Orientador: Nilson Ivo Tonin Zanchin / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T18:49:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Alves_BeatrizSantosCapela_D.pdf: 5512305 bytes, checksum: 707ea6299bc24ddc6fb459520d79aeee (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: O combate à dengue atualmente está limitado praticamente aos esforços de eliminação do mosquito transmissor, o Aedes aegypti, porém esta estratégia não tem se mostrado eficiente. O desenvolvimento de novos instrumentos de combate à dengue requer, portanto, maior conhecimento sobre a biologia do vírus com relação à sua interação com seus hospedeiros. O genoma do vírus é constituído por um RNA simples-fita de polaridade positiva e possui duas regiões não traduzidas (5¿ e 3¿ UTR). A região 5¿UTR viral possui organização similar à dos mRNAs eucarióticos, diferentemente da região 3¿UTR que é longa e não possui cauda de poli(A). Em vez disso, na região 3¿UTR encontram-se estruturas conservadas entre os diferentes Flavivirus, dentre elas a estrutura 3¿ stem-loop (3¿SL) que é indispensável para a replicação do RNA viral. O objetivo do nosso estudo foi identificar novas proteínas humanas capazes de interagir com a estrutura 3¿SL do RNA do vírus da dengue. Dados da literatura descrevem que a proteína Mov34 de camundongo interage com 3¿SL do vírus da encefalite japonesa. Devido à alta similaridade entre as proteínas ortólogas humana e de camundongo, bem como das respectivas estruturas 3¿SL dos vírus da dengue e da encefalite japonesa, foi testada a interação entre a Mov34 humana com o 3¿SL do vírus da dengue. Porém, em nenhuma das condições testadas foi possível obter evidência de interação da Mov34 humana com 3¿SL dos vírus da dengue e da encefalite japonesa. Para a identificação de novas proteínas que são capazes de interagir com a estrutura 3¿SL do RNA do vírus da dengue foi utilizado o ensaio de triplo-híbrido de levedura. A proteína humana PACT, conhecida como proteína celular ativadora de PKR, foi isolada neste ensaio utilizando 3¿SL como isca. PKR é uma quinase ativada por PACT ou RNA dupla-fita. A ativação de PKR leva a um estado antiviral adquirido pela fosforilação do fator de iniciação da tradução eIF2a e conseqüente inibição da tradução. Além disso, PKR está envolvida em outras vias de transdução de sinal e na resposta celular à proteínas desenoveladas. A ação antiviral de PACT é evidenciada pela ação de proteínas dos vírus influenza A e herpes simplex tipo 1 que inibem a ativação de PKR por PACT e por RNA dupla-fita. A interação direta de PACT com 3¿SL do RNA do vírus da dengue foi confirmada por ensaio de UVcrosslinking PACT possui três domínios de interação com RNA dupla-fita, sendo que os dois domínios N-terminais são responsáveis pela sua interação com o 3¿SL. Foi identificada uma região específica do 3¿SL, o stem-loop superior, onde PACT interage com maior afinidade. Além disso, foi mostrado que PACT endógena de células HEK293 é capaz de interagir com o 3¿SL biotinilado. Para caracterizar a função desta interação durante a infecção viral, foi desenvolvida uma linhagem celular com inibição da expressão de PACT através da técnica de RNA de interferência. Com esta linhagem poderemos analisar a importância da interação entre PACT e o RNA do vírus da dengue quanto à ativação e/ou inibição de PKR durante a infecção viral / Abstract: The combat to the dengue virus is basically limited to the efforts in eliminating the transmitter mosquito, the Aedes aegypti. But this strategy is not very efficient. The development of new instruments of combat to dengue virus requires improved knowledge about the virus biology and its relation to hosts. The dengue virus genome is a single-stranded RNA of positive polarity flanked by a 5¿ untranslated region (UTR) of ~100 bases and a highly structured 3¿ UTR of ~450 bases. As many other viruses, dengue encodes the enzymes required for its genome replication, but relies completely on the host translational machinery to synthesize its proteins. The essential difference between host cellular mRNAs and dengue virus genome RNA involves the 3¿UTR, which instead of a polyadenylate tail contains highly conserved structural elements, including the 3' stem-loop (3¿SL), located at the 3' terminus of the 3'UTR of many flaviviruses that is essential for their replication. The aim of this study is to identify new human proteins capable of interacting with dengue virus RNA 3¿SL structure. Literature data describe that the murine Mov34 protein interacts with Japanese encephalitis virus 3¿SL. Giving the high similarity between the human and murine ortholog proteins, as well as the conservation of the Flavivivirus RNA 3¿SL structure, we tested the interaction between the human Mov34 and the dengue virus 3¿SL. However, no interaction was detected under the conditions used in this work. In addition, the yeast three-hybrid system was used to screen for novel proteins that interact with the dengue virus 3¿SL. Human PACT, known as the cellular protein activator of PKR, was identified as a putative 3¿SL-interacting protein. PKR is an interferon-inducible, PACT or double-stranded RNA activated protein kinase. Activated PKR phosphorylates the translation initiation factor eIF2a, inhibiting translation of cellular and viral RNAs, leading to a cellular antiviral state. PACT and doublestranded RNA activation of PKR is inhibited by influenza A and herpes simplex type 1 virus proteins during viral infection, indicating that PACT plays a role in the cellular antiviral state. Direct interaction between PACT and 3¿SL was confirmed by UV-crosslinking assays. PACT contains three doublestranded RNA interaction motifs, but only the two N-terminal motifs are responsible for 3¿SL interaction. A 3¿SL specific region, the top stem-loop, was identified to interact with PACT with higher affinity. Furthermore, HEK293 cells endogenous PACT interacts with biotin-labeled 3¿SL. To further characterize PACT-3¿SL interaction during dengue virus infection, a cell line with low expression of PACT was developed using the RNA interference technique. This cell line will be used to determine the propagation rate of dengue virus which is expected to reveal the importance of PACT either for the cell antiviral state or for dengue virus proliferation / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador: Carlos Henrique Inácio Ramos / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T21:37:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gava_LisandraMarques_D.pdf: 9573403 bytes, checksum: 4d69a29d08ffc20e4544b876f131fb0d (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A função biológica das proteínas está relacionada à sua estrutura tridimensional adquirida pelo processo de enovelamento protéico. Neste contexto, proteínas denominadas, genericamente, de chaperonas moleculares exercem papel fundamental atuando no auxílio do enovelamento correto, no reenovelamento e na dissociação de agregados protéicos. A Hsp90 é uma das chaperonas moleculares mais importantes, é essencial para a viabilidade celular em eucariotos e está normalmente associada a proteínas atuantes no ciclo e sinalização celular, o que torna essa chaperona um alvo bastante interessante para abordagens terapêuticas de diversas doenças. A Hsp90 pode ser modulada por co-chaperonas diversas. Nesse trabalho foram caracterizadas as proteínas CHsp90 (domínio C-terminal da Hsp90 humana), e as co-chaperonas Hop e Tom70, além da interação entre C-Hsp90 e Tom70. Foram aplicadas técnicas de dicroísmo circular e emissão de fluorescência do triptofano; seguidas pela caracterização por ultracentrifugação analítica, gel filtração analítica, espalhamento dinâmico de luz, cromatografia de gel filtração acoplada a espalhamento de luz em multi-ângulos (SEC-MALS) e gel nativo. Para os ensaios de interação foram aplicadas técnicas de pull-down, SEC-MALS e calorimetria de titulação isotérmica. As proteínas foram produzidas puras e enoveladas, com estado oligomérico determinado como dímero para C-Hsp90 e monômero para Hop e Tom70, sendo que essas também foram encontradas como espécies diméricas. A estequiometria de interação entre a C-Hsp90 e Tom70 foi determinada em 1 monômero da Tom70 para 1 dímero da C-Hsp90, com KD de 360 ± 30 nM, ?Happ = -2,6 ± 0,1 kcal/mol e ?S = 21 ± 1 cal/mol.K, sugerindo que a interação é dirigida por entalpia e entropia. Os resultados obtidos nesse trabalho contribuem para uma melhor compreensão do sistema Hsp90, que está envolvido em diversos processos celulares essenciais e patológicos, como doenças neurodegenerativas, processos inflamatórios, infecções e câncer / Abstract: The biological function of proteins is related to its three dimensional structure acquired via protein folding process. In this context, the molecular chaperones play a key role acting as auxiliary protein on protein folding, refolding and dissociation of protein aggregates. Hsp90 is one of the most important molecular chaperones, is essential for cell viability in eukaryotes and is usually associated with proteins involved in cell cycling and cell signaling, which makes these chaperone a very interesting targeting for therapeutic approaches for several diseases. The chaperone activity of Hsp90 can be modulated by other proteins, called co-chaperones. In this work, we characterized the protein C-Hsp90 (Cterminal domain of human Hsp90) and the co-chaperones Hop and Tom70, and also the interaction between C-Hsp90 and Tom70. Circular dichroism and fluorescence emission of tryptophan was first applied for initial characterization of the proteins, followed by analytical ultracentrifugation, analytical gel filtration, dynamic light scattering, size exclusion chromatography - multi angle light scattering (SEC-MALS) and native gel. The interaction between C-Hsp90 and Tom70 were measured by techniques like pull-down, SEC-MALS and isothermal titration calorimetry. The proteins were produced pure and soluble and their oligomeric state were determined as dimer for C-Hsp90, and monomer for Hop and Tom70, these two co-chaperones were also found as dimeric species. The stoichiometry of interaction between C-Hsp90 and Tom70 was determined by SEC-MALS and ITC as been 1 dimer of C-Hsp90 to 1 monomer of Tom70, with a KD of 360 ± 30 nM, ?Happ = -2.6 ± 0.1 kcal/mol and ?S = 21 ± 1 cal/mol.K, suggesting that these interaction is driven by both, enthalpy and entropy. The results contribute to a better understanding of the important Hsp90 machinery, which is involved in many essential cellular and pathological processes, such as neurodegenerative diseases, inflammation, infection and cancer / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientadoesr: Carlos Henrique Inácio Ramos, Gonçalo Amarante Guimarães Pereira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T06:21:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Goncalves_DanieliCristina_M.pdf: 10469841 bytes, checksum: df29d5b11d3cdd27679b971b2bbcb032 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Chaperonas moleculares (Heat Shock proteins - HSPs) são componentes chave do sistema de controle de qualidade de proteínas (PQC - Protein Quality Control), que é essencial para a vida, sendo responsável por manter a homeostase proteica e a adequada função de diversas vias. Problemas no processo de enovelamento estão relacionados a doenças degenerativas, amilóides e câncer. Em plantas, as chaperonas moleculares desempenham um papel crucial na proteção contra estresses bióticos e abióticos, pois como organismos sésseis, as plantas devem ser capazes de responder rapidamente a mudanças na temperatura, salinidade, déficit hídrico, entre outros. A chaperona molecular Hsp90 (Heat Shock protein 90 kDa) compreende uma família ubíqua, considerada um 'hub' por interagir com chaperonas, co-chaperonas e ter como clientes proteínas regulatórias essenciais como fatores de transcrição, quinases, receptores de hormônios, entre outros. A Hsp90 age em conjunto com co-chaperonas, as quais modulam e direcionam sua função. Uma destas co-chaperonas é a Hop (Hsp70-Hsp90 organizing protein), capaz de interagir simultaneamente com a Hsp90 e Hsp70, mediando a transferência de substratos. A Hop é composta por três domínios com repetições de tetratricopeptídeos (TPR) (TPR1, TPR2A e TPR2B), responsáveis pela interação com as chaperonas, porém a dinâmica desta interação não está bem entendida, uma vez que ainda não há estrutura da Hop inteira e o estado oligomérico desta co-chaperona ainda é controverso na literatura. Neste trabalho apresentamos a classificação de um gene de Hsp90 de cana-de-açúcar, e o início de sua caracterização funcional através de transgenia em Arabidopsis thaliana. Apresentamos também a caracterização biofísica de uma importante co-chaperona da Hsp90, a Hop (Hsp70-Hsp90 organizing protein) humana. Através da análise de sequências a Hsp90 de cana-de-açúcar foi classificada como Hsp90-3, uma isoforma citosólica. Plantas transgênicas de A. thaliana, produzidas a partir da inserção do gene da Hsp90-3 de cana-de-açúcar, apresentaram níveis reduzidos de Hsp90. Tal perturbação nos níveis de Hsp90 parece ter afetado a expressão de outras proteínas da rede de interações, relacionadas com processos diversos como resposta imune e fotossíntese. As plantas transgênicas também exibiram germinação mais rápida e raízes mais longas em relação ao controle. Sob estresse térmico, linhagens transgênicas apresentaram maior suscetibilidade à alta temperatura em relação ao controle. Tais resultados sugerem que a Hsp90 tem um importante papel na fisiologia celular e no desenvolvimento, e que os níveis de Hsp90 são críticos para a resposta frente a estresses. A caracterização biofísica do mutante Hop D456G, uma mutação no domínio TPR2B, mostrou que esta proteína é uma mistura de monômeros, dímeros e oligômeros maiores, porém com prevalência do estado monomérico. O resíduo D456 pode ter uma participação na dinâmica de dimerização e é possível que o estado oligomérico da Hop seja regulado entre os estados monomérico e dimérico, com a finalidade de facilitar sua atividade adaptadora / Abstract: Molecular chaperones (heat shock proteins - HSPs) are key components of protein quality-control system (PQC - Protein Quality Control), which maintains protein homeostasis and the proper function of several pathways, being essential for life. Defects in folding processes are related to degenerative diseases, amyloidosis and cancer. In plants, which as sessile organisms must be able to respond rapidly to changes in temperature, salinity, water deficit, and others, molecular chaperones play a crucial role in protecting against such biotic and abiotic stresses. Molecular chaperone Hsp90 (Heat Shock Protein 90 kDa) comprise an ubiquitous family, considered a hub as it interacts with chaperones, co-chaperones, and have as clients key regulatory proteins such as transcription factors, kinases, hormone receptors, and others. The chaperone acts together with co-chaperones, which modulate and guide Hsp90 function. The co-chaperone Hop (Hsp70-Hsp90 organizing protein), interacts simultaneously with Hsp90 and Hsp70, mediating substrate transfer. Hop has three TPR domains (TPR1, and TPR2A TPR2B) responsible for interaction with the chaperones, but this interaction dynamics remains unclear, since there is no structure of full length Hop and its oligomeric state is controversial in literature reports. This work presents the classification of an Hsp90 gene from sugarcane, and primary functional characterization studies in Arabidopsis thaliana transgenic lines. We also present the biophysical characterization of the human Hsp90 co-chaperone Hop (Hsp70-Hsp90 organizing protein). Through sequence analysis the Hsp90 from sugarcane has been classified as Hsp90-3, a cytosolic isoform. Transgenic A. thaliana, produced by Hsp90-3 insertion, exhibited reduced transcript levels of Hsp90. This disruption in Hsp90 levels seems to affect the expression of other proteins from the interaction network, which are related to various processes such as immune response and photosynthesis. Transgenics also exhibited faster germination and longer roots than the control. Under heat stress, transgenic lines showed increased susceptibility to high temperature. These results suggest that Hsp90 has an important role in cellular physiology and development; in addition the levels of Hsp90 are critical for responses to stresses. The biophysical characterization of the mutant D456G Hop, a mutation in domain TPR2B showed that this protein is a mixture of monomers, dimers and higher oligomers, but the monomeric state is majoritary. The residue D456 may be involved in dimerization dynamics, and it is possible that Hop is regulated between monomeric and dimeric species, to enable its adaptor functions / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Nilson Ivo Tonin Zanchin / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-14T12:40:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 KosckyPaier_CarlosRoberto_M.pdf: 3760581 bytes, checksum: 99331529324819b59a4360d60efd9b9a (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A quinase de 70 kDa da proteína ribossomal S6, isoforma 1 (S6K1), é uma fosfoproteína implicada na regulação de genes relacionados ao controle da tradução em mamíferos e possui uma forma nuclear (a1) e uma citoplasmática (a2). A fosforilação do seu principal alvo, a proteína RPS6, tem sido comumente associada ao recrutamento seletivo dos 5'-TOP (5' tract of oligopyrimidine) mRNAs pela maquinaria de tradução, embora haja estudos contrariando esta hipótese. Devido às funções de seus demais alvos, S6K1 tem sido implicada na sobrevivência celular e em diversos outros processos, como crescimento, câncer e resistência à insulina. S6K1 é ativada por um mecanismo que envolve fosforilação seqüencial através da ativação das vias mTORC1 (complexo 1 do alvo da rapamicina em mamíferos) e PI3K (fosfoinositol-3 quinase). Como uma quinase da família AGC, S6K1 deve ser fosforilada por mTORC1 no resíduo Thr389 do domínio hidrofóbico e, em seguida, por PDPK1 (proteína quinase 1 dependente de fosfoinositol) no resíduo Thr229 da alça T do domínio catalítico. Estes eventos ocorrem somente após a fosforilação em diversos sítios do domínio auto-inibitório carboxiterminal, por mTORC1. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um ensaio modelo para análise da função da S6K1 in vitro e utilizá-lo como ferramenta na elucidação do papel de proteínas adaptadoras da via de mTOR em interações com a S6K1. Para isso foi necessário produzir as proteínas recombinantes para ensaios de interação e para realização de um ensaio de atividade para a S6K1. Foram testados vários sistemas de expressão para Escherichia coli para produção das construções GST-S6K1a1-His6, GST-S6K1a2-His6 e GST-S6K1a2T389E?CT (forma a2 de S6K1 com a substituição T389E e o carboxiterminal truncado), GST-PDPK1 e GST-CDPDPK1 (domínio catalítico de PDPK1 fusionado a GST). A expressão das formas truncadas de S6K1 e PDPK1 foi mais eficiente em E. coli. Embora o rendimento tenha ficado muito aquém do esperado, foi suficiente para os ensaios de interação in vitro. Também foi feita a expressão em E. coli da região C-terminal da proteína RPS6, que é o substrato da S6K1, em fusão com a proteína D do fago ?. Posteriormente, foram montados sistemas de expressão das construções His6-S6K1a2T389E?CT e His6-CDPDPK1 em células de inseto, a partir de vetor de baculovírus. Constatou-se que essas construções são expressas na forma de fosfoproteínas em células de inseto. Ensaios de GST pull-down com GST-S6K1a2-His6 e GST-S6K1a2T389E?CT contra as duas isoformas da subunidade catalítica da PP2AC, His6-PP2ACa(maior) e His6-PP2ACa(menor), revelaram que His6-PP2ACa(maior) não interage com GST-S6K1a2-His6, embora interaja fortemente com GST-S6K1a2T389E?CT. Já a construção His6-PP2ACa(menor) interage fracamente com as construções GST-S6K1a2-His6 e GST-S6K1a2T389E?CT. Tomados em conjunto, os resultados sugerem que a presença do C-terminal não fosforilado de S6K1a2 impede a interação com PP2ACa(maior). PP2ACa(menor) comporta-se de forma completamente diferente da isoforma maior, pois a interação entre PP2ACa(menor) e S6K1a2 parece ser independente do carboxiterminal da quinase, visto que as quantidades de S6K1a2T389E?CT e de S6K1a2 inteira que interagem com PP2ACa(menor) são semelhantes. Esses resultados necessitam ainda serem confirmados in vivo. Outros experimentos de GST pull-down confirmaram que as construções de S6K1 não interagem com a4, embora interajam com TIPRL1. Se confirmado in vivo, esse resultado compõe um novo quadro na regulação coordenada entre mTOR1 e PP2A, do qual TIPRL1 parece participar. As construções genéticas e os sistemas de expressão gerados neste trabalho possibilitaram a obtenção dos reagentes necessários para analisar o mecanismo de regulação da quinase S6K1, mediado por proteínas regulatórias. Permitem também desenvolver uma série de experimentos, como busca de inibidores específicos para a S6K1, que dependem da reconstituição de ensaios de atividade in vitro com a S6K1 ativada. Contudo, o ensaio de atividade realizado não apresentou resultados satisfatórios e precisa ser desenvolvido. / Abstract: The 70kDa ribosomal S6 protein kinase 1 (S6K1) is a phosphoprotein involved in the regulation of genes related to translational control in mammals. S6K1 shows distinct nuclear (a1) and cytoplasmic (a2) forms. Phosphorylation of the S6K1 best characterized target, the protein of the small ribosomal subunit (RPS6), has been generally associated to the selective recruitment of the 5'-TOP mRNAs (5' tract of oligopyrimidine) by the translational machinery, although there is still some controversy on this issue. Due to the function of its targets, S6K1 has been implicated in several cellular processes including cell growth, cancer and insulin resistance. S6K1 is activated by a mechanism of sequential phosphorylation following activation of the mTORC1 (mammalian target of rapamycin complex 1) and PI3K (phosphoinositide-3-kinase) pathways. As a kinase of the AGC family, S6K1 activation requires mTORC1 phosphorylation of residue Thr389 of the hydrophobic domain followed by PDPK1 (phosphoinositide dependent protein kinase 1) phosphorylation of residue Thr229 at the T loop of the catalytic domain. These take place only after phosphorylation by mTORC1 of several residues of the autoinhibitory C-terminal domain. The objective of this work was to develop an assay to analyze the function of S6K1 in vitro and use it as a tool in the discovering of the functions of regulators proteins of the mTOR cascade in interactions with S6K1. For these purposes, expression systems were constructed to produce the various recombinant proteins to be used in the interaction and activity assays. Several genetic constructions were tested in Escherichia coli for the production of GST-S6K1a1-His6, GST-S6K1a2-His6 and GST-S6K1a2T389E?CT (a2 form of S6K1 with the T389E substitution and truncated carboxiterminus), GST-PDPK1 and GST-CDPDPK1 (GST fusion protein of the catalytic domain of PDPK1). The truncated forms were expressed more efficiently in E. coli. Although the yield in E. coli was lower than expected, it was sufficient to perform interaction assays. The C-terminal domain of RPS6, a substrate for S6K1, was successfully expressed in E. coli as a fusion protein with the phage ? protein D. Subsequently, expression systems for production of His6-S6K1a2T389E?CT and His6-CDPDPK1 in insect cells were constructed using baculovirus vectors. It was found that these constructs are expressed in the form of phosphoproteins in insect cells. GST pull-down assays using GST-S6K1a2-His6 e GST-S6K1a2T389E?CT to test interaction with the PP2AC isoforms His6-PP2ACa(major) and His6-PP2ACa(minor) revealed that His6-PP2ACa(major) does not interact with GST-S6K1a2-His6, although it interacts strongly with GST-S6K1a2T389E?CT. On the other hand, His6-PP2ACa(minor) interacts weakly with both GST- S6K1a2-His6 and GST-S6K1a2T389E?CT. This finding suggests that the unphosphorylated C-terminal of S6K1a2 inhibits interaction with PP2ACa(major). His6-PP2ACa(minor) behaves differently form His6-PP2ACa(major). Its interaction with S6K1a2 seems to be independent of the C-terminal since the amounts of S6K1a2T389E?CT and S6K1a2 that interact with His6-PP2ACa(minor) are similar. Future work in vivo is required to confirm these results. GST pull-down assays confirmed that a4 does not interact with the constructions of S6K1, while TIPRL1 interacts with them. If confirmed in vivo, these results provides a new perspective for the coordinated regulation between mTOR1 and PP2A, which apparently involves also TIPRL1. The genetic constructions and expression systems established in this work allow the production of the reagents required to study the mechanism of S6K1 regulation mediated by adaptor proteins. They will also allow the development of experiments such as screening for specific S6K1 inhibitors, which depend on reconstitution of S6K1 activity assays using activated S6K1. Nevertheless, the activity assay performed did not yield satisfactory outcomes and must be improved. / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Gelatina Hidrolisada (GH), Glúten de Trigo (GT) e Isolado Protéico de Soja (IPS) foram misturados em diferentes proporções com o objetivo de substituir proteínas lácteas em uma formulação alimentícia utilizada em programas institucionais de alimentação escolar, buscando-se uma redução de custos sem alterações significativas das propriedades nutricionais e sensoriais do produto final. A qualidade nutricional das misturas foi avaliada de acordo com os métodos \"Escore Químico corrigido pela Digestibilidade PDCAAS\" e \"Razão de Eficiência Protéica - NPR\". As misturas, aplicadas àformulação de uma bebida láctea, foram avaliadas sensorialmente através do método de \"Diferença Escalar do Controle\". Os resultados obtidos experimentalmente pelo delineamento simplex-centróide foram utilizados para modelar equações canônicas de Scheffé que pudessem descrever o efeito da proporção de cada componente na qualidade final. Todos os resultados foram correlacionados através de análise multivariada e representados na forma de Análise de Componente Principal (ACP). Uma \"solução de compromisso\" contendo 25% de GH, 15% GT e 60% de IPS foi selecionada na otimização conjunta das respostas nutricional, sensorial e econômica, resultando na redução média de 6% do custo do produto final sem alteração significativa de qualidade (p < 0,01). Estes resultados revelaram a eficiência da utilização de técnicas estatísticas multivariadas na otimização simultânea e na visualização das interações que ocorrem em processos complexos como sistemas biológicos. / Hidrolizated Gelatin (HG), Wheat Gluten (WG) and Soybean Protein Isolate (SPI) were mixed at different proportions in order to partially replace milk proteins in food formulation utilized in Food Programs to reduce its cost without significant decrease in its nutritional and sensorial properties. The nutritional quality of the mixtures was evaluated by the \"Protein DigestibilityCorrected Amino Acid Score (PDCAAS)\" and \"Net Protein Ratio (NPR)\"methods. The sensorial quality of the mixtures was evaluated by the \"Scale Difference of Control\". The results obtained experimentally by simplex design were used to elaborate Scheffé\'s canonical equations that would describe the effect of the proportion of each component on the final nutritional quality of the product. Ali the results were correlationed by Multivariate Analysis and represented by Principal Component Analysis (PCA). A \"compromise solution\" containing 25% HG, 15% WG and 60% SPI was selected as multiresponse optimization. This mixture was applicated in food formulation and submitted to the evaluations of nutrition and sensorial quality. The final product showed about 6% of cost reduction without any significant change in its quality (p< 0,01). These results demonstrated the statistics multivariate methods efficiency in simultaneous optimization and visualization of interactions which are present in complex process like biological systems.

O gene AGT1 do locus mal1g, do sistema de transporte de maltose de S. cerevisiae, codifica uma proteína de 67 kDa, que tem 75% de similaridade e 58% de identidade com o transportador de maltose do locus MAL1. Sua expressão é ativada por genes reguladores constitutivos do sistema MAL, e é reprimida pela glicose. A cepa AP68-7A carrega o gene AGT1, e possivelmente o gene transportador MAL31, e transporta trealose ao final da primeira fase de crescimento anaeróbico. SDS-PAGE comparando proteínas de membranas de células reprimidas pela glicose (taxa de transporte &#60;0,5 U/mg), com aquelas de células induzidas por &#945;-metilglicosídeo (taxa de transporte de ~35 U/mg), verificou-se 2 bandas (PMs 57 e 66 kDa) exclusivas em membranas de células induzidas. As 2 bandas foram isoladas por três métodos diferentes (cromatografia de troca iônica, lavagens da membrana com tampão de alta força iônica e cromatografia de afinidade) e testadas para ligação de 14C-trealose. A ligação foi enriquecida ~3 X após a cromatografia de troca iônica. O transporte de trealose na cepa AP77-4C (que não tem nenhum dos genes transportadores dos loci MAL) foi recuperado após sua transformação com plasmídeo YEp366-AGT1. De membranas plasmáticas destas células (transporte de trealose ~25 U/mg) foram isoladas por cromatografia de afinidade, 2 bandas cujos PMs em SDS-PAGE são idênticos aos das proteínas isoladas das membranas da cepa AP68-7A. Estes resultados permitem concluir que o transportador de trealose de leveduras é codificado pelo gene AGT1. / The AGT1 gene presente in the mal1g locus from S. cerevisiae maltose transport system encodes a 67 kDa protein which shares 75% similarity and 58% identity with the maltose transporter protein encoded in MAL6 locus. The expression of this gene is regulatory genes from MAL system and is repressed by glucose. The strain AP68-7A which harbors the AGT1 gene and probably the MAL31 transporter gene, expresses trehalose transport activity at the end of first anaerobic growth. The comparison from the SDS-PAGE of membrane proteins from glucose repressed cells (trehalose transport activity of &#60;0.5 U/mg), and &#945;-methylglucoside induced cells (trehalose transport activity of ~35 U/mg), revealed 2 bands (Mr 57 and 66 kDa) present only in the induced cells membranes. Those bands were isolated by 3 different methods (ionic exchange chromatography, high strength ionic washes and affinity chromatography, and tested for 14C-trehalose binding. Both bands bind trehalose and this activity was enriched about 3 times after the ionic exchange chromatography. The trehalose transport activity was recovered by strain AP77-4C, (which does not harbor any MAL transporter gene) after its transformation with a plasmid containing the AGT1 gene. From the membranes of these cells (trehalose transport activity of ~25 U/mg) 2 bands were isolated by affinity chromatography with similar Mrs to those isolated from AP68-7A strain. The results permit to conclude that the AGT1 gene encodes the yeast trehalose transporter.

A insuficiência cardíaca é uma síndrome clínica de mau prognóstico caracterizada por disfunção cardíaca associada à intolerância aos esforços, retenção de fluído e redução da longevidade. Dentre as serina/treonina quinases associadas às alterações funcionais e estruturais cardíacas observadas na progressão da insuficiência cardíaca, a família das proteínas quinase C (PKC) composta por 12 diferentes isoformas parece modular a contratilidade miocárdica e o remodelamento cardíaco. No presente estudo, caracterizamos o fenótipo cardíaco e o perfil de ativação das diferentes isoformas de PKC na progressão da insuficiência cardíaca de etiologia isquêmica em ratos. Além disso, estudamos o efeito da inibição sustentada da isoforma PKC&#946;II sobre a sobrevida, o remodelamento cardíaco e a função ventricular em modelo de insuficiência cardíaca de etiologia isquêmica. Conseguinte, identificamos possíveis substratos cardíacos da PKC&#946;II envolvidos na progressão da insuficiência cardíaca. Para isso, avaliamos os efeitos agudo e crônico da inibição da PKC&#946;II sobre o transiente de cálcio e a contratilidade de cardiomiócito isolados de ratos adultos com insuficiência cardíaca. Por fim, testamos as inibições específicas das PKC&#946;II e PKC&#946;I na progressão da hipertrofia cardíaca compensada para a insuficiência cardíaca em modelo animal de hipertensão arterial sustentada. Nossos resultados sugerem que a inibição sustentada da PKC&#946;II reverte o quadro de insuficiência cardíaca, melhorando a função ventricular, o remodelamento cardíaco e a sobrevida dos diferentes modelos de insuficiência cardíaca estudados, constituindose em uma estratégia terapêutica celular promissora / Heart failure is a common endpoint for many forms of cardiovascular disease and a significant cause of morbidity and mortality worldwide. Protein kinase C isozymes emerge as important potential therapeutic targets in chronic cardiovascular disease. However, individual PKC isozymes play different roles in the pathogenesis of cardiac diseases. Here, we characterized the cardiac phenotype as well as the different PKC isozyme activation profile during myocardial-induced heart failure progression in rat. Furthermore, we evaluated the role of selective PKC&#946; II inhibition on survival, left ventricle remodeling and cardiac function in myocardial-induced heart failure. Moreover, we identified the cardiac PKC&#946;II substrates related to heart failure. Finally, PKC&#946;II and PKC&#946;I specific inhibitors were chronically delivered to hypertensive-induced heart failure rats and the cardiac phenotype was evaluated. Our data suggest that 6-wks of PKC&#946;II inhibition, but not PKC&#946;I, improved animal survival by restoring cardiac function and promoting cardiac anti-remodeling effect in both myocardial infarctioninduced heart failure and hypertensive-induced heart failure rats. The improved cardiac function and anti-remodeling effect of PKC&#946;II inhibition seems to be associated with increased contractility of cardiac myocytes, improved miofilaments/Ca2+ sensitivity and decreased cardiac inflammatory response. Altogether, the results provide evidence for beneficial effects of PKC&#946;II specific intracellular inhibition on cardiac function and remodeling, which may be a promising cellular therapy for heart failure treatment

A pneumonia nosocomial é uma infecção prevalente e associada com elevados custos e morbi-mortalidade. A maioria destes episódios ocorre em pacientes criticamente doentes em ventilação mecânica. Os biomarcadores, como a proteína C-reativa, tem se mostrado uteis na avaliação da evolução dos pacientes, podendo se descrever padrões de resposta associados ao sucesso da terapia antimicrobiana e ao prognostico de paciente com pneumonia associada a ventilação mecânica. Nesta tese, apresenta-se uma revisão da literatura abordando aspectos da fisiopatologia, diagnostico e manejo da pneumonia associada a ventilação mecânica. Além disso, é feita a análise do uso de biomarcadores em duas populações especificas de pacientes criticamente doentes (pacientes com doença critica cronica e pacientes idosos). Foram avaliados 405 pacientes com diagnostico clínico de pneumonia associada a ventilação mecânica. Descreve-se que pacientes com doença critica crônica apresentam episódios de pneumonia associada a ventilação mecânica com pior prognostico do que pacientes que não apresentam doença critica crônica. Entretanto, esses achados não parecem associados a um comprometimento da resposta inflamatória, uma vez que nao houve diferença significativa nem nos níveis basais, nem na evolução dos níveis de proteína C-reativa comparando episódios de pacientes com doença critica crônica com aqueles sem esta condição, sugerindo que seu uso é válido nessa população de pacientes. Ainda, descreve-se a evolução dos pacientes com pneumonia associada a ventilação mecânica de acordo com a idade. A partir dos 65 anos, parece haver um efeito da idade na mortalidade dos pacientes com PAV. No entanto, não houve alteração na resposta da PCR ou na sua cinética nas primeiras 96h quando comparamos pacientes com diferentes faixas etárias a partir de um ponto de corte de 65 anos, também sugerindo a validade do uso deste biomarcador nesta população de pacientes. Estes achados originais permitem que estudos futuros avaliem intervenções baseadas em biomarcadores em pacientes com pneumonia nosocomial levando em consideração estas populações especificas de pacientes não avaliadas previamente na literatura. / Nosocomial pneumonia is a prevalent infection associated with higher costs and worse outcomes. Most episodes occur in mechanically ventilated critically ill patients. Biomarkers, such as C-reactive protein, are useful to assess patients evolution, allowing identification of patterns associated with antimicrobial treatment success and prognosis in ventilator-associated pneumonia patients. In this thesis, a literature review is presented evaluating aspects of pathopsysiology, diagnosis and management of ventilator-associated pneumonia patients. In addition, biomarker use in two specific populations (chronic critical illness and elderly) was assessed. Four hundred and five patients with ventilator associated pneumonia clinical diagnosis were evaluated. Patients with chronic critical illness presented ventilator-associated pneumonia episodes associated with worse prognosis. However, these findings were not associated with a compromise of inflamatory response, assessed by comparison of C-reactive protein basal levels and kinetis evolution in patients with and wihtout chronic critical illness, suggesting its use remains valid in this specific population. Still, evolution of ventilator-associated pneumonia according to age is described. After 65 years old, our data suggest an effect of age on mortality in ventilator-associated pneumonia patients. However, no change in C-reactive protein basal levels, response or kinetics within 96h was found when comparing patients younger and older than 65 years old, also suggesting this biomarker usefulness in this specific population. These original findings allow that future studies assessing intervention based on biomarkers evolution in patients with nosocomial pneumonia consider these specific populations, never assessed before in literature.

Orientador: José Antônio Dell’Aqua Junior / Resumo: O estudo proteômico é utilizado como ferramenta na reprodução animal como auxílio para compreesão da fisiologia das células. Neste sentido esta técnica é empregada em espermatozoides na tentativa de elucidar os processos biológicos e assim determinar os mecanismos moleculares envolvidos na separação do sexo. Assim, o objetivo deste estudo foi descrever as proteínas das células espermáticas de bovinos em diferentes aspectos. No estudo 1, investigou-se a influência do tampão de extração, associado ou não ao método mecânico (flash-frozen), e da concentração celular sobre a quantidade de proteínas extraídas de espermatozoides de bovinos. Foram utilizados como tampões TRIS contendo Nonidet P-40 (NP), RIPA modificado (RP) e uréia/tiuréia/CHAPS (UT), e as concentrações de 2, 4, 6, 8 e 10 x 106 espermatozoides/mL em grupos submetidos ou não ao flash-frozen. As concentrações de proteína total foram quantificadas e gel de eletroforese SDS-1D foi confeccionado. O tratamento UT recuperou maior concentração de proteínas, porém no RP as proteínas apresentaram melhor resolução no gel de eletroforese. A concentração protéica aumentou de acordo com a concentração de células no NP e UT. A influência do flash-frozen variou de acordo com o tratamento. No estudo 2, o objetivo foi traçar o perfil proteico de células espermáticas sexadas (X e Y) de bovinos. Foram utilizadas amostras comerciais de espermatozoides sexados X (n = 6) e Y (n = 6). As proteínas foram solubilizadas, submetidas a espectrom... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The proteomic study is used as a tool in animal reproduction as an aid to understanding of the cells physiology. In this regard, this technique is used in spermatozoa in an attempt to elucidate the biological processes and thus determine the molecular mechanisms involved in the sex separation. Therefore the aim of this study was to describe the bovine sperm cell proteins in different aspects. In study 1, the influence of the extraction buffer, associated or not to mechanical method (flash-frozen), and cellular concentration on the amount of proteins extracted from bovine spermatozoa were investigated. TRIS buffers containing Nonidet P-40 (NP), modified RIPA (RP) and urea/thiourea/CHAPS (UT) were used as well as concentrations of 2, 4, 6, 8 and 10 x 106 spermatozoa/mL in groups submitted or not to flash-frozen. Total protein concentrations were quantified and SDS-1D gel electrophoresis was prepared. The UT treatment recovered a higher concentration of proteins, but in RP the proteins showed better resolution in electrophoresis gel. The protein concentration increased according to the concentration of cells in the NP and UT. The influence of flash-frozen varied according to the treatment. In study 2, the objective was to map the protein profile of sexed sperm cells (X and Y) of cattle. Commercial samples of sexed spermatozoa X (n = 6) and Y (n = 6) were used. The proteins were solubilized, submitted to mass spectrometry SWATH analisys. 459 proteins common to the groups were ide... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:05Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-01-22Bitstream added on 2014-06-13T18:41:40Z : No. of bitstreams: 1 barbosa_oa_dr_arafcf.pdf: 2189639 bytes, checksum: 802d62d6e97402bb210b732010f065f8 (MD5) / O soro proveniente da fabricação de queijo tem sido utilizado para fins diversos, sendo uma importante fonte proteica de baixo custo apresentando alta percentagem de aminoácidos essenciais. Nesse contexto, a hidrólise de suas proteínas melhora a biodisponibilidade e permite que peptídeos bioativos formados sejam absorvidos. O objetivo desse estudo foi verificar a biodisponibilidade in vitro das proteínas do soro de queijo e seus hidrolisados com diferentes teores de hidrólise e o efeito da suplementação da dieta de ratos wistar adultos com esses hidrolisados. As soroproteínas foram submetidas a tratamento com as proteases pepsina, quimotripsina, carboxipeptidase-A e tripsina em pH e temperatura específicos, produzindo suplementos com médio (MTH) e alto (ATH) teor de hidrólise. A biodisponibilidade dos hidrolisados foi analisada por meio da simulação da digestão gástrica e duodenal. Os peptídeos e aminoácidos foram analisados por CLAE e o perfil proteico por SDS-PAGE. O perfil sérico, cálcio ósseo e a proteína muscular dos animais foram avaliados após suplementação com proteínas integrais e hidrolisados de alto e médio teor por um período de 43 dias. A biodisponibilidade de aminoácidos foi maior nos hidrolisados MTH e ATH após a simulação da digestão gastrointestinal, indicando que a hidrólise das soroproteínas pode aumentar a absorção destes compostos. O perfil sérico dos ratos apresentou alterações significativas principalmente em relação à glicemia após suplementação da dieta, sendo que os animais que receberam o suplemento MTH apresentaram uma grande redução nesse parâmetro e também excelente resultado em relação ao HDL, cálcio sérico e massa muscular. Embora de forma menos expressiva, os animais... / The whey from cheese production has been used for various purposes and it is an important low cost protein source with high proportion of essential amino acids. In this context, the hydrolysis of its proteins improves the bioavailability and allows the absorption of bioactive peptides formed. The aim of this research was to determine the in vitro bioavailability of whey proteins and their hydrolysates with different hydrolysis levels and the effect of supplementing the diet of adult Wistar rats with these hydrolysates. Whey proteins were subjected to treatment with proteases pepsin, trypsin, chymotrypsin, and carboxypeptidase A in specific pH and temperature, producing supplements with medium (MTH) and high (ATH) content of hydrolysis. The hydrolysates bioavailability was analyzed by simulating the gastric and duodenal digestion. Peptides and amino acids were analyzed by HPLC and protein profile by SDS-PAGE. The animals serum profile, bone calcium and muscle protein were evaluated after supplementation with integral proteins, high and medium hydrolyzed levels over a period of 43 days. The amino acid bioavailability was greater in hydrolysates MTH and ATH after simulating gastrointestinal digestion, indicating that the hydrolysis of whey proteins may increase the absorption of these compounds. The serum profile of the rats showed significant changes mainly related to glucose after dietary supplementation, and the animals that received the MTH supplement showed a large reduction in this parameter and also excellent results compared to HDL, serum calcium and muscle mass. The animals that received the ATH supplement showed satisfactory results for serum phosphorus and total protein. Thus, MTH supplement showed better results in terms of bioavailability and when used how supplement, and its excellent performance with respect... (Complete abstract click electronic access below)