La leucémie aiguë promyélocytaire (APL) est un cancer des globules blancs qui se caractérise par l’accumulation de granulocytes immatures appelés promyélocytes. Dans la majorité des cas, la maladie est causée par la translocation réciproque des gènes RARα et PML, menant à l’expression de la protéine de fusion PML/RARα qui compromet à la fois les fonctions assurées normalement par RARα et par PML. Ainsi, la répression de la transcription des gènes cibles de RARα et la perturbation de la formation des corps nucléaires PML seraient la cause de la non-différenciation et de la survie par inhibition de l’apoptose des promyélocytes. Un des agents thérapeutiques utilisés dans le traitement de la maladie est le trioxyde d’arsenic (ATO) et malgré le fait que son efficacité soit prouvée, les mécanismes moléculaires par lesquels il exerce son action ne sont pas entièrement caractérisés. PML étant SUMOylée en réponse à l’ATO, nous avons émis l’hypothèse que d’autres protéines pourraient être régulées dans leurs modifications post-traductionnelles (PTMs) en réponse à l’agent thérapeutique et pourraient occuper un rôle dans le processus de guérison. Une analyse par protéomique quantitative de cellules HEK293 traitées à l’ATO a permis d’identifier 92 protéines significativement régulées en SUMOylation, incluant certains substrats connus de la caspase-3. Suite à cette observation, nous avons supposé que la SUMOylation pourrait protéger les substrats de la caspase-3 de leur clivage protéolytique. À l’aide d’essais in vitro et d’immunobuvardages, nous avons confirmé que la SUMOylation de PARP1 empêche son clivage par la caspase-3, ce qui pourrait jouer un rôle dans le destin cellulaire. / Acute promyelocytic leukemia (APL) is a cancer of white blood cells characterized by the accumulation of immature granulocytes called promyelocytes. In most cases, the disease is caused by the reciprocal translocation of the RARα and PML genes, leading to the expression of the PML/RARα fusion protein that compromises both the functions normally provided by RARα and by PML. Thus, repression of the transcription of RARα target genes and disruption of the formation of PML nuclear bodies may cause the non-differentiation of promyelocytes and the promotion of their survival by inhibition of apoptosis. One of the therapeutic agents used to treat the disease is arsenic trioxide (ATO) and despite the fact that its effectiveness is proven, the molecular mechanisms through which it exerts its action are not fully characterized. Since PML is SUMOylated in response to ATO, it is likely that other proteins may also exhibit changes in their post-translational modifications (PTMs) and play a role in the response. By using large-scale proteomic workflows on HEK293 cells following ATO treatment, we identified 92 proteins that shown significant changes in SUMOylation, including some known capase-3 substrates. Following this observation, we surmised that SUMOylation may protect these substrates from caspase-3 cleavage. Using in vitro assays and immunoblots, we confirmed that SUMOylation of PARP1 prevents its cleavage by caspase-3, an event that could mediate cell fate.

Protein SUMOylation is a highly dynamic and reversible post-translational modification that targets lysine residues on a wide range of proteins involved in several essential cellular events, including protein translocation and degradation, mitotic chromosome segregation, DNA damage response, cell cycle progression, cell proliferation, and migration. Protein SUMOylation is an ATP-dependent enzymatic process that involves an E1 activating enzyme SAE1/2, a E2 conjugase UBC9, and usually facilitated by SUMO E3 ligases. The SP-RING family is the largest family of SUMO E3 ligases, encompassing seven mammalian protein inhibitor of activated STAT (PIAS) proteins. PIAS family was originally identified as specific inhibitors for signal transducer and activator of transcription (STAT), which involves gene transcriptional regulation. Recent studies showed that PIAS proteins also play important roles in the regulation of protein stability and signal transduction through the SUMOylation of target substrates. In addition, PIAS-mediated protein SUMOylation is also involved in several cellular processes, including DNA damage repair, immune response, cellular proliferation, and motility. Most notably, PIAS proteins are highly expressed in different cancer types and have been implicated in tumorigenesis. Several reports suggest that PIAS proteins could promote cancer cell growth and progression by regulating the SUMOylation of different substrates. To date, a number of substrates of PIAS ligases have been identified from several individual studies, and hundreds of specific SUMO E3 ligase substrates were identified from a human proteome microarray-based activity screen. However, how these substrates are selected, and which SUMOylation sites are targeted by these PIAS are still unknown. To answer these questions, I started my investigation with PIAS1, one of the most well studied SUMO E3 ligases. By changing the expression level of PIAS1 in HeLa cells using gene overexpression or CRISPR/Cas9 gene knockout, I found PIAS1 had a physiological impact on cell proliferation and migration. I took advantage of the previously developed SUMO proteomics workflow to quantitatively profile global SUMOylome changes upon PIAS1 overexpression in a site-specific manner. I identified 983 SUMO sites on 544 proteins, of which 62 proteins were assigned as putative PIAS1 substrates. In particular, Vimentin (VIM), a type III intermediate filament protein involved in cytoskeleton organization and cell motility, was identified as PIAS1 substrates. Two SUMOylation sites mediated by PIAS1 at Lys-439 and Lys-445 residues were further evaluated and found to be necessary for dynamic disassembly and assembly of vimentin intermediate filaments, which further regulates cell migration and motility. In the second study, I extended my investigation to all PIAS ligases and further found that all PIAS proteins impact cell proliferation and migration of breast cancer cell MDA-MB-231 after CRISPR/Cas9 gene knockout. I further optimized my SILAC-based quantitative SUMO proteomics approach and combined it with transcriptomics to gain a system-level understanding of the functional components involved in PIAS regulatory networks. A large subset of proteins/ genes involved in cell proliferation and migration were commonly regulated by all PIAS proteins, suggesting a redundancy of regulation within the PIAS family. In addition, each PIAS regulated a unique pool of substrates/genes involved in different cellular processes, such as DNA damage repair, chromatin remodeling, and SUMO chain formation, suggesting that each PIAS specifically regulates cellular functions. The trans-scale analyses between proteomics and transcriptomics shed light on the comprehensive pictures of the regulation networks by PIAS proteins beyond their direct enzymatic activity. Overall, the quantitative SUMO proteomics approach provided a robust method for identifying substrates of PIAS SUMO E3 ligases. The combination of proteomic and transcriptomic analyzes made it possible to draw up a global portrait of the regulatory mechanisms governed by the PIAS proteins. / La SUMOylation des protéines est une modification post-traductionnelle se produisant sur des lysines d’un large éventail de protéines cellulaires. Cette modification est dynamique et régit plusieurs évènement cellulaires essentiels, dont la translocation et la dégradation des protéines, la ségrégation chromosomique mitotique, la réparation de l'ADN, la progression du cycle cellulaire, la prolifération cellulaire et la migration. La conjugaison de la protéine SUMO sur son substrat se produit grâce à une triade enzymatique regroupant l’enzyme d’activation E1 SAE 1/2, la conjugase E2 UBC9 et dans la plupart des cas une ligase SUMO E3. Cette cascade enzymatique nécessite une source d’ATP pour son initiation. Parmi la famille des ligases SUMO E3, on retrouve un domaine spécifique nommé SP-RING présent chez une sous population de celles-ci. Parmi ces ligases on retrouve 7 protéines inhibitrices des protéines STAT activées regroupees sous le nom de PIAS. Les ligases PIAS ont été identifiées à l'origine comme des inhibiteurs spécifiques des protéines STAT responsable du signal de transduction et de l’activation de la transcription génique. Des études récentes ont montré que les protéines PIAS jouent également un rôle important sur la stabilité de leurs substrats et la transduction de leur signal. De plus, les substrats SUMOylés par les PIAS sont impliqués dans plusieurs processus cellulaires, notamment la réparation des dommages à l'ADN, la réponse immunitaire, la prolifération et la motilité cellulaire. Ces divers processus cellulaires peuvent être déréglés et entrainer le développement du cancer. Il s’avère que les protéines PIAS sont fortement exprimées dans divers types de cancer et sont impliquées dans la tumorigenèse. Plusieurs rapports suggèrent que les protéines PIAS pourraient favoriser la croissance et la progression des cellules cancéreuses en régulant le niveau de SUMOylation de plusieurs substrats. Initialement, les substrats des ligases PIAS ont été identifiés à partir de plusieurs études individuelles et plus récemment, des centaines de substrats spécifiques de la SUMO E3 ligase ont été identifiés à partir de criblage de micropuces à protéines interrogeant le protéome humain. Cependant, la manière dont ces substrats sont sélectionnés et quels sont les sites de SUMOylation ciblés par ces PIAS demeurent encore méconnus. Afin d’aborder ces questions, j’ai commencé mon étude avec PIAS1, l'une des ligases SUMO E3 les plus étudiées. Pour ce faire, j’ai varié le niveau d'expression de PIAS1 dans des cellules iv HeLa selon l’approche CRISPR/Cas9. Ainsi, deux modèles ont été construit, soit via une surexpression du gène ou via un knockout du gène. Ces mutants ont permis de constater que PIAS1 avait un impact physiologique sur la prolifération et la migration des cellules. J’ai tiré avantage d’une méthode protéomique précédemment développé sur les peptides SUMO pour déterminer les changements de SUMOylation lors de la surexpression de PIAS1. J’ai identifié 983 sites SUMO sur 544 protéines, dont 62 protéines ont été identifiées comme substrats potentiels de PIAS1. Parmi celles-ci, la vimentine (VIM), une protéine de la famille des filaments intermédiaire de type III impliquée dans l'organisation du cytosquelette et la motilité cellulaire, a été reconnu comme un substrat de PIAS1. Afin de valider le rôle de la SUMOylation des lysines Lys-439 et Lys-445 de VIM j’ai effectué des études fonctionelles de motilité cellulaire avec les mutants où ces sites ont été substitués en arginine. Ces expériences m’ont permis de constater que la SUMOylation de VIM aux sites Lys-439 et Lys-445 est nécessaire à l’assemblage et désassemblage dynamique des filaments intermédiaires de VIM, lesquels regulent la migration et la motilité cellulaire. Dans la deuxième étude, j’ai élargi mon recherche sur toutes les ligases PIAS et avons découvert que ces dernières avaient toutes un impact sur la prolifération cellulaire et la migration des cellules du cancer du sein MDA-MB-231 suite à un knockout de ces gènes par CRISPR / Cas9. De plus, j’ai optimisé mon approche de protéomique quantitative SUMO via SILAC et l'avons complémenté d’une analyse transcriptomique. Cette combinaison a permis d’acquérir une compréhension des composants fonctionnels impliqués dans les réseaux de régulation PIAS. Il s’avère qu’un grand sous-ensemble de gènes / protéines impliqués dans la migration et la prolifération des cellules sont régulés par tous les membres de la famille PIAS, et suggère une certaine redondance fonctionnelle parmi ces ligases. De plus, chaque PIAS régule un ensemble unique de substrats / gènes impliqués dans plusieurs processus cellulaires différents, tels que la réparation des dommages de l'ADN, le remodelage de la chromatine et la formation de la chaîne SUMO. Ces résultats suggèrent que chacune des PIASs régule de façon spécifique les fonctions cellulaires. La combinaison des analyses protéomiques et transcriptomiques ont permi de dresser un portrait global des mécanismes de régulation régit par les protéines PIAS et ce au-delà de leur activité enzymatique directe.

Le liquide interstitiel est aujourd’hui considéré comme un candidat prometteur comme alternative, ou complément, à l’analyse sanguine pour la quantification de biomarqueurs. Localisé notamment dans la peau, sa composition demeure peu décrite dans la littérature. Cela peut s’expliquer par le fait que le prélèvement de liquide interstitiel reste problématique. En effet, les méthodes d’extraction actuelles sont chronophages, douloureuses et conduisent au prélèvement de volumes très faibles ne permettant pas toujours une analyse subséquente. L’utilisation de timbres de microaiguilles conçus en hydrogel superabsorbant représente une solution indolore, rapide et efficace pour le prélèvement du liquide interstitiel. Un premier type de timbre a été conçu par photopolymérisation, un processus de fabrication caractérisé par sa rapidité. Ce type de timbre de microaiguilles présente une capacité d’absorption très élevée et peut trouver une application dans l’élaboration des profils protéomique, métabolomique et lipidomique du liquide interstitiel dermique. Le second type de timbres de microaiguilles est obtenu par chauffage d’une formulation contenant des polymères superabsorbants. Ce procédé s’avère plus long mais conduit à un hydrogel superabsorbant riche en groupements chimiques permettant d’envisager une fonctionnalisation pour la capture et la détection in situ de biomarqueurs spécifiques du liquide interstitiel dermique. In fine, les timbres de microaiguilles développés pourraient donc permettre d’approfondir notre connaissance de la composition du liquide interstitiel; mais laissent également entrevoir la possibilité de développer des dispositifs médicaux portables permettant le diagnostic, ou la surveillance, rapide et indolore de certaines pathologies. Ces dispositifs pourraient diminuer les coûts normalement associés à ces pratiques et améliorer la prise en charge des patients. C’est le cas notamment de l’insuffisance cardiaque, dont la gestion pourrait être considérablement facilitée par le suivi à domicile du biomarqueur NT-proBNP. / Nowadays, interstitial fluid is considered a valid alternative for blood analysis and biomarker monitoring. However, its composition is scarcely described in the literature. Notably located in the skin, its collection remains a challenge as current methods are time-consuming, painful and the extracted volume limits subsequent analysis. Here we put forward the use of superabsorbant hydrogel-based microneedle patches to enable a painless, rapid and efficient sampling of dermal interstitial fluid. A first kind of microneedle patch was obtained using UV-curing, a rapid fabrication process. This type of microneedle patch enables the collection of a high volume of liquid and can therefore be utilized for subsequent proteomic, metabolomic and lipidomic analyses of the dermal interstitial fluid that had been extracted in a painless fashion. The second class of microneedle patch developed was fabricated from superabsorbant polymers using heating. Although time consuming, this process produced hydrogel-based microneedle patches that could be functionalized for the in situ detection of specific biomarkers in the dermal interstitial fluid. In fine, the aforementioned microneedle patches have the potential to broaden our understanding of the interstitial fluid composition, as well as be integrated in novel portable biosensing devices for a rapid and painless diagnosis, or for the monitoring of certain medical conditions. For example, quantifying the NT-proBNP biomarker in the dermal interstitial fluid could significantly improve the quality of life of heart failure patients.

Le cancer du sein est le cancer le plus fréquemment diagnostiqué et le plus mortelle chez la femme, où sa progression vers le stade métastatique constitue une menace pour la vie des patientes. La présence de métastases représente le défi clinique central de l'oncologie des tumeurs solides, de sorte que les mécanismes et les voies sous-jacents au processus métastatique doivent être mieux définis. L'expression aberrante du récepteur tyrosine kinase (RTK) AXL a été liée cliniquement à la formation de métastases et à l'acquisition d'une résistance aux médicaments contre le cancer. AXL est un membre de la sous-famille des récepteurs tyrosine kinase TAM et intervient dans plusieurs processus biologiques tels que l'atténuation de la réponse immunitaire, l'élimination des cellules apoptotiques et la promotion de la survie cellulaire. L'expression d'AXL dans les tumeurs primaires humaines corrèle avec la faible survie des patients. Malgré sa régulation positive préférentielle dans les lignées cellulaires triple négatives / basales B, des études ont montré que l’expression d’AXL est indépendante du sous-type de la tumeur mammaire des patients. AXL peut être activé par son ligand GAS6 ou par d'autres RTK. Lors de son activation, AXL induit une signalisation en aval entraînant l'activation d'intermédiaires de signalisation canoniques, notamment MAPK, AKT et PI 3-kinases. Cependant, les voies de signalisation spécifiques engagées par AXL pour conférer un tel pouvoir pro-invasion ne sont pas connues. Ainsi, le but de cette thèse est d'identifier des substrats spécifiques d’AXL et des voies en aval qui jouent un rôle important dans le maintien d'un état « EMT » et d'un renforcement du phénotype mésenchymal dans les cellules cancéreuses. À la recherche de régulateurs en amont du complexe ELMO/DOCK1 impliqués dans l’activation de RAC, nous présentons au chapitre 2 les protéines d’échafaudage ELMO en tant que substrats directs et partenaires de liaison d’AXL. Grâce à des approches de protéomique et de mutagenèse, nous révélons que la kinase AXL phosphoryle ELMO1/2 sur un résidu tyrosine carboxy-terminal conservé. Dans les cellules cancéreuses du sein, l'activation d'AXL dépendante de GAS6 a conduit à la phosphorylation endogène d'ELMO2 sur Tyr-713, menant ainsi à la formation du complexe AXL/ELMO. En outre, l'activation de RAC induite par GAS6 dans les cellules cancéreuses du sein dépendait de l'expression d'ELMO2. Semblable au blocage d’AXL, l'inhibition d’ELMO2 ou l'inhibition pharmacologique de DOCK1 supprime l'invasion des cellules du cancer du sein, qui, selon nous, dépendait de l'état de phosphorylation d'ELMO. Notre travail au chapitre 2 définit un nouveau mécanisme par lequel AXL favorise la prolifération et l'invasion cellulaire et identifie l'inhibition de la voie ELMO/DOCK comme une cible thérapeutique potentielle pour arrêter les métastases induites par AXL. Bien qu'il soit encore difficile de savoir comment les signaux d’AXL induisent son phénotype pro-invasif, notre travail au Chapitre 3 vise à identifier des substrats et des voies de signalisation spécifiques qui sont significativement modulés lors de l'activation d'AXL. Pour y remédier, nous avons défini le phosphoprotéome de la régulation d’AXL dans des cellules cancéreuses du sein triple-négatives en utilisant une approche quantitative. Nous révélons qu’AXL module de manière robuste, parmi de nombreux processus et voies biologiques importants, la phosphorylation d'un réseau de protéines d'adhésion focale (FA) aboutissant à un désassemblage plus rapide des FA. De manière intéressante, nous avons trouvé que la modulation de la voie FA était unique à AXL par rapport à d'autres RTK tels que l'EGFR. En particulier, nous avons trouvé qu’AXL phosphoryle la protéine NEDD9, modulant la formation du complexe NEDD9/CRKII/DOCK3, qui orchestre la phosphorylation de la pseudo-kinase PEAK1 médiée par AXL. Nos données révèlent un mécanisme distinct par lequel les complexes PEAK1 avec la kinase CSK médient la phosphorylation de PXN et le renouvellement des FA induit par AXL. En utilisant l'injection orthotopique de cellules cancéreuses du sein dans le tissu adipeux mammaire des souris et dans la veine de la queue, nous révélons que l'inactivation de PEAK1 par CRISPR diminue la croissance tumorale et les métastases in vivo. De plus, notre travail au chapitre 3 révèle une contribution unique et inattendue de la signalisation d’AXL à la dynamique des FA, révélant un mécanisme longtemps recherché sous-tendant l'activité invasive d'AXL. Cette compréhension approfondie des réseaux de signalisation régulés par AXL identifie PEAK1 comme une nouvelle cible thérapeutique dans les tumeurs AXL positives. En conclusion, cette thèse a identifié, pour la première fois, le phosphoprotéome d’AXL et des voies de signalisation spécifique à AXL, pouvant justifier le rôle du récepteur en tant que promoteur de métastases et de résistance aux médicaments. Notre travail révèle de nouvelles cibles thérapeutiques qui pourraient avoir un grand potentiel si elles sont utilisées en thérapie combinatoire avec l’inhibition d’AXL pour prévenir la formation de métastases des tumeurs AXL positives. / Breast cancer is the most frequently diagnosed cancer in women where its progression to the metastatic stage poses a threat to the life of patients. The metastatic disease represents the central clinical challenge of solid tumor oncology such that mechanisms and pathways underlying the metastatic process must be better defined. The aberrant expression of the receptor tyrosine kinase (RTK) AXL has been linked clinically to metastasis and acquisition of drug resistance. AXL is a member of the TAM subfamily and functions in several biological processes such as dampening the immune response, clearing apoptotic cells and promoting cell survival. Despite its preferential upregulation in triple negative/basal B cell lines, studies have shown AXL expression in the clinic to be subtype independent. AXL can be activated by its ligand GAS6 or by a crosstalk with other RTKs. Upon its activation, AXL induces downstream signaling resulting in the activation of canonical signaling intermediates including MAPKs, AKT and PI 3-kinases. However, the specific signaling pathways engaged by AXL to confer such enhanced pro-invasion power are not known and the goal of this thesis is to identify AXL-specific substrates and downstream pathways that are behind AXL’s significant role in maintaining an EMT state and reinforced mesenchymal phenotype in cancer cells. In search of upstream regulators of ELMO/DOCK1 complex involved in RAC activation, we reported ELMO scaffolds as direct substrates and binding partners of AXL. Through proteomics and mutagenesis approaches, we revealed phosphorylation of ELMO1/2 by AXL kinase on a conserved carboxyl-terminal tyrosine residue. In breast cancer cells, GAS6-dependent activation of AXL led to endogenous ELMO2 phosphorylation on Tyr-713 and AXL/ELMO complex formation. In addition, GAS6-induced RAC activation in breast cancer cells was dependent on ELMO2 expression and phosphorylation. Our work in chapter 2 defines a new mechanism by which AXL promotes cell proliferation and invasion and identifies inhibition of ELMO/DOCK pathway as a potential therapeutic target to stop AXL-induced metastases. While it still remains elusive how AXL signals to induce its pro-invasive phenotype, our work strove to identify specific substrates and signaling pathways that are significantly modulated upon AXL activation using a quantitative phosphoproteomics approach. By generating GAS6-induced AXL phosphoproteome, we found that AXL robustly modulates, among many different significant biological processes and pathways, the phosphorylation of a network of focal adhesion (FA) proteins culminating in faster FA disassembly. Interestingly, we found AXL modulation of FA pathway to be unique to AXL in comparison with other RTKs such as EGFR. NEDD9 FA protein was identified to be a direct substrate of AXL, where its phosphorylation modulates its complex formation with CRKII/DOCK3, and this subsequently orchestrates the AXL-mediated phosphorylation of the pseudo-kinase PEAK1. Our data revealed a distinct mechanism by which PEAK1 complexes with CSK kinase, mediating PXN phosphorylation and AXL-induced FA turnover. Using in vivo assays such as tail-vein metastasis assay and tumor growth assay, we revealed that gene inactivation of PEAK1 by CRISPR CAS9 decreased tumor growth and metastasis. Furthermore, our work in chapter 3 uncovers an unexpected and unique robust contribution of AXL signaling to FA dynamics revealing a long sought-after mechanism underlying AXL pro-invasive activity. This in-depth understanding of AXL regulated signaling networks identifies PEAK1 as a new therapeutic target in AXL positive tumors. In conclusion, this thesis identified, for the first time, AXL phosphoproteome and AXL specific downstream signaling pathways that may justify AXL’s role as a promoter of metastasis and drug resistance. Our work reveals novel therapeutic drug targets that may hold a great potential if used in combinational therapeutics with AXL inhibition to prevent metastasis of AXL positive tumors.

Le virus de l'herpès simplex de type 1 (VHS-1) est l'un des agents pathogènes humains les plus anciens et les plus efficaces. On estime que 3.7 milliards de personnes dans le monde vivent avec le VHS-1. Le virus persiste à l'état latent dans les neurones sensoriels, réapparaissant occasionnellement sous la forme d'une infection lytique qui endommage l'épithélium. Même si le VHS-1 provoque une maladie bénigne connue sous le nom de feu sauvage dans la majorité des cas, l'infection peut entraîner des conséquences catastrophiques telles que l'encéphalite et la kératite chez les personnes immunodéprimées les nouveau-nés. Compte tenu de la présence généralisée des infections à VHS-1, le virus représente une menace potentielle pour le système de santé. Le génome à ADN du VHS-1 est protégé par une cage protéique appelée capside. Bien que l'assemblage de la capside du VHS-1 et l'encapsidation du génome aient lieu à l'intérieur du noyau de l'hôte, les étapes finales de la maturation doivent être achevées dans le cytoplasme. Ainsi, pour la sortie du noyau, le virus a développé un mécanisme connu sous le nom d’enveloppement-déenveloppement-réenveloppement. La première étape de ce processus est principalement régulée par le complexe de sortie nucléaire (pUL31 et pUL34) et entraîne le bourgeonnement de la capside alors enveloppée dans l'espace périnucléaire. Par la suite, le déenveloppement de ces capsides périnucléaires et leur libération dans le cytoplasme seraient largement modulés par la kinase virale pUs3. Ce processus est sélectif, car les capsides remplies d'ADN (capsides C) sortent préférentiellement du noyau au détriment des intermédiaires viraux sans génome (capsides A et B). Cependant, nous ne savons pas pourquoi les capsides C sont favorisées lors de ce processus. En aval, le virus mûrit, recrute de nombreuses protéines puis acquiert une enveloppe à partir d'un compartiment cytoplasmique. Il sort ensuite de la cellule sous forme de virions enveloppés matures. Outre les facteurs viraux mentionnés et quelques protéines hôtes, l'implication de nombreuses autres protéines virales et cellulaires dans cette voie n'a pas été entièrement caractérisée. Pour élucider davantage ce processus de sélection de la capside C, nous avons profité de l'analyse MS/MS des capsides nucléaires du VHS-1 pour définir les facteurs hôtes et viraux spécifiques à chaque intermédiaire de capside nucléaire (Chapitre 2; Article 1). Nous avons trouvé deux protéines virales (pUL42 et pUL46) et sept facteurs de l'hôte (glycogène synthase, quatre protéines différentes liées à la kératine, fibronectine 1 et PCBP1) qui étaient spécifiques des capsides C matures. Fait intéressant, toutes ces protéines semblent posséder des fonctions qui ont le potentiel de médier la sortie nucléaire préférentielle des capsides C. Par conséquent, l'analyse fonctionnelle future de ces protéines pourrait nous fournir des informations inestimables sur la sortie nucléaire actuellement énigmatique des capsides du VHS-1. Les travaux en cours d'un collègue de laboratoire avec lequel je collabore impliquent PCBP1 en tant que modulateur de la sortie nucléaire (mémoire de Mackenzie Thornbury). Nous nous sommes ensuite concentrés sur un ensemble de données protéomiques déjà existantes des virions extracellulaires matures, qui a identifié jusqu'à 49 protéines hôtes incorporées dans le virus, y compris une hélicase à ARN humaine appelée DDX3X qui s'est avérée être un modulateur actif de la propagation virale (Chapitre 2; Article 2). Nous avons remarqué que cette protéine se déplace vers le noyau tard lors de l'infection, coïncidant avec la majeure partie de la sortie nucléaire virale. Par conséquent, nous avons émis l'hypothèse que DDX3X serait impliqué dans la sortie nucléaire virale. Nous avons découvert que, tardivement au cours de l'infection, pUL31 interagit avec DDX3X au niveau du noyau. Nous avons également constaté que DDX3X stimule de grandes agrégations de capsides virales matures dans la périphérie nucléaire. Fait intéressant, la redirection de DDX3X vers le bord nucléaire dépend de la présence de la machinerie de sortie nucléaire virale (pUL31, pUL34 et pUs3) et de capsides matures. Enfin, nos données ont montré qu'en l'absence de DDX3X, les capsides C s'accumulent entre les deux membranes nucléaires, probablement à la suite d'une incorporation inefficace de pUs3 au site de sortie. Ces résultats ont élucidé une nouvelle fonction de DDX3X et pourraient ouvrir de nouvelles voies passionnantes de recherche pour développement d’antiviraux en ciblant cette hélicase à ARN cellulaire. / Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) is one of the oldest and most successful human pathogens. It is estimated that 3.7 billion people worldwide are living with HSV-1. The virus latently persists in sensory neurons, occasionally recurring as a lytic infection which damages the connected epithelium. Even though HSV-1 causes a mild disease known as the cold sore in majority of cases, the infection can have catastrophic consequences such as encephalitis and keratitis in immunocompromised individuals, newborns and, more rarely, in immune competent adults. Considering the widespread presence of HSV-1 infections, the virus poses a potential threat to the healthcare system. The DNA genome of HSV-1 is protected by a protein cage called a capsid. Although HSV-1 capsid assembly and genome packaging take place inside the host nucleus, the final steps of maturation must be completed inside the cytoplasm. Since the large diameter of these viral capsids (~125 nm) far exceeds the 30 nm cut-off of the nuclear pore complex, the virus has evolved a mechanism known as envelopment-deenvelopmentreenvelopment. The first step of this complex process is mainly regulated by the components of the nuclear egress complex (pUL31 and pUL34) and results in the budding of enveloped capsid into the perinuclear space. Subsequently, deenvelopment of these perinuclear capsids and their release into the cytoplasm is thought to be largely modulated by the viral kinase pUs3. This process is selective as DNA-filled capsids (C-capsids) preferentially exit the nucleus compared to genome-free viral intermediates (A- and Bcapsids). However, it is unclear how C-capsids are preferentially selected for the nuclear egress. Further downstream, the virus matures and recruit numerous proteins onto the viral capsids and acquire an envelope from a cytoplasmic compartment. It then exits the cell as mature enveloped virions. Apart from the mentioned viral factors and a handful of host proteins, implication of many other viral and cellular proteins in this pathway have not been fully characterized. To further resolve this process of C-capsid selection, we took advantage of MS/MS analysis of HSV-1 nuclear capsids to define host and viral factors specific to each nuclear capsid intermediate (Chapter 2; Article 1). We found two viral proteins (pUL42 and pUL46) and seven host factors (glycogen synthase, four different keratin-related proteins, fibronectin 1, and PCBP1) that were specific to mature C-capsids. Interestingly, all these proteins seem to possess functions that have the potential to mediate the preferential nuclear exit of C-capsids. Therefore, future functional analysis of these proteins might provide us with invaluable insights into the currently enigmatic nuclear egress of HSV-1 capsids. Ongoing work by a lab colleague with which I collaborate implicates PCBP1 as a modulator of nuclear egress (memoir of Mackenzie Thornbury). We then focused on an existing proteomics data set of mature extracellular virions, which revealed 49 virus-incorporated host proteins, including a human RNA helicase called DDX3X that we found to be an active modulator of viral propagation (Chapter 2; Article 2). We observed that DDX3X relocates to the nuclear rim late during infection, coinciding with the bulk of viral nuclear egress, and leading us to hypothesize that DDX3X is involved in the process. We discovered that, late during the infection, pUL31 interacts with DDX3X at the nuclear rim. We also found that DDX3X stimulates large aggregations of mature viral capsids in the nuclear periphery. Unexpectedly, redirection of DDX3X to the nuclear rim was dependent on the presence of the viral nuclear egress machinery (pUL31, pUL34 and pUs3) and mature capsids. Lastly, our data showed that in the absence of DDX3X, C-capsids accumulate in the perinuclear space, likely as the result of inefficient incorporation of pUs3 to the site of egress. These results have elucidated a novel function for DDX3X and may open new and exciting paths to produce antivirals by targeting this cellular RNA helicase.

Thesis with manuscript / La communication intercellulaire joue un rôle important dans tous les organismes, car elle permet l'échange de molécules bioactives entre les cellules. La plupart des cellules peuvent sécréter des vésicules extracellulaires (VE) délimitées par une membrane, qui peuvent servir de médiateur pour le transfert sélectif de matériel génétique, en particulier de molécules d'ARN, vers des cellules réceptrices et modifier leur phénotype. Pour faciliter le ciblage de l'ARN vers les VE, les protéines de liaison de l'ARN (RBP) interagissent avec les ARN, formant des complexes ribonucléoprotéiques (RNP) et guidant leur localisation vers les sites de production des VE. Alors que la facilitation du transport de l'ARN par les RBP est bien étudiée dans les cellules, leur mécanisme dans les VE reste mal compris. Pour mieux comprendre le chargement sélectif des ARN dans les VE, nous avons effectué un profilage RBP complet du sécrétome libéré par les cellules épithéliales mammaires humaines (HMLE), en comparaison avec le matériel des cellules entières. Nous avons d'abord utilisé la réticulation UV pour lier de manière covalente les RBP et leurs ARN associés, puis nous avons isolé le sécrétome par ultracentrifugation et purifié les RBP par extraction d'ARN lié à des protéines (XRNAX) et par spectrométrie de masse (MS). Grâce à une analyse comparative des RBP dans les environnements cellulaire et extracellulaire, nous avons identifié des collections de protéines associées à l'ARN qui étaient communes aux deux compartiments (n=189), ou qui présentaient une association plus spécifique avec l'ARN dans les échantillons cellulaires (n= 866) ou EV (n=502). Nous avons constaté que les RBP du compartiment extracellulaire (ExRBP) avaient des signatures fonctionnelles distinctes (par exemple, le métabolisme cellulaire, la structure et la modification des cellules, le repliement des protéines) par rapport aux facteurs enrichis en cellules (par exemple, le processus métabolique de l'ARN non codant). Notamment, des RBP EV bien connus, tels que ALIX, ANXA1, hnRNPR, hnRNPQ (SYNCRIP), YBX1, ainsi que des marqueurs EV de tétraspanine (CD9, CD81, TSG101), étaient enrichis dans l'ExRBP, ce qui indique le succès de XRNAX dans la purification des RBP EV. En comparant notre collection d'ExRBP aux signatures MS des VE plus pures dérivées des cellules HMLE, nous avons également pu délimiter les ExRBP qui vi sont susceptibles d'être enrichies en VE (PureEVRBP) par rapport à celles trouvées dans le sécrétome non VE (SecRBP). Il est frappant de constater que le PureEVRBP étaient enrichies en protéines de jonction cellulaire, tandis que le secRBP étaient enrichies en facteurs spliceosomaux, ce qui implique un chargement sélectif des RBP dans les VE ou leur sécrétion dans l'espace extracellulaire. Cette recherche fournit des informations précieuses sur la composition des RBP dans les EV, servant d'ensembles de données protéomiques clés pour élucider davantage les mécanismes modulant le recrutement sélectif des ARN dans les EV et améliorant notre connaissance des rôles des RBP dans la biologie des VE. / Intercellular communication plays an important role in all organisms, as it enables the exchange of bioactive molecules between cells. Most cells can secrete membrane-delimited extracellular vesicles (EVs), which can mediate the selective transfer of genetic material, in particular RNA molecules, to recipient cells and modify their phenotypes. To facilitate the targeting of RNA to EVs, RNA binding proteins (RBPs) are thought to interact with RNAs, forming ribonucleoprotein complexes (RNPs) and guiding their localization to sites of EV production. While the facilitation of RNA transportation by RBPs is well-studied in cells, their mechanism in EVs remain poorly understood. To gain insights into the selective loading of RNAs into EVs, we conducted comprehensive RBP profiling on the secretome released by Human Mammary Epithelial (HMLE) cells, in comparison to whole cell material. We first employed UV cross-linking to covalently link RBPs and their associated RNAs, followed by secretome isolation through ultracentrifugation and purification of RBPs using Protein-Xlinked RNA Extraction (XRNAX) and mass spectrometry (MS). Through a comparative analysis of RBPs in cellular and extracellular environment, we identified collections of RNA-associated proteins that were common to both compartments (n=189), or which exhibited more specific RNA association in cellular (n= 866) or EV (n=502) specimens. We found that extracellular compartment RBPs (ExRBPs) had distinctive functional signatures (e.g. cellular metabolism, cell structure and modification, protein folding) compared to cellular-enriched factors (e.g. non-coding RNA metabolic process). Notably, well-known EV RBPs, such as ALIX, ANXA1, hnRNPR, hnRNPQ (SYNCRIP), YBX1, as well as tetraspanin EV markers (CD9, CD81, TSG101), were enriched in ExRBP, indicating the success of XRNAX in EV RBP purification. By comparing our ExRBP collection to the MS signatures of more pure HMLE cell derived EVs, we were also able to delineate ExRBPs that are likely to be EV-enriched enriched versus those found in the non-EV secretome. Strikingly, pure EV-RBPs were enriched for cell-junction proteins, while general secretome RBPs were enriched for spliceosomal factors, implying selective loading of RBPs into EVs or their secretion into the extracellular space. This research provides valuable insights into the composition of RBPs in EVs, serving as key proteomic datasets to further elucidate iv the mechanisms modulating the selective recruitment of RNAs into EVs and enhancing our knowledge of the roles of RBPs in EV biology.

Les protéines de liaison à l'ARN (PLA) s'assemblent en complexes cytoplasmiques avec les ARNm pour contrôler la traduction locale des ARNm et le transport axonal. Ces processus sont essentiels au maintien de la survie des neurones et leur déficience est impliquée dans le développement de nombreuses maladies neurodégénératives, telles que la SLA. Il a été montré ultérieurement que la déplétion nucléaire de TDP-43, liée à la SLA, entraîne l'accumulation d'une variante épissée alternativement de la ribonucléoprotéine nucléaire hétérogène A1 (hnRNP A1). Cette isoforme, appelée hnRNP A1B, possède une région désordonnée (RID) et, dans le contexte neuronal, localise dans les neurites et dans le noyau, alors que la hnRNP A1 localise majoritairement dans le noyau. Ceci appui l'hypothèse que la hnRNP A1B peut avoir une fonction cytosolique dans les neurones qui n'est pas partagée avec la hnRNP A1. En outre, les hnRNP A1 et hnRNP A1B sont mutées dans de rares cas de SLA familiale, dont certaines mutations sont spécifiques à la hnRNP A1B. Jusqu'à présent, la littérature se concentre sur l'isoforme hnRNPA1 tandis que peu est répertorié sur la fonction de la hnRNP A1B. Ainsi, cette étude vise à déterminer et caractériser la fonction cytosolique de la hnRNP A1B dans les neurones. Puisque très peu est répertorié sur la hnRNP A1B, il a fallu tout d’abord déterminer des partenaires d’interaction. Ainsi, une immunoprécipitation utilisant un anticorps spécifique à la hnRNP A1B suivi d'une spectrométrie de masse (IP-MS) a été réalisée sur la moelle épinière de souris. Les résultats soulèvent que de nombreux interacteurs de la hnRNP A1B sont associés au trafic intracellulaire dépendant du cytosquelette. Les interactions avec KLC1/KIF5C/Myh9/DyncIHI ont été validées par des tests d'immunoprécipitation et de colocalisation. Aussi, l’impact de certains mutants hnRNP A1B associés à la SLA ont été étudiées au niveau des interactions avec les protéines motrices. Des expériences visant à évaluer comment la hnRNP A1B peut être transportée, ainsi que réguler le transport, sont en cours. Les résultats confirment que la hnRNP A1B peut avoir une fonction cytosolique dans les neurones pour le transport axonal/dendritique de l'ARNm. Des études futures exploreront cette nouvelle fonction dans le contexte de la SLA. / RNA-binding proteins (RBPs) assemble into cytoplasmic complexes with mRNAs to control mRNA local translation and axonal transport. These processes are essential for maintaining neuronal survival and their impairment is implicated in the development of many neurodegenerative diseases, such as ALS. We have discovered that TDP-43 depletion, linked to ALS, drives the accumulation of an alternatively spliced variant of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1 (hnRNP A1). This isoform, termed hnRNP A1B, has an elongated prion-like domain (PrLD) and is present in neuronal processes, while hnRNP A1 is not. This finding supports a hypothesis that hnRNP A1B may have a cytosolic function in neurons that is not shared with hnRNP A1. In addition, hnRNP A1 and hnRNP A1B are mutated in rare cases of familial ALS with some mutations specific to hnRNP A1B. To date, the literature has mostly focused on the hnRNPA1 isoform and little is known about hnRNP A1B function. Thus, this study aims to identify and characterize the cytosolic function of hnRNP A1B in neurons. Since very little is known about hnRNP A1B, it was first necessary to identify interaction partners of the protein. Thus, immunoprecipitation using an antibody specific to hnRNP A1B followed by mass spectrometry (IP-MS) was performed on mouse spinal cord. Our results show that many hnRNP A1B interactors are associated with cytoskeletal-dependent intracellular trafficking. We then proceed to validate the interactions with the motor proteins KLC1/KIF5C/Myh9, by immunoprecipitation and proximity ligation assays. In addition, some hnRNP A1B ALS mutants were studied in the context of these interactions. Experiments to evaluate how hnRNP A1B may be transported, as well as regulate transport are currently underway. Our findings support that hnRNP A1B may have a cytosolic function in neurons in mRNA axonal/dendritic transport. Future studies will explore this novel function in the ALS context.

A travers cette thèse, nous montrons l'importance de la modélisation et de la coopération de métaheuristiques pour la résolution de problèmes réels en bioinformatique. Pour ce faire, deux problèmes ont été étudiés : le premier dans le domaine de la protéomique pour l'identification de protéines à partir de données spectrales et le second dans le domaine de l'analyse structurale de molécules pour le problème du docking moléculaire flexible. Ainsi, pour le premier problème, un nouveau modèle basé sur une comparaison directe des bases de données protéiques avec les données expérimentales brutes a été mise en place. L'approche associée a été intégrée au sein d'un moteur d'identification par empreinte de masse peptide appelé ASCQ_ME. Ce modèle d'identification a permis ensuite de proposer et de valider une modélisation pour le problème de " de novo protein sequencing " qui consiste à retrouver la séquence d'une protéine à partir seulement des données expérimentales. Il s'agit d'un modèle en trois étapes appelé SSO pour " Sequence ", " Shape " et " Order ". Après une étude de chacune de ces étapes, SSO a été implémenté et testé à travers trois métaheuristiques collaborant de manière séquentielle. Pour le second problème, une étude des nouvelles modélisations multi-objectives a été menée et a conduit à la définition d'un ensemble de huit modèles différents testés à l'aide d'algorithmes génétiques multi-objectifs parallèles. Une douzaine de configuration d'opérateurs génétiques ont été testé afin de mettre en évidence l'efficacité de l'hybridation des algorithmes génétiques avec des recherches locales. Pour chacune des parties, l'implémentation et la mise en place des collaborations fut possible grâce à la plateforme ParadisEO et notamment grâce à mes contributions à la partie ParadisEO-MO dédiée aux métaheuristiques à base de solution unique. L'ensemble de ces travaux a été soutenu par le PPF BioInformatique de l'Université des Sciences et Technologies de Lille et le projet ANR Dock.

Le colza est une oléagineuse très exigeante en soufre (S). L'étude des impacts de limitations en S sur la physiologie du colza et sa qualité grainière revêt un intérêt majeur dans un contexte de baisse des dépôts atmosphériques entrainant un appauvrissement des sols en S. Les objectifs étaient donc d'étudier l'incidence d'une limitation en S sur la physiologie de jeunes feuilles, et sur la qualité, le métabolisme soufré et la vigueur germinative des graines. L'analyse physiologique (photosynthèse, flux de S par utilisation de traceur ³⁴S-sulfate), protéomique et biochimique (métabolites S, espèces réactives de l'O₂) a démontré qu'une limitation en S provoque des perturbations du métabolisme carboné et soufré de la feuille et de la graine, pouvant affecter la qualité grainière. Ainsi, une restriction en S au stade rosette se traduit par la chute de l'activité photosynthétique des jeunes feuilles et conduit à un stress oxydatif. Des restrictions en S à différents stades reproducteurs altèrent la qualité protéique et lipidique de la graine aboutissant à une accumulation amoindrie des acides oléique, linoléique, linolénique et des protéines de stockage (SSPs) riches en S. Une accumulation accrue de SSPs pauvres en S permet un maintien de la teneur en protéines de la graine en cas de restriction survenant en fin de cycle. L'accumulation de S dans les protéines de la graine apparaît principalement contrôlée par la synthèse protéique. La vigueur germinative des graines produites est réduite en cas de restriction précoce en S. Ces travaux ont également permis de démontrer que le péricarpe et la graine en développement sont capables d'assimiler le sulfate par la voie réductrice.

Cette thèse préparée au CEA Leti, Minatec Campus, Grenoble, et à l’IMS, Bordeaux, s’inscrit dans le thème du traitement de l’information pour des données protéomiques. Nous cherchons à reconstruire des profils protéiques à partir des données issues de chaînes d’analyse complexes associant chromatographie liquide et spectrométrie de masse. Or, les signaux cibles sont des mesures de traces peptidiques qui sont de faible niveau dans un environnement très complexe et perturbé. Ceci nous a conduits à étudier des outils statistiques adaptés. Ces perturbations peuvent provenir des instruments de mesure (variabilité technique) ou des individus (variabilité biologique). Le modèle hiérarchique de l’acquisition des données permet d’inclure ces variabilités explicitement dans la modélisation probabiliste directe. La mise en place d’une méthodologie problèmes inverses permet ensuite d’estimer les grandeurs d’intérêt. Dans cette thèse, nous avons étudié trois types de problèmes inverses associés aux opérations suivantes: 1. la quantification de protéines cibles, vue comme l’estimation de la concentration protéique, 2. l’apprentissage supervisé à partir d’une cohorte multi-classe, vu comme l’estimation des paramètres des classes, et 3. la classification à partir des connaissances sur les classes, vue comme l’estimation de la classe à laquelle appartient un nouvel échantillon.La résolution des problèmes inverses se fait dans le cadre des méthodes statistiques bayésiennes, en ayant recours pour les calculs numériques aux méthodes d’échantillonnage stochastique (Monte Carlo Chaîne de Markov). / This thesis has been prepared at the CEA Leti, Minatec Campus, (Grenoble, France) and the IMS (Bordeaux, France) in the context of information and signal processing of proteomic data. The aim is to reconstruct the proteomic profile from the data provided by complex analytical workflow combining a spectrometer and a chromatograph. The signals are measurements of peptide traces which have low amplitude within a complex and noisy background. Therefore, adapted statistical signal processing methods are required. The uncertainty can be of technical nature (instruments, measurements) or of biological nature (individuals, “patients”). A hierarchical model, describing the forward problem of data acquisition, allows for includingexplicitly those variability sources within the probabilistic model. The use of the inverse problem methodology, finally, leads us to the estimation of the parameters of interest. In this thesis, we have studied three types of inverse problems for the following applications:1. quantification of targeted proteins, seen as estimation of the protein concentration,2. supervised training from a labelled cohort, seen as estimation of distribution parameters for each class,3. classification given the knowledge about the classes, seen as estimation of the class a biological sample belongs to.We solve these inverse problems within a Bayesian framework, resorting to stochastic sampling methods (Monte Carlo Markov Chain) for computation.