La vigne est sensible à de nombreuses maladies cryptogamiques qui vont altérer la qualité des raisins et des vins. Depuis plusieurs années, l’Esca est devenue un fléau pour la viticulture moderne, car elle est responsable de la mort des pieds de vigne lorsqu’elle se présente sous forme apoplectique. Sa forme chronique est liée à la présence d’un cortège de champignons pathogènes dans le tronc et les bras, qui vont provoquer le plus souvent des symptômes foliaires. L’altération de la photosynthèse que cela provoque, va avoir des conséquences sur la maturation du fruit. Cependant, peu de travaux de recherche ont été menés pour caractériser précisément l’impact de cette maladie sur le métabolisme et la composition chimique des baies de raisin. Notre étude avait pour but d’apprécier, grâce à une approche protéomique, les conséquences de cette maladie sur la qualité des raisins. Nos travaux ont permis de mettre en évidence que l’expression de symptômes foliaires d’Esca provoque une modification d’abondance des protéines liées aux mécanismes de défense et de stress oxydatif de la pellicule du raisin. Il est également observé un changement de capacité antioxydante par modulation des teneurs en peroxyde d’hydrogène, en glutathion ou en pyridoxine. Les concentrations en molécules d’intérêt œnologique comme les acides aminés, les amines biogènes ou les tannins sont également modifiées en présence de symptômes foliaires d’Esca. / The vine is susceptible to many fungal diseases that will affect the quality of grapes and wines. For several years, Esca has become the bane of modern viticulture because it is responsible for the death of the vines when presented in the form apoplectic. Its chronic form is associated with the presence of a procession of pathogenic fungi in the trunk and arms that will most often cause leaf symptoms. The alteration of photosynthesis that this causes will affect fruit ripening. However, little research has been conducted to characterize precisely the impact of this disease on the metabolism and chemical composition of grape berries. Our study aimed to assess, using a proteomic approach the disease's impact on the quality of grapes and get specific markers. Our work allowed us to demonstrate that the expression of foliar symptoms of Esca causes a change in abundance of proteins related to defense mechanisms and oxidative stress in the grape skin. It is also observed a change in antioxidant capacity by modulating levels of hydrogen peroxide, glutathione or pyridoxine. The concentrations of molecules of oenological interest such as amino acids, biogenic amines or tannins are also modified in the presence of foliar symptoms of Esca.

Le glioblastome (GB) est une tumeur hétérogène, agressive devant laquelle les possibilités thérapeutiques disponibles restent limitées. L’étude de la zone péritumorale macroscopiquement normale (ZMN) des GB est essentielle à la compréhension de ses mécanismes de progression et de récidive. Le premier objectif de ce travail de Thèse a été de comparer les données de transcriptomique et de protéomique issues de l’analyse de la zone tumorale des GB dans le cadre du Projet Gliome Grand Ouest. Le taux de concordance entre les 2 modalités est faible, retrouvant toutefois comme point commun une dysrégulation de la protéine légère des neurofilaments qui pourrait servir de biomarqueur potentiel des GB. Le deuxième objectif de ce travail de Thèse a été la caractérisation de la ZMN des GB. Nous avons mis en évidence que cette zone, dont l’aspect est similaire à première vue à celui du tissu cérébral sain, n’est pas une simple zone de transition entre le GB et le tissu cérébral sain. En effet, la ZMN est une entité spécifique possédant des caractéristiques qui lui sont propres, comme la présence d’un phénotype particulier de cellules tumorales infiltrantes et de cellules stromales et une sur’expression des protéines CRYAB et H3F3A. Ce travail de Thèse a aussi été l’occasion de développer de nouvelles techniques d’imagerie per-opératoire de la ZMN, afin d’évaluer la présence d’un contingent tumoral et ainsi optimiser la qualité de la résection chirurgicale. La caractérisation de cette ZMN nous permet de mieux appréhender son implication dans la tumorogenèse et la présence de caractéristiques spécifiques de cette zone ouvre la porte à la détection de biomarqueurs spécifiques, ainsi qu’au développement de thérapies ciblées. Ce travail de Thèse a été valorisé par 2 publications, 2 articles soumis et un brevet est en cours de dépôt et d’évaluation par un cabinet de brevet. / Glioblastoma (GB) is a heterogeneous andaggressive tumor, before which therapeutic options arelimited. The study of the macroscopically normalperitumoral brain zone (PBZ) of GB is essential tounderstand its mechanisms of progression andrecurrence.The first objective of this thesis work was tocompare the transcriptomic and proteomic data from theGB tumor area obtained through the “Grand Ouest”glioma Project. The concordance rate between the 2modalities is low. However, one of the common featureis the dysregulation of neurofilament light polypeptide,which could serve as a biomarker potential of GB.The second objective of this thesis was thecharacterization of the PBZ. We have shown that thisarea, similar at first glance to that of healthy braintissue, is not a simple transition area between the GBand healthy brain tissue but a specific entity withcharacteristics of its own. For example, the ZMNpresents a particular phenotype of infiltrating GB cellsand stromal cells and a surexpression of CRYAB andH3F3A proteins.This thesis work was also an opportunity todevelop new intraoperative imaging techniques of thePBZ, with the aim to assess the presence of a tumoralinfiltration and optimize the quality of the surgicalresection.The characterization of this PBZ allows us tobetter understand its involvement in tumorigenesis andthe presence of specific characteristics of this areaopens the door for the detection of specific biomarkersand the development of targeted therapies.This thesis work was led to 2 publications, 2articles submitted and a patent being evaluated andredacted by a patent office.

Eviter la piqûre de moustiques vecteurs en utilisant des mesures antivectorielles reste le meilleur moyen de se protéger des maladies vectorielles. La salive de moustique peut induire une réponse anticorps (Acs) spécifique chez l’hôte qui pourrait être utilisé pour définir l'efficacité de ces mesures de protection antivectorielle. L’objectif de notre projet était d’évaluer la possibilité d’utiliser cette réponse Acs anti-salive de moustiques pour mesurer l’exposition à des espèces spécifiques de moustiques ainsi que d’identifier des marqueurs d’exposition. Nous nous sommes tout d’abord assurés de l’absence de différences intraspécifiques entre différentes colonies de moustiques, une condition indispensable pour pouvoir observer des différences au niveau de l’espèce. Par ailleurs, nous avons mis au point un protocole pour préserver les échantillons salivaires dans des conditions de terrains non optimales. A partir de ces expérimentations préliminaires, nous avons évalué la diversité du répertoire protéique salivaire de quatre espèces d’Anopheles par des différentes approches, et montré une spécificité de genre et d’espèce aussi bien au niveau protéique qu’antigénique. Enfin, nous avons montré une évolution spatio-temporelle de l’intensité de la réponse Acs anti-salive ainsi que sa spécificité de genre et d’espèce, chez des individus exposés à différents niveaux à Ae. caspius. Ces résultats souligne la possibilité de caractériser des antigènes salivaires spécifiques de genre et d’espèces qui peuvent avoir un intérêt pour mesurer le contact hôte/vecteur au niveau individuel, le risque de transmission de maladies vectorielles ou l’efficacité des mesures antivectorielles. / The primary mean to protect individuals from arthropod-borne diseases is the prevention of bites from infected arthropods which could be achieved by vector control strategies. Mosquito saliva could induce a specific antibody response in exposed individuals that could be used to assess the effectiveness of anti-vector measures. The aim of this study is to assess the possibility to use anti-mosquito saliva antibody responses in order to evaluate the exposure to specific species of vectors and to identify salivary protein candidates that can be used as immunological markers of exposure. We first verify the lack of intraspecific differences among several mosquito colonies which is essential to further observe potential differences at the species level. Moreover, a convenient storage method was developed to preserve salivary samples in non optimal condition on the field. Based on these preliminary results, we evaluated the salivary gland protein repertory diversity among four Anopheles species using complementary approaches and we shown a genus and species specificity at the protein and antigen level. At least, a spatio-temporal evolution of anti-saliva antibody responses was shown according to the Aedes caspius density using sera of differentially exposed individuals. The specificity of this response was also reported at the genus and species level. All together, these results suggest the feasibility to characterize genus and species specific salivary antigens which could be used as immunological markers of exposure to evaluate host/vector contacts, the risk of vector-borne disease transmission or the effectiveness of anti-vector strategies.

Lactobacillus sakei est une bactérie lactique qui fait partie de la flore dominante de la viande. Elle possède un équipement génétique inhabituel chez les bactéries lactiques, dédié à l'utilisation du fer : des transporteurs et 3 régulateurs de transcription fer-dépendants de la famille Fur. Nous avons i) évalué la capacité de L. sakei à utiliser les sources de fer de son environnement en développant une méthode de microanalyse du fer par microscopie (EELS) et spectrométrie de masse (Nano-SIMS), ii) réalisé une étude fonctionnelle des 3 régulateurs Fur-like et iii) réalisé une analyse transcriptomique globale en présence de transferrine ou d'hème. Ce travail a montré que le fer sous forme complexé, transferrine ou hème, était internalisé et améliorait la survie de L. sakei. Nous avons montré que la catalase hème-dépendante n'est pas l'acteur principal de cette survie car un mutant ΔkatA survit comme la souche sauvage en présence d'hème. Nos travaux ont montré aussi que le fer et l'hème induisent des réponses globales différentes. L'hème a un effet protecteur alors que le fer induit plus de stress. Nous avons mis en évidence que les 3 régulateurs Fur-like sont fonctionnellement distincts. Le régulateur Mur est impliqué dans l'homéostasie du manganèse, le PerR régule des gènes impliqués dans la réponse au stress oxydant et le Fur est impliqué dans la séquestration du fer, la morphologie des cellules et la résistance au stress. Cette étude montre que le fer et l'hème conduisent à des réponses cellulaires différentes chez L. sakei et indique que ce métabolisme pourrait être un facteur important pour la compétitivité dans l'écosystème carné. / Lactobacillus sakei is a meat-borne lactic acid bacteria. This species harbors a quite complete genetic equipment dedicated to iron utilization such putative iron transporters and 3 transcriptional iron-dependent regulators of the Fur family. We evaluate L. sakei ability to use iron sources encountered in its natural environment by i) developing an iron microanalysis method coupling microscopy (EELS) and mass spectrometry (Nano-SIMS), ii) functional study of the 3 Fur-like regulators and iii) global transcriptomic analysis in response to transferrin or heme. This work shows that iron in complexed forms (transferrin or heme) is internalized and leads to an enhanced survival in L. sakei cells. We show that the heme-dependant catalase is not the main factor implicated in this survival phenotype as the ΔkatA strain is not affected in its survival when heme is provided. Our work has revealed that heme and iron lead to different global responses. It also indicates a protecting effect of heme whereas transferrin induces stress. We show that the 3 Fur-like regulators belong to three functional families. The Mur regulator is implicated in manganese homeostasis, the PerR regulates genes implicated in the oxidative stress response and the Fur is implicated in iron storage, cells morphology and stress resistance. This study proves that heme and iron lead to different cellular responses in L. sakei and indicates that this metabolism could be an important adaptative factor in meat ecosystem.

La maturation des fruits est un processus complexe, principalement régulé par l'hormone végétal éthylène, qui entraîne d'importants changements métaboliques et physiologiques, ayant pour résultat la dispersion des graines. Le changement le plus visible qui se produit pendant la maturation des fruits est le changement de couleur. L'organite responsable de ce phénomène est le chromoplaste, lieu d’accumulation des caroténoïdes. Toutefois, ce n'est pas son unique rôle. Il a été montré qu’il est aussi impliqué dans la biosynthèse des lipides, de l’amidon, des vitamines et des arômes. Parce que la plupart des protéines (95%) qui composent le protéome du chromoplaste sont codées par le noyau, l’approche génomique n'est pas suffisante pour connaître les fonctions de chromoplaste dans la synthèse des métabolites d'intérêt. La protéomique de haut débit associée à la bio- nformatique a été utilisée pour caractériser le chromoplaste de tomate. L’analyse du protéome de chromoplastes de fruits de tomate rouges a révélé la présence de 988 protéines correspondantes à 802 unigènes d’Arabidopsis, dont 209 n’ont pas été répertoriés jusqu'à présent dans des banques de données plastidiales. Ces données ont révélé plusieurs caractéristiques du chromoplaste. Les protéines du métabolisme des lipides et de trafic sont bien représentées, y compris toutes les protéines de la voie de la lipoxygénase nécessaire à la synthèse des arômes volatiles dérivés de lipides. Les protéines impliquées dans la synthèse de l'amidon coexistent avec plusieurs protéines qui dégradent l'amidon. Les chromoplastes ne contiennent plus les protéines de biosynthèse de la chlorophylle mais contiennent des protéines impliquées dans la dégradation de la chlorophylle. Aucun des protéines impliquées dans le mécanisme de transport thylacoïdal n’ont été trouvées. Étonnamment, les chromoplastes contiennent l'ensemble des protéines du cycle de Calvin, y compris la Rubisco, ainsi que la voie des pentoses phosphates (OxPPP). L'analyse de l'évolution du transcriptome des gènes codant pour des protéines chromoplastiques a été réalisée. Ces données ont confirmé la réduction de la photosynthèse et le maintien du cycle de Calvin, ainsi que la biosynthèse de l'amidon et des lipides. Des analyses biochimiques complémentaires ont montré dans des chromoplastes isolés la présence d’une activité de deux enzymes importantes dans la biosynthèse des arômes (lipoxygénase et l'alcool déshydrogénase). Par ailleurs, à l’aide du couplage de protéines à la GFP et à leur expression dans des protoplastes, nous avons montré que des protéines ne présentant pas de peptide signal peuvent être localisées dans le chromoplaste. Enfin, un protocole d'isolement des plastes de fruits de tomate à différents stades de maturation a été mis au point et les fractions plastidiales ainsi obtenues ont été caractérisées par la microscopie confocale à balayage laser. La transition du chloroplaste à chromoplaste est un processus qui n'a jamais été décrit par la protéomique. Ce travail est en cours et devrait répondre à certaines questions concernant les changements qui ont lieu dans l'organite, et apporter des informations nouvelles pour la compréhension de la maturation des fruits. / Fruit ripening is a complex process, mainly regulated by the fruit hormone ethylene, resulting in significant metabolic and physiological changes, having as outcome seed dispersal. The most flagrant change taking place during ripening is the change in color. The organelle responsible for this is the chromoplast, the place of carotenoids accumulation. However this is not its unique role. It was found to be involved in lipid, starch, vitamins and aroma biosynthesis. Due to the fact that most proteins (95%) composing the chromoplast are codified by the nucleus knowledge on gene expression and genome sequences is not useful in the investigation of the functions of chromoplast in the synthesis of the metabolites of interest. High- hroughput proteomics associated with bio-informatics was used to characterize the tomato chromoplast and to reveal its intimate structure. Analysis of the proteome of red fruit chromoplasts revealed the presence of 988 proteins corresponding to 802 Arabidopsis unigenes, among which 209 had not been listed so far in plastidial data banks. These data revealed several features of the chromoplast. Proteins of lipid metabolism and trafficking were well represented, including all the proteins of the lipoxygenase pathway required for the synthesis of lipid-derived aroma volatiles. Proteins involved in starch synthesis co- xisted with several starch-degrading proteins and starch excess proteins. Chromoplasts lacked proteins of the chlorophyll biosynthesis branch and contained proteins involved in chlorophyll degradation. None of the proteins involved in the thylakoid transport machinery were discovered. Surprisingly, chromoplasts contain the entire set of Calvin cycle proteins including Rubisco, as well as the oxidative pentose phosphate pathway (OxPPP). The analysis of the evolution of the transcriptome of chromoplastic protein-encoding genes was performed. This data confirmed the reduction of the photosynthesis and the maintenance of the Calvin cycle, and of the lipid and starch biosynthesis. Further analysis is performed showing the activity of two important actors in the aroma biosynthesis (lipoxygenase and alcohol dehydrogenase). Several proteins with possible chromoplastic location were coupled with the GFP and expressed in the single cell system. A protocol for isolating tomato fruit chloroplasts and immature chromoplasts was described along with the characterization of the plastidial fractions by confocal microscopy. The transition of the chloroplast to chromoplast is a process that was never described by means of proteomics. This work answers some questions regarding the changes that take place in the organelle, and brings novel information for the understanding of fruit ripening process

Les maladies allergiques constituent une part importante des préoccupations de santé publique. Parmi elles, la maladie du poumon d’éleveur d’oiseaux (PEO) est une pathologie respiratoire liée à l’inhalation répétée de protéines antigéniques, localisées dans les fientes, les plumes et les squames des oiseaux. Actuellement, on connait peu de chose sur la nature des antigènes impliqués dans la maladie.La mise en évidence d’immunoglobulines G (IgG) spécifiques des agents étiologiques est un élément important dans la prise en charge diagnostique et thérapeutique. L’objectif de la thèse est d’identifier les protéines antigéniques de pigeon et de les produire par génie génétique afin de développer un test sérologique efficace et standardisé de type ELISA. L’approche immuno-protéomique développée combine l’utilisation d’analyses sérologiques (western blot, ELISA) et l’identification par spectrométrie de masse des protéines antigéniques et des protéines totales (shotgun) des fientes, squames et sérum de pigeon. Ainsi, 14 protéines antigéniques principalement localisées dans les fientes et les squames de pigeon ont été identifiées et 2 protéines recombinantes ont été produites, puis testées en ELISA. Les protéines recombinantes Immunoglobulin-lambda-like polypeptide-1 et Proprotéinase E sont très performantes pour le diagnostic sérologique du PEO avec une spécificité et une sensibilité respectives de 100% et 84%. Des protéines orthologues, potentiellement impliquées dans les réactions antigéniques croisées ont été identifiées à partir des fientes de perruche et de poule. Ce travail a permis d’identifier les protéines antigéniques des fientes de pigeon, d’apporter des précisions sur leur localisation, et de développer des antigènes recombinants standardisés et performants pour améliorer le diagnostic sérologique du PEO. Des études complémentaires, sur des modèles animaux et cellulaires, devront être menées pour explorer l'implication de ces protéines dans l'induction de la maladie. / Allergic diseases represent one of the most important public health concerns. Among them, Bird Fancier’s Lung disease (BFL) is a respiratory illness associated with repeated inhalation of antigenic proteins, present in bird droppings, feathers and blooms. Currently, little is known about the nature of the antigens involved in the disease. The detection of immunoglobulin G (IgG) specific etiologic agents is an important factor in diagnostic and therapeutic management.The objective of this thesis is to identify the antigenic proteins of pigeons and to produce them by genetic engineering in order to develop an effective and standardized ELISA-type serological test. The immuno-proteomic approach created combines the use of serological analyses (western blot, ELISA) and the identification by mass spectrometry of antigenic proteins and total proteins (shotgun) of pigeon droppings, blooms and serum. Thus, 14 antigenic proteins mainly located in droppings and blooms were identified, and 2 recombinant proteins were produced and then tested with ELISA.The recombinant proteins Immunoglobulin-lambda-like polypeptide-1 and Proproteinase E are highly effective for the serological diagnosis of BFL,with specificity and sensitivity rates of 100% and 84%, respectively. Orthologous proteins potentially involved in cross-antigen reactions were identified from budgerigar and hen droppings. This work made it possible to identify the antigenic proteins of pigeon droppings, to provide further details on their location, and to develop standardized and efficient recombinant antigens to improve the serological diagnosis of BFL.Additional studies on animals and cell models will be needed to explore the role of these proteins in the induction of the disease.

Les premières souches bactériennes résistantes aux antibiotiques sont connues depuis 70 ans et se sont multipliées ces dernières années posant un grave problème de santé publique. Parmi les nombreux types d’infections induites par ces bactéries, nous nous sommes intéressés aux infections intestinales qui peuvent dégénérer en maladies inflammatoires de l’intestin et cancers. Notre travail de thèse a consisté à proposer des outils thérapeutiques dans le traitement des pathologies intestinales infectieuses : des peptides antimicrobiens dérivés de la chromogranine A et des extraits de plantes de la médecine traditionnelle béninoise. La chromogranine A est une protéine libérée par les cellules nerveuses, neuroendocrines et immunitaires au cours d’un stress et maturée en peptides. Des peptides actifs contre quatre souches bactériennes pathogènes (Klebsiella oxytoca, Salmonella enterica, Shigella sonnei et Vibrio cholera non O1) ont été identifiés et l’interaction bactérie-peptide analysée. L’étude de la combinaison peptide-antibiotique montre que la cateslytine permet de réduire les doses d’antibiotiques nécessaires. Ensuite, nous avons étudié l’implication de deux peptides sur un modèle de cellules neuroendocrines, les cellules BON. La chromofungine provoque la stimulation des cellules BON en induisant un influx de calcium extracellulaire, tandis que la catestatine est capable de bloquer l’activité de la chromofungine.Après un screening des extraits de 14 plantes du Bénin, nous avons isolé deux molécules, la sinensétine et l’O-tétraméthyléther scutellaréine, responsables de l’activité antibactérienne de Chromolaena odorata contre les pathogènes étudiés. / The first bacterial strains resistant to antibiotics appeared 70 years ago and have proliferated in recent years causing a serious public health problem. Such bacteria are responsible of several types of infections including intestinal infections with chronic inflammatory bowel diseases and cancers. This work consisted of proposing new therapeutic tools in the treatment of intestinal pathologies. In this context, we have studied antimicrobial peptides derived from chromogranin A and plant extracts used in Beninese traditional medicine for the treatment of such diseases. Chromogranin A is a protein produced by nervous, endocrine and immune cells during a stress and processed to generate biologically active peptides. We identified antimicrobial peptides, active against four pathogenic bacterial strains (Klebsiella oxytoca, Salmonella enterica, Shigella sonnei and Vibrio cholera non O1) and analyzed the bacteria-peptide interactions. Moreover, the study of the peptide-antibiotic combination shows that cateslytin is useful for reducing doses of antibiotic drugs. In addition of this work, we have studied the effects of two peptides derived from chromogranin A on neuroendocrine cells with model of BON cells. Chromofungin stimules BON cells by inducing an influx of extracellular calcium, whereas catestatin is able to block chromofungin’s activity.With plant extracts, after a screening on 14 plants from Benin, our works enabled us to isolate two active molecules, sinensetin and O-tetramethylether scutellarein, responsible of the antimicrobial activity of Chromolaena odorata against the studied pathogenic strains.

Pseudomonas aeruginosa (PA) est une bactérie Gram négatif, pathogène opportuniste, impliquée dans un grand nombre d’infections nosocomiales. Cette bactérie est aussi le principal micro-organisme responsable des surinfections broncho-pulmonaires chez les patients atteints de mucoviscidose. Cette prééminence est due en partie à la capacité de PA à former des biofilms, ce qui lui confèrent une résistance exceptionnelle aux antimicrobiens. Au sein de notre laboratoire, une analyse protéomique différentielle a permis de démontrer, en 2004, l’existence d’un protéome spécifique lorsque la bactérie se développe en mode biofilm. Parmi les protéines spécifiquement exprimées en mode biofilm, la protéine hypothétique PA3731 a été plus particulièrement étudiée. Cette protéine est impliquée dans la formation de biofilm, la production de rhamnolipides, la résistance à la tobramycine et la mobilité de type « swarming ». Des recherches bioinformatiques ont montré que le gène pA3731 appartient à un cluster de 4 gènes allant de pA3729 à pA3732 (système BAC), qui pourraient être impliqués dans l’élaboration et/ou la régulation d’un même système protéique. Cette hypothèse a constitué le point de départ de ce travail de thèse. La présente étude a permis de confirmer l’implication du système BAC dans la formation du biofilm, la résistance aux antibiotiques et la production de rhamnolipides chez PA. Les études protéomiques ont mis en évidence l’implication de ce système dans l’expression de la pompe MexEF-OprN, de la porine OprD, et dans la régulation du Quorum Sensing. Des études intéractomiques, menées en parallèle, ont montré une forte interaction entre la protéine PA3731 et PA3732. Ces études ont également permis de valider une forte interaction entre ces protéines et les rhamnolipides. L’ensemble de ces résultats nous permettent d’avancer une hypothèse quant à l’implication du système BAC dans le transport des rhamnolipides vers le milieu extracellulaire. / Pseudomonas aeruginosa (PA) is a Gram-negative bacterium, opportunistic pathogen, involved in a large number of nosocomial infections. This microorganism is also the main infectious agent involved in bronchopulmonary infections in cystic fibrosis patients. This pre-eminence is partly due to the ability of PA to form biofilms, which confers to the bacterial cells an increased resistance to antibiotics. In our laboratory, a differential proteomic analysis allowed to demonstrate in 2004, the existence of a specific proteome when the bacterium grows in the biofilm mode. This study allowed identifying about 40 proteins, specifically accumulated when bacteria adhere to a surface. Among these proteins, the hypothetical protein PA3731 has been particularly investigated. This protein is involved in the biofilm formation, the rhamnolipids production, the resistance to tobramycin and the swarming mobility. Bioinformatic research showed that the pA3731 gene belongs to a cluster of 4 genes ranging from pA3729 to pA3732 (BAC system), which could be involved in the development and / or regulation of the same protein system. This hypothesis was the starting point of this thesis work. The present study confirmed the involvement of the BAC system in the biofilm formation, the antibiotic resistance and the rhamnolipid production in PA. Proteomic studies highlighted the implication of this system in the expression of the MexEF-OprN pump and that of the OprD porin, and in the regulation of Quorum Sensing. Interactomic investigations, conducted in parallel, showed a strong interaction between PA3731 and PA3732 proteins. These studies have also pointed out a strong interaction between these proteins and rhamnolipids. All these results suggest that the BAC system could play a major role in the transfer of rhamnolipids to the extracellular environment.

La plupart des virus ont développé des mécanismes de résistance ou de suppression du système immunitaire pour parvenir à infecter durablement leur hôte. Ces mécanismes demeurent encore imparfaitement connus. Un domaine immunosuppresseur (IS) a été identifié au niveau de la région transmembranaire des protéines d’enveloppe des rétrovirus endogènes ou infectieux. Ce domaine hautement conservé a été décrit par exemple comme inhibant l’activation lymphocytaire. Dans le laboratoire, il a été caractérisé en particulier via des expériences de rejet de cellules tumorales in vivo, ce qui a permis de définir des mutations inactivatrices. Afin de mieux comprendre les mécanismes de résistance des rétrovirus au système immunitaire, mes travaux de thèse ont porté sur l’identification de la ou des protéines capables d’interagir avec le domaine IS. Plusieurs approches cellulaires et moléculaires ont été développées, basées pour la plupart sur l’utilisation de sondes fluorescentes obtenues par synthèse chimique, constituées des domaines IS provenant de différents rétrovirus. Dans un premier temps, les cellules du système immunitaire qui lient les protéines virales ont été identifiées : les lymphocytes B et les cellules myéloïdes (monocytes, cellules dendritiques et macrophages). Dans un second temps, des expériences de co-immunoprécipitation et de chromatographie d’affinité couplées à la spectrométrie de masse ont été réalisées dans le but d’identifier sur ces cellules les protéines membranaires responsables de ces liaisons. Plusieurs agents de couplages chimiques ont été utilisés afin de maintenir les liaisons domaine IS - protéine de faibles affinités. En raison de résultats non-reproductibles obtenus au cours de ces expériences, des tests de liaison du domaine IS sur des cellules transfectées avec des banques d’ADNc, ou lors d’expériences de double hybride ont été réalisées. Ces deux approches ont permis d’identifier des protéines membranaires potentiellement impliquées dans la liaison du domaine IS : les protéines X1 et X2. Les co-transfections de vecteurs d’expression du domaine IS et de X2 ont mis en évidence des interactions protéiques au cours d’expériences de co-immunoprécipitation et de microscopie confocale, en particulier avec le domaine IS du rétrovirus HIV-1. Concernant X1, sa transfection induit la liaison cellulaire des domaines IS de HERV-W et MLV. En revanche, aucune interaction directe entre X1 et le domaine IS n’a pu être démontrée, notamment dans des expériences de co-immunoprécipitation et de microscopie confocale.La découverte des protéines membranaires qui interagissent avec le domaine IS demeure un enjeu critique pour la compréhension des voies de signalisation et de transcription qui permettent aux rétrovirus d’exercer leur effet sur le système immunitaire, l’objectif de ces travaux étant d’identifier à terme des nouvelles cibles thérapeutiques.En conclusion, même si des travaux complémentaires demeurent nécessaires, les protéines X1 et X2 pourraient contribuer à l’immunosuppression rétrovirale. / Most viruses have developed mechanisms of resistance or suppression of the immune system to achieve lasting infection of their host. These mechanisms are still imperfectly known. An immunosuppressive (IS) domain has been identified in the transmembrane region of envelope proteins of endogenous or infectious retroviruses. This highly conserved domain has been described, for example, as inhibiting lymphocyte activation. In the laboratory, it has been characterized by tumor cell rejection experiments in vivo, which has made it possible to define inactivating mutations. In order to better understand the mechanisms of resistance of retroviruses to the immune system, my thesis focused on the identification of the protein(s) interacting with the IS domain. Several cellular and molecular approaches have been developed, based for the most part on the use of fluorescent probes obtained by chemical synthesis, consisting of IS domains from different retroviruses. At first, immune system cells that bind viral proteins have been identified: B cells and myeloid cells (monocytes, dendritic cells and macrophages). In a second step, co-immunoprecipitation and affinity chromatography coupled to mass spectrometry were performed to identify on these cells the membrane proteins responsible for these bonds. Several chemical coupling agents have been used to prevent detachment of low affinity binding between proteins and the IS domain. Due to non-reproducible results obtained during these experiments, IS domain binding assays on cells transfected with cDNA libraries, or in double hybrid experiments were performed. These two approaches made it possible to identify membrane proteins potentially involved in the binding of the IS domain: the X1 and X2 proteins. Co-transfections of IS domain and X2 expression vectors demonstrated protein interactions in co-immunoprecipitation and confocal microscopy experiments, particularly with the IS domain of the HIV-1 retrovirus. Concerning X1, its transfection induces binding of the IS domains of HERV-W and MLV on cells membrane. On the other hand, no direct interaction between X1 and the IS domain could be demonstrated, especially in co-immunoprecipitation and confocal microscopy experiments.The discovery of membrane proteins that interact with the IS domain remains a critical issue for understanding the signaling and transcription pathways that allow retroviruses to exert their effect on the immune system, the aim of this work being to identify new therapeutic targets.In conclusion, although further work is still needed, the X1 and X2 proteins may contribute to retroviral immunosuppression.

La Nucléophosmine (NPM1) est l’une des protéines les plus fréquemment altérée dans les troubles hématopoïétiques. Sa mutation, au niveau de l’exon 12, est impliquée dans un tiers des leucémies myéloïdes aiguës et constitue l’un des premiers évènements dans la leucémogénèse. Elle est caractérisée par la séquestration aberrante de NPM1 au cytoplasme, on parle alors de NPMc+. NPM1 peut également subir plusieurs translocations menant à la synthèse de protéines de fusion dont NPM-MLF1. Cette dernière est impliquée dans les syndromes myéloprolifératifs et en plus faible proportion dans les leucémies myéloïdes aiguës. Cette translocation reste peu documentée. NPM1 est une protéine multifonctionnelle dont le rôle dans la régulation génique reste à être définie. La littérature fait état de quelques études rapportant que NPM1 influencerait l’expression génique mais aucun mécanisme n’a encore été clairement décrit. Nous proposons donc dans ce projet de doctorat, de définir comment NPM1 régule la transcription et nous déterminerons si la translocation NPM-MLF1 a un effet différent de celui de NPM1. Afin de déterminer de nouveaux partenaires d’interaction, nous avons purifié les complexes protéiques de NPM1 et NPM-MLF1 dans la lignée de cellules hématopoïétique K562. Dans une étude protéomique, nous avons mis en évidence par spectrométrie de masse puis par immunoprécipitation, que NPM1 et NPM-MLF1 interagissent avec les complexes de remodelage de la chromatine NuRD, P/BAF et ISWI. Par Ampli-Sequencing, nous avons identifié des gènes dérégulés par la baisse d’expression de NPM1 et anormalement exprimés chez les patients présentant une leucémie myéloïde aiguë avec mutation NPMc+. Nous avons déterminé par immunoprécipitation de la chromatine que NPM1 et NPM-MLF1 peuvent influencer l’expression de gènes cibles via le recrutement du complexe NuRD au niveau du site d’initiation de la transcription. Le profil des modifications d’histone est également perturbé. Nous montrons ici que NPM1 et NPM-MLF1 sont impliqués à la fois dans la répression et l’activation génique. Dans une seconde partie du projet, nous proposons de déterminer l’importance physiologique de la régulation, par NPM1-NuRD, de l’un des gènes cibles mis en évidence : SPARC. La méthode CRISPR-Cas9 a été utilisée pour générer des clones uniques K562 dont l’expression de SPARC est absente et celle de NPM1 est diminuée. Cette étude démontre que la diminution d’expression de NPM1 synergise avec la perte de SPARC afin d’induire la différenciation érythroïde et réduire l’invasion cellulaire. Nous montrons donc pour la première fois que NPM1 et la translocation NPM-MLF1 peuvent interagir avec des complexes de remodelage de la chromatine et peuvent influencer leur recrutement au niveau de gènes cibles afin de réguler la transcription. Nos résultats suggèrent que NPM1 est un facteur important dans le contrôle de la modification du transcriptome associée à la différenciation des cellules hématopoïétiques. Ce projet apporte donc de nouvel éclairage sur la compréhension des mécanismes associés à la mise en place des leucémies myéloïdes aiguës présentant une mutation NPMc+ ou la translocation NPM-MLF1. / Nucleophosmine (NPM1) is one of the most frequent altered proteins in hematopoietic disorders. NPM1 exon 12 mutation characterizes one third of all acute myeloid leukemia and can be fundamental to leukemogenesis. This mutation is characterized by the aberrant sequestration of NPM1 to the cytoplasm, the mutated protein is then called NPMc+. NPM1 can also undergo several translocations leading to the synthesis of fusion proteins including NPM-MLF1. The latter is involved in myeloproliferative disorders and in a lower proportion in acute myeloid leukemia. Little is known about this translocation. NPM1 is a multifunctional protein reported to influence gene regulation. The function(s) of NPM1 in gene regulation remains to be defined. The aim of this doctoral research project was to define how NPM1 regulates transcription and determine whether the NPM-MLF1 translocation could disrupt gene regulation imposed by NPM1. In order to determine new protein interaction partners, we purified NPM1 and NPM-MLF1 complexes in the K562 hematopoietic cell line. In a proteomic analysis performed by tandem immunoaffinity purifications followed by mass spectrometry and immunoprecipitation, we identified multiple nuclear protein partners of NPM1 and NPM-MLF1. Importantly, we found that NPM1 and NPM-MLF1 can interact with the chromatin remodeling complexes NuRD, P/BAF and ISWI. An analysis made by Ampli-Sequencing, indicated that multiple genes dysregulated by the decrease expression of NPM1 were also reported to be abnormally expressed in acute myeloid leukemia cells characterized by the NPMc + mutation. We demonstrate that not only NPM1 but also NPM-MLF1 can be recruited to NPM1 regulated genes and affect the chromatin recruitment of the NuRD complex. The variation in NuRD recruitment imposed by NPM1 knockdown or NPM-MLF1 expression, is associated to the abnormal transcriptional regulation of the target genes. We show here that NPM1 and NPM-MLF1 are involved in both gene repression and activation. In a second part of the project, we investigated the physiological importance of gene regulation imposed by NPM1-NuRD in these cells. Importance of the genetic link between NPM1 and the target gene SPARC was defined. Using the CRISPR-Cas9 methodology, we generated unique K562 clones whereby SPARC expression is abrogated and NPM1 expression is decreased. The decrease of NPM1 expression synergizes with the loss of SPARC expression to induce erythroid differentiation and reduce cell invasion. The results presented provide the first demonstration that NPM1 and NPM-MLF1 translocation can interact with chromatin remodeling complexes, influence their recruitment to target genes and thereby, influence the expression of specific genes. This project provides new information to understanding mechanisms affected in acute myeloid leukemia characterized by NPMc+ mutation or NPM-MLF1 translocation.