Utilizando as técnicas de imunoistoquímica e densitometria óptica, foi investigada a localização e a expressão da proteína c-Fos no SNC do caracol Megalobulimus abbreviatus. Neurônios imunorreativos foram encontrados nos gânglios cerebrais, pedais, parietal direito e visceral de caracóis submetidos ao estímulo térmico aversivo (50oC), e sacrificados em diferentes tempos (3, 6, 12, 18 e 24 h) após a estimulação. A análise da imunorreatividade à c-Fos através do método de medida da densidade óptica (DO) revelou uma diferença significativa no sentido de apresentar uma maior expressão (p<0,05) na área do lobo pedal do pós-cérebro do gânglio cerebral em relação às outras regiões analisadas no mesmo gânglio (mesocérebro, pró-cérebro e lobo pleural do pós-cérebro). Além disso, também houve expressão significativamente maior (p<0,05) quando comparada a densitometria da região do mesocérebro em relação ao lobo pleural do pós-cérebro nos grupos controle, 3h e 18h. O lobo pleural do pós-cérebro apresentou uma expressão significativamente menor (p<0,05) na imunorreatividade da proteína c-Fos quando comparado ao pró-cérebro em animais sacrificados 12h e 24h após e estímulo aversivo. Em relação ao grupo controle, a DO da proteína c-Fos não variou nos diferentes tempos de sacrifício quando comparada a mesma região do gânglio (cerebral, pedal, parietal direito ou visceral) ao longo do tempo na maioria das regiões. A única diferença estatisticamente significativa (p<0,05) foi encontrada no mesocérebro do gânglio de animais sacrificados 12 h após o estímulo térmico aversivo, mostrando uma diminuição da imunorreatividade. Nos animais tratados com salina (1ml) ou morfina (20mg/kg) 15 min antes do estímulo térmico aversivo, os mesmos grupos neuronais nos gânglios do SNC de M. abbreviatus mostraram imunomarcação à proteína c-Fos. Em relação ao grupo controle, observou-se uma expressão significativamente menor (p<0,01) na DO da imunorreatividade da proteína c-Fos nos neurônios anteriores do gânglio pedal nos animais sacrificados 3 h e 6 h após o estímulo térmico aversivo. No momento em que a comparação foi feita entre os grupos salina e morfina de animais sacrificados ao mesmo tempo, na grande maioria dos grupos observou-se uma diminuição na imunorreatividade da proteína c-Fos. Esta diferença, porém, mostrou-se significativa (p<0,01) no mesocérebro de animais do grupo 3h, no lobo pedal do pós cérebro de animais dos grupos 3 h, 6 h e 18 h, nos neurônios anteriores do gânglio pedal nos grupos 6 h e 12 h, nos neurônios mediais do gânglio pedal do grupo 3 h, nos neurônios posteriores do gânglio pedal do grupo 6 h, nos neurônios da região anterior do gânglio parietal direito no grupo 12 h e nos neurônios do gânglio visceral no grupo experimental 12 h. A diferença na DO da proteína c-Fos apresentou uma diminuição extremamente significativa (p<0,001) nos neurônios mediais do gânglio pedal de animais sacrificados 12 h após o estímulo térmico aversivo, nos neurônios posteriores do gânglio pedal dos animais sacrificados 12 h após o estímulo e nos neurônios do gânglio visceral dos animais do grupo experimental 6 h. A partir destes dados e da correlação com estudos realizados em M. abbreviatus para detecção de mediadores químicos envolvidos na nocicepção, podemos concluir que as áreas imunorreativas que apresentaram estas variações na densidade óptica da imunorreatividade à proteína c-Fos em diferentes tempos de sacrifício e tratamento com morfina estão envolvidas no processo nociceptivo neste caracol.

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2017-06-20T13:18:42Z No. of bitstreams: 1 Izaura Maria Barros de Lorena Rezende.pdf: 1142755 bytes, checksum: 8149545ca8d3ba83a3bdaebf94c34202 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-20T13:18:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Izaura Maria Barros de Lorena Rezende.pdf: 1142755 bytes, checksum: 8149545ca8d3ba83a3bdaebf94c34202 (MD5) Previous issue date: 2015-10-29 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Three experiments were conducted at the Poultry Module Agricultural Sciences Center of the Federal University of Paraíba - Campus Areia - PB, in order to determine the appropriate level of crude protein in diets for broilers at three housing stages, initial ( 1 to 10 days), growth (11 to 21 days) and final (22 to 42 days). In each experiment were used 720, 648 and 540 female broilers of the "Cobb" bread, according to the animal stage, distributed in a completely randomized design with six treatments and six repetitions with 20, 18 and 15 birds respectively. Treatments consisted in providing diets formulated based on digestible amino acids containing six different dietary protein levels. We evaluated the performance data (weight gain, feed intake and feed conversion) and carcass characteristics (carcass, breast, thighs, the thighs, the back, wings, liver, gizzard, the heart and abdominal fat yields). We also evaluated body composition of these animals. Data were subjected to analysis of variance and regression using the computer program ASSISTAT 7.7. beta (SILVA; Azevedo, 2008) to study the effect of different levels of protein. For the first experiment, the protein level did not affect feed intake. However, it was observed a quadratic effect affecting the weight gain and feed conversion, and estimated levels of crude protein that provided the best results in weight gain and feed conversion: 22.1% and 21.91% respectively. The carcass and cuts yields were not influenced by CP levels, however, the relative weights of the liver and gizzard were higher in birds fed high levels of PB. The body composition variables of the birds showed no significant effect on the parameters of ash and moisture. However, showed significant linear effect in the studied parameters protein and fat, in view of the decrease of muscle ether extract with reduced level of crude protein in the feed. However, birds fed 19% CP were more efficient in protein deposition and thereby, excreted less nitrogen in the environment. In the second experiment, it was observed linear effect of CP levels on weight gain, feed intake and feed conversion of the birds, with the level of 22.8%, 17.8% and 22.8% crude protein respectively. It was not observed effect of treatments on carcass traits and body composition at 21 days. But when it evaluated the efficiency and utilization of crude protein, it was found that the level of 17.8% CP showed better results, but not there among treatments, a significant difference to the deposition of crude protein in the carcass. There was a linear effect on consumption and nitrogen excretion with protein reduction. For the experiment III, was not observed effect of reduced CP levels on performance parameters, carcass yield, however, abdominal fat showed a linear effect when it reduced the dietary crude protein, which presented more with the level of 15.5% CP. Thus, depending on the breeding of birds stage, you can use the concept of ideal protein for improving the performance variables and carcass yield. / Três experimentos foram conduzidos no Módulo de Avicultura do Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal da Paraíba – Campus Areia - PB, com o objetivo de determinar o nível adequado de proteína bruta em rações para frangos de corte fêmeas em três fases de criação, inicial (1 a 10 dias), crescimento (11 a 21 dias) e final (22 a 42 dias). Em cada experimento foram utilizados 720, 648 e 540 frangos de corte fêmeas da linhagem “Cobb”, de acordo com as fases de criação das aves, distribuídos em um delineamento inteiramente ao acaso, com seis tratamentos e seis repetições com 20, 18 e 15 aves respectivamente. Os tratamentos consistiram no fornecimento de dietas contendo seis diferentes níveis de proteína bruta (PB) da dieta. Foram avaliados dados de desempenho (ganho de peso, consumo de ração e conversão alimentar) e as características de carcaça (rendimento de carcaça, de peito, de coxas, de sobrecoxas, de dorso, de asas, de fígado, de moela, do coração e da gordura abdominal) e de composição corporal e penas. Em cada experimento foi realizada as análises de digestibilidade da matéria seca e da proteína bruta das dietas. Os dados foram submetidos à análise de variância e regressão para estudar o efeito dos diferentes níveis de proteína. Para o experimento I, o nível de proteína não afetou o consumo de ração. No entanto, observou-se que o ganho de peso e conversão alimentar foram influenciados de forma quadrática, sendo os níveis estimados de proteína bruta que forneceram os melhores resultados no ganho de peso e conversão alimentar: 22,1% e 21,91 %, respectivamente. O rendimento de carcaça e de cortes não foram influenciados pelos níveis de PB, porém, os pesos relativos do fígado e da moela foram maiores nas aves alimentadas com níveis mais altos de PB. Houve efeito linear significativo nos parâmetros de proteína e gordura estudados, tendo em vista o decréscimo do extrato etéreo muscular com a redução do nível de proteína bruta da ração. Contudo, as aves alimentadas com 19% PB foram mais eficientes na deposição de proteína e com isso, excretaram menos nitrogênio no ambiente. No experimento II, foi observado efeito linear dos níveis de proteína bruta sobre o ganho de peso, consumo de ração e conversão alimentar das aves. Não foi constatado efeito dos tratamentos nas características de carcaça e composição química corporal aos 21 dias. Porém, quando se avaliou a eficiência e utilização da proteína bruta, constatou-se que o nível de 17,8% PB apresentou melhores resultados, mas não havendo entre os tratamentos, diferença significativa para a deposição de proteína bruta nas carcaças. Houve efeito linear no consumo e excreção de nitrogênio com a redução proteica. Para o experimento III, não foi observado efeito da redução dos níveis de PB sobre os parâmetros de desempenho e rendimento de carcaça, entretanto, a gordura abdominal apresentou efeito linear com a redução de PB dietética, onde se apresentou maior com o nível de 15,5% PB. Logo, dependendo da fase de criação das aves, é possível utilizar o conceito de proteína ideal por melhorar as variáveis de desempenho e do rendimento de carcaça.

As septinas compõem o quarto componente do citoesqueleto das células eucarióticas, atrás da actina, miosina e filamentos intermediários. São proteínas filamentosas que se arranjam em forma de fibras e anéis, desempenhando um papel estrutural na célula. Os seres humanos expressam 13 septinas, que são divididas em 4 grupos diferentes de acordo com sua estrutura primária: grupo I (SEPT3, SEPT9, SEPT12); grupo II (SEPT6, SEPT8, SEPT10, SEPT11, SEPT14); grupo III (SEPT1, SEPT2, SEPT4, SEPT5) e grupo IV (SEPT7), sendo que SEPT13 foi caracterizada como um pseudogene de SEPT7. O filamento fisiológico mais bem estudado é composto por SEPT2-SEPT6-SEPT7-SEPT9 (nesta exata sequência), e é usado como a base para a descrição da formação canônica, onde se acredita que septinas do mesmo grupo ocupam o mesmo lugar no filamento. Entretanto, ensaios de duplo-híbrido identificaram muitas interações não canônicas inesperadas entre septinas como SEPT9-SEPT6 e SEPT9-SEPT8, sugerindo estes também possam existir in vivo. Além destes, estudos mostraram a existência de interações entre septinas do grupo I e grupo II, e especialmente no caso SEPT11-SEPT12, a interação deixa de existir ao inserir uma mutação sítio-dirigida na interface G destas proteínas. O presente trabalho investiga a interação entre SEPT3, uma septina do grupo I, com todas aquelas do grupo II. Esta interação foi estudada por análises de coexpressão e copurificação em resina de afinidade ao cobalto, onde apenas a SEPT3 possuía uma extensão de seis histidinas em seu N-terminal. Esta primeira análise mostrou que SEPT3 não foi copurificada com todos os membros do grupo II dando uma clara evidência de variação de afinidade dentro do grupo. Usando esta abordagem, SEPT6, SEPT10 e SEPT14 não mostraram interação com SEPT3, enquanto SEPT8 e SEPT11 copurificaram com SEPT3, mas não em concentrações estequiométricas. Para os complexos SEPT3-SEPT8 e SEPT3-SEPT11, uma segunda etapa de purificação foi realizada por meio de cromatografia de exclusão molecular, onde um pico de grande variância em relação à média indicou um valor de massa molecular entre monômeros e dímeros. Os mesmos, quando avaliados por espalhamento de luz a múltiplos ângulos mostraram variação na massa molecular ao longo do pico de eluição conforme ele era eluído. Tal variação era compatível com a eluição de dímeros no início até monômeros no final. Os estudos da interação entre SEPT3-SEPT8 por ultracentrifugação analítica indicou uma tendência de associação em altas concentrações das proteínas, compatível com a constante de dissociação determinada por termoforese em microescala, na ordem de dezenas de micromolar. Tais resultados levantaram questões acerca da relevância fisiológica destes complexos e reforçam a importância de um estudo mais aprofundado na formação dos complexos não canônicos de septinas para o desenvolvimento celular. / The septins are accepted to be the fourth cytoskeleton component of the eukaryotic cells, after actin, myosin and intermediate filaments. They are filament forming proteins that are organized in fibers and rings, having a structural role in the cell. Humans express 13 septins, which are divided into 4 different groups according to their primary structure: group I (SEPT3, SEPT9, SEPT12); group II (SEPT6, SEPT8, SEPT10, SEPT11, SEPT14); group III (SEPT1, SEPT2, SEPT4, SEPT5) e group IV (SEPT7). SEPT13 was later characterized as a SEPT7 pseudogene. The best characterized filament is built up from SEPT2-SEPT6-SEPT7-SEPT9 (in this exact sequence), and is used as a basis for the description of the so-called canonical arrangement, which accepts that septins from the same group can occupy the same position within the filament. However yeast two-hybrid assays identified several unexpected interactions such as SEPT9-SEPT6 and SEPT9-SEPT8, raising the possibility that these could also exist in vivo. Furthermore, studies have shown the existence of interactions between group I and group II, and especially in the SEPT11-SEPT12, the interaction dissolves when a mutation in the G interface is inserted. The present work investigates the interaction between SEPT3, a group I septin, with all of those from group II. This interaction was studied through co-expression and co-purification methods using metal affinity chromatography, where only the SEPT3 contained the six histidines extention. This initial analysis showed that SEPT3 did not co-purify with all group II members, clearly pointing to variability in the affinity within group. Using this approach SEPT6, SEPT10 e SEPT14 showed no interaction with SEPT3, whilst SEPT8 and SEPT11 co-purified with SEPT3, but not in stoichiometric concentrations. For the SEPT3-SEPT8 and SEPT3-SEPT11 complexes, a second purification stage was performed using size exclusion chromatography, where a broad peak was observed corresponding to a molecular mass value which was intermediate between a dimer and a monomer. The same complexes, when evaluated by multiple angle light scattering revealed a variation in the molecular mass across the peak as it eluted. Such variation was compatible with elution of dimers at the beginning and monomers at the end. Studies for the SEPT3-SEPT8 interaction via analytical ultracentrifugation suggested a trend to associate in high protein concentration, consistent with the dissociation constant found by microscale thermophoresis, which was of the order of ten micromolar. The results raise questions concerning the physiological relevance of these complexes and reinforce the importance of further studies on the non-canonical assembly of septin complexes for cellular development.

As metaloproteases AAA/FtsH são componentes chave do controle da qualidade das proteínas inseridas nas membranas de mitocôndrias e cloroplastos. Em Arabidopsis thaliana, as proteases FtsH presentes nas membranas dos tilacóides formam um complexo heterohexamérico composto pelas subunidades FtsH1/FtsH5 (tipo A) e FtsH2/FtsH8 (tipo B). Este complexo está envolvido na reciclagem de proteínas foto-danificadas, especialmente da proteína D1, centro de reação do PSII. Algumas linhas de evidências indicam ainda que existe um limiar de concentração das proteases FtsH, necessário para a correta formação e desenvolvimento dos cloroplastos. Apesar da extensiva caracterização genética e molecular das proteases FtsH, o mecanismo regulatório do complexo FtsH dos cloroplastos não foi totalmente elucidado até o momento, contudo existem evidências de que a sua ativação pode estar relacionada a alta incidência luminosa e a outras condições de estresse. A presença de fatores proteicos auxiliares, foi testada como hipótese alternativa por nosso grupo, através do uso da protease FtsH5 como isca em um ensaio de duplo híbrido de leveduras. Este ensaio identificou uma proteína interagente putativa, nomeada FIP (FtsH5 Interacting Protein), a qual comprovadamente interage com FtsH5 e está localizada nas membranas dos tilacóides. De modo a investigar o papel regulatório putativo de FIP sobre a atividade do complexo FtsH, nós analisamos os padrões de expressão em uma ampla gama de condições de estresse a partir de dados públicos de microarranjos de DNA. Os perfis de expressão indicam que FIP pode ser um regulador negativo da atividade do complexo. Os resultados também sugerem que o complexo pode estar envolvido na resposta do cloroplasto a diferentes tipos de condições de estresse. O estudo da história evolutiva das proteínas interagentes FtsH5 e FIP evidenciou que as sequências homólogas a FIP são encontradas exclusivamente em musgos e plantas superiores, sugerindo assim que a origem de FIP pode estar relacionada a colonização terrestre. Todos os genes codificantes das proteases FtsH do complexo foram usados como \"query\" na busca por sequências homólogas, permitindo a classificação das proteases FtsH nos tipos A e B por inferência filogenética Bayesiana. Análises filogenéticas Bayesianas também foram feitas para FIP e as proteases FtsH tipos A e B, independentemente. A análise Mirrortree suportou a existência de coevolução entre FIP e as proteases FtsH tipo A. Por outro lado, nenhuma correlação foi encontrada entre FIP e as proteases FtsH tipo B, o que corrobora nossas observações experimentais anteriores. Além disso, o agrupamento portador de homólogos FIP pôde ser recuperado em uma filogenia mais completa das proteases FtsH do tipo A. Análises subsequentes mostraram que ambas as proteínas interagentes estão extensivamente sobre seleção negativa e que proteases FtsH tipo A são bastante conservadas, principalmente nos seus domínios internos. / Eukaryotic AAA/FtsH metalloproteases display a key role in the protein quality control of membrane-inserted proteins in mitochondria and chloroplasts. In Arabidopsis thaliana, chloroplast thylakoidal membranes FtsH proteases form a heterohexameric complex made by FtsH1/FtsH5 (type A) and FtsH2/FtsH8 (type B) subunits. This complex is involved in protein turnover of photo-damaged proteins, in particular the D1 protein at the PSII reaction center. Several lines of evidence also indicate that a FtsH threshold level is necessary for the proper formation and development of chloroplasts. Despite extensive genetic and molecular characterization of the FtsH proteases, the regulatory mechanism of the FtsH complex in chloroplasts has not yet been fully elucidated, however, there are evidences that its activation might be related to high light incidence and other stress conditions. The presence of auxiliary protein factors, as an alternative hypothesis, was tested by our group, through the use of the protease FtsH5 as bait in a yeast two-hybrid assay. This essay identified a putative interacting protein named FIP (FtsH5 Interacting Protein), which has been proved to interact with FtsH5 and be located at the thylakoid membranes. In order to investigate a putative regulatory role of FIP on FtsH complex activity, we analyzed gene expression patterns in a wide range of stress conditions from public DNA microarray data. The expression profiles indicate that FIP could be a negative regulator of the FtsH complex activity. The results also suggest that the complex may be involved in the chloroplast response to different types of stress conditions. In order to shed some light on the evolutionary history of FtsH5 and FIP interacting proteins, we have shown that FIP\'s homologous sequences were exclusively found in mosses and higher plants, suggesting that FIP origin might be related to the plant terrestrial colonization. All Arabidopsis FtsH complex-encoding genes were used as \"query\" sequences in search for homologous sequences, allowing us to classify the FtsH proteases in type A and B by Bayesian phylogenetic inference. Bayesian phylogenetic analyses were also run for FIP and FtsH types A and B proteases, independently. Mirrortree analysis supported coevolution between FIP and type A FtsH proteases. On the other hand, no correlation was found between FIP and type B FtsH homologues, which support our previous experimental observations. In addition, the FIP bearing cluster could be recovered in a more complete type A FtsH phylogeny. Subsequent analyzes have shown that both interacting proteins are extensively under negative selection and that type A FtsH are very conserved, mainly in its inner domains.

Orientador: Orientador : Kleber Gomes Franchini / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-21T12:58:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cardoso_AlissonCampos_D.pdf: 4487510 bytes, checksum: eec48cf16c52d89f7324a6a56476ca59 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Durante os primeiros dias do desenvolvimento pós-natal, os miócitos cardíacos perdem a capacidade de proliferação, sendo o crescimento adicional do coração decorrente de hipertrofia e não hiperplasia dos miócitos cardíacos. No entanto, em situações de estresse os miócitos cardíacos diferenciados podem apresentar desdiferenciação e reestabelecimento do ciclo celular. Os mecanismos envolvidos nesse fenômeno são ainda pouco compreendidos. No presente estudo, demonstramos que a ativação do fator de transcrição MEF2C (Myocyte Enhancer Factor 2-C) tem papel crítico no processo de desdiferenciação de miócitos cardíacos. Essa conclusão foi obtida por meio de experimentos de ganho de função pela superexpressão de MEF2C em miócitos ventriculares de ratos neonatos em cultura (MVRNs). Demonstramos que a superexpressão de MEF2C em MVRNs induziu a desdiferenciação e a ativação de mecanismos envolvidos na progressão do ciclo celular. Esses resultados foram obtidos por meio de experimentos de microarranjo de DNA, PCR em tempo real, western blotting e análise do fenótipo celular por microscopias de luz, confocal e eletrônica de transmissão. Esses fenômenos foram atenuados pela superexpressão da quinase de adesão focal (FAK), uma proteína que reconhecidamente exerce efeitos pró-hipertróficos em miócitos cardíacos adultos. Experimentos in vivo e in vitro demonstraram a interação direta entre o fator de transcrição MEF2C e a FAK. Estudos com base em ensaios de reação cruzada associada à espectrometria de massas, dinâmica molecular, espalhamento de raios-X a baixos ângulos e mutação sítio dirigida, demonstraram que as hélices 1 e 4 do domínio FAT da FAK interagem diretamente com a domínio de ligação ao DNA do dímero de MEF2C. Estudos de afinidade e de gel shift demonstraram que a porção FAT da FAK desloca a interação MEF2C/DNA in vitro. Ensaios de gene repórter demonstraram que a FAK, mediada pela região C-terminal, diminui a atividade transcricional de MEF2C em células C2C12. O conjunto de dados demonstra que a ativação do fator de transcrição MEF2C em MVRNs induz a desdiferenciação e ativação de mecanismos de progressão do ciclo celular e que a FAK impede esses efeitos através da interação inibitória no domínio de ligação de MEF2C ao DNA / Abstract: During the first days of postnatal development, cardiac myocytes lose their ability to proliferate, and the further growth of the heart is due to hypertrophy and not hyperplasia of cardiac myocytes. However, in response to stress, cardiac myocytes may have dedifferentiation and re-establishment of the cell cycle. The mechanisms involved in this phenomenon are still poorly understood. In the present study, we demonstrated that activation of the transcription factor MEF2C (myocyte enhancer factor 2-C) plays a critical role in the process of dedifferentiation of cardiac myocytes. This conclusion was obtained by gain-of-function experiments through overexpressing MEF2C in neonatal rat ventricular myocytes in culture (NRVMs). We also showed that overexpression of MEF2C in NRVMs induced the dedifferentiation and activation of mechanisms involved on cell cycle progression. These results were obtained by DNA microarray experiments, real time PCR, western blotting and cell phenotype analysis by light microscopy, confocal and electronic transmission. These effects were attenuated by overexpression of focal adhesion kinase (FAK) protein known to exert pro-hypertrophic effects on adult cardiac myocytes. In vivo and in vitro experiments demonstrated the direct interaction between the transcription factor MEF2C and FAK. A model based on crosslinking technology coupled with mass spectrometry, small angle X-ray scattering and the site directed mutation analyses indicated that alpha-helices 1 and 4 of FAK FAT domain interacts directly with the DNA binding domain of MEF2C dimer. Affinity studies and gel shift assay demonstrated that the FAK FAT domain displaces the MEF2C/DNA interaction in vitro. Reporter gene assays demonstrated that FAK, mediated by the C-terminal region, decreases the transcriptional activity of MEF2C in C2C12 cells. The data set shows that the activation of the transcription factor MEF2C in MVRNs induces dedifferentiation and activation of cell cycle progression and that FAK prevents these effects by inhibitory interaction with DNA binding domain of MEF2C / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutor em Ciências

Orientador: Nilson Ivo Tonin Zanchin / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T22:37:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Morello_LuisGustavo_D.pdf: 80024877 bytes, checksum: 1848ac9901b4322b786b1dcd7a521a69 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Estudos prévios realizados em nosso laboratório demonstraram a interação entre as proteínas humanas SBDS e NIP7. SBDS participa da biogênese de ribossomos e sua deficiência está associada à síndrome de Shwachman- Bodian-Diamond. NIP7 é uma proteína conservada e já foi caracterizada em levedura, onde participa da formação da subunidade ribossomal 60S. Neste trabalho, nós investigamos o papel de NIP7 na síntese de ribossomos em células humanas. A depleção de NIP7 revelou defeitos no processamento do pré-rRNA associado à produção do rRNA 18S, causando déficit na formação da subunidade ribossomal 40S. Essa divergência de resultados entre a função de NIP7 em levedura e células humanas é consistente com o fato de que NIP7 humana não complementa levedura deficiente em Nip7p. Ainda, um rastreamento em sistema de duplo-híbrido tendo NIP7 humana como isca revelou parceiros de interação diferentes daqueles reportados para Nip7p em levedura. FTSJ3 foi a parceira isolada com maior frequência. FTSJ3 é a provável ortóloga de Spb1p em levedura, a qual está envolvida na formação da subunidade ribossomal 60S. A associação entre FTSJ3 e NIP7 foi demonstrada por ensaios de pull-down e imunoprecipitação, como sendo dependente de RNA. A co-localização nucleolar e co-sedimentação dessas proteínas em fracionamento em gradiente de sacarose corroboram a associação. Além disso, células humanas deficientes em FTSJ3 revelaram defeitos na via de maturação do rRNA 18S, mesma via afetada pela depleção de NIP7. Em adição, a caracterização proteômica de complexos contendo FTSJ3 e NIP7 revelaram que essas proteínas co-purificam complexos pré-ribossomais. Uma comparação entre o conjunto de proteínas que interagem com Spb1p e as proteínas identificadas nos ensaios de pull-down com FLAG-FTSJ3 revelou que elas apresentam apenas um ortólogo em comum, o qual, incrivelmente, é Nip7/NIP7. Essas observações revelaram diferenças significativas na função desses fatores durante a síntese de ribossomos em levedura e células humanas, adicionando NIP7 e FTSJ3 na lista crescente de fatores com funções divergentes nas vias de processamento do rRNA em levedura e humanos / Abstract: Previous studies from our laboratory have demonstrated the interaction between the SBDS and NIP7 human proteins. SBDS play a role in ribosome biogenesis and its deficiency is associated to the Shwachman-Bodian-Diamond syndrome. NIP7 is a conserved protein and has already been characterized in yeast, where it participates in the 60S ribosomal subunit formation. In this work, we investigated the role of NIP7 in ribosome biogenesis in human cells. NIP7 knockdown caused pre-rRNA processing defects associated to the 18S rRNA maturation, leading to deficiency in 40S ribosomal subunit synthesis. The divergence between NIP7 function in yeast and human cells is further supported by the fact that human NIP7 does not complement yeast deficient in Nip7p. In addition, a two-hybrid screen using human NIP7 as bait revealed interaction partners different from those reported for yeast Nip7p. FTSJ3 was isolated as one of the most frequent human NIP7-interacting candidates. FTSJ3 is a putative ortholog of yeast Spb1p, which has been implicated in 60S ribosomal subunit synthesis. The association between FTSJ3 and NIP7 was showed by pull-down and immunoprecipitation assays as an RNA-dependent interaction. Nucleolar colocalization and co-sedimentation on a sucrose gradiente fractionation corroborate this association. Furthermore, RNAi-mediated knockdown revealed that depletion of FTSJ3 causes pre-rRNA processing defects in the pathway leading to 18S rRNA maturation, the same pathway affected by NIP7 downregulation. In additon, proteomic characterization of FTSJ3- and NIP7- containing complexes showed that these proteins copurify pre-ribosomal complexes. A comparison of the set of Spb1p-interacting proteins with the proteins identified in the pulldown with FLAG-FTSJ3 showed that they share only one ortholog which, incredibly, is Nip7/NIP7. These observations revealed significant differences in the function of these factors during the synthesis of ribosomes in yeast and human cells, adding NIP7 and FTSJ3 to the growing list of factors with different functions in yeast and human rRNA processing pathways / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:28:11Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo2996_1.pdf: 1090235 bytes, checksum: c9df39a664777bc77995e62019585122 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2009 / Informações de interações de proteínas são fundamentais para a compreensão dos processos celulares. Por esta razão, várias abordagens têm sido propostas para inferir sobre pares de proteínas de redes de todos os tipos de dados biológicos. Nesta tese é proposto um método de bi-clustering, Lbic, baseado num modelo de classificação logística, para analisar dados biológicos binários. O Lbic é comparado com outros dois métodos de bi-clustering apresentados na literatura, mostrando melhores resultados. Seu desempenho também é comparado àqueles de um método supervisionado, análise de correlação canônica com Kernel, aplicado aos mesmos conjuntos de dados. Os resultados mostram que o Lbic alcança desempenho superior aos da aborgadem supervisionada treinada com até 25% do conhecimento da rede alvo

Orientadores: Marcelo Menossi Teixeira, Ricardo Aparicio / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-27T14:13:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Soares_JoseSergiodeMacedo_D.pdf: 4995080 bytes, checksum: ad3458f447f7044749e0ee6cb95f4315 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O agronegócio da cana de açúcar movimenta cerca de R$ 40 bilhões por ano no Brasil. A cadeia produtiva da cana de açúcar como atividade na economia é responsável por 1,5% do produto interno bruto (PIB) nacional e um dos principais componentes econômicos é a quantidade de sacarose acumulada nos colmos. No entanto, a síntese de sacarose e sua acumulação em plantas superiores é o resultado do produto de uma extensa rede de interações. Quando descarregada nas células do parênquima de armazenamento, a sacarose é metabolizada por diferentes enzimas, sendo a UDP-glucose pirofosforilase (UGPase) uma das enzimas responsáveis pela síntese de sacarose em cana de açúcar. O objetivo deste trabalho foi avaliar o padrão de expressão do gene ScUGPase-1 e os mecanismos regulatórios que controlam a atividade da proteína UGPase de cana de açúcar. Análises por RT-qPCR revelaram que a expressão do gene ScUGPase-1 diminui ao longo da maturação dos colmos e o gene é mais expresso nos entrenós em comparação com o tecido de folha. Porém, nenhuma diferença de expressão significativa foi observada entre dois cultivares contrastantes em teor de sacarose. In vivo, a localização subcelular da proteína ScUGPase-1 indicou uma associação à membrana nos tecidos de folha e colmo. Utilizando anticorpo primário fosfo-específico, observamos a fosforilação da proteína ScUGPase-1 apenas na fração solúvel e microssomal do tecido de folha. In vitro, a proteína ScUGPase-1 formou um complexo com a proteína recombinante caseína quinase 1 (CK1) e sua atividade foi afetada por agentes óxido-redutores. Para complementar os dados de óxido-redução, análises de espalhamento de luz a baixo ângulo (SAXS) forneceram o primeiro modelo estrutural do dímero da proteína ScUGPase-1 em solução, destacando que a interface de dimerização está localizada na região C-terminal. Os dados indicam que a fosforilação, interação protéica e oligomerização podem exercem um papel importante na regulação da proteína ScUGPase-1 durante a síntese de sacarose em cana de açúcar. / Abstract:The sugarcane agribusiness generates around R$ 40 billion per year in Brazil, while the entire supply chain of sugarcane is responsible for 1.5% of the gross domestic product (GDP). Sugarcane productivity is mainly determined by the accumulation of sucrose in the culms. However, the synthesis and accumulation of sucrose in plants is the result of an extensive network. When sucrose is unloaded in the storage parenchyma cells, it is metabolized by different enzymes, and UDP-glucose pyrophosphorylase (UGPase) is one of the enzymes responsible for the synthesis of sucrose in sugarcane. The objective of this work was to gain insights on the ScUGPase-1 expression pattern and the regulatory mechanisms that control protein activity. ScUGPase-1 transcript levels were negatively correlated with sucrose content in the internodes and only a slight difference in the expression pattern was observed between two cultivars that differ in their sucrose content. The intracellular localization of ScUGPase-1 indicated association with membranes in both leaves and internodes. Using a phospho-specific antibody, we observed that ScUGPase-1 was phosphorylated in vivo in the soluble and membrane fractions from leaves, but not from internodes. In vitro, the purified recombinant enzyme interacted with recombinant protein casein kinase 1 and its activity was affected by redox modification. To complement the redox data, Small-Angle X-ray Scattering provided the first structural model of the dimer of sugarcane UGPase in solution, highlighting that the dimer interface is located at the C-terminal. The data indicated that phosphorylation, protein interaction and oligomerization may play an important role in the regulation of ScUGPase-1 activity / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Domínio proteico é uma sequência de aminoácidos evolutivamente conservada e funcionalmente independente. Um dos aspectos mais importantes do estudo de uma proteína que contem múltiplos domínios é o entendimento da comunicação, entre os diferentes domínios, e seu papel biológico. Essa comunicação em maior parte é feita pela interação direta entre domínios. A interação poderia ser tratada como uma clássica interação proteína-proteína. Entretanto, proteínas multidomínio possuem restrições determinadas por suas regiões conectoras. Os conectores interdomínio impõem restrições e limitam espaço conformacional dos domínios. Apresentamos aqui o MAD, uma rotina capaz de obter modelos tridimensionais de alta resolução para proteínas, contendo qualquer número de domínios, a partir de sua sequencia primária. Os domínios conservados são identificados utilizando a base de domínios conservados (CDD) e seus limites são utilizados para definir as regiões conectoras. É criado um ensamble de possíveis dobramentos dos conectores e sua distribuição de distâncias C/N-terminais são utilizadas como restrição espacial na busca pela interação entre os domínios.Os modelos dos domínios são obtidos por uma modelagem comparativa. Foi implementada uma heurística, capaz de lidar com a natureza combinatorial dos múltiplos domínios e com a necessidade imposta pela limitação computacional de realizar o docking dos domínios em forma de pares. Todas combinações de domínios são submetidas as rotinas de docking. Aplica-se filtro de distância e energético, excluindo as conformações que apresentam distância C/N-terminal entre domínios maior do que o valor máximo observado no ensamble de conectores e seleciona as conformações energeticamente mais favoráveis. As conformações são submetidas a uma rotina de agrupamento hierárquico baseada em sua similaridade estrutural. Para a segunda fase as conformações selecionadas são pareadas com seu domínio complementar e ressubmetidas a rotina de docking até que todas as fases tenham sido completadas. Foi criado um conjunto de testes a partir do Protein Data Bank contendo 54 proteínas multidomínio para que a rotina de docking do MAD fosse comparada com outros softwares utilizados pela comunidade cientifica, mostrou-se superior ou equivalente aos métodos testados. A capacidade de utilizar dados experimentais foi demostrada através da proposição de um modelo da forma ativa da enzima tirosina fosfatase 2, nunca observado experimentalmente. A rotina de docking foi expandida paralelamente em uma aplicação standalone e utilizada na resolução de diversos problemas biológicos. Concluímos que a inovação metodológica proposta pelo MAD é de grande valia para a modelagem molecular e tem potencial de gerar uma nova perspectiva a respeito da interação de proteína multidomínio, visto que é possível analisar essas proteínas em sua plenitude e não como domínios separados. / Protein domain is an evolutionary conserved and functionally independent amino acid sequence. One of the most important aspects of the study of a protein that contains multiple domains is the understanding of communication between the different areas, and their biological role. This communication is made mostly by direct interaction between domains. The interaction could be treated as a classical protein-protein interaction. However, multidomain proteins have certain restrictions for its connector regions. The intra connectors impose restrictions and limit conformational space of the domains. We present the MAD, a routine able to get three-dimensional models of high-resolution protein, containing any number of domains, from its primary sequence. The conserved domains are identified using the basic conserved domains database (CDD) and its boundaries are used to define the connector regions. This creates a ensemble of possible folding of the connectors and distribution of distances C/N-terminals are used as spatial restriction in the search for interaction between domains.Os models of the domains are obtained by comparative modelling. A heuristic able to handle the combinatorial nature of the multiple areas and the need imposed by the computer to perform the limitation of the docking areas as pairs was implemented. All combinations of domains are referred to the docking routines. Distance and energy filters are applied, excluding conformations that have C/N-terminal domains distances larger than the maximum value observed in the connectors ensemble and selects the most favourable energy conformations. Conformations are subjected to hierarchical clustering routine based on their structural similarity. For the second phase, the selected conformations are paired with its complementary domain and resubmitted to the docking routine until all phases have been completed. A test set has been created from the Protein Data Bank containing 54 multidomain proteins so that the docking routine of MAD could be compared with other software used by the scientific community, it has been shown to be superior or equivalent to the tested methods. The ability to use experimental data was demonstrated by proposing a model of the active form of tyrosine phosphatase enzyme 2, never observed experimentally. The docking routine was expanded in a standalone application and used in solving various biological problems. We conclude that the methodological innovation proposed by the MAD is very useful for molecular modelling and has the potential to generate a new perspective on multidomain protein interaction as you can analyse these proteins in its entirety and not as separate domains.

La corvina es una especie carnívora que se ha incorporado a la producción de la acuicultura en el Mar Mediterráneo, por sus altos índices de crecimiento y calidad de la carne. Por la poca información nutricional existente para esta especie, se ha introducido en su producción la experiencia que ya se tiene en la dorada y la lubina. Los objetivos de esta tesis doctoral fue determinar las necesidades nutritivas de la corvina y estudiar la inclusión del turtó de soja como una fuente proteica vegetal alternativa de la harina de pescado. Para determinar las necesidades de proteína y energía se trabajó con un pienso comercial, se experimentó con dos grupos de peces (53 y 200 g), en donde se aplicó un modelo factorial, obteniendo que las necesidades de mantenimiento para la proteína fue de 0,0617 g PD 100 g pez-1 día-1 y para la energía de 2.74 kJ ED 100 g pez-1 día-1. Las necesidades para el máximo crecimiento de la proteína fue de 0,64 g PD 100 g pez-1 día-1 y de energía 38.5 kJ ED 100 g pez-1 día-1. Con peces de 52 g, se realizó el estudio del efecto de los niveles de la proteína digestible (35%, 43%, 49% y 53%), los peces alimentados con piensos con niveles de 43%, 49% y 53% de proteína digestible, obtuvieron los mejores crecimientos (Coeficiente térmico de crecimiento = 2,47, 2,57 y 2.69 x 10-3, respectivamente). El nivel óptimo de proteína digestible ingerida para juveniles de corvina fue de 0,8 g PD 100 g pez-1 día-1. Para determinar la relación Proteína/Energía se experimentaron con peces de 147 g en jaulas marinas y fueron alimentados con piensos de 47/20, 51/28 y 55/17, obteniendo los mejores crecimientos e índices de conversión con el pienso 47/20. Para estudiar la inclusión del turtó de soja en la corvina se realizaron dos fases de investigación. En una primera fase se utilizaron 800 peces de 165 g, durante 107 días fueron alimentados con cuatro piensos isoproteíco (50% de proteína bruta) e isolípidico (17% de grasa bruta), con niveles de inclusión del 0, 15, 30 y 45% de turtó de soja. En los piensos del 15 y 30% de turtó de soja se obtuvieron los mejores resultados y de acuerdo a la regresión cuadrática el nivel óptimo de inclusión de turtó de soja fue del 27.6%. La relación entre el porcentaje de aminoácidos esenciales de la dieta y el porcentaje de aminoácidos esenciales a nivel corporal de los peces presentó deficiencias en arginina, lisina, treonina y principalmente de metionina. En la segunda fase se utilizó la misma metodología que en el primer experimento, pero utilizando 300 peces de 346 g de media durante 26 días. Los resultados muestran que la corvina presentó un alto crecimiento (Coeficiente térmico de crecimiento = 4,00 x 10-3) y se recomienda una inclusión de turtó de soja de entre un 30 ¿ 45%. En base a los resultados obtenidos, se propone un pienso para Argyrosomus regius de 47% de proteína bruta, 17% de grasa bruta y un 30% de inclusión de turtó de soja, suplementado con metionina y lisina, con el fin de obtener altos crecimientos, disminuir el uso de la harina de pescado y hacer más rentable la producción acuícola de esta especie en el Mar Mediterráneo / Velazco Vargas, JL. (2014). Contribución al estudio de las necesidades nutritivas de la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801) [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/35446 / TESIS