Orientadores: Ana Carolina de Mattos Zeri, Nilson Ivo Tonin Zanchin / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-14T05:56:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_JulianaFerreirade_D.pdf: 4266971 bytes, checksum: b6c93b83027283390194f44df501c5b2 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Proteínas da família SBOS (Shwachman-Bodian-Diamond Syndrome) ocorrem largamente na natureza e s.ão bastante conservadas, apresentando ortólogas em Archaea e eucariotos. Estudos de análises genômica e biofísica tem relacionado a SBOS com o metabolismo de RNA e biosíntese de ribossomos. O gene ortólogo da SBOS de Archaea está localizado em um operon conservado que contém genes do processamento de RNA; estudos de perfil de expressão gênica tem agrupado o gene da proteína SBOS de Saccharomyces cerevisiae, Sdo1p, com fatores do processamento de rRNA e estudos de análise proteômica identificaram a interação da proteína Sdo1p com fatores da biossíntese de ribossomos; ortólogas de planta contém um C-terminal estendido apresentando motivo de ligação a RNA. Mutações identificadas no gene SBDS tem sido relacionadas com a síndrome Shwachman-Oiamond (80S), uma doença caracterizada por insuficiência exócrina pancreática e disfunção na medula óssea, cujos pacientes apresentam grandes chances de desenvolver leucemia. SOS representa, portanto, um importante modelo para entender os processos envolvidos no desenvolvimento da leucemia. O objetivo principal desse trabalho consistiu na caracterização estrutural e funcional de proteínas da família SBOS. Foram realizados ensaios de cristalização com ortólogas ; da SBOS de Archaea, levedura, tripanossoma e humana. A SBOS de Pyrococcus abyssi foi cristalizada, porém os cristais difrataram a baixa resolução (3,50 A). A ' caracterização da SBOS ortóloga de Trypanosoma cruzi (TcSBOS) mostrou que esta, proteína contém uma região C-terminal estendida. Ensaios de proteólise limitada,' dicroismo circular e espectroscopia por Ressonância Magnética Nuclear (RMN) indicaram que a região adicional da TcSBOS se comporta como um fragmento de proteína intrinsicamente desenovelado, responsável pela interação da TcSBOS com RNA, verificada por ensaios de Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA). Também foi realizada a determinação da estrutura da ortóloga humana (HsSBOS) em solução por espectroscopia de RMN. A proteína HsSBOS é composta de três domínios bem estruturados, apresentando mobilidade conformacional entre os domínios N-terminal e central. Experimentos de titulação de RNA, novamente utilizando-se RMN, possibilitaram a confirmação da interação direta da SBOS humana com RNA. A região de ligação ao RNA foi identificada no N-terminal da proteína, região bastante conservada na família e considerada o principal alvo das mutações relacionadas à doença SDS / Abstract: The Shwachman-Bodian-Oiamond syndrome (SBOS) protein family occurs widely in nature and is highly conserved, with orthologues in Archaea and eukaryotes. Genomic and biophysical studies have suggested involvement of this protein in RNA metabolism and in ribosome biogenesis. Archaeal SBOS orthologue genes are located within highly conserved operons that include RNA-processing genes; transcriptional profiling analysis has clustered the yeast ortholog protein Sdo 1 p with rRNA processing factors and proteomic analysis have identified potential interactions between Sd01 p and ribosome biogenesis factors; several plant SBOS orthologues contain extended C-terminal region with putative RNA binding motif. Mutations in the SBDS gene are associated to the Shwachman-Oiamond syndrome (SOS), arare multisystem disorder characterized by exocrine pancreatic insufficiency, bone marrow dysfunction, and an increased risk of acute myeloid leukemia. SOS therefore represents an extremely useful model for understanding leukaemogenesis. The objective of the present work was the structural and functional characterization of the SBOS protein family. SBOS orthologues from Archaea, yeast, trypanosomatid and human were assayed for crystallization. The Archaeal SBOS orthologue, PaUPF0023 in Pyrococcus abyssi, was crystallized, but the crystals 'diffracted to a relatively low resolution (3.50 A). Characterization of the Trypanosoma cruzi SBOS ortholog (TcSBOS) by using limited proteolysis, circular dichroism and NMR analyses indicated that the C-terminal additional region of TcSBOS behaves as a natively unfolded protein segment, responsible for TcSBOS-RNA interaction activity in electrophoretic mobility shift assays. We have also determined the solution structure and backbone dynamics of the human SBOS protein using NMR spectroscopy. The overall structure of human SBOS comprises three well-folded domains with conformational exchange in the linker between the N-terminal and the central domains. RNA titration experiments using NMR spectroscopy provide evidence that human SBOS interacts with RNA via the N-terminal domain, a conserved region in the SBOS family and the most frequent target for SOSassociated mutations / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Maria Isabel Nogueira Cano, Carlos Henrique Inacio Ramos / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-08T19:46:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lira_CristinaBragadeBrito_D.pdf: 9068778 bytes, checksum: 7561201fa37b1109dc7803fb6173aad0 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A leishmaniose é uma doença parasitária que foi considerada pela Organização Mundial de Saúde como uma doença de Categoria 1, pois para a mesma não existem formas de controle, diagnóstico ou terapia eficientes. Os parasitas do gênero Leishmania (família Trypanosomatidae) são agentes etiológicos da leishmaniose e possuem cromossomos lineares com extremidades teloméricas. Os telômeros são complexos nucleoproteicos essenciais para manuntenção da estabilidade do genoma e viabilidade celular. Devido à importância das proteínas teloméricas na manutenção dessas estruturas, elas têm sido considerados bons alvos para a terapia anticâncer e antiparasitária. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi identificar proteínas que se associam aos telômeros de Leishmania amazonensis. Três metodologias diferentes foram utilizadas para antigir este objetivo: (i) purificação de proteínas teloméricas a partir de extratos de L. amazonensis, (ii) busca no banco de dados de Leishmania por proteínas homólogas que apresentassem domínios de ligação ao DNA do tipo Myb, e (iii) seleção genética em levedura (sistema mono-híbrido). A purificação de proteínas teloméricas a partir de extratos nucleares de L. amazonensis resultou no isolamento da proteína LaRbp38. Ensaios in vitro de interação proteína-DNA e ensaios in vivo (imunoprecipitação de cromatina) comprovaram a interação de LaRbp38 com DNA telomérico, DNA rico em GT e DNA do cinetoplasto. LaRbp38 pode ser considerada um bom alvo para a terapia antiparasitária pois é uma proteína exclusiva de tripanosomatídeos e seu homólogo em T. brucei é essencial para a sobrevivência do parasita. Para dar início a experimentos de caracterização da estrutura dessa proteína, LaRbp38 foi expressa em bactérias. Como a proteína permaneceu na fração insolúvel, experimentos preliminares de renovelamento foram feitos mostrando que a proteína necessita da presença de DNA, ou de moléculas análogas, para se renovelar in vitro. As buscas no banco de dados de L. major resultaram no descobrimento de uma lista de proteínas que apresentam domínio de ligação ao DNA do tipo Myb. Uma proteína foi escolhida e sua homóloga em L. amazonensis foi denominada LaTBP1. O domínio Myb de LaTBP1 se localiza na porção central da proteína e apresenta alta similaridade de seqüência com domínios Myb encontrados em fatores de transcrição to tipo TFIIIB, proto-oncogene c-MYB e membros da família de proteínas teloméricas Rap1p. Ensaios de interação proteína-DNA e de imunoprecipitação de cromatina confirmaram que LaTBP1 interage tanto com o DNA telomérico quanto com DNAs ricos em GT. Prefências por estes dois tipos de DNAs são apresentadas pelas proteínas teloméricas Rap1, Taz1 e TEBP1, descritas em leveduras e eucariotos superiores. A utilização do sistema mono-híbrido para identificação de proteínas teloméricas de Leishmania resultou em uma lista de proteínas candidatas. A possível função telomérica das mesmas foi inferida com base na homologia de seqüência com proteínas já descritas e em testes de interação proteína-DNA in vitro utilizando-se extratos das leveduras recombinantes. Apesar desses resultados serem promissores, análises mais detalhadas são necessárias para confirmar estas interações. Concluindo, as três metodologias se mostraram eficazes para a identificação de proteínas teloméricas e a utilização das mesmas resultou na identificação de diversas proteínas teloméricas, algumas delas ainda hipotéticas / Abstract: Leishmaniasis is a parasitic disease that was classified by World Health Organization as a Category 1 disease because there are no effective control programs or therapeutics to this disease. Parasites from the Leishmania genus are the ethiologic agents of leishmaniasis and they possess linear chromosomes with telomeric ends. Telomeres are nucleoprotein specialized nucleoprotein complexes essential for maintaining chromosomal stability and cell viability. Since telomeric proteins are essential for the maintenance of telomeres, they could be considered good targets for anticancer and antiparasitic drugs. Therefore, the goal of this work was to identify Leishmania amazonensis proteins that interact with the telomeric DNA. Three methodologies were used the achive this goal: (i) purification of telomeric proteins from nuclear extracts of L. amazonensis, (ii) Leishmania genome database mining for protein containing a Myb-like domain, and (iii) use of One-hybrid system (Clontech). The search for telomeric proteins in nuclear extracts of L. amazonensis resulted in the identification of LaRbp38. EMSA and immunoprecipitation assays were used to attest LaRbp38 binding to telomeric, GT-rich and kinetoplast DNAs, both in vitro and in vivo. LaRbp38 could be considered a good drug target for antiparasitic therapy since it is exclusive of trypanosomatids and itshomologue in T. brucei is essential for parasite survival. In order to characterize structurally this protein, LaRbp38 was expressed in bacteria. The protein was present in the insoluble fraction of the bacterial lysate. Therefore, preliminary experiments of refolding were done. LaRbp38 seems to need DNA, or analog molecules, in order to correctly refold in vitro. Data-mining in the L. major genome resulted on a list of proteins bearing a Myb-like domain. One protein was chosen and its L. amazonensis homologue was termed LaTBP1. LaTBP1 Myb-like domain is centrally localized and shares sequence similarities with Myb-like domains found on transcription factors TFIIIB and c-MYB, and with the RAP1 telomeric proteins. Competition and chromatin immunoprecipitation assays confirmed the specificity of LaTBP1 for telomeric and GT-rich DNAs. This binding specifities are also found on the telomeric proteins Rap1, Taz1 and TEBP1, described in yeast and higher eukaryotes. A list of proteins with a putative telomeric function was generated after the use of the Onehybrid system. Sequence analysis (search for homologues in other organisms) and EMSA, done with protein extract of recombinant yeast, were used to infer a telomeric function for the proteins found by this methodology. Although the results are encouraging, detailed analysis are necessary to validate the interactions. In conclusion, the three methodologies were usefull for the identification of telomeric proteins. This work resulted in the identification of several telomeric candidate proteins / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientadores: Marcelo Menossi Teixeira, Ricardo Aparicio / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T01:59:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fonseca_JosePedro_D.pdf: 3971415 bytes, checksum: b23d47eff6b16f53235b5d581fcd3ae6 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Estresses bióticos e abióticos como a seca, salinidade e ataque por patógenos são responsáveis por perdas significantes em culturas de grãos ao redor do mundo. Diversos genes são regulados em resposta a esses fatores e podem ser ativados ou reprimidos para gerar uma resposta específica na planta de maneira a gerar uma resposta de defesa que atenue os efeitos do estresse e promoção de tolerância pela planta. É importante entendermos o funcionamento desses mecanismos moleculares, e dos genes e proteínas envolvidas nestas vias de sinalização para um melhor conhecimento de como estas vias de transdução operam em plantas, bem como no desenvolvimento de variedades de plantas tolerantes. No capítulo I deste trabalho nós descrevemos a análise funcional de um motivo de ligação do fator TGA localizado na região promotora do gene NIMIN-1 que é altamente induzido por ácido salicílico (SA) durante defesa de plantas (estresse biótico). Fatores TGA desempenham um papel chave na defesa de plantas através da interação com elementos presentes na região promotora de genes de defesa para induzir a sua expressão. O ácido salicílico (SA) é um fito-hormônio que induz a expressão do gene que codifica a proteína NIMIN-1. Essa proteína interage com a proteína NPR1/NIM1, reguladora da resistência sistêmica adquirida (SAR). Neste trabalho foi investigado se um motivo de ligação do fator TGA2 "TGACG", localizado na região promotora imediatamente anterior ao sítio de iniciação da transcrição de NIMIN-1, é necessário a indução de NIMIN-1 por ácido salicílico. Uma versão mutagenizada do promotor do gene NIMIN-1 foi gerada por mutação sítio-dirigida. Nós geramos construções T-DNA nas quais tanto a região promotora nativa quanto a mutagenizada foram fusionadas aos repórteres proteína verde fluorescente (GFP) e beta-glucuronidase (GUS). Foram geradas plantas transgênicas e a expressão de GFP sob o controle da região promotora de NIMIN-1 foi observada em raízes, no pecíolo e folhas de Arabidopsis. A atividade dirigida pelo promotor mutagenizado e o selvagem foi quantificada por PCR quantitativo em tempo real. Tanto a construção contendo o promotor de NIMIN-1 como a cópia endógena de NIMIN-1 foram induzidas por SA. Em contraste, a construção promotora mutagenizada foi bem menos sensível a SA que o promotor nativo de NIMIN-1. Esse dado indica que o motivo de ligação do fator TGA2 analisado está diretamente envolvido na modulação da expressão de NIMIN-1 induzida por SA em Arabidopsis. No capítulo II nós descrevemos a caracterização da proteína ScCBL1 de cana-de-çúcar que apresenta elevada identidade com membros da família de proteínas sensoras de cálcio do tipo calcineurina B (CBL) em plantas. Experimentos de duplo-híbrido realizados em nosso grupo mostram que a proteína ScCBL1 interage com uma proteína quinase (ScCIPK8). Trabalhos prévios também desenvolvidos em nosso laboratório demonstraram que ScCIPK8 está envolvida no metabolismo do carboidrato e é diferencialmente expressa em resposta a ABA. O gene ScCBL1 foi clonado e a proteína codificada expressa e purificada a partir do extrato solúvel por cromatografia de afinidade usando resina Ni-NTA e a proteína eluída foi usada para estudos estruturais. Análises por espectrometria por dicroísmo circular (CD) mostraram que a proteína ScCBL1 é composta predominantemente por ?-hélices, em concordância com programas de predição da sequência de aminoácido desta proteína. Experimentos de espalhamento de raio-x a baixos ângulos (SAXS) indicaram que as amostras obtidas da ScCBL1 estavam homogêneas e monodispersas em solução e que ocorre uma mudança em seu estado oligomérico quando adicionado o agente redutor DTT, ocorrendo uma diminuição na intensidade de espalhamento (I(0)) a uma ordem de 1,56 para a mesma concentração, acompanhado de uma diminuição de 10 Å em seu raio de giro. As analises por SAXS indicaram que a proteína ScCBL1 é pentamérica em seu estado nativo e um trímero quando adicionado DTT. Análises por SAXS também indicaram que a proteína ScCBL1 está enovelada em solução, apresentando estrutura terciária estável. A modelagem de baixa resolução ab initio, juntamente com a função de distribuição das distâncias P(r) indicaram que a proteína possui um formato alongado (prolato). Ensaios iniciais de cristalização a partir de amostras monodispersas da proteína ScCBL1, confirmadas por DLS, foram feitas e um monocristal simétrico de aproximadamente 0.05 mm de diâmetro obtido além de outros sinais promissores para um refinamento das condições de cristalização de ScCBL1 para determinação de sua estrutura tridimensional a uma alta resolução. Esses dados contribuem para uma caracterização inicial da estrutura da proteína ScCBL1 / Abstract: Many biotic and abiotic stresses such as drought, salinity and pathogen attack are responsible for major crop losses around the world. Several genes are regulated in response to these factors to counteract the stress effects and promote plant tolerance. Understanding the molecular mechanisms as well as the roles of genes and proteins involved in stress signaling pathways is key to a better understanding of plant tolerance. We report in chapter I the functional analysis of a TGA biding factor located in the promoter region of NIMIN-1 that is highly induced by SA during plant defense against pathogen attack (biotic stress). TGA factors play a key role in plant defense by binding to the promoter region of defense genes, inducing their expression. Salicylic acid (SA) induces the expression of the gene encoding NIMIN-1, which interacts with NPR1/NIM1, a key regulator of systemic acquired resistance. In this work we investigated whether the TGA2-binding motif TGACG located upstream of the NIMIN-1 gene is necessary for SA induction of NIMIN-1 expression. A mutated version of the NIMIN-1 promoter was created by site-directed mutagenesis. We generated T-DNA constructs in which native NIMIN-1 and mutated promoters were fused to green fluorescent protein and ?-glucuronidase reporters. We produced transgenic Arabidopsis plants and observed NIMIN-1 promoter-driven green fluorescent protein expression in the roots, petiole and leaves. Constructs were also agroinfiltrated into the leaves to evaluate gene expression of mutagenized and native promoters driving expression of GUS using quantitative real-time RT-PCR. We characterized the normal gene response to SA and compared it to the response of the mutant version of the NIMIN-1 promoter. Both the native NIMIN-1 construct and an endogenous copy of NIMIN-1 were induced by SA. However, the mutated promoter construct was much less sensitive to SA than the native NIMIN-1 promoter, indicating that this TGA2-binding motif is directly involved in the modulation of SA-induced NIMIN-1 expression in Arabidopsis. In chapter II we describe the characterization of a sugarcane ScCBL1 protein which displays high sequence identity to the calcium binding protein family calcineurin B-like (CBL) from plants. Using the two-hybrid system our group has shown that ScCBL1 binds to a protein kinase (ScCIPK8). Previous work done in our laboratory also showed that ScCIPK8 is involved in carbohydrate metabolism and that it is differentially expressed in response to ABA. ScCBL1 was cloned, expressed and purified by one round of affinity chromatography using a Ni-NTA resin and the purified eluted protein was used for structural analysis. Spectroscopic analysis by circular dichroism (CD) showed that ScCBL1 is mainly composed of ?-helices agreeing with secondary structure prediction by PredictProtein server. Small Angle X-Ray Scattering (SAXS) analysis showed that ScCBL1 sample is homogeneous and monodisperse in solution and that the protein undergoes an oligomeric change when DTT is added, with a decrease in scattering intensity (I(0)) by a factor of 1,56 for samples with the same concentration, together with a decrease in the radius of gyration of 10 Å. SAXS experiments also showed that ScCBL1 is pentameric in its native state and the protein undergoes a change in its oligomeric state to a trimer when DTT is added. SAXS experiments also showed the protein is folded in solution and ab initio modeling of ScCBL1 protein envelope together with the pair-distribution function P(r) indicates that the protein has a rod-like, elongated shape. An initial crystallization screening with ScCBL1 monodisperse samples (confirmed by DLS experiments) was carried out and some crystallization signals were obtained, including a single crystal of around 0.05 mm in length. These data shed light on the structural features of ScCBL1 / Doutorado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

O Adenovírus (Ad) é um agente etiológico que causa infecções em diversas espécies e também pode ser utilizado na forma de vetor como ferramenta tecnológica para terapia gênica. O Controle sobre a replicação de Ad pode trazer beneficio para o combate de infecções e para as tecnologias de transferência genica. Porém, poucas ferramentas existem que podem inibir a replicação de Ad. Uma aplicação importante seria a inibição da replicação de Adenovírus helper utilizado na produção de Vírus Adenoassociado recombinante (rAAV), assim minimizando contaminação da produção de rAAV com o virus helper. Dessa maneira o objetivo desse trabalho foi investigar se há inibição da replicação do Ad mediada por RNA de interferência (RNAi) direcionada para alvos adenovirais chaves. Para isso foram construídos vetores lentivirais que codificam shRNAs para os genes hexon, IVa2 e pol. Em seguida foram criadas linhagens que expressam constitutivamente os shRNAs em 293T, células onde os vetores adenovirais conseguem se replicar. Os shRNAs específicos para hexon e IVa2 promoverem significantemente a redução dos níveis destes mRNAs conforme revelado utilizando RT-qPCR para quantificação dos transcritos adenovirais. Em seguida, knockdown do gene hexon se mostrou promissor em inibir a replicação do Ad, visto como redução de vírus produzido em células 293T anti-hexon. O knockdown do transcrito de hexon e a redução em replicação de Adenovírus foram mais acentuados após cell sorting e obtenção de clones celulares a partir da linhagem anti-hexon. O clone anti-hexon mostrou significante redução na quantidade de partículas adenovirais visualizadas por microscopia eletrônica e redução de 92% das partículas infecciosas em relação a 293T quando a produção foi realizada em larga escala. Esses resultados indicam que a tecnologia de shRNA para inibir a replicação do Ad é promissora e representa o primeiro passo de desenvolvimento de uma estratégia para a produção de rAAV livre de contaminação com Ad helper / Adenovirus (ad) is an etiologic agent that causes infections in diverse species and can also be used as a technologic resource, such as a vector applied in gene therapy. Control over Ad replication could be beneficial for the combat of infections and for the technology of gene transfer. However, few tools exist that may useful for the inhibition of Ad replication. One important application would be to impede replication of helper adenovirus utilized in the production of recombinant Adenoassociated Virus (rAAV), thus minimizing the contamination of the rAAV production with helper virus. The objective of the study was to investigate the use of RNA interference (RNAi) directed against key adenoviral targets as an inhibitor of Ad replication. For this, lentiviral vectors encoding shRNAs for hexon, IVa2 and pol were constructed. Next, constitutive expression of the shRNAs was established in 293T cells, the parental cell line that is permissive for adenovirus replication. The shRNAs specific for hexon or IVa2 significantly promoted reduction in the level of these mRNAs as revealed by RT-qPCR quantification of the adenoviral transcripts. Next, knockdown of hexon was shown to be promising as an inhibitor of Ad replication, seen as the reduction of Ad produced in the 293T anti-hexon cell line. Both the knockdown of the hexon transcript and reduction in adenovirus replication were accentuated after cell sorting and isolation of cellular clones from the anti-hexon cell line. The anti-hexon clone showed significant reduction in the quantity of adenovirus particles when visualized by electron microscopy and 92% fewer infectious particles as compared to the parental 293T cells when full scale production was made. These results indicate that the use of shRNA technology for the inhibition of Ad replication is promising and represents the first step for the development of a strategy for the production of rAAV free from helper virus contamination

Orientador: Marcelo Brocchi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-23T20:40:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ota_MeirePriscilla_M.pdf: 2076382 bytes, checksum: 656fb21011c6e51639a88741d801237c (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: S. enterica provoca desde enterocolítes até infecções sistêmicas sendo S. enterica I 4,5,12:i:- (flagelar monofásica) responsável por diversos surtos de salmonelose em diversas partes do mundo. Sua incidência tem aumentado consideravelmente nas últimas décadas e ela é caracterizada pela ausência da variação de fase flagelar, processo no qual dois tipos de flagelinas são expressos. Este trabalho teve como objetivo estudar a estabilidade do operon fljBA, responsável pela variação de fase flagelar, sob diferentes condições de cultivo. Para isso, o gene cat (resistência ao cloranfenicol) foi inserido próximo ao operon fljBA em linhagens de S. enterica Typhimurium uma vez que este sorovar deu origem a S. enterica I 4,5,12:i:- por deleção de fljBA. A estabilidade do operon foi verificada in vitro e in vivo e após tratamento da cultura com mitomicina C, antibiótico indutor de profagos. Este último tratamento foi utilizado em virtude da presença do fago Fels-2 próximo ao operon fljBA, uma vez que dados da literatura sugerem que a deleção do operon foi em decorrência da excisão/recombinação imprecisa de profagos. Os resultados obtidos sugerem que a deleção do operon parece ser um evento raro, dado que em nenhuma condição testada houve a reversão da resistência frente ao cloranfenicol. Essas observações abrem discussões sobre a essencialidade da variação de fase flagelar na patogenicidade de S. enterica. É possível que os clones que deram origem a S. enterica I 4,5,12:i:- apresentem características genotípicas e fenotípicas compensatórias a perda de variação de fase. Ainda neste trabalho a ausência dos genes fljA e fljB foram confirmadas em amostras clínicas de S. enterica I 4,5,12:i:- isoladas no Brasil, mas a análise de isolados provenientes de granjas sugerem a existência de um novo padrão de deleção do operon fljBA, dados estes que precisam ser melhor investigados. Além disso, foi desenvolvida uma reação de PCR-Duplex para detecção de S. enterica I 4,5,12:i:- (Clone Americano) e diferenciação deste de outros sorovares, particularmente Typhimurium. Este PCR se mostrou eficiente na identificação e diferenciação de S. enterica I 4,5,12:i:- (clone Americano) podendo ser utilizado como técnica complementar as técnicas tradicionais de sorotipagem, visto ser um método rápido, preciso e acurado. Os testes sorológicos são laboriosos e devido ao fato do flagelo de fase II nem sempre ser expresso, amostras do sorovar Typhimurium podem ser erroneamente identificadas como S. enterica I 4,5,12:i: / Abstract: S. enterica causes from enterocolitis to systemic infections with S. enterica serovar I 4,5,12:i:- (monophasic flagelar) responsible for multiple salmonellosis outbreaks worldwide. Its incidence increased considerable in recent years and it is characterized by absence of flagellar phase variation, a process in which normally two flagellins are expressed. This work aimed to study the instability of fljBA operon, responsible for flagellar phase variation under different conditions growth. For this goal, cat gene (resistant for chloramphenicol) was inserted next to fljBA operon in S. enterica Typhimurium strains once this serovar originated S. enterica I 4,5,12:i:- by fljBA deletion. Stability of operon was verified "in vitro", "in vivo" and culture treatment with Mitomycin C, prophages antibiotic inductor. This last treatment was used due the presence of Fels-2 prophage next to fljBA operon since previous works suggest that the deletion of operon is a result of imprecise excision/recombination of prophages. Results from this work suggest that the deletion of operon appear to be a rare event, since in none of condition tested were observed reversion of resistance mark to chloramphenicol. This observation leads to discussions about the essentiality of flagellar phase variation in pathogenicity of S. enterica. It is possible that clones whom originated S. enterica I 4,5,12:i:- presented compensatory genotypic and phenotypic features to the loss of phase variation. Absence of fljA and fljB genes was confirmed in clinic samples of S. enterica serovar I 4,5,12:i:- isolated in Brazil, but poultry samples suggest the presence of a new deletion pattern of fljBA operon, data that needs to be better investigated. Furthermore a Duplex-PCR were designed aiming S. enterica I 4,5,12:i:- (American Clone) and differentiation of it along others serovars, specially Typhimurium. This PCR showed efficient to identification and differentiation of S. enterica I 4,5,12:i:- (American Clone) technique that can be used as a complementary assay to traditional serotyping, since it is a fast, precise and accurate test. Serological tests are laborious and due phase flagellar II not always be expressed, samples of serovar Typhimurium can be misidentified as S. enterica I 4,5,12:i:- / Mestrado / Clinica Medica / Mestra em Clínica Médica

Orientador: Ljubica Tasic / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-20T16:55:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Prando_Alessandra_D.pdf: 9977861 bytes, checksum: 15d25bce7d95433f95b938e68fdeaac8 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Até o momento, pouco se sabe sobre os mecanismos de virulência da bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri (XAC), agente causador do cancro cítrico. Acredita-se que chaperonas de secreção (CS) estão envolvidas no processo de patogenicidade de XAC primeiramente formando complexos com fatores de virulência e auxiliando no encaminhamento desses para os sistemas de secreção utilizando o ATP como fonte de energia. Neste trabalho foram adquiridos dados de fluorescência de emissão, dicroísmo circular, desenovelamento térmico e de ressonância magnética nuclear de H NMR e de 2D {N,H} HSQC de duas proteínas da XAC, a XAC1990 (FlgN) e XACb0033. Para ambas proteínas foram propostas estruturas 3D usando a análise de footprinting com restrições SASA e rmsd. Para as estruturas propostas foi verificado que os dados de fluorescência corroboram com a estrutura 3D não ocorrendo o mesmo para os dados de CD e NMR que revelaram baixo conteúdo helicoidal além de ausência de estrutura 3 D. A interação da proteína FlgN com a sua proteína parceira FlgK também foi sugerida através das análises de CD e fluorescência. Na segunda parte do trabalho foram estudadas as interações entre a proteína Hsp90 da laranja com diferentes ligantes aplicando a técnica de Saturation Transfer Difference (STD-NMR) e espectroscopia de fluorescência. Estas análises revelaram dados que corroboraram com o modelo proposto e, além disso, indicaram que os hidrogênios H-8 e H-2 da adenina e H-1'da ribose estão localizados no sítio ligante da proteína com os fosfatos orientados para fora. Através da fluorescência foram calculados os valores de Kd e foi verificado que a geldanamicina é um potente inibidor de Hsp90 da laranja / Abstract: So far, the Xanthomonas axonopodis pv. citri (XAC) mechanisms of bacterial virulence is unknown. It is believed that secretion chaperones (CS) are involved in the XAC's virulence process by first forming complexes with virulence factors, and assisting in their presentation to corresponding secretion systems using ATP as a source of energy. Fluorescence emission, circular dichroism, thermal unfolding and nuclear magnetic resonance NMR H and 2D {N,H} HSQC data from two proteins of XAC, XAC1990 (FlgN) and XACb0033 were collected. For both proteins, 3D structures were proposed using the footprinting analysis with RMSD and SASA restrictions. For the proposed structures were verified which the fluorescence data were consistent with the 3D structure. The CD and NMR data revealed low-helical content and absence of 3D structure. The interaction of the protein FlgN with its partner, FlgK, was suggested by CD and fluorescence analysis. In the second part, the interactions between the orange's Hsp90 protein with different ligants using Saturation Transfer Difference (STD-NMR) and fluorescence spectroscopy techniques were studied. These analyzes revealed which the data were consistent with the proposed model and moreover showed that the adenine's hydrogens H-8 and H-2 and ribose's hydrogen H-1'are located in the protein binding site with the phosphate driven out. By fluorescence values were calculed Kd and it was verified that geldanamycin is a potent inhibitor of orange's Hsp90 / Doutorado / Quimica Organica / Doutor em Ciências

[pt] Ferramentas BLAST são normalmente utilizadas para efetuar comparações entre sequências de DNA, RNA e proteínas. No entanto, face ao crescimento exponencial das bases biológicas, existe uma preocupação quanto ao desempenho do BLAST, mesmo considerando os equipamentos de grande capacidade computacional hoje existente. Considerando tal fato, algumas ferramentas capazes de executar o BLAST em ambientes distribuídos, tais como clusters e grids, vêm sendo desenvolvidas de modo a acelerar consideravelmente a sua execução. No entanto, até o presente momento, não foi constatado, na literatura existente, nenhum estudo com o objetivo de comprar o desempenho entre essas ferramentas. A avaliação de desempenho dessas ferramentas é normalmente efetuada de forma isolada, considerando apenas o tempo de execução (elapsed time), em situações diversas, como, por exemplo, variando o número de nós em que a ferramenta BLAST é executada.. Almejando uma investigação mais detalhada, principalmente no que diz respeito a avaliação de desempenho do BLAST em ambientes distribuídos, a presente dissertação tem como um dos seus objetivos efetuar um estudo detalhado sobre como comparar o desempenho do BLAST em um ambiente distribuído, considerando para tal, a avaliação de três ferramentas BLAST, dentre elas balaBLAST, desenvolvida no Laborátorio de Bioinformática da PUC-RIO. O segundo objetivo é verificar a eficácia do balanceamento de carga efetuada pela ferramenta balaBLAST. / [en] BLAST tools are typically used to make comparisons between sequences of DNA, RNA and proteins. However, given the exponential growth of the biological databases, there is concern about the performance of BLAST, even considering the equipment of large computing power that exists today. Considering this fact, some tools to run BLAST in distributed environments such as clusters and grids, have been developed to greatly accelerate its performance. However, until now, has not been found in existing literature, no study in order to compare the performance between these tools. The performance evaluation of these tools is usually done in isolation, considering only the execution time (elapsed time) in different situations, for example, varying the number of nodes in the tool BLAST runs. Craving a more detailed investigation, especially with regard to performance evalution of BLAST in distributed environments, this dissertation has as one of your goals make a detailed study to compare the performance of BLAST in a distributed enviroment, considering for such the evaluation of three tools BLAST, among them the balaBLAST developed in the Bioinformatics Laboratory of PUC-Rio. The second objective is to verify the effectiveness of load balancing performed by the tool balaBLAST.

Durante a transição menopausal e a pós-menopausa cerca de 75% das mulheres apresentam sintomas de hipoestrogenismo, tais como fogachos. O emprego de terapia hormonal (TH) para alívio dos sintomas da menopausa está bem estabelecido, mas seus efeitos cardiovasculares (CV) permanecem controversos. Dados de estudos recentes indicam a presença de duas populações distintas quanto aos efeitos CV da TH. Essa diferenciação estaria relacionada principalmente com a idade e o tempo de pós-menopausa. Evidências sugerem também que a presença de fatores de risco cardiovascular antes do início do TH, ou de uma associação de fatores de risco, podem ser determinantes dos efeitos CV do TH. Dose de medicação, via de administração e o tipo de progestogênio utilizado em associação com estrogênio para TH também vem sendo estudados como possíveis fatores relacionados ao impacto CV do TH. O presente trabalho é composto por: 1) Ensaio clínico randomizado, comparando os efeitos da via oral baixa dose e via não oral sobre variáveis relacionadas com risco CV em uma população de mulheres saudáveis na pósmenopausa recente; 2) Ensaio clínico randomizado, onde foram avaliados os efeitos da adição de progesterona natural micronizada ao estrogênio não oral durante TH em mulheres na pós-menopausa recente; e 3) Revisão sistemática e meta-análise, onde foram sistematicamente buscados todos os artigos com TH baixa dose que avaliassem os efeitos desta terapia sobre variáveis relacionadas com risco cardiovascular: peso, índice de massa corporal, pressão arterial, proteína C reativa e lipídios. Desenvolvemos ensaio clínico randomizado, cross-over, com objetivo de avaliar os efeitos de dois tipos de tratamento hormonal na menopausa: oral baixa dose, estradiol 1 mg e drospirenona 2 mg diário e não oral, estradiol 17 β gel 1.5 mg (ou nasal 300 mcg) diário e progesterona micronizada vaginal, 200 mg, 14 dias por mês, sobre peptídeo natriurético atrial, variáveis relacionadas com inflamação e função endotelial, perfil antropométrico e metabólico em mulheres na pós-menopausa recente e sem doença clínica evidente. 101 mulheres na pós-menopausa foram alocadas aleatoriamente para iniciar o TH por um dos dois grupos de tratamento: via oral baixa dose (n=50) ou via não oral (n=51). Todas as pacientes utilizaram ambos os TH de forma seqüencial. Após o primeiro período de 2 a 3 meses de TH a paciente passava para o segundo tratamento, sem período de washout. A avaliação laboratorial foi realizada antes e após cada um dos tratamentos. A amostra do estudo foi composta por mulheres com média etária de 51 ± 3 anos e tempo de amenorréia de 22 ± 10 meses. Oitenta e seis pacientes concluíram o estudo. Peso e índice de massa corporal não se modificaram, enquanto que a circunferência da cintura reduziu de forma similar em ambos os grupos de tratamento. Colesterol total e LDL-C reduziram após ambos os TH, e triglicerídeos reduziram somente após a TH não oral. Insulina e glicemia de jejum não se modificaram. Não foram observadas modificações nos níveis de fibrinogênio, fator von Willebrand (FvW) e proteína C reativa (PCR) após TH oral. Após TH não oral, observou-se redução significativa de fibrinogênio e FvW. Níveis de PCR não se modificaram. Houve redução do número de pacientes no maior tertil de PCR (alto risco CV) após TH não oral. Essas pacientes passaram a integrar os grupos de risco intermediário e baixo. Níveis de peptídeo natriurético atrial (PNA) mantiveram-se inalterados após os ambos os TH. Não houve modificações significativas na pressão arterial e esta não se correlacionou com valores de PNA. Realizamos análise adicional do TH não oral, quanto às diferenças entre a via nasal e a percutânea e quanto aos efeitos da adição de progesterona natural micronizada ao estrogênio. Não houve diferenças significativas para todas as variáveis estudadas entre a via nasal e a via percutânea. A adição de progesterona natural micronizada não modificou os efeitos metabólicos e CV do estrogênio não oral. Foi realizada busca sistemática de todos os artigos que incluíssem como TH estrogênio baixa dose e avaliassem os efeitos deste tratamento sobre as variáveis de interesse: peso, índice de massa corporal, pressão arterial, proteína C reativa e lipídeos. Foram consultadas as bases MEDLINE, Cochrane CENTRAL, EMBASE. Foram revisadas todas as referências dos artigos de interesse e revisões e metaanálises no assunto, em busca de artigos relevantes. Após exclusão dos artigos em duplicata, 8610 artigos foram revisados. Destes, 28 artigos foram selecionados para meta-análise. Desta análise foi possível concluir que pacientes em uso de TH baixa dose apresentaram em média menor peso corporal, colesterol total e LDL-C do que não usuárias. A TH baixa dose não apresentou efeitos deletérios sobre demais variáveis estudadas. Em conclusão, ambos os TH apresentaram efeitos neutros ou benéficos sobre variáveis relacionadas com risco CV em uma população de mulheres na pósmenopausa recente e sem evidência de doença CV. A adição de progesterona natural micronizada não modificou os efeitos do estrogênio não oral. Os resultados da metaanálise sobre TH baixa dose e variáveis relacionadas com risco CV também permitem concluir que a TH baixa dose não exerceu efeitos deletérios sobre lipídeos e pressão arterial, e foi observado um possível efeito benéfico deste tratamento sobre o peso corporal. / During the menopausal transition and postmenopause about 75% of women have symptoms of hypoestrogenism symptoms such as hot flushes. The use of hormone therapy (HT) for relief of menopausal symptoms is well established, but its cardiovascular effects (CV) remain controversial. Data from more recent studies suggest the presence of two distinct populations regarding the cardiovascular effects of HT. This differentiation is related mainly to age and time after menopause. Evidence also suggests that the presence of cardiovascular risk factors before the onset of HT, or a combination of risk factors may be determinants of CV effects of HT. Medication dose, route of administration and type of progestin used in combination with estrogen for HT has also been studied as possible factors related to the CV impact of HT. This work consists of: 1) Randomized clinical trial, comparing the effects of low dose oral and non-oral route of variables related to CV risk in a population of healthy women in early postmenopausal; 2) A randomized clinical trial, which we assessed the effects of the addition of natural micronized progesterone to non-oral estrogen for HT in women in early postmenopausal; and 3) systematic review and meta-analysis, which were systematically searched all items with low-dose HT to assess the effects of this therapy on variables related to cardiovascular risk: weight, body mass index, blood pressure, C-reactive protein and lipids. A cross-over, randomized clinical trial was designed in order to evaluate the effects of two types of HT: low dose oral treatment, estradiol oral 1 mg and drospirenone 2 mg, by day and non-oral treatment, estradiol 1.5 mg 17 β gel by percutaneous route (or nasal route 300 mcg) by day and vaginal micronized progesterone, 200 mg/d, 14 days by month on atrial natriuretic peptide, variables associated with inflammation and endothelial function, anthropometric and metabolic variables on early and healthy postmenopausal women. One hundred one women were randomly allocated to start with one of the treatments: low dose oral treatment (n=50) or non-oral treatment (n=51). At the end the first three months period, the patients were crossed over without washout for an additional three months. Laboratory evaluated were carried before and after oral and non-oral HT. The sample of the study included postmenopausal women with a mean age of 51 years and duration of amenorrhea of 22±10 months. Eighty-six patients completed the study. Weight and body mass index remained unchanged, while the waist circumference decreased similarly in both treatment groups. Total cholesterol and LDL-cholesterol reduced after both the HT and triglycerides reduced only after nonoral HT. Insulin and fasting glucose did not change. No changes were observed in the levels of fibrinogen, von Willebrand factor (vWF) and C-reactive protein (CRP) after oral HT. After non-oral HT, there was a significant reduction of fibrinogen and vWF. CRP levels did not change. There was a reduction in the number of patients in the highest tertile of CRP (high CV risk) after non-oral HT. These patients have joined the groups of intermediate and low risk. Levels of atrial natriuretic peptide, ANP, were unchanged after both HT. There were no significant changes on blood pressure and did not correlate with values of ANP. We performed additional analysis of nonoral HT, for the differences between nasal and percutaneous and about the effects of addition of natural micronized progesterone to estrogen. There were no significant differences for all the variables studied between the nasal and percutaneously. The addition of micronized natural progesterone did not modify the metabolic and CV effects of non-oral estrogen. Systematic search of all articles that include as TH low dose estrogen and evaluate the effects of this treatment on the variables of interest was taken: weight, body mass index, blood pressure, C-reactive protein and lipids. The MEDLINE, Cochrane CENTRAL, EMBASE databases were consulted. All references of interest and reviews and meta-analyzes on the subject, in search of relevant articles were reviewed. After removing duplicate articles, 8610 articles were reviewed. Of these, 28 articles were selected for meta-analysis. From this analysis it was concluded that patients using low-dose TH had on average lower body weight, total cholesterol and LDL-C than non-users. The TH low dose showed no deleterious effects on other variables. In conclusion, low-dose oral and non-oral treatments had neutral or beneficial effects on variables related to CV risk in a population of women in early post menopausal and without evidence of CV disease. The addition of micronized natural progesterone did not modify the effects of non-oral estrogen. The results of the metaanalysis of low dose and TH variables related CV risk also showed that the TH low dose did not exert deleterious effects on lipids and blood pressure, and a possible beneficial effect of this treatment on body weight was observed.

Orientador: Jorg Kobarg / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T17:04:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Meirelles_GabrielaVaz_D.pdf: 11269390 bytes, checksum: bfd22a079ffc68a78b96b3e50dd60b1c (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A proteína NIMA foi identificada e caracterizada funcionalmente em Aspergillus nidulans como sendo uma serina/treonina cinase critica para a progressão do ciclo celular. As Neks (NIMA-related kinases) constituem uma família de cinases composta por 11 membros em mamíferos, que compartilham 40-45% de identidade com a proteína NIMA no domínio catalítico N-terminal. As Neks estão associadas a funções do ciclo celular e diversas patologias, o que as torna potenciais alvos quimioterápicos. Mutações no gene da Nek1 levam ao desenvolvimento da doença renal policistica e ao aparecimento de diversos efeitos pleiotrópicos, sugerindo sua participação em vias reguladoras de vários processos celulares. A Nek6, por sua vez, e ativada durante a mitose, e a super-expressão de mutantes inativos ou a sua depleção por RNAi produz células exibindo defeitos no fuso, anormalidades nucleares, parada na metáfase e apoptose. A Nek6 humana foi recentemente associada a carcinogênese, mas, assim como para a maioria das Neks, sua estrutura molecular, parceiros de interação e vias de sinalização permanecem ainda desconhecidos. Nesse trabalho, introduzimos a hNek6 como uma hub no interactoma humano. Uma extensa comparação de bancos de dados baseada em analises de conectividade mostrou que o quinoma humano e enriquecido em hubs. Nossas redes de interação incluem um amplo espectro de novos parceiros de interação para a hNek6 identificados em screenings de duplo - hibrido em levedura, classificados em 18 categorias funcionais. Alguns novos parceiros de interação da hNek6 são também possíveis substratos e, ainda, colocalizam com a hNek6 e ?-tubulina em células humanas, apontando para uma possível interação centrossomal. Os diversos parceiros de interação conectam a hNek6 a novas vias, como a sinalização de Notch e a regulação do citoesqueleto de actina, ou fornecem novas pistas de como a hNek6 poderia regular vias previamente propostas, como ciclo celular, reparo de DNA e sinalização do NF-?B. Alem disso, obtivemos o primeiro modelo estrutural de baixa resolução para a hNek6 a partir de SAXS. Analises estruturais revelaram que a hNek6 e um monômero em solução, apresentando uma conformação predominantemente globular, mas levemente alongada. Particularmente, a curta região N-terminal desordenada da hNek6 e importante para mediar as interações com seus parceiros. No caso da hNek1, observamos que ela interage com Fez1 e Clasp2 através de seus motivos coiled-coil, e colocaliza com essas proteínas em uma região candidata ao centrossomo / Abstract: NIMA was identified and functionally characterized in Aspergillus nidulans as a critical Ser/Thr kinase for cell cycle progression. The mammalian Neks (NIMA-related kinases) represent an evolutionarily conserved family of 11 serine/threonine kinases that share 40-45% identity with NIMA N-terminal domain. Neks are associated to cell cyclerelated functions and diverse pathologies, which highlight them as potential chemotherapeutic targets. Nek1 gene mutations lead to the development of polycystic kidney disease and the emergence of several pleiotropic effects, suggesting its involvement in pathways regulating various cellular processes. Nek6, in turn, is activated during mitosis, and overexpression of inactive mutants or its depletion by iRNA produces cells exhibiting mitotic spindle defects, nuclear abnormalities, metaphase arrest and apoptosis. Human Nek6 was recently found to be linked to carcinogenesis, but as for the majority of Neks, the molecular structure, interacting partners and signaling pathways remain elusive. Here we introduce hNek6 as a hub kinase in the human interactome. We performed a broad databank comparison based on degree distribution analysis and found that the human kinome is enriched in hubs. Our networks include a large set of novel hNek6 interactors identified in our yeast two-hybrid screens, classified into 18 functional categories. Some novel interactors are also putative substrates and colocalized with hNek6 and ?-tubulin in human cells, pointing to a possible centrosomal interaction. The interacting proteins link hNek6 to novel pathways, e.g. Notch signaling and actin cytoskeleton regulation, or give new insights on how hNek6 may regulate previously proposed pathways such as cell cycle, DNA repair and NF-?B signalings. Furthermore, we obtained the first low-resolution structural model of hNek6 by SAXS. Structural analysis revealed that hNek6 is a monomer in solution with a mostly globular, though slightly elongated conformation. Notably, we found that hNek6 unfolded short N-terminal region is important to mediate the interactions with its partners. In the case of hNek1, we found that it interacts with Fez1 and Clasp2 through coiled-coil motifs and colocalizes with these proteins in a candidate centrosomal region / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Transgenic plants containing genes from Bacillus thuringiensis have been used as an alternative to chemical insecticides for insect pest control. The vegetative insecticidal proteins (Vip) secreted during the vegetative growth phase of bacteria are considered a second generation of insecticidal proteins since they do not share any structural or sequence homology with previously used crystal proteins (Cry) as well as having a wide insecticidal spectrum. One of the target pests for this protein is the fall armyworm (FAW) (Spodoptera frugiperda), the most important corn pest in South America. Previously it has been controlled by insecticides and maize expressing Cry proteins, but has rapidly evolved resistance to many control practices and remains a top concern for sustainable biotechnology control efforts. Thus, resistance characterization involving mode of action and genetics of resistance can help with Insect Resistance Management strategies, and improve the durability of control. In this dissertation, using two selected FAW population resistant to Vip3Aa20 Bt protein (Vip-R1and Vip-R2) we generated comparative proteomic and transcriptomic data among resistant and susceptible colonies. In the chapter 2, we bring FAW biology/ecology and Brazilian agriculture landscape data to support the high adaptive potential of this pest to genetically modified maize expressing Bt Cry proteins in Brazil. Proteomics studies in the chapter 3 revealed that neither Vip-R1 nor Vip-R2 showed difference between resistant and susceptible colonies either for Vip3Aa20 activation through proteolysis assay nor protein binding to the receptor. Transcriptomic sequencing and RNA-seq analysis in the chapter 4 showed strong evidence of ABC transporter genes associated with resistance as well as genes related to G-protein signaling pathway as downregulated. These results will be discussed in context of providing best management practices for managing FAW resistance to Vip, and extending the durability of Vip technology. / Plantas Transgênicas expressando genes de Bacillus thuringiensis (Bt) tem sido usadas como alternativa ao controle químico para controle de insetos praga. A proteina Vip (Vegetative Insecticide Protein) cuja secreção é realizada durante fase de crescimento da bacteria é considerada como segunda geração de proteinas inseticidas em função desta não apresentar similaridade de sequencias com todas as outras proteinas cristal (Cry), apresentando ainda maior espectro de controle de pragas. Uma das pragas alvo desta proteina é a lagarta-do-cartucho do milho (Spodoptera frugiperda), considerada a mais importante na cultura do milho na América do Sul. Larvas desta espécie foram sempre controladas com inseticidas e mais recentemente, milho expressando proteínas Cry. No entanto, esta praga tem desenvolvido resistência para várias ferramentas de controle, trazendo preocupação para a sustentabilidade das taticas de controle geradas através da biotecnologia. Dessa forma, estudos de caracterização da resistencia envolvendo modo de ação e characteristicas genéticas envolvidas com resistência pode contribuir para melhorar estratégias de Manejo de Resistencia de Insetos (IRM) e aumentar a durabilidade destas tecnologias para o controle. Nesta dissertação, foi gerado dados proteômicos e de transcriptoma comparando uma população de S. frugiperda resistente a Vip3Aa20 com a susceptivel. No capítulo 2, abordamos as características de bio-ecologia da praga associado ao sistema de cultivo suportando o alto potencial adaptativo desta espécie para hibridos de milho expressando proteinas Bt no Brazil. No capitulo 3, estudos de proteômica mostrou que Vip-R1 e Vip-R2 quando comparado com SUS, não demostraram diferenças para ativação da proteina nem ausencia de ligação da proteína com receptor de membrana no intestino do inseto. Dados de transcriptoma descritos no capitulo 5 mostrou forte evidências de que a baixa expressão de genes relacionados ao sistema transportador ABC pode estar associado com resistência bem como genes da via de sinalização das proteínas G. Estes resultados serão discutidos em um contexto para suportar boas praticas de manejo de resistência para lagarta-do-cartucho e assim estender a durabilidade da tecnologia Viptera® no campo.