.Cette méthode est prête à être implémentée en industrie, et pourrait fournir un support en temps réel aux développements du procédé de production de mAb, ainsi que pour évaluer la pureté des biomédicaments. / Recent instrumental developments in mass spectrometry, notably in terms of scan speed and resolution, allowed the emergence of “data independent acquisition” (DIA) approach. This approach promises to combine the strengths of both shotgun and targeted proteomics, but today DIA data analysis remains challenging. The objective of my PhD was to develop innovative mass spectrometry approaches, and in particular to improve DIA data analysis. Moreover, we developed an original Top 3-ID-DIA approach, allowing both a global profiling of host cell proteins (HCP) and an absolute quantification of key HCP in monoclonal antibodies samples, within a single analysis. This method is ready to be transferred to industry, and could provide a real time support for mAb manufacturing process development, as well as for product purity assessment.

Le paludisme constitue un problème majeur de santé publique en zone tropicale et subtropicale. La morbidité ainsi que la mortalité sont principalement dues au parasite Plasmodium falciparum transmis à l'homme par la piqûre de moustiques femelles du genre Anopheles. Dans le but d'orienter au mieux les stratégies d'élimination du paludisme et d'une meilleure évaluation de l'efficacité des méthodes de lutte, les indicateurs mesurant le risque de transmission doivent être plus sensibles. Il a été montré que la réponse anticorps humaine contre des protéines/peptides salivaires d'Anopheles représente un bio-marqueur d'exposition aux piqûres de moustiques et pouvait être un indicateur de la transmission du paludisme. Toutefois cet outil doit être optimisé. Ce travail a ainsi un double objectif : i) valider la protéine salivaire CE5 comme bio-marqueur d'exposition aux piqûres d'Anopheles et comme indicateur évaluant l'efficacité de stratégie de lutte anti-vectorielle, et 2) identifier de nouvelles protéines salivaires comme candidat bio-marqueur spécifique à l'exposition de l'homme aux seules piqûres infectantes d'Anopheles. Tout d'abord, nous avons démontré que la réponse anticorps IgG contre la protéine CE5 pourrait être un indicateur du contact homme-vecteur, complémentaire et très sensible, en mesurant l'exposition de l'homme aux piqûres d'Anopheles et un outil évaluant l'efficacité, à court terme, des moustiquaires imprégnées d'insecticide. Par la suite, les méthodes de protéomique 2D-DIGE et de spectrométrie de masse ont permis d'identifier cinq protéines salivaires (gSG6 , gSG1b , TRIO , SG5 et la forme longue D7) qui sont surexprimées dans les glandes salivaires d'An. gambiae infectées par P. falciparum. Des peptides de chaque protéine, définis in silico, apparaissent antigéniques chez des individus exposés aux piqûres d'Anopheles, après évaluation par la technique d'épitope mapping. L'ensemble de ces travaux est non seulement une première étape pour optimiser cet outil immuno-épidémiologique évaluant le contact homme-vecteur mais démontre également la possibilité de définir un nouveau bio-marqueur qui serait spécifique des piqûres infectantes d'Anopheles. / Malaria is a major public health problem in tropical and subtropical areas. Morbidity and mortality are mainly due to Plasmodium falciparum transmitted to human individuals by the bite of female Anopheles mosquitoes. In order to orientate appropriate strategies for malaria elimination and for a better evaluation of the efficacy of control methods, the indicators measuring the risk of transmission should be more sensitive. It has been shown that the human antibody response against Anopheles salivary proteins/peptides represents a biomarker of exposure to mosquito bites and could be an indicator of malaria transmission. However, this tool must be optimized. This work has thus two objectives: i) to validate the salivary protein cE5 as biomarker of exposure to Anopheles bites and as an indicator for evaluating the efficacy of vector control strategy, and 2) to identify new salivary proteins as a candidate biomarker only specific to human exposure to infective bites of Anopheles.First, we demonstrated that the IgG antibody response to cE5 protein could be an indicator of human-vector contact, complementary and very sensitive, measuring the human exposure to Anopheles bites and a tool evaluating the short-term efficacy of insecticide treated nets. Subsequently, the proteomic methods, 2D - DIGE and mass spectrometry, allowed to identify five salivary proteins (gSG6, gSG1b, TRIO, SG5 and the long form D7) which are overexpressed in the salivary glands of An . gambiae infected by wild P. falciparum. Peptides for each protein, identified in silico, appear antigenic in individuals exposed to Anopheles bites, after the evaluation by the epitope mapping technique.Altogether, this work is not only the first step to optimize this immuno-epidemiological tool assessing the human-vector contact, but also demonstrates the possibility to define a new biomarker specific to the infective bites of Anopheles.

Ce projet de recherche comporte deux parties principales qui possèdent comme lien unificateur l’amélioration des méthodes et techniques utilisées actuellement pour évaluer aussi bien l’activité que l’expression des cytochromes P450 (CYP450s) et menant par la suite à leur application en clinique. Le premier volet de ce projet de recherche porte sur le développement de méthodes LC-MS/MS pour un cocktail de 7 substrats marqueurs des CYP450s. Notre objectif est de développer et valider une méthode LC-MS/MS spécifique et sensible permettant l’évaluation des activités des CYP1A2, 2B6, 2C9, 2C19, 2D6, 3A4/5 et 2E1 suivant l’administration orale et à faible dose d’un cocktail de substrats marqueurs chez des patients et sujets sains. Les méthodes développées peuvent être utilisées pour évaluer les mécanismes de variabilité interindividuelle comme l’impact de polymorphismes génétiques, de facteurs environnementaux et de maladies dans le processus de métabolisme et d’élimination des médicaments, mais également pour investiguer les interactions médicamenteuses. Ce cocktail a été appliqué avec succès, dans un projet clinique portant sur l’évaluation des effets du diabète sur la capacité métabolique par les CYP450s. Le deuxième volet de ce projet de recherche vise à développer des méthodes analytiques par LC-HRMS afin de caractériser et quantifier les CYP1A1, 1A2, 1B1, 2B6, 2C8, 2C9, 2C19, 2D6, 2E1, 2J2, 3A4, 3A5, 3A7 et 4F2 dans l’intestin grêle humain. Notre hypothèse suggère que les CYP450s retrouvés le long de l’intestin grêle peuvent affecter significativement l’effet de premier passage de certains médicaments administrés par voie orale et influencer leurs concentrations plasmatiques et conséquemment, leurs effets pharmacologiques et/ou toxiques. Ma participation à ce projet a permis d’identifier des peptides protéotypiques par digestion in silico et in vitro et de développer des méthodes de quantification absolue par LC-HRMS. Ce projet est une première étape dans la caractérisation des CYP450s majeurs le long de l'intestin grêle. Il permettra de mieux comprendre les mécanismes de variabilité interindividuelle dans la réponse aux médicaments associés au processus d'absorption intestinal et de mieux prédire la variabilité dans la biodisponibilité des médicaments et de développer des modèles pharmacocinétiques plus complexes. / This research project is divided into two sections, both aiming at the development of sensitive and specific LC-MS methods to evaluate activity and expression of CYP450 and finally, looking at their clinical application. The first section of this research project focuses on the development of analytical methods by LC-MS/MS for a seven CYP450 probe-drug cocktail. Although these cocktails have shown value they also suffer from many limitations. Our objective was to develop and validate highly sensitive and selective LC-MS/MS assays allowing the determination of CYP1A2, 2B6, 2C9, 2C19, 2D6, 3A4/5 and 2E1 activities following administration of low oral doses of a modified CYP450 probe-drug cocktail in patients. These methods can be used to phenotype CYP450 activities, evaluate inter-individual variabilities, study the impact of pathological conditions on drug metabolism and elimination, and evaluate drug-drug interactions. Our CYP450 cocktail assays have been successfully applied to phenotype CYP450 activities in type 2 diabetic patients. The second section of this project aims at the development of a LC-HRMS method for the characterization and absolute quantification of CYP1A1, 1A2, 1B1, 2B6, 2C8, 2C9, 2C19, 2D6, 2E1, 2J2, 3A4, 3A5, 3A7 and 4F2 in the human small intestine. Our hypothesis suggests that CYP450 isoenzymes found along the small intestine can significantly affect the first-pass effect of certain drugs administered orally and thus influence their pharmacological and/or toxic effects. My participation in this project allowed to identify proteotypic peptides by in silico and in vitro digestion and to develop LC-HRMS methods allowing the absolute quantification of CYP450. This project is a first step in the characterization of the main CYP450 along the small intestine. This project will allow a better understanding of inter-individual variability in drug response associated with intestinal absorption of drugs, a better prediction of variability in drug bioavailability and to develop more complex pharmacokinetic models.

Dans le contexte fromager, les champignons filamenteux du genre Mucor ont un rôle ambivalent. En fonction du fromage considéré, ils peuvent être assimilés à des microorganismes d’altération responsables de défauts de fabrication ou au contraire contribuer au développement des qualités organoleptiques des produits. Dans le cadre de ce travail, nous avons souhaité confirmer et objectiver la dichotomie classiquement faite en industrie fromagère entre espèces technologiques et espèces contaminantes, et investiguer les mécanismes d’adaptation potentiels mis en oeuvre chez les espèces technologiques. La morphologie et la croissance radiale de 7 souches représentatives d’espèces technologiques, contaminantes et non-fromagères (endophyte) de Mucor ont été étudiées sur différents milieux (synthétique, mimant le fromage et fromager) en fonction de facteurs clés du processus de production des fromages (température, aw, pH). Les valeurs cardinales de croissance ont été déterminées sur milieu synthétique, un modèle prédictif a été proposé et validé sur matrices fromagères pour le facteur température et la meilleure faculté de croissance des souches technologiques sur milieux fromagers par rapport au milieu synthétique a été démontrée. Une approche de protéomique comparée a permis de décrire les voies métaboliques mises en jeu par 4 de ces souches dans les deux types d’environnement, fromager et non-fromager, et 35 protéines spécifiquement surexprimées par la souche technologique M. lanceolatus UBOCC-A-109153 sur milieu mimant le fromage ont été identifiées. Les avantages compétitifs associés à ces potentiels marqueurs d’adaptation vont faire l’objet d’investigations complémentaires. / In the cheese industry context, Mucor species exhibit an ambivalent behavior, as some species are essential technological organisms contributing to the required organoleptic characteristics of some cheeses while some others can be spoiling agents. The present study aimed at better understanding this ambivalence and investigating the putative adaptation mechanisms to cheese existing in Mucor technological species. Morphology and radial growth of 7 representative Mucor species: technological, contaminant and non-cheese related (plant endophyte) species were monitored on different media (synthetic, cheese-mimicking media and cheese) in function of key parameters for cheese manufacture (temperature, aw, pH). Cardinal values were determined on synthetic medium and as a result a predictive model was proposed and validated on cheese matrices for the temperature parameter. Interestingly, cheese technological species exhibited higher optimal growth rates on cheese related matrices than on synthetic media, while the opposite was observed for non-technological species. A comparative proteomic approach allowed unraveling the main metabolic pathways playing a role in growth of 4 of the 7 studied strains on both synthetic medium and cheese-mimicking medium. This proteomic study also highlighted the occurrence of 35 proteins specifically expressed by the technological strains M. lanceolatus UBOCC-A-109153 on the cheese-mimicking medium. Putative competitive and adaptative advantages of these hypothetical adaptation markers will be tested through additional investigations.

Corynebacterium pseudotuberculosis est une bactérie pathogène intracellulaire facultative, divisée en deux biovars : C. pseudotuberculosis ovis, agent de la lymphadénite caséeuse (petits ruminants), et C. pseudotuberculosis equi, responsable de lymphangites ulcéreuses (chevaux), mammites (bovins) et d’œdèmes cutanés (buffles). La génomique fonctionnelle a pour but d'élucider le rôle que joue chaque gène dans l'organisme, ainsi que l'interaction de ces gènes dans un réseau biologique. Au cours de ce travail de thèse, différentes stratégies protéomiques ont été adoptées pour l’étude fonctionnelle du génome de C. pseudotuberculosis : i) l’analyse du protéome extracellulaire des souches 1002_ovis et C231_ovis a permis la caractérisation totale de 60 protéines différentes de C. pseudotuberculosis dont 18 protéines sont régulées différemment ;ii) le protéome de la souche 1002_ovis été analysé en réponse au stress nitrosant révélant 58 protéines différentiellement régulées et impliquées dans différents processus biologiques susceptibles de favoriser la survie à ce stress ; iii) les souches 1002_ovis et 258_equi ont été utilisées pour induire des infections expérimentales sur modèle souris. L’analyse de leur protéome extracellulaire avant et après passage en série sur souris a permis d’identifier 250 protéines différentiellement régulées touchant diverses fonctions. Pour conclure, ce travail a permis de générer une base de données de protéines et de valider la fonctionnalité de différents gènes jusqu’alors prédits in silico seulement et des informations importantes sur les facteu / Corynebacterium pseudotuberculosis is a facultative intracellular pathogenic bacterium, subdivided into two biovars: C. pseudotuberculosis ovis, agent of caseous lymphadenitis (small ruminants), and C. pseudotuberculosis equi, which causes ulcerative lymphangitis (equines), mastitis (bovines), and oedematous skin disease (buffalos). Functional genomics aims to elucidate the role that each gene plays in organism, as well as the interactions of these genes into a biological network. In this PhD work, various proteomic approaches were used to evaluate the functional genome of C. pseudotuberculosis: i) the analysis of the exoproteome of strains 1002_ovis and C231_ovis enabled the characterization of 60 proteins of C. pseudotuberculosis of which 18 were differentially regulated; ii) the proteome of the strain 1002_ovis was analyzed after a nitrosative stress revealing 58 proteins differentially regulated when compared to the control conditionsThese 58 proteins are involved in different biological processes which may favor the survival of this pathogen under exposition to nitrosative stress; iii) the strains 1002_ovis and 258_equi were used in a murine model of experimental infection. A comparative analysis of their extracellular proteomes before and after passage in mice revealed that 250 proteins ibnvolved in various functions were differentially regulated in C. pseudotuberculosis. Altogether, this PhD work allowed the generation of a protein data base, as well as the validation of several genes previously predicted in silico, and generated information about factors that fa

Les polyphénols sont des métabolites secondaires d’origine végétale. Ces substances naturelles connues pour leurs pouvoirs antioxydants et anti-radicalaires, contribuent à la protection de la santé humaine notamment contre les maladies cardiovasculaires et neurodégénératives, mais également contre certains cancers et diabètes. Dans certains cas, ces effets biologiques bénéfiques pour la santé pourraient également être liés à une interaction spécifique polyphénol-protéine peu étudiée à ce jour par manque d’outils moléculaires adaptés. Les travaux effectués au cours de cette thèse ont consisté à concevoir, à synthétiser et à évaluer des sondes moléculaires polyvalentes porteuses de polyphénols comme substrats d’affinité pour l’analyse des interactions polyphénol-protéine. Dans ce contexte, de nombreuses sondes arborant différents types de polyphénols ont été synthétisées. Ces différentes sondes pourront être utilisées en protéomique chimique du type "Affinity-Based Protein Profiling" (ABPP) pour identifier au sein d’un mélange complexe de protéines, une protéine ayant une affinité spécifique pour un polyphénol donné. Ces mêmes sondes permettront également d’étudier de manière qualitative les interactions d’un polyphénol avec une protéine donnée en temps réel par la technique de résonance plasmonique de surface (SPR). / Polyphenols are plant secondary metabolites. These natural substances, known for their antioxidant and anti-free radical properties, generally contribute to the protection of human health not only against cardiovascular and neurodegenerative diseases, but also against certain cancers and diabetes. In some cases, these beneficial biological effects could also be related to specific polyphenol-protein interactions. However, studying this type of interactions has suffered from the lack of adequate molecular tools. The work carried out during this thesis has included designing, synthesizing and evaluating modulable polyfunctional molecular probes carrying polyphenols as affinity substrates to analyze polyphenol-protein interactions. In this context, various probes harboring different kinds of polyphenols were synthesized. These probes could be used in chemical proteomics following an “Affinity-Based Protein Profiling” approach (ABPP) to identify a protein within complex protein mixtures, which has a specific affinity with a given polyphenol. These probes will also allow studying the interactions of a polyphenol with a given protein in real time in a qualitative way by surface plasmon resonance (SPR).

La spectrométrie de masse fait partie des technologies haut débit et offre à ce titre un regard inédit, à une échelle nouvelle, sur les protéines contenues dans divers échantillons biologiques. Les études biomédicales utilisant cette technologie sont de plus en plus nombreuses et visent à détecter de nouveaux biomarqueurs de différents processus biologiques, notamment de processus pathologiques à l'origine de cancers. Cette utilisation comme outil de criblage pose des questions quant à la capacité même des expériences de spectrométrie de masse dans cette détection. La puissance statistique traduit cette capacité et rappelle que les études doivent être calibrées pour offrir des garanties suffisantes de succès. Toutefois, cette exploration de la puissance statistique en spectrométrie de masse n'a pas encore été réalisée. L'objet de cette thèse est précisément l'étude des déterminants de la puissance pour la détection de biomarqueurs en spectrométrie de masse. Une revue de la littérature a été réalisée, reprenant l'ensemble des étapes nécessaires du traitement du signal, afin de bien comprendre les techniques utilisées. Les méthodes statistiques disponibles pour l'analyse du signal ainsi traité sont revues et mises en perspective. Les situations de tests multiples, qui émergent notamment de ces données de spectrométrie de masse, suggèrent une redéfinition de la puissance, détaillée par la suite. La puissance statistique dépend du plan d'expérience. La taille d'échantillon, la répartition entre groupes étudiés et l'effet différentiel ont été investigués, par l'intermédiaire de simulations d'expériences de spectrométrie de masse. On retrouve ainsi les résultats classiques de la puissance, faisant notamment ressortir le besoin crucial d'augmenter la tailles des études pour détecter des biomarqueurs, particulièrement lorsque ceux-ci présentent un faible effet différentiel. Au delà de ces déterminants classiques de la puissance, des déterminants propres à la spectrométrie de masse apparaissent. Une chute importante de puissance est mise en évidence, due à l'erreur de mesure des technologies de spectrométrie de masse. Une synergie péjorative existe de plus entre erreur de mesure et procédure de contrôle du risque de première espèce de type FDR. D'autre part, les méthodes de détection des pics, par leurs imperfections (faux pics et pics manqués), induisent un contrôle suboptimal de ce risque de première espèce, conduisant à une autre chute de puissance. Ce travail de thèse met ainsi en évidence trois niveaux d'intervention possibles pour améliorer la puissance des études : la meilleure calibration des plans d'expérience, la minimisation de l'erreur de mesure et l'amélioration des algorithmes de prétraitement. La technologie même de spectrométrie de masse ne pourra conduire de façon fiable à la détection de nouveaux biomarqueurs qu'au prix d'un travail à ces trois niveaux. / Mass-spectrometry (MS) belongs to the high-throughput technologies and therefore offers an originalperspective on proteins contained in various biological samples, at a new scale. Biomedicalstudies using this technology are increasingly frequent. They aim at detecting new biomarkersof different biological processes, especially pathological processes leading to cancer. This use asa screening tool asks questions regarding the very detection effectiveness of MS experiments.Statistical power is the direct translation of this effectiveness and reminds us that calibratedstudies are required to offer sufficient guarantees of success. However, this exploration of statisticalpower in mass-spectrometry has not been performed yet. The theme of this work is preciselythe study of power determinants for the detection of biomarkers in MS studies.A literature review was performed, summarizing all necessary pretreatment steps of thesignal analysis, in order to understand the utilized techniques. Available statistical methods forthe analysis of this pretreated signal are also reviewed and put into perspective. Multiple testingsettings arising from MS data suggest a power redefinition. This power redefinition is detailed.Statistical power depends on the study design. Sample sizes, group repartition and the differentialeffect were investigated through MS experiment simulations. Classical results of statisticalpower are acknowledged, with an emphasis on the crucial need to increase sample sizes forbiomarker detection, especially when these markers show low differential effects.Beyond these classical power determinants, mass-spectrometry specific determinants appear.An important power drop is experienced when taking into account the high measurement variabilityencountered in mass-spectrometry. A detrimental synergy exists between measurementvariability and type 1 error control procedures (e.g. FDR). Furtheremore, the imperfections ofpeak detection methods (false and missed peaks) induce a sub-optimal control of this type 1error, leading to another power drop.This work shows three possible intervention levels if we want to improve power in MS studies: a better study design, measurement variability minimisation and pretreatment algorithmsimprovements. Only a work at these three levels can guarantee reliable biomarker detections inthese studies.

La spermatogenèse chez les mammifères est une fonction biologique complexe incluant des processus de prolifération cellulaire, de méiose et de différenciation uniques visant à la production des gamètes mâles au sein du testicule. Si l’épithélium séminifère est bien décrit sur le plan de son organisation et de la morphologie des cellules qui le composent, les processus par lesquels les cellules germinales diploïdes indifférenciées entrent en méiose pour donner ensuite des cellules haploïdes subissant par la suite de nombreuses transformations morphologiques, ne sont pas totalement décryptés. Ils reposent sur l’expression coordonnée et séquentielle de gènes dont les produits spécifiques de chaque stade de développement des cellules germinales sont essentiels aux étapes clés de la spermatogenèse. La transcriptomique depuis les années 1990 et la protéomique depuis les années 2000 ont contribué à l’amélioration de la connaissance de ces mécanismes. Une étude protéomique visant à caractériser par des approches systématiques et différentielles les protéomes des cellules de Sertoli et de la lignée germinale, et d’autre part une étude récente, réalisée dans notre unité, qui a permis de caractériser et de quantifier le transcriptome des cellules testiculaires isolées de rat en utilisant le séquençage de novo des transcrits (RNA-Seq), ont été à la base de mes travaux de thèse. Cette dernière étude a mis en évidence l’accumulation de longs ARNs non codants (lncRNAs) et de transcrits testiculaires non annotés (TUTs) aux stades méiotique et post- méiotique de la spermatogenèse chez le rat. Dans ce contexte, mon travail a consisté à valider le potentiel codant de nombreux gènes exprimés dans les cellules germinales par une approche dite PIT (Proteomics Informed by Transcriptomics) couplant protéomique Shotgun et RNA-Seq. Dans ce type d’approche, les séquences protéiques déduites des transcrits des différents types cellulaires, assemblés par RNA-Seq, sont intégrées dans une base personnalisée de séquences protéiques utilisée pour interroger les données de spectrométrie de masse obtenues à partir de protéines de cellules méiotiques et post-Méiotiques. L’approche PIT a permis de montrer que 69 TUTs ou lncRNA (correspondant à 44 loci) codent pour des protéines dans les cellules méiotiques et post méiotiques. L’expression post-Méiotique de deux nouveaux transcrits, l’un codant pour la protéine VAMP9, une protéine de la famille SNARE, et l’autre pour une nouvelle énolase T-ENOL a pu être confirmée. L’expression post-Méiotique de T-ENOL a été confirmée par immunohistochimie à l’aide d’un anticorps polyclonal produit contre la protéine recombinante. Cette approche nous a également permis d’identifier de nouvelles isoformes de protéines connues spécifiques de chaque stade de la spermatogenèse. Les cellules germinales et les cellules de Sertoli entretiennent le dialogue nécessaire au bon déroulement de la spermatogenèse. Une autre partie de mon travail a consisté à identifier des protéines membranaires des cellules germinales et des corps résiduels, susceptibles d’intervenir dans le dialogue entre les cellules de Sertoli et les cellules germinales, par une approche protéomique de quantification relative ICPL. Cette approche a permis d’établir une liste de 166 protéines différentiellement exprimées entre les spermatocytes pachytène, les spermatides rondes et les corps résiduels, qui sont susceptibles de jouer un rôle dans la spermiogénèse. Grâce aux annotations de le Gene Ontology, j’ai pu établir une liste de 8 protéines ayant un rôle supposé dans la transduction du signal, la reconnaissance cellulaire ou bien la différenciation. Par ailleurs, j’ai pu établir par protéomique Shotgun un premier protéome des cellules de Sertoli, des cellules germinales et des corps résiduels chez le rat. / Spermatogenesis in mammals is a complex biological function including cellular processes such as proliferation, meiosis and differentiation, aiming to the production of male gametes in the testis. If the seminiferous epithelium is well described in terms of organization and cellular morphology of cells that compose it, the processes by which undifferentiated diploid germ cells enter meiosis and give haploid cells that undergo many morphological transformations, are not fully decrypted. These processes rely on the coordinated and sequential expression of genes, including specific products for each stage of germ cell development These gene products are essential at each key stage of spermatogenesis. Transcriptomics since the 1990s, and proteomics since the 2000s have contributed to the improved. understanding of these mechanisms. A long term proteomic study aiming at characterizing the proteomes of Sertoli cells and germ cells, and a recent study that characterized and quantified the transcriptome of isolated rat testicular cells at high resolution using de novo sequencing of transcripts (RNA-Seq), have been the basis of my thesis work. The latter study showed the accumulation of long non-Coding RNAs (lncRNAs) and testicular unannotated transcripts (TUTs) at meiotic and post-Meiotic stages of spermatogenesis in the rat. In this context, my thesis work aimed at validating the coding potential of many genes expressed in germ cells using RNA-Seq combined with shotgun proteomics, a so-Called PIT (Proteomics Informed by transcriptomics) approach. In this approach, the protein sequences translated from the transcripts assembled by RNA-Seq in the different testicular cell types are integrated into a custom database of protein sequences used to query mass spectrometry data obtained from proteins of meiotic and post-Meiotic cells. The PIT approach showed that 69 TUTs or lncRNA (corresponding to 44 loci) code for proteins in meiotic cells and post meiotic cells, and we confirmed experimentally the meiotic and post-Meiotic expression for two new transcripts encoding for VAMP9, a protein of the SNARE family, and a new testicular enolase T-ENOL. The post-Meiotic expression of T-ENOL protein was confirmed by immunohistochemistry using a polyclonal antibody raised against the recombinant protein. This approach also allowed us to identify new isoforms of known proteins, specific to each stage of spermatogenesis. Germ cells and Sertoli cells maintain a dialogue which is necessary to the success of spermatogenesis and spermiogenesis. Another part of my work aimed at identifying membrane proteins, in germ cells and residual bodies, that may be involved in the dialogue between Sertoli cells and germ cells, using a ICPL relative quantification proteomic approach. The ICPL analysis enabled us to establish a list of 166 proteins whose expression is differential between pachytene spermatocytes, round spermatids and residual bodies. Their differential expression suggests that these proteins may play a role in spermiogenesis. Thanks to the Gene Ontology annotations, a list of 8 proteins with a putative role in signal transduction, cell recognition or differentiation, thus potentially involved in the dialogue between Sertoli and germ cells was drawn. In addition, I provided a first proteome of rat Sertoli cells, germ cells and residual bodies obtained by shotgun proteomics.