Orientador: Sara Terezinha Olalla Saad / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-09T12:26:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Borges_Luciene_D.pdf: 3990737 bytes, checksum: 7c865de830ecbe5f830e992e6c69fb2c (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Estímulo mecânico é um dos principais eventos envolvidos na hipertrofia cardíaca que afeta vários componentes de vias de sinalização do miocárdio. Recentemente, um novo transcrito altamente expresso em músculo cardíaco, denominado de ARHGAP21, foi descrito como um membro da família de proteínas Rho GAP, que demonstrou atividade catalítica sobre Cdc42 e interação com ARF1, ARF6 e a-catenina, proteínas importantes do remodelamento do citoesqueleto e junções aderentes. No presente estudo, tivemos como objetivo analisar a expressão da ARHGAP21 em resposta ao estresse mecânico agudo em corações de ratos adultos, e sua associação com FAK e PKC?. Utilizando-se fracionamento subcelular, microscopia confocal e eletrônica, demonstramos que ARHGAP21 relocaliza-se das regiões nucleares e miofilamentos para linhas Z, discos intercalares e costâmeros de cardiomiócitos submetidos à sobrecarga de pressão, sugerindo que esta roteína pode desenvolver uma importante função no remodelamento cardíaco. Além do mais, ensaio de imunoprecipitação mostrou que ARHGAP21 interage com PKC? e FAK em ratos controle, submetidos à coarctação da aorta e espontaneamente hipertensos (SHR). Três diferentes regiões de FAK, contendo cauda de GST acoplada, foram utilizadas em ensaio de ligação in vitro, demonstrando que ARHGAP21 se liga à porção carboxi terminal de FAK. Além disso, ARHGAP21 associa-se à PKC? fosforilada em Thr410 em o-imunoprecipitados de extratos protéicos de ratos controle e SHR. Entretanto, ARHGAP21 associa-se apenas à FAK fosforilada em Tyr925 em SHR. Também foi verificado que PKC? é fosforilada por estímulo mecânico. Estes resultados sugerem que ARHGAP21 pode atuar como uma molécula sinalizadora ou proteína adaptadora das vias de sinalização de FAK e PKC? em cardiomiócitos, provavelmente desempenhando importante função durante estresse cardíaco / Abstract: Mechanical stimulus is one of the major events involved in cardiac hypertrophy, and affects components of essential myocardium signaling pathways. Recently, we described a highly expressed mRNA in the cardiac muscle as a member of the RhoGAP family of proteins, ARHGAP21, which demonstrated GAP activity over Cdc42 and interacted with ARF1, ARF6 and a-catenin important proteins of the cytoskeleton assembly and adherent junctions. In the present work, we aimed to analyze the expression of ARHGAP21 in response to acute mechanical stress in the adult rat heart and its association with FAK and PKC? proteins. By subcellular fractionation, confocal and immunoelectron microscopy, we demonstrated that ARHGAP21 is relocated from the nucleus to the plasma membrane, Z-lines and costameres of cardiomyocytes submitted to pressure overload conditions, suggesting that this protein may develop a role in cardiac remodeling. Furthermore, immunoprecipitation assay showed that ARHGAP21 interacted with PKC? and FAK in control rats, rats submitted to aortic clamping and spontaneously hypertensive rats (SHR). Using three different GST-tagged regions of FAK, we found that ARHGAP21 binds to the carboxyl terminal portion of FAK. Moreover, ARHGAP21 binds to PKC? phosphorylated on Thr410 in co-immunoprecipitates of protein extracts from sham control rats and SHR. However, ARHGAP21 only binds to FAK phophorylated on Tyr925 of SHR. We have also shown that PKC? is phosphorylated by mechanical stimuli. Altogether, these results suggest that ARHGAP21 may act as a signaling molecule or scaffold protein of FAK and PKC? signaling pathways in cardiomyocytes, probably developing an important function during cardiac stress / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutor em Fisiopatologia Medica

No Brasil, e em outros paises de clima tropical, os carrapatos se tornaram um enorme problema economico de^$de que a industria do gado se desenvolveu. O carrapato Boophilus microplus, um dos artropodes mais importantes na veterinaria, causa efeitos direto, como suc,cao de sangue, e indireto, como a transmissao de uma grande variedade de patogenos que normalmente resulta em infec,c~es letais. As vacinas genicas contendo o antigeno Bm86, uma proteina ligada a membrana do intestino do carrapato B. microplus, representam uma alternativa atrativa aos acaricidas para controlar as infesta~oes por carrapatos em contrapartida aos inconvenientes produtos quimicos. Devido sua administra,cao ser feita em 4 doses no primeiro ano, seguida de refor,cos a cada seis meses, estas formula,coes vacinais nao s3c adequadas para paises com cria,cao extensiva de gado, como no Brasil. Visando uma libera~ao sustentada do antigeno Bm86, neste trabalho desenvolveuse uma vacina de dose unica baseada em microesferas polimericas. Para obter o padrao de liberac,ao desejavel, diferentes formula,coes e parametros de processo foram variados, como a composi,cao do polimero, a taxa entre os monomeros ^Uacido latico:acido glicolico\" e o tamanho das microparticulas. As formula,coes foram preparadas pelo metodo de emulsao multipla e evapora,cao do solvente. A formula~ao que melhor se enquadrou nos objetivos da vacina de dose unica foi preparada com PLGA 75:25, solu,cao 3% de PVA como estabilizante, agita,cao de 11000 rpm para forma,cao da emulsao primaria e de 800 rpm para forma,cao da emulsao multipla e evapora,cao do solvente. As particulas assim obtidas apresentaram um tamanho medio de 25 ,um, uma taxa de encapsula,cao maior que 90% e aproximadamente 50% da proteina foi liberada in vitro em 60 dias. Analises por SDS-PAGE e Westem Bloning revelaram que a proteina se manteve integra apos encapsula,cao. Os resultados da avalia,cao da imunogenicidade em bovinos mostraram que a formula,cao baseada em microesferas polimericas biodegradaveis e habil a conseguir, com uma unica dose, uma resposta imune similar aquela conseguida com tres doses das formula,coes convencionais da vacina de Bm86. / In Brazil, and in others tropical countries, the ticks have become a huge economic problem since the industry of livestock has developed. Ticks and tick-borne diseases affect animal and human health and are the cause of significant economic losses. The cattle tick Boophilus microplus is one of the most important arthropods in veterinary. This tick species causes both direct effects, such as blood sucking, and indirect effects, such as transmission of a wide variety of pathogens, which usually result in lethal infections. The gene vaccines based on Bm86 antigen, a midgut membrane-bound protein of the cattle tick B. microplus, represent a good alternative to control tick infestations, compared to chemicals. However, due to these vaccine formulations need 4 doses over the first year with booster at each 6 months to be effective, they are not suitable for countries with extensive cattle raising, like Brazil. Aiming a sustained release of Bm86 antigen, in this work we developed a single shot vaccine based on Bm86 loaded polymeric microspheres. In order to obtain desired release patterns, different formulations and processing parameters were varied, for example, the composition of the polymer, the monomer ratio lactic acid:glycolic acid and the size of the microparticles. The formulations were prepared by solvent evaporation method based on double emulsion. The formulation that presented better result as single shot vaccine was prepared with PLGA 75:25, solution 3% of PVA as stabilizer, agitation of 11000 rpm to form the primary emulsion and 800 rpm to obtain the double emulsion and solvent evaporation. The particles thus obtained presented an average size of 25 m, encapsulation ratio greater than 90% and approximately 50% of the protein was released in vitro in 60 days. Analysis by SDSPAGE and Western Blot showed that the integrity of the protein remained after encapsulation. The immunogenic studies showed that the formulation based onbiodegradable polymeric microspheres is able to elicit, with a single dose, an immune response and protection similar to that attained with 3 doses of conventional Bm86 vaccine formulations.

Orientador : Admar Costa de Oliveira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-07-15T20:51:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Jalali_VahidehRahnemayeRabbani_D.pdf: 5861725 bytes, checksum: 0bdb0691ce6169d57d18becdfc931b67 (MD5) Previous issue date: 1992 / Resumo: A presente tese teve como objetivo verificar a influência do feijão (Phaseolus vulgaris) cozido, como fonte pro- teica, na quantidade de nitrogênio endógeno fecal de ratos Wistar, como também estabelecer a origem deste material através da marcação de proteínas e ácidos nucléicos dos ra- tos, respectivamente, com 3H-aminoácidos e 3H-nucleosideos. Realizou-se três ensaios de balanço de nitrogênio em ratos Wistar, previamente jejuados e adaptados à dieta, adrede marcados em suas proteínas mediante injeção intrape- ritonial de L-[5-3H]-arginina-monocloridrato, [2-3H]-glicina ou DL-[4,5-3H]-leucina, em dose única de 42-45 uCi por rato, e colocados em dietas de feijão cv. Carioca 80, feijão cv. Aeté 3 ou caseina, com teor proteico de 10% e aprotéica. Isto permitiu comparar as excreções endógenas de nitrogênio fecal e urinário dos ratos nas diversas dietas balanceadas utilizadas. Visando uma análise mais confiável e como um monitoramento fez-se determinação da dieta consumida, variação de peso dos animais e sua correlação com o nitrogênio retido, a digestibilidade e o valor biológico das proteínas. Observou-se que o consumo do grupo em dieta de caseina era significativamente (p < 0,05) maior do que o consumo dos grupos em dieta de feijão. 0 consumo de alimento pelos grupos em dieta de feijão não chegou a ser diferente, em dois experimentos, daquele dos ratos em dieta aprotéica. As cor- relações entre variação de peso e nitrogênio retido foram expressas por regressão linear positiva (r = 0,83309, p < 0,0001). 0 nitrogênio fecal total excretado pelos grupos em dieta de feijão foi significativamente (p < 0,05) maior, chegando de 2,6 a 4,1 vezes maior do que o excretado pelos ratos em dieta de caseina. Para comparar a excreção endógena fecal dos ratos em dietas teste com aqueles em dieta controle de caseina e aprotéica, determinou-se a radioatividade nas fezes dos ratos. Observou-se que o grupo em dieta Carioca 80 excretou quantidade significativamente (p < 0,05) maior de radioatividade do que aqueles em dietas de caseina e aprotéica. Para o grupo em dieta Aeté 3, a radioatividade das fezes foi maior em relação à aprotéica, mas nem sempre diferiu daquela dos ratos em dieta de caseina. A quantificação de nitrogênio fecal endógeno era estimada a partir da proporção do nitro- gênio endógeno total e a radioatividade das fezes, com base na dieta aprotéica. As quantidades estimadas referente às dietas de cultivares de feijão, bem como as decorrentes da dieta aprotéica, demostraram que os animais alimentados com feijão excretaram 133 a 166% mais nitrogênio endógeno. A determinação da radioatividade do intestino delgado monitorado com radioautografia evidenciou uma maior incorpo- ração de arginina do que leucina e glicina. Os coeficientes das correlações lineares positivas, obtidas entre a radioa- tividade das fezes e o nitrogênio fecal, r = 0,8694, p < 0,001; r = 0,7708, p < 0,001 e r = 0,7212, p < 0,003, respectivamente para 3H-arginina, 3H-leucina e 3H-glicina, bem como o maior parâmetro B do modelo ajustado (y = Bo + Bx), demonstraram que, no caso de arginina, a radioatividade que chega às fezes ligada ao nitrogênio é maior. Sendo assim, considerou-se arginina como marcador proteico mais apropriado. Tendo em vista estabelecer se o aumento da excreção de nitrogênio era devida à descamação dos enterócitos, realizou-se ensaio de balanço de nitrogênio, no qual os ratos foram previamente marcados em seus ácidos nucléicos mediante a injeção intraperitonial de 50 uCi de [G-3H]-adenosina e co- locados em dietas de feijão Carioca 80, caseína ou aprotéica. O conteúdo de RNA das fezes do grupo em dieta Carioca 80 era significativamente maior (p < 0,05) do que o do grupo em caseína; entretanto, o valor da radioatividade das fezes não apresentou diferença significativa com o grupo em caseína. A radioatividade mostrou-se significativamente mais incorporada no intestino delgado dos ratos em dieta do feijão, após 96 horas. Por outro lado, no ensaio realizado com [5-3H]-uridina, no qual os ratos mantidos durante 15 dias nas dietas de feijão Carioca 80 ou caseína, receberam injeção intraperitonial de 120 uCi de [5-3H]-uridina, foi observado que a radioatividade do intestino delgado dos ratos em dieta de feijão, nos períodos de 2,4 e 6 horas, era maior do que a obtida para os ratos em dieta de caseína. Os resultados obtidos nos experimentos com nucleosídeos, confirmaram um metabolismo maior de nucleosídeos para ratos em dieta de feijão. O maior metabolismo de nucleosídeos no intestino delgado de ratos em dieta de feijão, foi considerado como indicativo de uma maior hipertrofia e ou hiperplasia celu- lar; entretanto, os resultados obtidos não mostraram evidência de um aumento significativo na descamação da mucosa intestinal / Abstract: The objective of this research was to investigate the influence of cooked beans as a source of protein, on the quantity of fecal endogenous nitrogen excretion and to explain the origins of this material in Wistar rats. To attain these objectives the technique of labeling protein and nucleic acid with 3H-aminoacids and 3H-nucleosides, respectively, was used. Three experiments of nitrogen balance were carried out with Wistar rats. The animals were first subjected to fasting, followed by a period of adaptation to the diet before labelling their proteins with intraperitoneal injection of a 45 uCi dose of L-[5-3H]-arginine- monohydrochloride, [2-3H]-glycine or DL-[4,5-3H]-leucine. They were then fed on diets containing either bean (cv. Carioca 80), bean (cv. Aete 3) or casein providing a total of 10% protein or a non-protein diet. These experiments permitted a comparison of the quantity of endogenous nitrogen excreted in the feces and urine of the rats on test diets and control diets. To ensure the accuracy of the analysis, a simultaneous assessment of diet intake, correlation between the weight gain and retention of nitrogen, as well as the digestibility and biological value of the protein were also undertaken. Rats fed diets containing casein showed a significantly (p < 0.05) higher ingestion of diet, as compared with those on the bean diet. The correlations between the weight gain and the retention of nitrogen were expressed by positive and moderate linear regression (r = 0.83309, p < 0.0001). The total fecal nitrogen excreted by the groups fed the bean diet were between 2.6 and 4.1 times more than that excreted by animals fed the casein diet. In order to compare the quantity of endogenous nitrogen excreted in the feces and urine of rats on test diets and control diets, the radioactivity of the feces of rats fed on test diets and on control diets were determined. The rats fed on the diet containing Carioca 80 excreted significantly (p < 0.05) more radioactivity than animals on the casein diet. For those fed a diet containing Aete 3 the excretion of radioactivity was signficantly (p < 0.05) higher than for the groups fed a non-protein diet but not always higher than those fed a casein diet. The quantification of endogenous fecal nitrogen in both cultivars of bean and of non-protein diet demonstrated that the animals fed the bean diet excreted higher levels (133 to 166%). Endogenous nitrogen exretion of rats was estimmated by the ratio of total endogenous nitrogen to marker nitrogen, based on the protein-free diet. The determination of radioactivity in the small intestine monitored with adioautography indicated a larger incorporation of arginine than leucine. The coefficients of the positive and moderated linear regression obtained between radioactivity of feces and fecal nitrogen r = 0.8694, p < 0.001; r = 0.7708, p < 0.001 and r = 0.7212, p < 0.003, respectively for 3H-arginine, 3H-leucine and 3H-glycine, together with the larger B parameter of the adjusted model (y = Bo + Bx) demonstrated that the levels of radioactivity appearing in the feces combined with nitrogen were higher in the case of arginine, as compared to leucine and glycine, thus indicating arginine as the most appropriate protein labeller. In order to establish if the increased fecal secretion of nitrogen by rats fed on a diet containing bean was due to an enhancement of proliferation and loss of enterocytes, a nitrogen balance was carried out in which the rats were labelled with intraperitoneal injection of 50 uCi doses of [G-3H]-adenosine and then put on the Carioca 80 diet, casein diet or non-protein diet. Comparing the group on the Carioca 80 diet to the casein group, the quantity of RNA in the feces was significantly (p < 0.05) larger, but the radioactivity level of the feces, although somewhat higher, was not shown to be statistically significant (p < 0.05). The radioactivity was significantly more incorporated in the small intestine of rats fed on a bean diet after 96 hours. Another experiment was carried out with [3H-5]-uridine in which the rats were kept for a period of 15 days on bean (cv. Carioca 80) or casein diet and immediately after received an intraperitoneal injection of 120 uCi [5-3H]- uridine. This demonstrated that the radioactivity was higher in the small intestines of the bean-fed rats than in the casein-fed rats, over periods of 2, 4 and 6 hours. The results obtained from the nucleoside experiments indicated elevated metabolism of the nucleosides by the small intestines of bean-fed rats. This increase in metabolism provided evidence of increased cellular proliferation. However the results provide no evidence of increased loss of intestinal mucosal cells / Doutorado / Doutor em Ciência de Alimentos

Orientador: Roberto Herminio Moretti / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade Tecnologia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-07-16T13:08:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PezoaGutierrez_Vladimir_M.pdf: 13123148 bytes, checksum: 637b07d4712007dce945f00490a7241e (MD5) Previous issue date: 1975 / Resumo: Foi estudada a solubilização de um isolado de proteínas por hidrólise enzimática, em um sistema continuo, empregando-se um reator enzimático com membrana ultrafiltrante. Correlacionou-se o comportamento de diferentes variáveis, tais como concentração de substrato, substrato desnaturado e não desnaturado, concentração de enzima, pH, pressão temperatura. Para este sistema foi usado como substrato uma solução de um isolado de proteínas de soja; e como enzima, uma enzima proteolítica de reação ácida obtida de Rhizopus chinensis. Os efeitos das diferentes variáveis foram estimados analisando-se a concentração de peptídios solúveis no permeado e o fluxo do permeado através do tampo de reação. Também foram efetuadas as análises de composição química do substrato, da atividade da enzima sobre o mesmo, e também a determinação do peso molecular dos peptídios solúveis no permeado resultante. Verificou-se que quanto menor é a concentração de peptídios solúveis no permeado, maior é o fluxo do mesmo através da membrana; observou-se também que a concentração de peptídios solúveis no permeado é diretamente proporcional à concentração do substrato e da enzima no reator. Também se determinou que o fluxo de permeado através da membrana varia com a pressão exercida no sistema quando se trabalha no intervalo de 1,0 a 2,0 kg/cm². Ao empregar um vácuo de 0,3 kg/cm² os resultados foram similares aos obtidos com a pressão de 1,0 kg/cm². Demonstrou-se que um incremento de temperatura faz com que aumente a concentração de peptídios solúveis no permeado. Encontrou-se que o pH ótimo para a atividade da enzima esta no intervalo 2,5 a 3,0; e quando o pH se torna menor que 2,5 ou maior que 3,0, a atividade enzimática decai significativamente. Determinou-se ainda que o rendimento em proteínas solubilizadas estava entre 6,77% e 35,54%, para as diversas condições estudadas. Finalmente, determinou-se que o peso molecular dos peptídios ultrafiltrados é inferior a 10 000 / Abstract: Solubilization of an isolated protein by enzymatic hidrolysis in a continuous reactor using ultrafiltration was studied. The following variables were investigated: substrate concentration, denatured and undenatured substrate, enzyme concentration, pH, pressure and temperature. Isolated soybean protein was employed as substrate and proteolitic enzyme from Rhizopus chinensis was used. Besides the above mentioned variables, soluble peptide concentration permeate and permeate flow rate during reaction time was measured. The chemical composition of the substrate, enzyme activity and the molecular weights of soluble peptides of the permeate were determined. During the test, it was observed that a lower concentration of soluble peptides in the permeate corresponds to a higher flow rate of permeate and that the concentration of soluble peptides in the permeate is directly related to the concentration of substrate and enzyme in the reactor. Permeate flow rate was found to be proportional to the pressure on the system in the range 1,0 - 2,0 kg/cm² and at a low pressures such as 0,3 kg/cm². The main results obtained during this study the following: - temperature affects soluble peptide concentration in the permeate, encreasing proportionally. - enzyme activity is best in the 2,5 - 3,0 pH range and declines when the pH is lower than 2,5 or larger than 3,0 - the soluble protein yield obtained at different conditions varied from 6,77 to 35,54 %. - the molecular weight of soluble peptides of permeate is less than 10000 / Mestrado / Mestre em Tecnologia de Alimentos

Orientador: Benedito de Oliveira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-19T21:59:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marques_MariaRisoletaFreire_D.pdf: 5230967 bytes, checksum: 560f78c2e493fb4bf266804f21146619 (MD5) Previous issue date: 1994 / Doutorado / Genetica / Doutor em Ciências Biológicas

Orientador: Kleber Gomes Franchini / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-11T19:13:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cardoso_AlissonCampos_M.pdf: 1504948 bytes, checksum: 1996e50c40d74c7a53a5058831fb03ab (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Estudos anteriores demonstraram que em miócitos cardíacos submetidos a estímulos mecânicos ocorre pronta fosforilação e ativação da FAK. Resultados de estudos recentes, realizados em corações de ratos indicaram que em resposta a estímulos mecânicos, a FAK, além de ser ativada, localiza-se no núcleo dos miócitos cardíaco. Estudos conduzidos em corações de ratos Wistar adultos, utilizando a técnica de Imunoprecipitação de cromatina (ChIP) com anticorpo anti- FAK, identificaram uma seqüência intrônica de 182pb do gene fosfolambam (plnil), contendo sítio para a ligação do fator de transcrição MEF2. Portanto, no presente estudo, investigamos se a região intrônica do gene que codifica o fosfolamban tem função regulatória transcricional. Utilizando técnicas de EMSA (Ensaio de retardamento da mobilidade eletroforética), ensaios de Precipitação e de gene reporter, avaliamos a interação entre a FAK e plnil além da função regulatória transcricional dessa seqüência. Como resultado, demonstramos que ocorre pronta ativação da FAK e seu acúmulo no núcleo de miócitos cardíacos de ventrículo esquerdo de ratos submetidos a coarctação da aorta. Através de ensaios de EMSA, demonstramos que proteínas nucleares de ventrículo esquerdo de ratos submetidos a sobrecarga pressórica, apresentaram um aumento na interação com a sonda plni1 em relação aqueles de ratos controles. Também, ensaios de EMSA indicaram uma interação entre MEF2 e a sonda plnil, mas não entre a FAK ou seus domínios (FERM e Cterminal) com a sonda plnil. Ensaios de precipitação com fragmentos recombinantes da FAK (GST-FERM e GSTCterminal) com extratos nucleares de coração de ratos coarctados indicaram uma associação entre FAK e MEF2. Ensaios adicionais demonstraram que a interação entre FAK e MEF2 é dependente do domínio Cterminal e do estado fosforilado da FAK. Estudos de transfecção com gene reporter, utilizando plasmídeo contendo a seqüência plnil, em cultura de miócitos cardíacos submetidos ao estiramento, demonstraram que a região intrônica plnil possui função regulatória transcricional e esse papel é dependente da ligação do fator de transcrição MEF2 ao seu sítio específico no DNA. Portanto, esses dados indicam que FAK e MEF2 podem estar envolvidos na regulação da expressão do gene pln através de regulação mediado pela região intrônica plnil. / Abstract: Previous studies have shown that mechanical stress induces phosphorylation and activation of FAK in cardiac myocytes. Recent studies carried out in rat overloaded hearts indicated that FAK re-locates in the nucleus of the cardiac myocytes. By assays in the nuclei of overloaded cardiac myocytes with chromatin immunoprecipitation (ChIP) approach with anti-FAK antibody, we identified an intronic sequence of phospholamban gene (plnil), containing a MEF2 consensus site. In the present study, we investigated whether Plnil has any regulatory function in the pln. To accomplish this, we combinated techniques such as EMSA (Electrophoreses Mobility Shift Assay), reporter gene and pulldown assays. FAK was shown to be rapidly activated and to accumulate in the nuclei of cardiac myocytes taken from overloaded left ventricle. Using EMSA assays, we demonstrated that nuclear extracts of left ventricle rats overloaded, interacted with the plnil probe. EMSA assays, also indicated an interaction between MEF2 and the plnil probe, but no interaction was found between FAK or its domains (FERM and Cterminal) with the plni1. Pulldown assays with FAK recombinant fragments (GST-FERM and GST-Cterminal) and nuclear extracts from left ventricle overloaded indicated that FAK and MEF2 physically interact through FAK Cterminal domain. Reporter gene assays, using a construction of plnil coupled luciferase transfected to cardiac myocytes culture underwent stretching, had demonstrated that the intronic region has transcriptional regulatory function and this role is dependent of the transcription factor MEF2 binding site in the DNA. Therefore, these data indicate that FAK and MEF2 interact in the nuclei of cardiac myocytes and that FAK/MEF2 complex may regulate phospholamban gene expression through the plnil. / Mestrado / Medicina Experimental / Mestre em Fisiopatologia Médica

Orientador: Kleber Gomes Franchini / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-20T13:11:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Antunes_MichelleBuenodeMouraPereira_D.pdf: 4387492 bytes, checksum: bf7a9e478bc9627b01a4e45548a6f170 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Diversos tipos celulares respondem ao estresse mecânico ativando sinais que culminam com remodelamento e sobrevivência. O estresse mecânico pode atuar como agente modulador da homeostase celular e de numerosos processos patológicos. Evidências sugerem que a Quinase de Adesão Focal (FAK) medeia a resposta de miócitos cardíacos ao estresse mecânico. Contudo, os mecanismos moleculares que regulam a função da FAK ainda não são totalmente conhecidos. No presente trabalho foi demonstrado que a small heat shock protein ?B-Cristalina interage de forma direta e protege a FAK da degradação pela calpaína 2. Ensaios de pull down, cross-linking acoplado a espectrometria de massas, mutagênese sítio dirigida, docking e modelagem molecular demonstraram que as ?-hélices 1 e 4 do domínio FAT da FAK interage no sítio de ligação constituído pelas folhas ?4 e ?8 da ?B-Cristalina. Os dados funcionais e estruturais obtidos indicaram que ocorre um aumento da associação da ?B-Cristalina e o domínio FAT da FAK após mudanças conformacionais associadas com a fosforilação dependente de Src da tirosina 925. Experimentos de pull down demonstraram que a associação com a ?B-Cristalina protege a FAK da proteólise mediada pela calpaína 2. Miócitos cardíacos submetidos ao silenciamento gênico da ?B-Cristalina apresentaram uma menor quantidade de FAK detectada em 125 KDa, indicando que esta interação protege FAK da proteólise. A submissão dessas células ao estiramento cíclico revelou uma maior taxa de morte celular por apoptose, sendo que a superexpressão da FAK restaurou a viabilidade celular. Os achados deste trabalho indicam que o complexo formado entre FAK e ?B-Cristalina apresenta papel fundamental na proteção da FAK da proteólise durante o estresse mecânico, sendo importante na manutenção da sobrevivência celular / Abstract: Cell types of diverse function respond to mechanical stress by triggering downstream signals for remodelling and survival. As such, mechanical stress impacts organismal homeostasis and numerous pathologic processes. Evidence suggests that focal adhesion kinase (FAK) mediates the responses of myocytes to mechanical stress, yet the molecular mechanisms to regulate FAK function are unclear. We find that FAK is recognized and protected from calpain-induced degradation by the small heat shock protein alpha-B crystalline (CryAB). A model based in the pull down, crosslinking technology coupled with mass spectrometry, site-directed mutagenesis, molecular docking and molecular modeling indicated that a cleft formed by ?4 and ?8 sheets of ?B-Crystalline is critical to the interaction with ?-helix 1 and ?-helix 4 of FAK. Functional and structural data indicated that CryAB binds directly the FAT domain of FAK upon changes in conformation associated with Src-dependent phosphorylation of tyrosine 925 induced by cell stretch. Pulldown assay indicated that ?B-Crystalline interacts and protects from calpain-induced degradation FAK. Cardiomyocytes depleted of CryAB show reduced FAK quantity detected in 125KDa, indicating that this interaction protects degradation of FAK. The submission of such cells to stretch cyclic revealed a higher rate of cell death via apoptosis, whereas restoration of FAK expression restored cell viability. Our findings highlight a new role for CryAB in forming a complex with FAK that is essential for regulating cardiomyocyte survival in response to mechanical stress / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutor em Ciências

Orientador: Goran Neshich / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T22:35:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moraes_FabioRogeriode_D.pdf: 15399723 bytes, checksum: 4f1315f86b2c74d078c5105b299a9750 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Dentro do ambiente celular, há uma variedade de moléculas e a interação entre si regulam praticamente todos os processos necessários e essenciais para a manutenção da vida. Interações entre proteínas estão envolvidas no controle de vários processos intra e intercelulares, como regulação metabólica e da expressão gênica, reconhecimento antígeno-anticorpo etc. que definem as características biológicas do funcionamento da vida entre os diversos organismos. Ao conhecer a interface de interação de uma proteína chave para desenvolvimento de casos patológicos, é possível desenhar drogas com alta especificidade com o sítio de ligação. Para avançar nessa frente, o conhecimento da estrutura proteica é fundamental, porém não suficiente. É necessário conhecermos o sítio de ligação alvo para cada parceiro de interação. Este estudo visa entender as características do nano-ambiente das interfaces proteicas - área através da qual as macromoléculas se comunicam e exercem sua funcionalidade. Propomos utilizar uma abordagem de estudo das características físico-químicas e estruturais dos resíduos formadores de interfaces de complexos conhecidos e com estrutura quaternária resolvida experimentalmente, utilizando um conjunto de dados sem redundância sequencial, extraindo os parâmetros/descritores que descrevem de forma objetiva as diferentes classes de complexos, revelando as características principais sobre interações proteína-proteína. A finalidade deste trabalho é de conhecer os detalhes que definem uma área como interface e aplicá-lo em uma ferramenta preditiva para todas as proteínas com arranjo estrutural conhecido e/ou modelado. Propomos de forma pioneira, o uso de classificadores específicos para cada tipo de aminoácido e independente do uso de descritores sobre conservação de aminoácidos. Resultados obtidos com classificador linear e por ensemble de redes neurais destacam a nossa abordagem, desenhada e aplicada nesta tese, como uma com os melhores indicadores de desempenho na predição precisa dos resíduos de aminoácido na interface entre as abordagens descritas recentemente na literatura. Ainda, enquanto os outros métodos dependem de descritores sobre conservação de aminoácidos, é mostrado aqui que nenhum ganho de desempenho é obtido com a incorporação de tais descritores em nosso modelo classificador. Esse resultado indica que o uso de descritores puramente físico-químicos e estruturais é suficiente para explicar o grau de conservação dos aminoácidos / Abstract: Inside cells, there is a variety of molecules and their interactions regulate virtually all necessary and essential processes to the maintenance of life. Interactions among proteins are involved in the control of several processes within and out of the cell, such as, metabolic and gene expression regulation, anti-body and antigen recognition, etc. that defines biological characteristics of life among many organisms. If the protein interface amino acids of a key protein related to a given pathologic phenomenon are known, it is possible to rationally design drugs with high specificity for a specific binding site. To gain insight in this field, the knowledge of the protein three-dimensional structure is mandatory, but not sufficient. It is also necessary to know the interface between the target protein and its partners. This study focuses in understanding the characteristics of the area through which the macromolecules communicate to each other and exercise their function. Here, it is proposed an approach to study the physicochemical and structural characteristics of the interface forming residues with known quaternary structure (experimentally solved). It was selected a sequence non-redundant dataset and by extracting parameters/descriptors, that objectively describe different complex classes, it was possible to unravel the basic characteristics of protein-protein binding. The goal of this study is to unravel the details that outline a specific area as interface and apply it in a form of a predictive tool for all proteins with known atomic structure. It is proposed by the first time, the use of amino acid specific classifiers regarding amino acid type and free of amino acid conservation attributes. The results obtained here by employing linear and ensemble of neural network classifiers show that, based on purely physicochemical and structural descriptors, it is possible to get precise predictions about interface forming residues in protein-protein assemblies. Comparatively, the method described here retains better performance indicators than the ones recently described in the literature. In addition, we showed that, for our method, adding "conservation" attributes does not induce any performance gain, which is a major difference if compared to other described methods. This result indicates the purely physicochemical and structural descriptors are sufficient to explain how conserved amino acids are / Doutorado / Bioinformatica / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientadores: Everardo Magalhães Carneiro, Marcia Queiroz Latorraca / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T10:35:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Veloso_RobertoVilela_D.pdf: 1133010 bytes, checksum: ae2bb8d027240ebc20854087fa364a1b (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A restrição protéica materna reduz o crescimento e promove alterações permanentes na estrutura e função de órgãos da prole, contribuindo para o desenvolvimento de doenças cardiovasculares, obesidade e diabetes. O consumo de alimentos à base de soja está associado a um menor risco de desenvolver diabetes pelo seu conteúdo de isoflavonas e pela composição de aminoácidos de sua proteína que contribuem para uma melhora na secreção de insulina. Tem sido sugerido que a genisteína, uma isoflavona da soja, modula a secreção de insulina através das vias AMPc/PKA e PLC/PKC. Deste modo, nós avaliamos o valor biológico da dieta à base de farinha de soja e seus efeitos sobre o crescimento de órgãos, o perfil de aminoácidos, insulina e metabólitos séricos em ratos submetidos à restrição protéica na infância e recuperados com essa dieta após o desmame, bem como o efeito da dieta à base de soja sobre a secreção de insulina em resposta a glicose e a ativadores do adenilato ciclase e proteína quinase C, além da expressão da PKAa e PKCa em ilhotas pancreáticas de ratos adultos. Ratos de mães alimentadas com 17% ou 6% de proteína (caseína) durante a gestação e lactação foram mantidos com dieta contendo 17% de proteína à base de caseína (grupos CC e RC) ou dieta com 17% de proteína à base de farinha de soja (grupos CS e RS) e dieta com 6% de proteína (grupo HP). Após 90 dias de idade, proles de mães alimentadas com dieta hipoprotéica exibiram déficit permanente de peso corpóreo e de concentrações séricas de insulina, taurina, glutamina, fenilserina e lisina, porém apresentaram um aumento no peso relativo dos órgãos, exceto do fígado. A dieta à base de farinha de soja reduziu o peso relativo do fígado e aumentou as concentrações séricas de insulina, taurina, ornitina e fenilserina. Embora ratos recuperados com soja (RS) tenham ingerido mais dieta proporcionalmente ao peso corpóreo do que os ratos recuperados com caseína (RC) eles mostraram menor coeficiente de eficácia alimentar, e resultou em peso corpóreo final similar entre esses grupos. As concentrações séricas de albumina e proteínas totais não diferiram entre os grupos RS e RC. A dieta à base de soja melhorou a resposta de células beta de ratos controles em concentrações fisiológicas de glicose, enquanto em ilhotas de ratos recuperados isso ocorreu na presença de concentrações suprafisiológicas de glicose. A presença de PMA induziu uma resposta secretória com potência similar em ilhotas dos grupos RS e CS e a expressão de PKC foi similar em todos os grupos, exceto no grupo HP, que expressou menores concentrações dessa proteína. A adição de forskolin ao meio de incubação aumentou a secreção de insulina em ratos recuperados e naqueles mantidos com caseína e a expressão de PKAa foi maior no grupo RS em relação ao grupo CS. Esses resultados sugerem que dieta à base de farinha de soja é capaz de promover a recuperação nutricional em animais submetidos à restrição protéica em fases críticas de desenvolvimento, melhorando o perfil de aminoácidos séricos que estimulam a secreção de insulina. Além disso, a melhora na secreção de insulina parece não ser devido a ativação das vias AMPc/PKA e inositol fosfato/PKC / Abstract: Maternal protein restriction leads to reduction in the growth of organs, permanent changes in their structure and functions contributing to development of cardiovascular disease, obesity and diabetes. Consumption of soy-based foods is associated to lower risk of diabetes by its isoflavone content and amino acid composition of its protein that contribute to improve of insulin secretion. It has been suggested that genistein, soy isoflavone, modulates the insulin secretion through of cAMP/PKA and PLC/PKC pathways. Thus, we evaluated the biological value of soybean flour diet and its effects on organ growth, serum amino acids, insulin and metabolites profile in rats submitted to protein restriction in early life and recovered with those diet after weaning, as well as, the effect of soybean diet on insulin secretion in response to glucose and activators of adenylate cyclase and PKC, besides the expression of PKA and PKC in pancreatic islets from adult rats. Rats from mothers fed with 17% or 6% protein (casein) during pregnancy and lactation were maintained with 17% casein (CC and CR groups) or soybean (SC and SR groups) diet and with 6% casein (LP groups) diet. At 90d of age offspring of protein-restricted-mothers exhibited permanent deficit of body weight, serum insulin, taurine, glutamine, phenylserine and lysine concentrations, but increased relative organs¿ weight, except liver. Soybean flour diet reduced the relative liver weight and increased serum insulin, taurine, ornithine and phenylserine concentrations. Although SR rats had eaten proportionally to body weight more diet than CR rats they showed lower feed conversion efficiency which resulted in the final body weight similar between these groups. The SR and CR also exhibited similar serum albumin and protein concentrations. Soybean diet improved the response of ß-cells from control rats to a physiological concentration of glucose, whereas in islets from recovered rats this occurred in presence of a supra-physiological glucose concentration. PMA induced similar potent secretory response in islets from SR and SC groups and PKC expression was similar in all groups, except LP that expressed lower levels this protein. Forskolin increased the insulin secretion in recovered rats and in those maintained with casein diet and PKA expression was higher in SR than in SC rats. These results suggest that soybean flour diet is able to promote the nutritional recovery in animals submitted to protein restriction in critical phase of development improving serum amino acid levels that have the stimulatory effect on insulin release. Moreover the improve of insulin secretion seemed does not to be due the activation of the cAMP/PKA and inositol phosphate/PKC pathways / Doutorado / Fisiologia / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Jorg Kobarg / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-07T08:03:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Passos_DarioOliveirados_D.pdf: 4831709 bytes, checksum: 0aa3e031d4e82dc447636416b68401e8 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: A proteína Ki-1/57 que é encontrada tanto no núcleo quanto no citoplasma está associada com atividade de proteína quinase serina/treonina e é fosforilada nestes resíduos após ativação celular. Neste trabalho verificamos que Ki-1/57 interage com a proteína Chromatin-Helicase-DNA-binding domain 3 (CHD3) e com a proteína adaptadora/sinalizadora RACK1 no núcleo. Pelo sistema do duplo híbrido de levedura (SDHL) a proteína arginina metiltransferase 1 (PRMT1) foi selecionada como outra proteína de interação. A PRMT1 integra uma família representada por nove enzimas humanas que catalisam reações de metilação em resíduos de arginina. Em seguida, usando agora a PRMT1 como isca - no SDHL - identificamos as proteínas Ki-1/57 e hnRNPQ, juntamente com outras 13. A maioria delas contêm motivos ¿RGG-box¿ em suas seqüências de aminoácidos, que são conhecidos alvos para metilação. Posteriormente verificamos que Ki-1/57 e seu provável parálogo CGI-55 conservam dois motivos ¿RGG/RXR-box¿ e que são substratos in vitro para a metilação de argininas pela PRMT1. Estudos de mapeamento mostraram que todos os fragmentos contendo o motivo ¿RGG/RXR-box¿ interagem com a PRMT1 e são alvos à metilação in vitro. Ki-1/57 endógena, imunoprecipitada de células L540, mostrou ser metilada in vivo, além de ser um alvo a metilação pela PRMT1 in vitro, somente quando as células são previamente tratadas com o inibidor da metilação Adox. Tratamento das células Hela com o inibidor da metilação (Adox) causa desaparecimento da imuno-marcação citoplasmática de Ki-1/57 e relativa redistribuição do parálogo CGI-55 para o citosol. Assim, pode ser especulado que a metilação destas proteínas deve ser um evento importante para suas localizações subcelulares e conseqüentemente para suas funções. Em resumo, nossos dados sugerem que o SDHL é um método efetivo na identificação de novos substratos celulares para a PRMT1 e poderia ser estendido para a identificação e caracterização de novos substratos para os outros integrantes da família das PRMTs humanas / Abstract: The protein Ki-1/57 that is found both in the cytoplasm and nucleus is associated with serine/threonine protein kinase activity and gets phosphorylated on serine and threonine residues upon cellular activation. We demonstrated that Ki-1/57 interacts with the Chromatin-Helicase-DNA-binding domain protein 3 (CHD3) and with the adaptor/signaling protein RACK1 in the nucleus. By utilizing the yeast two-hybrid system (YTHS), we were further able to find the protein arginine-methylatranseferase-1 (PRMT1) as another interacting protein. PRMT1 is a member of the family constituted by 9 human enzymes that catalyze methylation reactions on arginine residues. Afterwards, by using PRMT1 as bait in the YTHS we identified both Ki-1/57 and NSAP1 as interacting proteins, along with 13 other proteins. The majority of them present RGG-box clusters in their amino acid sequences, which are known to be targets for arginine methylation. We further found that Ki-1/57 and its putative paralogue CGI-55 have two RGG/RXR-box clusters conserved between them and that they are substrates for arginine-methylation by PRMT1 in vitro. In mapping studies, we observed that all Ki-1/57 protein fragments containing the RGG/RXRbox clusters interact with PRMT1 and are targets for methylation in vitro. Endogenous cellular Ki-1/57 seems to be methylated in vivo and is a target for methylation by PRMT1 in vitro, only when cells have been previously treated with the methylation inhibitor Adox. Treatment of Hela cells with the inhibitor of methylation (Adox) causes the disappearance of the immuno-staining of Ki-1/57 in the cytoplasm and a relative redistribution of the paralogue CGI-55 to the cytosol. It can therefore be speculated that the methylation of these proteins is important for their sub-cellular localization and in consequence for their function. In summary our data suggest that the YTHS is an effective method for the identification of novel cellular PRMT substrates and could be extended for the identification and characterization of novel substrates to the other components of the human PRMT1 family / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular