Arf1 est une petite protéine G (pG), essentiellement impliquée dans le trafic vésiculaire. Arf1 oscille entre deux conformations, l'une active liée au GTP et l'autre inactive associée au GDP. Arno est un des facteurs d'échange (GEF) capable d'activer Arf1 en stimulant l'échange GDP/GTP. Suractivée dans les cellules invasives du cancer du sein, Arf1 joue un rôle important dans la migration et la prolifération des cellules cancéreuses.Le but de ma thèse s'inscrit dans l'étude et la modulation de l'interaction pG-GEF, et plus spécifiquement, le couple Arf1-Arno. Mon travail a été planifié autour de deux axes: (1) L'étude fine de l'interaction entre Arf1 et Arno, et sa modulation avec un inhibiteur connu la Bréféldine A (BFA). (2) La mise en place d'une stratégie de conception d'inhibiteurs de l'interaction protéine-protéine du couple Arf1-Arno.Dans un premier temps, nous avons mis en place une méthode basée sur la résonance plasmonique de surface (SPR) permettant la détermination des paramètres cinétiques de l'interaction entre Arf1 et Arno. Nous avons précisé aussi les conséquences des partenaires allostériques (GDP, GTP, et Mg2+) et de la BFA sur les paramètres cinétiques de l'interaction. Ceci a permis une analyse fine de la régulation allostérique et du mode d'action de la BFA. Appliquée à d'autres inhibiteurs, cette méthode permettra d'examiner leur mécanisme d'inhibition.Dans la deuxième partie j'expose, la stratégie que nous avons utilisé pour la conception rationnelle d'inhibiteur de l'interaction entre Arf1 et Arno. Elle est basée sur le criblage virtuel de fragments au niveau des résidus clé « hotspots » de l'interaction, la validation des molécules-touches par des techniques biophysiques, et l'élimination de molécules artefacts. Les structures des complexes fragments-Arno ont été résolues, ce qui confirme la validité de cette stratégie ouvrant la voie vers l'optimisation moléculaire pour obtenir des inhibiteurs plus efficaces. / Arf1 is a small GTPases, essentially involved in the vesicular traffic. Arf1 switch between two conformations, an active form bound to GTP and an inactive form bound to GDP. Arno is one of the exchange factors (GEF) that can activate Arf1, through its catalytic Sec7 domain, promoting the exchange of GDP by GTP. Activated in breast cancer cells, Arf1 plays an important role in the migration and proliferation of cancer cells.The aim of my thesis was the study and the modulation of the interaction between small G proteins and their GEFs, more precisely the Arf1-Arno interaction. My work has been planned around two axes: (1) the study of the interaction between Arf1 and Arno, and its modulation with a known inhibitor Brefeldin A (BFA). (2) The development of a rational strategy for designing inhibitors of protein-protein interaction for the Arf1-Arno complex.In the first part of my PhD work, we set up a Surface Plasmon Resonance (SPR) method allowing to determine the kinetic parameters of the interaction between Arf1 and Arno. We also studied the effects of allosteric partners such as GDP, GTP and Mg2+ as well as the known uncompetitive inhibitor (Brefeldin A). This SPR approach allowed a very informative analysis at qualitative and quantitative levels of the various complexes taking place during the exchange reaction that should help to solve the inhibitory mechanism for the known inhibitors reported in the literature. In the second part of my thesis, we propose a strategy for targeting the interaction between Arf1and Arno. This approach is based on virtual screening of fragments at hotspot regions. Using biophysical techniques such fluorescence techniques, SPR, NMR and X-Ray crystallography, we identified and validated Hits, showing by crystallographic structural data their modes of interaction with the target protein Arno. A fluorescence polarization test was also developed to identify false positive fragments to eliminate promiscuous aggregators. Taken together, our work proposes a method based on SPR allowing the study of known inhibitors of GEFs, understanding at molecular level their mode of action. We also propose a general strategy for finding Hit fragments that designing competitive inhibitor of the interaction small G protein with its GEFs, that can be the scaffold for designing more powerful inhibitors.

Mass spectrometry (MS) is a rapid, specific and very sensitive analytical method with a broad spectrum of proteomic applications such as protein identification and sequencing, 3D protein structure characterization or study of protein-protein interaction. The introduction of two ionization techniques in late 1980's that are able to ionize the large biomolecules such as proteins, oligosaccharides or nucleic acids with no or low fragmentation has started the rapidly expanding field of MS-based proteomics. The presented thesis was aimed at the application of mass spectrometric approaches to answer several proteomic questions. Firstly we have employed the chemical cross-linking in combination with MS analysis to solve the 3D structure and protein-protein interactions of three model systems: (1) homodimeric human regulatory protein 14-3-3, (2) model of 14-3-3 and regulatory domain of tyrosine hydroxylase, and (3) system of two membrane proteins, cytochrome P450 2B4 and cytochrome b5, involved in xenobiotics biotransformation. This approach works in aqueous solutions under physiological conditions and thus preserves native structure of the investigated proteins. The second part of the thesis was focused on MS identification of proteins/peptides in fungal spores of Aspergillus and Pseudallescheria...

Em eucariotos, o processamento de pré-rRNA depende de vários fatores como endonucleases, exonucleases, RNA helicases, enzimas modificadoras de rRNA e componentes de snoRNPs. Com o objetivo de caracterizar novas proteínas envolvidas no processamento de pré-rRNA, foi identificada a proteína Nop53p interagindo com a proteína nucleolar Nop17p a partir de uma varredura da biblioteca de cDNAs de Saccharomyces cerevisiae. A cepa condicional contendo a seqüência da ORF NOP53 sob controle do promotor de galactose não cresce em meio contendo glicose, indicando que Nop53p seja uma proteína essencial para a viabilidade celular. Os resultados deste trabalho demonstram que Nop53p está envolvida nas etapas iniciais de clivagem do pré-rRNA, assim como nas clivagens responsáveis pela formação dos rRNAs maduros 5.8S e 25S. Análise mais detalhada do processamento de pré-RNA por Northern blot e \"pulse-chase labeling\", revelou também que Nop53p afeta principalmente o processamento do rRNA intermediário 27S, que origina os rRNAs maduros 5.8S e 25S. Nop53p participa do processamento desses rRNAs afetando a poliadenilação dos precursores dos rRNAs 5.8S e 25S. Experimentos de co-imunoprecipitação de RNA com a proteína de fusão ProtA-Nop53p confirmaram o envolvimento de Nop53p no processamento do 27S rRNA, indicando que essa proteína possa ligar RNA diretamente. A capacidade de Nop53p de ligar RNA foi confirmada através de testes in vitro, enquanto que ensaios de co-imunoprecipitação de cromatina revelaram que Nop53p liga-se ao rRNA 5.8S durante a transcrição. Nop53p regula a função do exossomo através da sua interação direta com a subunidade exclusivamente nuclear deste complexo, Rrp6p. / In eukaryotes, the rRNA processing depends on several factors, such as, endonucleases, exonucleases, RNA helicases, rRNA modifying enzymes and components of the snoRNPs. With the purpose of characterizing new proteins involved in pre-rRNA processing, Nop53p was identified interacting with the nucleolar protein Nop17p in a two hybrid assay. The conditional yeast strain containing the sequence of the ORF NOP53 under the control of the galactose promoter cannot grow in medium containing glucose, indicating that the protein is essential for cell viability. The results of this work demonstrate that Nop53p is involved in the initial steps of pre-rRNA processing and in the cleavages responsible for the formation of the mature rRNAs 5.8S and 25S. A more detailed analysis of the pre-rRNA processing, by Northern blot and pulse-chase labeling, revealed that Nop53p affects the processing of the 27S precursor, that originates the rRNAs 5.8S and 25S. Nop53p participates in the processing of these RNAs by affecting the polyadenylation of the precursors of the rRNAs 5.8S and 25S. RNA co-imunoprecipitation assays with the fusion protein A-Nop53p confirmed the involvement of Nop53p in the processing of the 27S pre-rRNA, indicating that the protein may interact directly with the RNA. The capacity of Nop53p to bind RNA was confirmed by in vitro assays, while chromatin imunoprecipitation assays demonstrated that Nop53p binds the 5.8S rRNA co- transcriptionally. Nop53p regulates the function of the exosome by interacting directly with the exclusively nuclear subunit of the complex, Rrp6p.

Neste trabalho estudamos por espalhamento de raios-X a baixos ângulos (SAXS) quatro diferentes sistemas de interesse biológico. Visamos investigar a auto-agregação de proteínas e de complexos proteicos que darão origem a fibras amilóides, interação proteína-proteína, simulando ambientes altamente concentrados, interação proteína-membrana simulando vesículas de matriz extracelular (MVs) de sistemas de biomineralização e interações proteína-agentes desnaturantes. No caso de formação de amilóides, investigamos a agregação do domínio GTPase da septina 6 (SEPT6G) e do complexo formado com o domínio GTPase da septina 2 (SEPT2G-SEPT6G). A temperaturas de até 15°C, tanto SEPT6G quanto SEPT2G-SEPT6G apresentam-se predominantemente diméricas em solução. Já a 25°C, o heterodímero SEPT2G-SEPT6G permanece estável enquanto agregados maiores de SEPT6G evoluem e coexistem em solução com SEPT6G-SEPT6G dimérica, sendo que a proporção de dímeros diminui com a temperatura. No estudo das MVs, mostramos que miméticos lipossomais de DPPC e DPPC:DPPS (9:1) possuem as mesmas características estruturais na ausência e presença de cálcio na solução. A interação da proteína anexina V humana (A5), envolvida em processos de biomineralização, impacta na membrana modelo induzindo a formação de nanoporos. A adição da fosfatase alcalina tecido não-específico (TNAP) não altera as propriedades estruturais do proteolipossomo na presença de A5. A ação do surfactante dodecil sulfato de sódio (SDS) a 30 mM não altera a conformação da albumina soro bovina (BSA), de maneira que é observada a formação de micelas de SDS coexistindo com a proteína livre em solução. Já a adição de 50 mM de SDS induz um desenovelamento parcial da proteína, identificado pela análise das curvas de SAXS via modelo de \"colar de pérolas\". A ação de uréia a 3 M e 8 M promove um desenovelamento parcial e total da BSA, respectivamente, com subsequente agregação de proteína dependente da temperatura (T > 30°C). A adição de 6 mM de SDS em proteínas parcialmente desenoveladas pela ação da uréia promove um desenovelamento mais acentuado. O potencial efetivo resultante da interação entre duas proteínas distintas, BSA e lisozima a concentração total de 100 mg/mL em solução, pH 7.0, foi obtido da análise de curvas de SAXS. Para isto, utilizou-se uma análise simplificada (em primeira aproximação) considerando um potencial efetivo de interação entre BSA-BSA, lisozima-lisozima e lisozima-BSA. Variamos a razão molar BSA:LISO até 1:42. No pH estudado, BSA tem uma carga residual superficial de -11e, enquanto a lisozima possui +9e. Conforme variamos a razão molar BSA:LISO, observamos dois regimes para o potencial efetivo resultante: i) até BSA:LISO 1:2, a carga efetiva do sistema é praticamente nula com um potencial resultante de caráter atrativo e ii) para razões entre BSA:LISO 1:3 a 1:42, a carga efetiva aumenta e o potencial resultante tem caráter repulsivo. Assim, lisozima e BSA coexistem sem agregar, através de um delicado balanço de forças atrativas e repulsivas no sistema. / In this work we have used small-angle x-ray scattering (SAXS) to study four systems of biological interest. We aim to investigate the self aggregation of proteins and protein complexes that would form amyloid fibers; protein/protein interaction, simulating high concentrations; protein/cell-membrane interaction, simulating extracellular matrix vesicles (MVs) from biomineralizing systems; and protein/denaturating-agents interactions. On the case of amyloid formation, we have investigated the aggregation of G-domain of septin-6 (SEPT6G) and the protein complex formed with G-domain of septin-2 (SEPT2G-SEPT6G). At temperatures lower than 15°C, both SEPT6G and SEPT2G-SEPT6G were found predominantly as dimers. At 25°C, SEPT2G-SEPT6G heterodimer is still stable while aggregates of SEPT6G grow. Both coexist in solutions of SEPT2G-SEPT6G dimers, with the percentage of dimers decreasing the higher the temperature. As for the study of MVs, we have shown that DPPC and DPPC:DPPS (9:1) liposomal mimetics have the same structural characteristics at the absence or presence of Calcium. The interaction with human annexin V protein (A5), related to biomineralization processes, affects the model membrane by the creation of nanopores. The addition of tissue-nonspecific alkaline phosphatase (TNAP) does not change the structural properties of the proteoliposome when A5 is present. The addition of SDS surfactant (30 mM) does not alters the conformation of bovine serum albumin (BSA), and we have observed the formation of SDS micelles coexisting with free protein in solution. The addition of 50 mM of SDS, on the other hand, induces the partial unraveling of the protein, as seen by the analysis of SAXS data via the pearl necklace\'\' model. The effect of adding 3M and 8M urea is, respectively, the partial and total unraveling of BSA, with ensuing aggregation of the protein dependent on the temperature (T > 30°C). The introduction of SDS 6mM promotes further unraveling in proteins that were previously partially unraveled by urea. The resulting effective potential for the interaction between BSA and lysozyme at total concentration of 100mg/ml and 7.0 pH has been obtained from the analysis of SAXS curves. In order to obtain this result we have used a simplified analysis (first order approximation) in which were considered the effective potentials for the interactions between BSA-BSA, lysozyme-lysozyme and lysozyme-BSA. We have varied the BSA:LISO molar ratio up to 1:42. At the studied pH, BSA has a surface residual charge of -11e, and lysozyme has +9e. As we changed the BSA:LISO molar ratio, we have found two regimens for the resulting effective potential: i) up to BSA:LISO 1:2, the effective charge of the system is virtually zero and the resulting potential is attractive; and ii) for BSA:LISO between 1:3 and 1:42 the effective charge increases, and the resulting potential is repulsive. Therefore, both lysozyme and BSA coexist without forming aggregates, by a delicate balance of attractive and repulsive forces.

Neste trabalho, analisamos a interação de pequenas moléculas, marcadores hidrofóbicos, com hemoglobina, em diferentes estados: monocristal, pó e solução aquosa. Os métodos de análise empregados, são baseados nas teorias de relaxação em líquidos e técnicas não lineares de ressonância ST-RPE (transferência de saturação), fornecendo informações sobre mudanças locais nas vizinhanças desses marcadores. Um dos marcadores hidrofóbicos, o TEMPO, mostrou uma anisotropia considerável nos espectros de RPE do monocristal de hemoglobina que está relacionado com o empacotamento molecular da proteína do cristal. A associação desses métodos de análise conduziu a importantes informações sobre mudanças na camada de hidratação em várias proteínas: hemoglobina, mioglobina e lisozima, monitoradas pelo marcador covalente derivado da maleimida, e induzidas pela temperatura, sob diferentes condições de hidratação. Desta forma o uso da espectroscopia de RPE especialmente com simulação espectral e DT-RPE mostro ser um método potente e ainda não explorado no estado de hidratação de proteínas / In this work, the interactions of small molecules, hydrophobic spin labels, with hemoglobin, under different states was analysed: single crystal, powder and aqueous solution. The methods of analysis employed, are based in relaxation theory in liquids and non-linear techniques, saturation transfer (ST-EPR), giving informations on the local changes in neighbourhood of the labels. One of the hydrophobic labels, TEMPO, showed a considerable anisotropy in the hemoglobin single crystal spectra, a result related to the molecular packing in the protein single crystal. The association of the techniques of analysis all together lead to important informations an temperature induced changes in the hydration layer in several proteins: hemoglobin, myoglobin, NEM*, a maleimide derivated, in different conditions of hydration. In this way the use of EPR spectroscopy and particularly with spectral simulations and ST-EPR, proved to be a powerful and not yet very much explored method to study the problem of protein hydration

As septinas compõem o quarto componente do citoesqueleto das células eucarióticas, atrás da actina, miosina e filamentos intermediários. São proteínas filamentosas que se arranjam em forma de fibras e anéis, desempenhando um papel estrutural na célula. Os seres humanos expressam 13 septinas, que são divididas em 4 grupos diferentes de acordo com sua estrutura primária: grupo I (SEPT3, SEPT9, SEPT12); grupo II (SEPT6, SEPT8, SEPT10, SEPT11, SEPT14); grupo III (SEPT1, SEPT2, SEPT4, SEPT5) e grupo IV (SEPT7), sendo que SEPT13 foi caracterizada como um pseudogene de SEPT7. O filamento fisiológico mais bem estudado é composto por SEPT2-SEPT6-SEPT7-SEPT9 (nesta exata sequência), e é usado como a base para a descrição da formação canônica, onde se acredita que septinas do mesmo grupo ocupam o mesmo lugar no filamento. Entretanto, ensaios de duplo-híbrido identificaram muitas interações não canônicas inesperadas entre septinas como SEPT9-SEPT6 e SEPT9-SEPT8, sugerindo estes também possam existir in vivo. Além destes, estudos mostraram a existência de interações entre septinas do grupo I e grupo II, e especialmente no caso SEPT11-SEPT12, a interação deixa de existir ao inserir uma mutação sítio-dirigida na interface G destas proteínas. O presente trabalho investiga a interação entre SEPT3, uma septina do grupo I, com todas aquelas do grupo II. Esta interação foi estudada por análises de coexpressão e copurificação em resina de afinidade ao cobalto, onde apenas a SEPT3 possuía uma extensão de seis histidinas em seu N-terminal. Esta primeira análise mostrou que SEPT3 não foi copurificada com todos os membros do grupo II dando uma clara evidência de variação de afinidade dentro do grupo. Usando esta abordagem, SEPT6, SEPT10 e SEPT14 não mostraram interação com SEPT3, enquanto SEPT8 e SEPT11 copurificaram com SEPT3, mas não em concentrações estequiométricas. Para os complexos SEPT3-SEPT8 e SEPT3-SEPT11, uma segunda etapa de purificação foi realizada por meio de cromatografia de exclusão molecular, onde um pico de grande variância em relação à média indicou um valor de massa molecular entre monômeros e dímeros. Os mesmos, quando avaliados por espalhamento de luz a múltiplos ângulos mostraram variação na massa molecular ao longo do pico de eluição conforme ele era eluído. Tal variação era compatível com a eluição de dímeros no início até monômeros no final. Os estudos da interação entre SEPT3-SEPT8 por ultracentrifugação analítica indicou uma tendência de associação em altas concentrações das proteínas, compatível com a constante de dissociação determinada por termoforese em microescala, na ordem de dezenas de micromolar. Tais resultados levantaram questões acerca da relevância fisiológica destes complexos e reforçam a importância de um estudo mais aprofundado na formação dos complexos não canônicos de septinas para o desenvolvimento celular. / The septins are accepted to be the fourth cytoskeleton component of the eukaryotic cells, after actin, myosin and intermediate filaments. They are filament forming proteins that are organized in fibers and rings, having a structural role in the cell. Humans express 13 septins, which are divided into 4 different groups according to their primary structure: group I (SEPT3, SEPT9, SEPT12); group II (SEPT6, SEPT8, SEPT10, SEPT11, SEPT14); group III (SEPT1, SEPT2, SEPT4, SEPT5) e group IV (SEPT7). SEPT13 was later characterized as a SEPT7 pseudogene. The best characterized filament is built up from SEPT2-SEPT6-SEPT7-SEPT9 (in this exact sequence), and is used as a basis for the description of the so-called canonical arrangement, which accepts that septins from the same group can occupy the same position within the filament. However yeast two-hybrid assays identified several unexpected interactions such as SEPT9-SEPT6 and SEPT9-SEPT8, raising the possibility that these could also exist in vivo. Furthermore, studies have shown the existence of interactions between group I and group II, and especially in the SEPT11-SEPT12, the interaction dissolves when a mutation in the G interface is inserted. The present work investigates the interaction between SEPT3, a group I septin, with all of those from group II. This interaction was studied through co-expression and co-purification methods using metal affinity chromatography, where only the SEPT3 contained the six histidines extention. This initial analysis showed that SEPT3 did not co-purify with all group II members, clearly pointing to variability in the affinity within group. Using this approach SEPT6, SEPT10 e SEPT14 showed no interaction with SEPT3, whilst SEPT8 and SEPT11 co-purified with SEPT3, but not in stoichiometric concentrations. For the SEPT3-SEPT8 and SEPT3-SEPT11 complexes, a second purification stage was performed using size exclusion chromatography, where a broad peak was observed corresponding to a molecular mass value which was intermediate between a dimer and a monomer. The same complexes, when evaluated by multiple angle light scattering revealed a variation in the molecular mass across the peak as it eluted. Such variation was compatible with elution of dimers at the beginning and monomers at the end. Studies for the SEPT3-SEPT8 interaction via analytical ultracentrifugation suggested a trend to associate in high protein concentration, consistent with the dissociation constant found by microscale thermophoresis, which was of the order of ten micromolar. The results raise questions concerning the physiological relevance of these complexes and reinforce the importance of further studies on the non-canonical assembly of septin complexes for cellular development.

Redes complexas são utilizadas para representar sistemas complexos, compostos de elementos que interagem uns com os outros. Uma das grandes vantagens de se empregar as redes é a possibilidade de se estudar a topologia presente nos mais diversos sistemas para obtermos informações sobre eles, entendê-los e compará-los. Devido à sua importância para a compreensão de processos intracelulares, desde início do desenvolvimento da área das redes complexas estudou-se a topologia da interação entre proteínas. Entretanto nos últimos anos com o desenvolvimento de novas técnicas de detecção o número de proteínas e interações reportadas cresceu de maneira muito acentuada; além disso, também existem alguns pontos sobre a sua topologia sobre os quais ainda não existe um consenso, como por exemplo qual a distribuição de graus desse tipo de rede. Neste trabalho estudamos as propriedades topológicas de redes de interação entre proteínas, utilizando as informações do banco de dados STRING, com ênfase no comportamento de suas medidas de centralidade e do espectro da matriz Laplaciana normalizada. Tanto a análise das medidas de centralidade e de suas correlações, quanto do espectro da matriz Laplaciana mostram que existem padrões topológicos que são conservados entre as redes dos organismos e que os mesmos também podem ser empregados para sua caracterização. Nossos resultados também mostram que as funções biológicas desempenhadas pelas proteínas podem ser identificadas pelas medidas de centralidade. Especificamente para a centralidade de autovetor, nossas análises indicam que ela está localizada nos maiores K-cores das redes consideradas. Os resultados aqui obtidos ressaltam que muitas informações relevantes podem ser extraídas da topologia das interações entre proteínas, além de indicarem a existência de possíveis estruturas conservadas; entretanto devido a incompletude dessas redes mais estudos precisam ser conduzidos para a avaliação de possíveis mudanças nos resultados aqui apresentados. / Complex networks can be used to model complex systems, composed of main elements that interact with each other. The advantage of using this approach is the possibility to study the topology of a wide range of systems so that we can get more information, understand and compare them. Due to its importance on the understanding of the intracellular biological processes, since the early beginning of the development of the complex networks field protein-protein interaction topologies have been studied. However, new techniques for the detection of proteins and their interactions have been developed recently, which has significantly increased the availability and reliability of the corresponding data over the last few years; moreover, there still are some debate about the topology of protein-protein interaction networks such as the degree distribution of this type of network. Here we will study the topological properties of protein-protein interaction networks created using the information of the STRING database focusing on centrality measures of their nodes, the correlation between them, and the normalized Laplacian matrix spectrum. Our results show the existence of topological patterns conserved between the protein interaction networks of different organisms and that both the correlation of the centrality pairs and the spectrum of the Laplacian matrix can be used for network characterization. Another study indicates that the set of centrality measures of a protein can be used to identify clusters with well defined biological functions. A more detailed look at the eigenvector centrality behavior reveals that this measure is localized on the proteins of the highest k-cores for all networks. These results highlight the importance of the topology on the study of protein-protein interactions and that more studies can lead to a better a more complete understanding of such systems.

A existência de aminoácidos co-traducionalmente codificados pelo código genético tem estimulado estudos sobre os mecanismos de síntese, reconhecimento e incorporação nas cadeias polipeptídicas nascentes. Como exemplo, pode-se destacar a via específica de biossíntese do aminoácido selenocisteína, presente em eucariotos e procariotos, cuja incorporação ocorre juntamente ao códon de parada UGA. Em bactérias, a via de biossíntese de Sec é composta pelas proteínas Selenocisteína sintase (SelA), Fator de Elongação Específico (SelB), Selenofosfato sintetase (SelD), Seril-tRNA sintetase (SerRS) e Selenocisteína liase (CsdB). A via de síntese e incorporação de Sec depende também de dois RNAs; um tRNA específico (tRNASec) e uma sequência no mRNA (Sequência de Inserção de Selenocisteínas - SECIS), sinalizadora para correta incorporação de Sec junto ao códon UGA. Em eucariotos, essa via difere pela presença das proteínas O-fosfoseril-tRNASec Quinase (PSTK) e Selenocisteil-tRNASec sintase (SepSecS), em substituição a SelA, e pela presença de proteínas ligadoras ao elemento SECIS (SBP2). Pelo fato do selênio ter uma citotoxicidade elevada, é fundamental a compreensão do mecanismo catalítico e formação dos complexos da via na etapa de incorporação junto ao tRNASec. Em 2009, foi proposta a interação entre CsdB e SelD, porém não sendo demonstradaexperimentalmente até o momento. Dessa forma, esse estudo traz pela primeira vez, a caracterização biofísica e estrutural da interação macromolecular entre CsdB e SelD bacterianas, indicando uma elevada afinidade de interação entre elas sob diferentes condições experimentais. Estudos biofísicos mostraram que a interação aumenta a estabilidade térmica e os estudos estruturais resultaram em um modelo em baixa resolução do complexo, indicando uma assimetria para o complexo formado. Além disso, em 2013 nosso grupo anotou uma sequência putativa para uma SBP2 em N. gruberi, ameba não patogênica empregada como modelo para estudos de N. fowleri, conhecida a infectar humanos, resultando na patologia conhecida como Meningoencefalite Amebiana Primária. Deste modo, esse estudo também traz, pela primeira vez, a demonstração experimental da presença de uma SBP2 em N. gruberi Ademais, a interação desta proteína como o elemento SECIS também foi caracterizada através de diversos estudos biofísicos. Demonstrou-se que a NgSBP2 possui alto percentual de regiões de desordem e que ao interagir com o elemento SECIS apresenta enovelamento devido à interação. Dessa forma, este estudo trouxe um avanço no conhecimento das interações moleculares presentes na via de incorporação de selenocisteínas, sendo de grande relevância no entendimento dos determinantes moleculares de interação entre proteína-proteína e proteína-RNA. / The existence of co-translationally encoded amino acids by the genetic code has stimulated studies on the mechanisms of synthesis, recognition, and incorporation into new polypeptide chains. As an example, the selenocysteine (Sec) biosynthesis pathway, present in eukaryotes and prokaryotes, where the amino acid incorporation occurs at the canonical UGA stop-codon. In Bacteria, the Sec biosynthesis pathway is formed by Selenocysteine synthase (SelA), Specific Elongation Factor (SelB), Selenophosphate synthetase (SelD), Seryl-tRNA synthetase (SerRS) and Selenocysteine lyase (CsdB). The synthesis route also needs two RNAs; a specific tRNA (tRNASec) and a sequence in the mRNA (SelenoCysteine Insertion Sequence - SECIS) that encodes for the in-frame UGA Sec incorporation. In eukaryotes, the pathway is distinguished through the presence of O-phosphoseryl-tRNASec kinase (PSTK) and Selenocysteinyl-tRNASec synthase (SepSecS), replacing SelA, also the presence of SECIS binding proteins (SBP2). Once selenium presents high cell toxicity, it is crucial to fully understand the catalytic metabolism and complex formation for the tRNASec incorporation. In 2009, CsdB and SelD interaction was proposed, however, it has not been experimentally demonstrated until now. Thus, this project reports at the first time the biophysical and structural characterization of bacterial CsdB and SelD macromolecular interaction, indicating to a high-affinity interaction between these enzymes for the complex formation. Biophysical assays showed that the complex increased the thermal stability and structural studies showed a low-resolution model also indicating the macromolecule asymmetry. In addition, our research group reported in 2013 the putative SBP2 sequence in N. gruberi, the non-pathogenic amoeba used as a model for studies of N. fowleri, known as human infective, responsible for the pathology known as the Primary Amebic Meningoencephalitis. Moreover, this project also reports, at the first time, the experimental presence of N. gruberi SBP2. The SBP2.SECIS was also characterized by several biophysical methods. NgSBP2 has a high percentage of regions of disorder and access to each element SECIS presents due to interaction. Thus, this study was promoted in advance on the molecular interactions present in the incorporation of selenocysteines, being important for the understanding of the molecular determinants of the interaction between protein-protein and RNA-protein.

La pression rencontrée par les organismes sur Terre varie de la pression atmosphérique à 110 MPa atteinte dans la fosse la plus profonde de l'océan. Même si Escherichia. coli n’est pas naturellement résistante à la pression, elle capable d'acquérir une résistance et même supporter un choc de pression de 2 GPa (~20 000 atm). L'une des réponses intéressantes d’E. coli à un choc sous létal de pression (100 MPa) est l'induction d'une réponse SOS dépendante de RecA due à des lésions double brins de l’ADN. La pression elle-même n'est pas capable de compromettre l'intégrité covalente de l'ADN. Des criblages ont permis d’isoler des souches d’E. coli résistantes à la pression qui révèlent qu'une endonucléase de restriction (ER) de type IV, Mrr, est le seul facteur responsable du clivage de l'ADN. Cette enzyme cible uniquement l'ADN méthylé et l’expression d’une MTase étrangère, M.HhaII, est également capable d'induire une réponse SOS dans des souches de E. coli en présence de Mrr. Ici, nous démontrons en utilisant des techniques de fluctuations d’intensité de fluorescence, in vivo et in vitro que Mrr est un présent sous la forme d’un tétramère dans les cellules non stressées. La pression est capable de dissocier Mrr en dimères actifs qui peuvent lier l'ADN et cliver à certains sites cryptiques. En revanche, la MTase HhaII favorise la forme dimeric de Mrr liée à l’ADN en raison de la méthylation de nombreux sites de haute affinité. Une analyse mutationnelle et un modèle d’homologie 3D de la protéine entière révèle la base structurelle probable du changement entre la forme tétramérique inactive à la forme dimérique active. Nous avons mis en pace un système permettant de faire de la microscopie sous pression (in vitro and in vivo) et nos résultats préliminaires ont confirmé notre modèle d’activation de Mrr. / The pressure encountered by organisms on Earth varies from the atmospheric pressure to 110 MPa as reached in the deepest trench of the ocean. Although Escherichia coli is not naturally resistant to high pressure, it is capable of acquiring pressure resistance and withstanding a pressure shock up to 2 GPa (~20,000 atm). When exposed to a sub-lethal pressure shock (100 MPa) E. coli induces a RecA-dependent SOS response due to DNA double strand breaks. Pressure itself is not capable of compromising the covalent integrity of the DNA. Instead, screens for pressure-resistance E. coli mutants have revealed that a Type IV restriction endonuclease, Mrr is the only factor responsible for DNA cleavage. This enzymes targets only methylated DNA and expression of a foreign methyltransferase, M.HhaII, is also capable of inducing an SOS response in strains harboring Mrr. Here, we demonstrate using fluorescence fluctuation techniques in vivo and in vitro that Mrr is present as a tetramer in unstressed cells and that pressure dissociates Mrr into active dimers that can bind DNA and cleave at some cryptic sites. In contrast, the M.HhaII MTase pulls the Mrr tetramer-dimer equilibrium to the dimer-bound DNA form probably due to the methylation of many high-affinity sites. Mutational analysis associated with a 3D homology model of the full-length protein reveals the probable structural basis for the switch from an inactive tetramer to an active dimer. We set up a system that allows microscopy experiments (in vitro and in vivo) under pressure and preliminary results have confirmed our model of Mrr activation.

O estudo de processos de tradução do código genético em proteínas desperta o interesse pelo seu papel central no metabolismo celular, em particular, o estudo da via de síntese de novos aminoácidos, como a selenocisteína e a pirrolisina, que resultam na expansão do código genético dos 20 aminoácidos canônicos para um total de 22 aminoácidos. A selenocisteína (Sec, U) é um aminoácido que representa a principal forma biológica do elemento selênio e sua incorporação ocorre através de um processo cotraducional em selenoproteínas como resposta ao códon UGA em fase, usualmente interpretado como códon de parada. Essa incorporação requer uma complexa maquinaria molecular distinta entre os três domínios da vida em que as selenoproteínas estão presentes: Bactéria, Arquéia e Eucária. Em Escherichia coli, a via se inicia com a aminoacilação do tRNA específico para a incorporação de selenocisteínas (SelC, tRNASec) com um resíduo de L-serina pela seril-tRNA sintetase (SerRS) formando o tRNA carregado Ser-tRNA[Ser]Sec que é entregue ao complexo homodecamérico selenocisteína sintase (SelA) responsável pela conversão Ser-Sec utilizando a forma biológica de selênio entregue pela enzima selenofosfato sintetase (SelD). Uma vez carregado com L-selenocisteína, o Sec-tRNASec é então carreado pelo fator de elongação específico para selenocisteínas (SelB) para a sua incorporação na cadeia polipeptídica nascente na posição UGA adjunta ao elemento SECIS (SElenoCysteine Insertion Sequence), uma estrutura em grampo presente no RNA mensageiro que indica o códon de inserção de selenocisteínas. Uma vez que elementos contendo selênio são tóxicos para o ambiente celular, interações entre as enzimas da via se fazem necessárias, onde as enzimas participantes em procariotos são conhecidas e caracterizadas individualmente, no entanto, suas interações macromoleculares nas diferentes etapas ainda não foram caracterizadas. Este projeto visa à caracterização macromolecular e estrutural das interações entre as enzimas SelA e SelB com os RNAs participantes tRNASec e SECIS além do ribossomo de E. coli. Para isso, amostras de SelA, SelB, tRNASec, SECIS e ribossomo foram obtidas através de diferentes metodologias. Para SelA e tRNASec foram utilizados protocolos já estabelecidos enquanto que, para SelB, fez-se necessário a otimização do protocolo previamente publicado e, consequentemente, nova caracterização biofísica através de metodologias como dicroísmo dircular (CD) e fluorescência intrínseca (IFS). Para análise das interações, medidas de espectroscopia de anisotropia de fluorescência (FAS), ultracentrifugação analítica (AUC) e calorimetria de varredura diferencial (DSC) foram utilizadas para determinação dos parâmetros de interação dos diferentes complexos estudados. Somado a isso, experimentos de cinética GTPásica foram realizados na formação dos complexos e, além disso, foram gerados modelos estruturais utilizando diferentes metodologias como espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS) além de estudos por microscopia eletrônica de transmissão (TEM). Os estudos propostos irão auxiliar no entendimento do mecanismo de incorporação deste aminoácido em bactérias bem como nos demais domínios da vida além de elucidar o mecanismo sequencial de eventos, provendo conhecimento e desenvolvendo metodologias para sistemas complexos de interação proteína-proteína e proteína-RNA. / The study of genetic code processes in proteins is a central role in cell metabolism, in particular the study of the synthesis pathway of new amino acids, such as selenocysteine and pyrrolisine, which resulted in the expansion of the genetic code of the 20 canonical amino acids for 22 amino acids. Selenocysteine (Sec, U) is an amino acid that represents a major biological form of selenium element and its incorporation through a co-translational process in selenoproteins in response to the in-phase UGA-codon, usually interpreted as stop-codon. This incorporation requires a complex molecular machinery distinct between the three domains of life in which, as selenoprotein has present: Bacteria, Archaea and Eukaria. In Escherichia coli, an initiation pathway with an aminoacylation of the tRNA specific for the incorporation of selenocysteines (SelC, tRNASec) with an L-serine residue by seril-tRNA synthetase (SerRS) resulting in the charged tRNA Ser-tRNA[Ser] Sec that is delivered to the homodecameric complex selenocysteine synthase (SelA), responsible for Ser-Sec conversion using the biological form of selenium delivered by the enzyme selenophosphate synthetase (SelD). Once loaded with L-selenocysteine, Sec-tRNASec is then carried by the selenocysteine-specific elongation factor (SelB) for incorporation into the nascent polypeptide chain at the UGA position attached to the SECIS (SElenoCysteine Insertion Sequence) element, staple structure that indicates the insertion codon of selenocysteines. Since elements containing selenium are toxic to the cell, interactions between how pathway enzymes are made, where the enzymes participating in concepts are known and characterized individually, however, their macromolecular interactions in the different steps have not yet been characterized. This project aims at the macromolecular and structural characterization of the interactions between SelA and SelB enzymes with the RNAS tRNASec and SECIS participants in addition to the E. coli ribosome. For this, as samples of SelA, SelB, tRNASec, SECIS and ribosome were obtained through different methodologies. For SelA and tRNASec, protocols were used to determine parameters for SelB, it was necessary to optimize a previously published protocol and, consequently, a new biophysical characterization through methodologies such as circular dichroism (CD) and intrinsic fluorescence spectroscopy (IFS). To analyze the interactions, measurements of fluorescence anisotropy spectroscopy (FAS), analytical ultracentrifugation (AUC) and differential scanning calorimetry (DSC) were used to determine the interaction parameters of different complexes studied. In addition, GTPases activity experiments were carried out in the formation of the complexesand, in addition, we have generated models that characterize different methodologies such as small angles X-ray scattering (SAXS) and transmission electron microscopy (TEM). The proposed studies will aid in understanding the mechanism of incorporation of this amino acid into bacteria as well as the other domains of life besides elucidating the sequential mechanism of events, providing knowledge and development of methodologies for complex protein-protein and RNA-protein interaction systems.