Orientador: Ana Marisa Fusco Almeida / Coorientador: Maria José Soares Mendes Giannini / Banca: Alexandra Ivo de Medeiros / Banca: Maria Lúcia Taylor da Cunha e Mello / Resumo: Histoplasma capsulatum var. capsulatum é um fungo dimórfico que causa a histoplasmose, uma micose respiratória e sistêmica. H. capsulatum é primariamente adquirido após a exposição ao aerosol, pela inalação de microconídeos ou fragmentos de hifas. A evolução da doença respiratória depende da capacidade da levedura de Histoplasma em sobreviver e se replicar dentro dos macrófagos alveolares. Neste contexto, é conhecido que a adesão às células do hospedeiro constitui o primeiro passo para a colonização e é essencial para o estabelecimento da infecção. Em vista disso, alguns microrganismos aderem às superfícies biológicas e não biológicas formando biofilmes. Biofilmes são comunidades dinâmicas de microrganismos, que aderidos às superfícies, produzem uma matriz exopolimérica e essa formação representa um estado que permite que as células microbianas sobrevivam em ambientes hostis e dispersem para colonizar novos nichos. Com base na importância potencial de biofilmes para sua sobrevivência no hospedeiro humano e na natureza, este trabalho foi desenvolvido para investigar pela primeira vez a formação de biofilme por H. capsulatum correlacionando com sua capacidade em aderir às células epiteliais, bem como definir particularidades da interação entre macrófagos e H. capsulatum, incluindo análise de fragmentação nuclear pelo ensaio do cometa e TUNEL. Os ensaios foram realizados in vitro com duas cepas clínicas de H. capsulatum, uma isolada no México e a outra no Brasil. Além disso, foi realizada análise proteômica diferencial do fungo em biofilme e sob a condição planctônica. Os resultados mostraram que H. capsulatum é capaz de formar biofilmes e ambos os isolados selecionados tem uma alta capacidade em aderir aos pneumócitos (A549). Através de análise proteômica, o isolado EH-315 exibiu diferentes perfis protéicos, com aproximadamente... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Histoplasma capsulatum var. capsulatum is a dimorphic fungus that causes histoplasmosis, a respiratory and systemic mycosis. H. capsulatum is primarily acquired after exposure to the aerosol, by microconideas or hyphal fragments inhalation. The development of a respiratory disease depends on the ability of Histoplasma yeast to survive and replicate within alveolar macrophages. In this context, it is known that the adhesion to host cells is the first step in the colonization and is essential for the establishment of the infection. As a result, some microorganisms adhere to biological and non-biological surfaces producing biofilms. Biofilms are dynamic communities of microorganisms that adhere to surfaces producing an exopolimeric matrix, and this formation is a state that allows microbial cells to survive in hostile environments and to disperse to colonize new niches. Based on the potential importance of biofilms to survive in the human host and in nature, this study was performed to investigate, for the first time, the biofilm formation by H. capsulatum correlating with their ability to adhere to epithelial cells, as well as defining features of the interaction between macrophages and H. capsulatum, including analysis of nuclear fragmentation by comet assay. In addition, we performed differential proteomic analysis of the fungus in biofilm and under planktonic conditions. The results demonstrated that H. capsulatum is able to form biofilms and both selected isolates have a high ability to adhere to pneumocytes (A549). Through proteomic analysis, the EH-315 isolate exhibited different protein profiles, with approximately 250 proteins exclusively expressed in the biofilm format and others with different levels of expression when compared to the fungus in planktonic growth. The sequencing by MALDI-TOF/TOF revealed that most proteins are nuclear or are involved in the metabolism... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Lucilene Delazari dos Santos / Coorientador: Rui Seabra Ferreira Junior / Banca: Mario Sérgio Palma / Banca: Marília Afonso Rabelo Buzalaf / Resumo: Desde o advento da nova era da abordagem proteômica, a identificação de assinaturas moleculares individuais em vários sistemas biológicos pela pesquisa básica tem impulsionado a descoberta de biomarcadores diretamente relacionados a aplicações terapêuticas, promovendo desenvolvimento de testes diagnósticos clínicos mais específicos. Neste contexto, a necessidade da aplicação clínica estimula a pesquisa de bancada, sendo que novas tecnologias permitem novas descobertas e podem se transformar em prognósticos efetivos, medicamentos inéditos ou mais eficazes e/ou testes diagnósticos mais específicos. Os bubalinos tem sido alvo de muitas iniciativas econômicas e de pesquisas translacionais. Uma vez que, seu plasma sanguíneo é rico em fibrinogênio, búfalos da espécie Bubalus bubalis raça Murrah, se tornaram doadores primordiais de matéria-prima para o desenvolvimento de insumos biológicos, como por exemplo, o selante de fibrina derivado do veneno de serpentes e do sangue de bubalinos produzido pelo Centro de Estudos de Venenos e Animais Peçonhentos (CEVAP). Para tal, se fez necessário melhor compreender a composição do plasma sanguíneo e do crioprecipitado destes bubalinos, a fim de dar suporte à pesquisas futuras que envolverão a identificação de marcadores moleculares de doenças infecciosas que podem acometer estes animais doadores. Este trabalho foi dividido em duas partes: a primeira destaca-se os achados prévios e significância da bubalinocultura, a utilização do sangue de animais para o desenvolvimento de bioinsumos na saúde animal e humana, a produção e aplicação de diversos selantes de fibrina, o uso da abordagem proteômica como estratégia investigativa para a prospecção de biomarcadores moleculares de doenças infecciosas e uma breve descrição das principais técnicas analíticas empregadas pela abordagem proteômica. A segunda parte deste trabalho, destaca-se a caracterização proteica do... / Abstract: Since the advent of the new era of proteomics approach, the identification of individual molecular signatures in various biological systems for basic research has driven the discovery of biomarkers directly related to therapeutic applications, promoting the development of more specific clinical diagnostic tests. In this context, the need for clinical application stimulates the bench study, which new technologies and new discoveries can become effective prognostic, or novel drugs more effective and/or more specific diagnostic tests. The bubaline have been targets of several economic initiatives and translational research. Since its plasma is rich in fibrinogen, Bubalus bubalis water buffalos (Murrah) have became main donors of raw material for the development of biological insumes, as example, the fibrin sealant from snake venoms and water buffalos blood produced by The Center for the Studies of Venoms and Venomous Animals (CEVAP) at UNESP. Then, it was necessary to better understand the composition of the blood plasma and cryoprecipitate these buffalo, in order to support future research will involve the identification of molecular markers of infectious diseases that can affect these donor animals. This study was divided into two parts: the first stands up the previous findings and significance of buffalo, the use of animal blood for developing bioinsumes in animal and human health, the production and application of several fibrin sealants, the use proteomics approach as a research strategy for the discovery of molecular biomarkers of infect diseases and a brief description of the analytical methods used by proteomics approach. The second part of this work brings the protein characterization of blood plasma and cryoprecipitate of B. bubalis healthy buffalo, where have evidenced 17 groups of major proteins involved in the signaling pathway of the complement system and the cascade coagulation / Mestre

Orientador: Maria Stella Gonçalves Raddi / Coorientador: Iracilda Zeppone Carlos / Banca: Clarice Queico Fujimura Leite / Banca: Emanuel Carrilho / Banca: Fernanda de Freitas Anibal / Banca: Paulo Inácio da Costa / Resumo: Helicobacter pylori é o principal agente etiológico causador da gastrite crônica, úlcera péptica, adenocarcinoma e linfoma gástrico. Concentrações subinibitórias de antimicrobianos podem modificar os fatores de virulência da bactéria e, consequentemente, a relação micro-organismo/hospedeiro, podendo alterar a progressão da infecção. Este estudo avaliou fatores de virulência de H. pylori cultivados em ½ e ¼ da concentração inibitória mínima de amoxicilina que poderiam alterar a liberação de citocinas, indução de óxido nítrico e apoptose em macrófagos RAW 264.7 infectados. A análise proteômica foi realizada por eletroforese bidimensional e a identificação das proteínas diferencialmente expressas através da digestão por tripsina e espectrometria de massas A indução de óxido nítrico foi analisada através do reagente de Griess, as citocinas (interleucina - 1 beta, interleucina - 6, interleucina - 10, interleucina - 12, fator de necrose tumoral alfa e fator transformador de crescimento - beta) por ensaio imunoenzimático e apoptose por citometria, após 24 horas de infecção. Nossos resultados demonstraram que H. pylori previamente mantidos em sub-CIMs de amoxicilina apresentaram maior expressão de proteínas de choque térmico, enolase, argininosuccinato sintase, superóxido dismutase, ATP alfa sintase e proteína ativadora de neutrófilo, proteínas capazes de aumentar a indução de NO, IL - 1 β e IL - 12 e apoptose em relação à macrófagos infectados com H. pylori sem tratamento. Estes resultados sugerem que a amoxicilina em concentrações subinibitórias pode estimular a resposta imune no hospedeiro através da indução de alguns fator ... / Abstract: The infection caused by Helicobacter pylori is considered a major etiology agent in chronic gastritis, peptic ulcer, gastric carcinoma and gastric lymphomas. Sub-inhibitory concentrations of antibiotics have been shown to change virulent expression of microorganisms, which may change the progression of infection. This study assessed virulence factors of H. pylori after contact with ½ and ¼ the minimal inhibitory concentration of amoxicillin subinhibitory concentrations of amoxicillin that could modify the induction of cytokines, nitric oxide and apoptosis by infect RAW 264.7 macrophage-like cells. The proteomic analysis was realized by two dimensional electrophoresis and proteins differential expressions were characterized by tryptic digestion and mass spectroscopy. The induction of nitric oxide was assayed by Griess reagent, cytokines (interleukin - 1 beta, interleukin - 6, interleukin - 10, interleukin - 12, tumor necrosis factor alpha and transforming growth factor - beta) by Enzyme-Liked Immunoabsorbent Assay and apoptosis by annexin V - fluorescein isothiocyanate after 24 hours. Our results demonstrated that H. pylori previously maintained in sub - MICs of amoxicillin showed higher expression of virulence factors such as heat shock proteins, enolase, argininosuccinate synthetase, superoxide dismutase, ATP synthase alpha and neutrophil-activating protein inducing more oxide nitric, interleukin - 1β and interleukin - 12 and increased apoptosis than macrophages infected with H. pylori without treatment. These results suggest that amoxicillin, at sub-inhibitory concentrations, could contribute to the stimulation of immune response in the ... / Doutor

Orientador: Pedro de Magalhães Padilha / Banca: Luciana Fleury / Banca: Lincoln de Oliveira / Resumo: Este trabalho apresenta os resultados de fracionamento de proteínas ligadas ao mercúrio em amostras de músculo de tucunaré (Cichla spp.) e filhote (Brachyplatystoma filamentosum) oriundos do complexo hidrelétrico de Jirau, na Bacia do Rio Madeira, região amazônica do Brasil. O proteoma do músculo dessas espécies foi separado por eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida (PAGE 2D). O mercúrio presente nos spots proteicos foi determinado por espectrometria de absorção atômica em forno de grafite (GFAAS) após mineralização ácida assistida por banho de ultra-som. Os spots proteicos que apresentaram mercúrio foram caracterizados por espectrometria de massas por ionização com eletrospray em sequência (ESI- MS/MS) após digestão tríptica. As determinações GFAAS indicaram que 65% do mercúrio está ligada à fração proteica com massa molar (Mm) inferior a 90 kDa. As concentrações de mercúrio nos spots apresentaram-se na faixa de 13,60 - 17,10 mg g-1. Com base nas concentrações de mercúrio, foi possível estimar que os spots proteicos continham aproximadamente um átomo de mercúrio por molécula de proteína. A análise por ESI-MS / MS permitiu caracterizar em dez spots proteicos as seguintes proteínas e/ou enzimas: parvalbumina-2 (Mm = 12,40, pI = 3,80); parvalbumina alfa (Mm = 12,40, pI = 3,80); parvalbumina beta (Mm = 12,40, pI = 3,80); ubiquitina-40S proteína ribossômica S27a (Mm = 11,60, pI = 6,10); GTP cyclohydrolase 1 proteína reguladora de feedback (Mm = 13,00, pI = 4,00) e proteína de transmembrana 186 (Mm = 14,00, pI = 4,70). / Abstract: This paper presents the results of mercury fractionation in muscle samples of tucunaré (Cichla spp.) and filhote (Brachyplatystoma filamentosum) from the JIRAU Hydroelectric Power Plant in the Madeira River Basin in the Amazon region of Brazil. The proteome of the fishes muscle was separated by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2D PAGE). The mercury present in the protein spots was determined by graphite furnace atomic absorption spectrometry (GFAAS) after acid mineralization in an ultrasound bath. The protein spots in which the presence of mercury was detected were characterised by electrospray ionisation tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS) after tryptic digestion. The GFAAS determinations indicated that 65% of the mercury was linked to the protein fraction with a molar mass (Mm) of less than 90 kDa. The mercury concentration in the eleven spots in this protein fraction was present were in the range 13.60 to 17.10 mg g-1. Based on mercury concentrations, it was possible to estimate that the protein spots contained approximately one atom of mercury per protein molecule. Analysis by ESI-MS / MS protein allowed the characterization of ten spots as proteins and / or following enzymes: parvalbumin-2 (MW = 12.40, pI = 3.80); parvalbumin alpha (Mm = 12.40, pI = 3.80); parvalbumin beta (Mm = 12.40, pI = 3.80); ubiquitin-40S ribosomal protein S27a (Mm = 11.60, pI = 6.10); GTP cyclohydrolase 1 regulatory protein of feedback (Mm = 13.00, pI = 4.00) and transmembrane protein 186 (Mm = 14.00, pI = 4.70). / Mestre

Acanthamoeba spp. são patógenos protistas de vida livre, capazes de causar ceratite grave e encefalite granulomatosa fatal. Trofozoíto é a forma infectiva de Acanthamoeba spp. e pode provocar infecções em uma variedade de hospedeiros mamíferos e seres humanos, como resultado da complexa interação patógeno-hospedeiro. O dano causado por trofozoítos em infecções da córnea ou do cérebro é o resultado de vários mecanismos patogênicos diferentes não elucidados a nível molecular até agora. Neste trabalho, descrevemos os resultados da caracterização genotípica de isolados ambientais de Acanthamoeba spp. e a identificão por análises proteômicas do repertório de proteínas expressas por trofozoítos de Acanthamoeba polyphaga. Nossos resultados permitiram a caracterização de 13 isolados ambientais de Acanthamoeba spp. obtidos da água de piscinas, que foram classificados em nível de genótipo com base na análise da sequência do gene da subunidade menor do rDNA. Nove dos 13 isolados foram identificados como pertencentes ao genótipo T5, três ao genótipo T4 e um ao genótipo T3. Vários genótipos têm sido relatados em todo o mundo como agentes causadores de ceratite amebiana, incluindo os genótipos T3, T4 e T5. O presente estudo indica que o genótipo T5 é um contaminante comum na água de piscinas. Este trabalho também estabeleceu uma ampla análise do repertório de proteínas expressas por trofozoítos de A. polyphaga, baseado no conjunto de estratégias por 2-DE MS/MS e LC-MS/MS. Foram identificadas 192 proteínas não redundantes. Um mapa proteômico de referência de A. polyphaga na faixa de pH 3-10 foi produzido e de 370 spots resolvidos, 136 proteínas foram identificadas. A classificação funcional das proteínas revelou diversas proteínas com relevância potencial para a sobrevivência do parasita e infecção de hospedeiros mamíferos, incluindo proteínas de superfície e proteínas relacionadas aos mecanismos de defesa. Este estudo descreveu a primeira análise proteômica abrangente do estágio de trofozoíto de Acanthamoeba spp. e fornece bases para estudos prospectivos, comparativos e funcionais de proteínas envolvidas nos mecanismos moleculares de sobrevivência, desenvolvimento e patogenicidade de Acanthamoeba spp. / Acanthamoeba spp. are free-living protist pathogen, capable of causing a blinding keratitis and fatal granulomatous encephalitis. Trophozoite is the form infective of Acanthamoeba spp. and can provoke infections in a variety of mammalian hosts and humans, as result of complex interaction host-pathogen. The damage caused by trophozoites in human corneal or brain infections is the result of several different pathogenic mechanisms not elucidated at the molecular level so far. Here, we describe the results of the characterization genotypic of environment isolates of Acanthamoeba spp. and we performed proteomic analysis to identify the repertoire of proteins expressed by trophozoites of an environmental strain of Acanthamoeba polyphaga. Our results allowed the characterization of 13 Acanthamoeba isolates from swimming pools water that were classified at the genotype level based on the sequence analysis of the small-subunit rDNA gene. Nine of the 13 isolates were genotype T5, three were genotype T4, and one was T3. Several genotypes have been reported worldwide as causative agents of keratitis, including genotypes T3, T4, and T5. The present study indicates that genotype T5 is a common contaminant in swimming-pool water. This work also established a comprehensive analysis of the proteins expressed by A. polyphaga trophozoites based on complementary 2-DE MS/MS and gel-free LC-MS/MS approaches. Overall, 192 nonredundant proteins were identified. An A. polyphaga proteomic map in pH range 3-10 was produced, with protein identification for 136 out of 370 resolved spots. Functional classification of identified proteins revealed several proteins with potential relevance for parasite survival and infection of mammal hosts, including surface proteins and proteins related to defense mechanisms. This study describes the first comprehensive proteomic survey of the trophozoite infective stage of an Acanthamoeba species, and provides foundations to prospective, comparative and functional studies of Acanthamoeba proteins involved in molecular mechanisms of survival, development, and pathogenicity.

Submitted by Luiz Felipe Barbosa (luiz.fbabreu2@ufpe.br) on 2015-03-13T14:43:13Z No. of bitstreams: 2 Vladimir da Mota Silveira Filho - Tese PPGG.pdf: 7570223 bytes, checksum: 939c1f76d28cf506a0b7eff7badba469 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-13T14:43:13Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Vladimir da Mota Silveira Filho - Tese PPGG.pdf: 7570223 bytes, checksum: 939c1f76d28cf506a0b7eff7badba469 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012-03-15 / CPqAM CAPES CNPq Serviço de Referência em Peste / A peste, zoonose causada pela bactéria Yersinia pestis, continua sendo uma ameaça mundial. Como outras enfermidades relacionadas à pobreza, a peste é considerada uma doença negligenciada nos países tropicais, incluindo Brasil, onde ainda há detecção sorológica de atividade pestosa em animais-sentinela nos focos naturais. A ausência de uma vacina segura/efetiva, o surgimento de cepas multirresistentes e a possibilidade de seu uso como arma biológica aumentaram o interesse nos estudos genéticos/epidemiológicos do patógeno. Este trabalho teve como objetivos (1) comparar dois métodos moleculares de tipagem para identificar qual deles é capaz de estabelecer melhor correlação temporal e geográfica entre isolados brasileiros de Y. pestis; e (2) aprofundar os conhecimentos sobre os mecanismos de patogenicidade da bactéria. 25 cepas brasileiras de Y. pestis foram tipadas pela análise de múltiplos locos com número variável de repetições em tandem (MLVA) e pela eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE). A associação entre essas técnicas demonstrou, pela primeira vez, diversidade genética entre cepas brasileiras de Y. pestis. Contudo, apenas MLVA permitiu estabelecer correlação entre os isolados de diferentes eventos epidemiológicos, mostrando-se mais eficiente para tipagem de Y. pestis, em relação ao PFGE. Quatro cepas avirulentas P.CE 882/1R e 32R, P.Exu 369 e 390, e uma cepa controle indiana altamente virulenta (195P) foram comparadas a nível fenotípico, genotípico, transcricional e proteômico, a fim de identificar possíveis causas da perda de virulência. Não foi encontrada diferença fenotípica e genotípica entre os cinco isolados, onde foi detectada a presença dos genes irp2, psn, ybtE (localizados na Ilha de Alta Patogenicidade - HPI), fur, hmsH, YPO2271, YPO2281, sodA, phoP, psaA (cromossomais) e pla, lcrV, ymt, caf1 (plasmidiais). Entretanto, a análise transcricional mostrou diferentes níveis de transcrição dos genes da HPI, apesar de nenhuma alteração estrutural de sequência ter sido detectada. Provavelmente a presença de ferro livre no meio de cultura utilizado ativou a proteína Fur, um regulador transcricional negativo da HPI. A análise quantitativa revelou níveis de transcrição dos genes da HPI acima do esperado nas cepas P.Exu 369 e 390, sugerindo possível disfunção no mecanismo regulatório da captura de ferro. A análise proteômica da subcultura P.CE 882/1R sugere que distúrbios metabólicos decorrentes do subcultivo e/ou estocagem podem estar associados ao fenótipo de avirulência. Estes achados sobre os mecanismos de virulência de Y. pestis poderão contribuir para identificação de alvos importantes para o desenvolvimento de novas vacinas e abordagens terapêuticas contra a peste.

Submitted by Amanda Silva (amanda.osilva2@ufpe.br) on 2015-03-13T15:39:41Z No. of bitstreams: 2 TESE João de Andrade Filho.pdf: 1945201 bytes, checksum: 44d3299355bfac41e74d7acf09a4157a (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-13T15:39:41Z (GMT). No. of bitstreams: 2 TESE João de Andrade Filho.pdf: 1945201 bytes, checksum: 44d3299355bfac41e74d7acf09a4157a (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2014 / CAPES / O Estado de Pernambuco é o segundo maior produtor de cana-de-açúcar da Região Nordeste. Entre os principais fatores que dificultam o incremento na produtividade estão a elevada interação genótipo x ambiente que se expressa na heterogeneidade dos solos, relevos acidentados e irregularidade das chuvas com longos períodos de estiagem. Objetivou-se com este trabalho avaliar o desempenho agroindustrial e proteoma de genótipos RB (República do Brasil) de cana-de-açúcar associado ao estresse hídrico nas microrregiões canavieiras do Estado de Pernambuco. Os experimentos foram conduzidos nas áreas agrícolas das usinas parceiras do Programa de Melhoramento Genético da Cana-de-açúcar da Universidade Federal Rural de Pernambuco integrante da Rede Interunivertária para o Desenvolvimento do Setor Sucroenergético (PMGCA/UFRPE/RIDESA). A estatística genética e os modelos biométricos experimentais: Análise de variância, agrupamento de médias, decomposição da interação genótipo x ambiente e estratificação, estimação de parâmetros genéticos, de adaptabilidade e estabilidade e coeficiente de repetibilidade, foram aplicados. Foram realizadas análises bioquímicas, fisiológicas e moleculares (genômica funcional). As análises biométricas identificaram genótipos promissores a serem cultivados na região canavieira do Estado de Pernambuco contribuindo para um aumento de produtividade, através do coeficiente de repetibilidade verificou-se que é possível, reduzir, em até três anos agrícolas, o tempo de liberação de novos cultivares nas condições edafoclimáticas em estudo. Nos processos fisiológicos, não foram verificados efeitos indesejáveis da depressão endogâmica no clone de autofecundação em relação ao cultivar comercial. Desta forma a autofecundação pode ser utilizada no melhoramento genético da cana-de-açúcar no desenvolvimento de novos genótipos tolerantes ao estresse hídrico.

Submitted by Amanda Silva (amanda.osilva2@ufpe.br) on 2015-04-08T13:05:05Z No. of bitstreams: 2 Dissertação_Tulio_Diego_da_Silva.pdf: 899273 bytes, checksum: fa3051c19d26c20f1582174ad9033bfb (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-08T13:05:05Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação_Tulio_Diego_da_Silva.pdf: 899273 bytes, checksum: fa3051c19d26c20f1582174ad9033bfb (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012 / O tomateiro (Solanum lycopersicum) é uma das principais hortaliças de valor econômico no mundo e é a segunda solanácea mais cultivada, sendo superada apenas pela batata. Essa espécie está sujeita a várias doenças que comprometem seu desenvolvimento, dentre elas está a murcha de fusário, causada pelo fungo de solo Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (Fol). Para está doença o controle químico não é eficiente, assim o uso de cultivares resistentes representa um dos melhores recursos para evitar o prejuízo causado pelo fungo. A proteômica é uma grande ferramenta no estudo de diversos estresses, permitindo a identificação de proteínas alvo no melhoramento genético, a fim de se obter genótipos resistentes. Neste contexto, analisou-se o perfil das proteínas secretadas pelo tomateiro frente ao Fol, para se identificar aquelas que estejam relacionadas com a defesa ao fitopatógeno. Para isso utilizou-se o genótipo BHRS, resistente a isolados da raça 2 do Fol. Coletou-se o tecido radicular da planta, nos tempos 1, 2, 4 e 6 dias após inoculação (DAI). Em seguida as proteínas totais foram extraídas, solubilizadas e separadas por eletroforese bidimensional (2-DE), para posterior identificação via espectrometria de massas. As proteínas do tomateiro apresentam um caráter ácido, não apresentando boa resolução na faixa de pH 3-10. Por isso utilizou-se tiras de pH 4-7 na primeira dimensão da 2-DE. Pode-se reconhecer aproximadamente 500 proteínas diferentes em cada gel e 34 proteinas com expressão diferenciada no experimento. Estas proteínas foram analisadas pelo espectrômetro do tipo MALDITOF/ TOF. As proteínas identificadas foram agrupadas de acordo com os grupos funcionais, para melhor descrever seu papel no metabolismo durante a infecção. Encontraram-se proteínas relacionadas com patogenicidade e relacionadas com a reação de hipersensibilidade. Também foram encontrados proteínas de sinalização, relacionadas com outros mecanismos de defesa e de metabolismo primário. A presença de grupos protéicos relacionados com a resistência a patógenos evidencia alguns dos mecanismos que confere ao genótipo de tomateiro BHRS a qualidade de resistente a fusariose. Entretanto mais estudos são necessários, principalmente nas proteínas de membrana e parede celular, a fim de obter informações sobre a interação inicial entre a planta e o fungo.

Submitted by Caroline Falcao (caroline.rfalcao@ufpe.br) on 2017-04-10T18:11:34Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2012-Tese-VladimirSilveiraFilho.pdf: 7570666 bytes, checksum: acc48aa25629f4c3d970307fc0187b44 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-10T18:11:35Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2012-Tese-VladimirSilveiraFilho.pdf: 7570666 bytes, checksum: acc48aa25629f4c3d970307fc0187b44 (MD5) Previous issue date: 2012-03-15 / A peste, zoonose causada pela bactéria Yersinia pestis, continua sendo uma ameaça mundial. Como outras enfermidades relacionadas à pobreza, a peste é considerada uma doença negligenciada nos países tropicais, incluindo Brasil, onde ainda há detecção sorológica de atividade pestosa em animais-sentinela nos focos naturais. A ausência de uma vacina segura/efetiva, o surgimento de cepas multirresistentes e a possibilidade de seu uso como arma biológica aumentaram o interesse nos estudos genéticos/epidemiológicos do patógeno. Este trabalho teve como objetivos (1) comparar dois métodos moleculares de tipagem para identificar qual deles é capaz de estabelecer melhor correlação temporal e geográfica entre isolados brasileiros de Y. pestis; e (2) aprofundar os conhecimentos sobre os mecanismos de patogenicidade da bactéria. 25 cepas brasileiras de Y. pestis foram tipadas pela análise de múltiplos locos com número variável de repetições em tandem (MLVA) e pela eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE). A associação entre essas técnicas demonstrou, pela primeira vez, diversidade genética entre cepas brasileiras de Y. pestis. Contudo, apenas MLVA permitiu estabelecer correlação entre os isolados de diferentes eventos epidemiológicos, mostrando-se mais eficiente para tipagem de Y. pestis, em relação ao PFGE. Quatro cepas avirulentas P.CE 882/1R e 32R, P.Exu 369 e 390, e uma cepa controle indiana altamente virulenta (195P) foram comparadas a nível fenotípico, genotípico, transcricional e proteômico, a fim de identificar possíveis causas da perda de virulência. Não foi encontrada diferença fenotípica e genotípica entre os cinco isolados, onde foi detectada a presença dos genes irp2, psn, ybtE (localizados na Ilha de Alta Patogenicidade - HPI), fur, hmsH, YPO2271, YPO2281, sodA, phoP, psaA (cromossomais) e pla, lcrV, ymt, caf1 (plasmidiais). Entretanto, a análise transcricional mostrou diferentes níveis de transcrição dos genes da HPI, apesar de nenhuma alteração estrutural de sequência ter sido detectada. Provavelmente a presença de ferro livre no meio de cultura utilizado ativou a proteína Fur, um regulador transcricional negativo da HPI. A análise quantitativa revelou níveis de transcrição dos genes da HPI acima do esperado nas cepas P.Exu 369 e 390, sugerindo possível disfunção no mecanismo regulatório da captura de ferro. A análise proteômica da subcultura P.CE 882/1R sugere que distúrbios metabólicos decorrentes do subcultivo e/ou estocagem podem estar associados ao fenótipo de avirulência. Estes achados sobre os mecanismos de virulência de Y. pestis poderão contribuir para identificação de alvos importantes para o desenvolvimento de novas vacinas e abordagens terapêuticas contra a peste. / Plague, a zoonosis caused by the bacterium Yersinia pestis, remains as a global threat. As other poverty related diseases, plague is considered a neglected disease in tropical countries, including Brazil, where serological activity is still detected in sentinel animals in the natural foci. The lack of safe/effective vaccine and the rise of multiresistant strains and the possibility of its use as a biological weapon increased the interest in genetic/epidemiological studies of this pathogen. This work aimed (1) to compare two molecular typing methods to identify which offers better temporal and geographical correlation among Brazilian Y. pestis isolates; and (2) to further understand the pathogenicity mechanisms of the bacteria. 25 Brazilian strains of Y. pestis were typed by analysis of multiple loci with variable number of tandem repeats (MLVA) and by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). Association between these techniques demonstrated for the first time genetic diversity among Brazilian Y. pestis strains. However, only MLVA allowed establishing a correlation between isolates from different epidemiological events, proving to be more efficient for Y. pestis typing than PFGE. Four avirulent strains P.CE 882/1R and 32R, P.Exu 369 and 390, and a highly virulent Indian control strain (195P) were compared at phenotypic, genotypic, transcriptional and proteomic level in order to identify possible causes of virulence loss. No phenotypic and genotypic difference was found among the five isolates, which detected the genes irp2, psn, ybtE (from the High Pathogenicity Island - HPI), fur, hmsH, YPO2271, YPO2281, sodA, phoP, psaA (chromosomal) and pla, lcrV, ymt, caf1 (plasmidial). However, the transcriptional analysis indicated different transcription levels of the HPI genes, although no structural change on sequence being detected. Probably the presence of free iron in the culture medium activated the protein Fur, a negative HPI transcriptional regulator. Quantitative analysis revealed higher than expected transcription levels of P.Exu 369 and 390 HPI genes, suggesting possible alteration in the iron uptake regulation mechanism. The proteomic analysis of the subcultive P.CE 882/1R suggests that metabolic disturbances resulting from the subculture and/or storage may be associated with avirulence phenotype. Those findings about mechanisms of virulence of Y. pestis may contribute to identify important targets for development of new vaccines and therapies against plague.

Orientadores: Marco Aurelio Zezzi Arruda, Claudio Eduardo Muller Banzato / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-15T06:35:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sussulini_Alessandra_D.pdf: 1708235 bytes, checksum: 9eb972af4e73014944c3fe61c3ed86d5 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: O transtorno afetivo bipolar é uma doença psiquiátrica caracterizada por alterações de humor marcantes, oscilando entre episódios de mania e depressão, que afeta entre 1 a 3% da população mundial. Os mecanismos em nível molecular deste transtorno, assim como de seu tratamento com lítio, que é o medicamento mais utilizado, ainda não são estabelecidos. Assim sendo, o objetivo deste trabalho de Tese consistiu em explorar biomarcadores potenciais (metabólitos, proteínas e íons metálicos livres ou ligados a proteínas) para o transtorno afetivo bipolar e seu tratamento com lítio. Para isso, foi realizada a comparação dos perfis metabonômicos (utilizando espectroscopia de ressonância magnética nuclear de hidrogênio e análise quimiométrica), proteômicos (utilizando eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida e diferentes técnicas de espectrometria de massas molecular) e metalômicos (utilizando espectrometria de massas com fonte de plasma indutivamente acoplado) de amostras de soro sangüíneo de pacientes com transtorno afetivo bipolar utilizando o lítio (n = 15) ou outras drogas excluindo o lítio (n = 10) e de indivíduos saudáveis (n = 25). A análise metabonômica indicou os lipídeos como sendo os metabólitos mais afetados na presença do transtorno afetivo bipolar e do tratamento com lítio, o que corroborou com os resultados da análise proteômica, onde a apolipoproteína A-I foi uma das proteínas que sofreu maior alteração em seus níveis, sendo subexpressa em pacientes bipolares, independentemente do tratamento, porém apresentando uma restauração ao nível do grupo controle após o tratamento com lítio. As análises ionômicas apontaram As, B, Cl, Cr, Fe, K, Li, Mg, P, S, Se, Si, Sr e Zn como os íons livres diferenciais e as análises metaloproteômicas apontaram, principalmente, Ca, Co, Fe, K, Mg, Mn, Na, Ti e Zn ligados a proteínas como sendo os metais que sofreram as maiores alterações na presença do transtorno afetivo bipolar e de seu tratamento com lítio. Dentre as proteínas ligadas a metais que apresentaram diferenças entre os grupos estudados em termos de metais ligados, destacam-se a apolipoproteína A-I, a transtiretina e a vitronectina, que haviam sido identificadas previamente nas análises proteômicas por apresentarem alterações em suas expressões. A partir destes estudos, foi possível identificar, de maneira exploratória, moléculas diferenciais que podem orientar futuros estudos envolvendo os mecanismos patofisiológicos do transtorno afetivo bipolar e de ação terapêutica de drogas como o lítio, bem como na descoberta de biomarcadores para a doença e/ou seu tratamento com lítio / Abstract: Bipolar disorder is a psychiatric illness characterized by marked mood changes, oscillating between mania and depression episodes, which affects 1-3% of the worldwide population. Molecular level mechanisms of this disorder, as well as of its treatment with lithium, which is the most widely used medication, are not yet known. Thus, the aim of this work consisted in explore potential biomarkers (metabolites, proteins, metal ions free or bounded to proteins) for bipolar disorder and its treatment with lithium. For this purpose, it was performed the comparison of metabonomic (using hydrogen nuclear magnetic resonance spectroscopy and chemometric analysis), proteomic (using 2-D gel electrophoresis and different molecular mass spectrometry techniques), and metallomic (using inductively coupled plasma mass spectrometry) profiles for blood serum samples of bipolar disorder patients treated with lithium (n = 15) or other drugs than lithium (n = 10) and healthy individuals (n = 25). Metabonomic analyses indicated lipids as the most affected metabolites in the presence of bipolar disorder and of lithium treatment, which corroborated with the results of proteomic analyses, where apolipoprotein A-I was one of the proteins that showed highest alterations in its levels. It was downregulated in bipolar disorder patients, independently of the treatment, but showed a level restored to that of the control group after lithium treatment. Ionomic analyses detected As, B, Cl, Cr, Fe, K, Li, Mg, P, S, Se, Si, Sr e Zn as differential free ions, and metalloproteomic analyses detected mainly Ca, Co, Fe, K, Mg, Mn, Na, Ti and Zn bound to proteins as being the metals that presented highest alterations in the presence of bipolar disorder and lithium treatment. Among the metal-binding proteins that indicated differences between the studied groups, apolipoprotein A-I, transthyretin and vitronectin, which were previously identified in the proteomic analyses, are highlighted. With the studies described in this research work, it was possible to identify, in an exploratory way, differential molecules that can guide future studies on the patophysiological mechanisms of bipolar disorder or terapeutic action pathways of drugs like lithium, as well as on the discovery of biomarkers for the illness and/or its treatment with lithium / Doutorado / Quimica Analitica / Doutor em Ciências