Unter den Techniken der chemischen Proteomik hat Capture Compound – Massenspektrometrie (CCMS) den Vorteil, Interaktionen von Molekülen mit geringer Affinität zueinander effektiv untersuchen zu können. CCMS beruht auf kleinen molekularen Sonden (Capture Compounds, CCs), die aus drei funktionalen Bestandteilen bestehen: die Selektivitätsfunktion, ist ein kleines Molekül, das mit einem Zielprotein eine schwache Wechselwirkung eingeht. Die zweite Funktionalität erlaubt kovalente Anhaftung der molekularen Sonde an Proteine. Der dritte Anteil erlaubt Detektion mit sehr guten Sensitivität; allerdings ist die Quantifizierung weiterhin ein Schwachpunkt dieser Technik. Ziel dieses Projektes ist, eine in CCMS verwendbare Quantifizierungsmethode zu entwickeln. Heutzutage gibt es zahlreiche MS-basierte Quantifizierungsstrategien; unsere beruht auf der Einführung von Lanthanoid-haltigen Labels – Metal Coded Affinity Tagging (MeCAT). In dieser Arbeit wurde erstmalig die erfolgreiche Verwendung mit Metall- Markern chemoproteomischer Sonden (CCs) zur Detektion und absoluten Quantifizierung von Zielproteinen mit schwacher Wechselwirkung etabliert. Mit den Experimenten an isolierten Enzymen und an lebenden Zellen wurde nachgewiesen, dass Metall-Marker keinen negativen Einfluss auf andere funktionelle Teile chemoproteomischer Sonden haben. CCs, die mit Lanthanoid-Chelaten funktionalisiert sind, zeigen ähnliche Affinität zu ihren Zielproteinen wie die Referenz-Sonden. Zudem erlauben Metall-Marker, die für diese Art molekularer Sonden verwendet werden, die Entwicklung einer element-basierten Technik zur Bilderzeugung. Der herausragende Vorteil der Metall-funktionalisierten CCs kombiniert mit ICP-MS ist, dass diese eine absolute Quantifizierung der Ausbeute der Quervernetzungen ermöglichen. / Capture compound mass spectrometry (CCMS) is a chemical proteomics technique that has the advantage of addressing low abundant target proteins in lysates as well as in living cells. The CCMS is based on small molecule probes (capture compounds) that consist of three functionalities: a small molecule (quite often it is a drug), which interacts with the target protein; the moiety that allows covalent attachment of the molecular probe to the protein; the one that allows detection. The detection moiety utilized for CCMS can offer high sensitivity; however, the challenge of absolute quantification is still a bottleneck of this technique. Metal Coded Affinity Tagging (MeCAT) is a quantitative approach based on the chemical labeling with lanthanide; it allows obtaining both the structural and quantitative information. In this work for the first time the successful utilization of chemoproteomic probes functionalized with a metal tag for the detection and absolute quantification of target proteins was established. With the experiments both on isolated enzymes and living cells it was determined that MeCAT does not negatively influence other functional parts of the probes; therefore, capture compounds functionalized with lanthanide chelates demonstrate similar affinity to the target as the reference probes. Moreover, metal tags utilized for this type of molecular probes can offer a promising elemental imaging technique. However, to achieve the sufficient resolution multiple metal tags per molecular probe are needed. The striking advantage of the approach of utilization metal functionalized capture compound combined with ICP-MS detection is that it allows absolute quantification of crosslink yield, what cannot be performed with other detection methods applied for this technology.

Die Untersuchung der posttranskriptionellen Genregulation erfordert eine eingehende Kenntnis vieler molekularer Prozesse, die auf RNA wirken, von der Prozessierung im Nukleus bis zur Translation und der Degradation im Zytoplasma. Mit dem Aufkommen von RNA-seq-Technologien können wir nun jeden dieser Schritte mit hohem Durchsatz und Auflösung verfolgen. Ribosome Profiling (Ribo-seq) ist eine RNA-seq-Technik, die darauf abzielt, die präzise Position von Millionen translatierender Ribosomen zu detektieren, was sich als ein wesentliches Instrument für die Untersuchung der Genregulation erweist. Allerdings ist die Interpretation von Ribo-seq-Profilen über das Transkriptom aufgrund der verrauschten Daten und unserer unvollständigen Kenntnis des translatierten Transkriptoms eine Herausforderung. In dieser Arbeit präsentiere ich eine Methode, um translatierte Regionen in Ribo-seq-Daten zu erkennen, wobei ein Spektralanalyse verwendet wird, die darauf abzielt, die ribosomale Translokation über die übersetzten Regionen zu erkennen. Die hohe Sensibilität und Spezifität unseres Ansatzes ermöglichten es uns, eine umfassende Darstellung der Translation über das menschlichen und pflanzlichen (Arabidopsis thaliana) Transkriptom zu zeichnen und die Anwesenheit bekannter und neu-identifizierter translatierter Regionen aufzudecken. Evolutionäre Konservierungsanalysen zusammen mit Hinweisen auf Proteinebene lieferten Einblicke in ihre Funktionen, von der Synthese von bisher unbekannter Proteinen einerseits, zu möglichen regulatorischen Rollen andererseits. Darüber hinaus zeigte die Quantifizierung des Ribo-seq-Signals über annotierte Genemodelle die Translation mehrerer Transkripte pro Gen, was die Verbindung zwischen Translations- und RNA-Überwachungsmechanismen offenbarte. Zusammen mit einem Vergleich verschiedener Ribo-seq-Datensätze in menschlichen und planzlichen Zellen umfasst diese Arbeit eine Reihe von Analysestrategien für Ribo-seq-Daten als Fenster in die vielfältigen Funktionen des exprimierten Transkriptoms. / The study of post-transcriptional gene regulation requires in-depth knowledge of multiple molecular processes acting on RNA, from its nuclear processing to translation and decay in the cytoplasm. With the advent of RNA-seq technologies we can now follow each of these steps with high throughput and resolution. Ribosome profiling (Ribo-seq) is a popular RNA-seq technique, which aims at monitoring the precise positions of millions of translating ribosomes, proving to be an essential tool in studying gene regulation. However, the interpretation of Ribo-seq profiles over the transcriptome is challenging, due to noisy data and to our incomplete knowledge of the translated transcriptome. In this Thesis, I present a strategy to detect translated regions from Ribo-seq data, using a spectral analysis approach aimed at detecting ribosomal translocation over the translated regions. The high sensitivity and specificity of our approach enabled us to draw a comprehensive map of translation over the human and Arabidopsis thaliana transcriptomes, uncovering the presence of known and novel translated regions. Evolutionary conservation analysis, together with large-scale proteomics evidence, provided insights on their functions, between the synthesis of previously unknown proteins to other possible regulatory roles. Moreover, quantification of Ribo-seq signal over annotated transcript structures exposed translation of multiple transcripts per gene, revealing the link between translation and RNA-surveillance mechanisms. Together with a comparison of different Ribo-seq datasets in human cells and in Arabidopsis thaliana, this work comprises a set of analysis strategies for Ribo-seq data, as a window into the manifold functions of the expressed transcriptome.

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Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Wechselwirkung von halophilen Mikroorganismen mit Uran unter Verwendung verschiedener spektroskopischer, mikroskopischer und molekularbiologischer Methoden untersucht. Ausgewählte Vertreter halophiler Mikroorganismen waren dabei das moderat halophile Bakterium Brachybacterium sp. G1 sowie zwei extrem halophile Archaea der Gattung Halobacterium. Für das extrem halophile Archaeon H. noricense DSM15987T wurde auch die Wechselwirkung mit den trivalenten Metallionen Europium und Curium untersucht. Es konnte festgestellt werden, dass die Bioassoziation von Uran durch das untersuchte Bakterium und die beiden Archaea in unterschiedlicher Art und Weise erfolgte. Für den niedrigeren Urankonzentrationsbereich (30 - 50 μM) konnte für das moderat halophile Bakterium der Prozess der Biosorption nachgewiesen werden, welcher nach 2 h abgeschlossen war. Mittels in situ ATR FT-IR war ausschließlich die Anbindung von Uran an Carboxylgruppen detektierbar. Die Assoziation desselben Radionuklids an die Zellen der beiden extrem halophilen Archaea erfolgte im Gegensatz dazu in einem mehrstufigen Prozess. Dieser ist bisher in der Literatur nach bestem Wissen nur einmal für ein Bakterium beschrieben. Der mehrstufige Prozess ist gekennzeichnet durch eine erste kurze Assoziationsphase von einer Stunde, gefolgt von einer Freisetzung des Urans in die umgebende Lösung. Nach dieser vierstündigen Desorptionsphase setzte ein erneuter Assoziationsprozess ein. Bei höheren Urankonzentrationen (85 - 100 μM) wurde mit zunehmender Kontaktzeit mehr Uran assoziiert, ohne dass Desorptionsprozesse erkennbar waren. Um den mehrstufigen und konzentrationsabhängigen Assoziationsprozess von Uran an H. noricense DSM15987T auf molekularer Ebene aufzuklären, wurden Fluoreszenzmikroskopie, Elektronenmikroskopie gekoppelt mit EDX – Analyse sowie in situ ATR FT-IR, TRLFS und XAS komplementär eingesetzt und diese mikroskopischen und spektroskopischen Methoden durch die molekularbiologische Methode der Proteomik ergänzt. Mikroskopisch konnte eine Agglomeration der Zellen detektiert werden. Diese war mit zunehmender Inkubationszeit sowie bei höherer Urankonzentration stärker ausgeprägt. Mit den spektroskopischen Methoden konnte die Anbindung von Uran an carboxylische Funktionalitäten nachgewiesen werden. Zusätzlich war eine Phosphatspezies, strukturell analog dem U(VI) Mineral Meta-Autunit, nachweisbar. Die Fraktionsanalyse zeigt, dass bei niedriger Urankonzentration diese Phosphatspezies dominant ist. Demgegenüber überwiegt bei einer höheren Urankonzentration die carboxylische Spezies. Dies kann mit der verstärkten Agglomeration und der damit einhergehenden Freisetzung von EPS, wozu auch carboxylische Funktionalitäten in Form von verschiedenen Zuckerderivaten gehören, erklärt werden. Eine Bestätigung der Bildung eines Uran-Phosphat-Minerals erfolgte mit TEM/EDX. Die erhaltenen spektroskopischen und mikroskopischen Nachweise des Uran-Phosphat-Minerals konnten auch erstmalig mit molekularbiologischen Ergebnissen in Übereinstimmung gebracht werden. Dabei war mit Hilfe der Proteomik eine Uran-induzierte Änderung der Expression von Enzymen des Phosphatmetabolismus nachweisbar. Zusätzlich wurde die Interaktion von H. noricense DSM15987T mit trivalenten Metallen untersucht. Dabei kam das radioaktive Element Curium und sein analoges Lanthanid Europium zum Einsatz. Es konnte festgestellt werden, dass es sich bei der Assoziation von Europium, anders als beim Uran, nicht um einen mehrstufigen Prozess handelt. Jedoch ist auch hier nicht von einer reinen Biosorption auszugehen, da die Assoziation relativ langsam erfolgt. Mit TRLFS konnten drei zellassoziierte Spezies extrahiert werden. Durch den Vergleich mit Referenzspektren fand eine Zuordnung zu einer phosphatischen und einer carboxylischen Spezies statt. Bei der Assoziation von Curium an das halophile Archaeon konnten zwei Spezies identifiziert werden, welche allerdings auf Grund der geringen Anzahl an vorhandenen Referenzspektren nicht eindeutig zugeordnet werden konnte. Mit der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die bisher in der Literatur noch nicht beschriebene Kombination von spektroskopischen, mikroskopischen und molekularbiologischen Methoden zur Aufklärung der Uraninteraktion mit Mikroorganismen notwendig ist. So können stattfindende Prozesse zusätzlich durch eine veränderte Proteinexpression erklärt werden. Zusammenfassend ist zu sagen, dass die Art und Weise der Wechselwirkung eines Radionuklids mit einem Mikroorganismus stark vom jeweiligen Mikroorganismus abhängt. Daher ist es zukünftig wichtig die unter Endlagerbedingungen aktiven dominanten Vertreter zu identifizieren, um daraus resultierend die bedeutenden Stoffwechselwege abzuleiten und letztendlich thermodynamische Daten für die Sicherheitsanalyse zu generieren. Das in dieser Arbeit untersuchte Bakterium wird aufgrund seiner geringen Salztoleranz, trotz seiner starken Biosorption des Urans, eher eine untergeordnete Rolle für das Migrationsverhalten der Radionuklide im Salzgestein spielen. Demgegenüber sind Halobacterium Spezies auf Grund ihrer hohen Salztoleranz und ihres ubiquitären Vorkommens in weltweiten Salzvorkommen ein dominanter Mikroorganismus in Steinsalz. Die untersuchten extrem halophilen Archaea tragen dabei zu einer Immobilisierung des Urans (z. Bsp. durch Biomineralisierung und Bioreduktion) und somit zur Rückhaltung von im Salzgestein freigesetzten Radionukliden bei. Inwiefern diese Transformationsprozesse auch für andere sechswertige Actinide wie PuO22+ und NpO22+ zutreffen, muss in weiteren Experimenten geklärt werden.

Der Typ 2 Diabetes mellitus ist eine chronische Stoffwechselerkrankung; hauptsächlich wird dieser durch das Versagen der Insulin-produzierenden _-Zellen und der gestörten Funktion des Insulin Rezeptors in periphären Geweben definiert. Obwohl die Forschung schon tief in die Geschichte greift und der Inzidenz Anstieg besorgniserregende Tendenzen zeigt, bleiben die pathophysiologische Grundlagen dieser Krankheit unklar. Die Voraussetzung für die Entwicklung des T2D und das zentrale Thema dieser Dissertation – das _-Zellen Versagen – wurde in den letzten Jahrzehnten aktiv erforscht. Viele aktuelle, in gewisen Maße überlappende, Hypothesen wurden aufgestellt, in einem Versuch die biologischen Grundlagen zu erläutern, die zum Versagen der _-Zellen führen und gleichzeitig mögliche Lösungen für dieses Problem zu finden. Während die Hypothesen, die auf den nicht-immunen Zelltentod als Ursache für Zellen Versagen beruhen, durch neue Studien an Zugkraft verlieren, bleiben andere mit ERStress und Dedifferenzierung als Schwerpunkt immer noch relevant. Alle bisher genannten Mechanismen leiden dennoch an geringer Reproduzierbarkeit und herausfordernden Translationsmöglichkeiten. Zudem hat sich die momentan meist genutzte experimentelle Plattform zunehmend als suboptimal erwiesen, denn sie basiert auf Gewinnung von Langerhassche Inseln durch enzymatische Isolierungsverfahren aus Spenderorganen; insbesondere für die Studien die sich methodologisch auf hoch-empfindliche Hochdurchsatzmethoden gründen. Frühere Arbeiten des Solimena-Labors mit Microarray-basierten transkriptomischen Signaturen haben deutlich gezeigt, was seit dem Aufkommen erschwinglicher omics-Methoden in diesem Bereich spekuliert wurde. Es hat sich gezeigt, dass diese hochsensiblen experimentellen Ansätze beeinträchtigt werden, vor allem durch die Verfahren, die zur Isolierung der Inseln aus der gesamten Bauchspeicheldrüse von Spendern erforderlich sind. Die Einführung von Signaturen, die eher ein Produkt des experimentellen Verfahrens als der biologischen Variabilität sind, stellte ein erhebliches Hindernis für die Interpretation der Daten dar, die aufgrund der verworrenen Natur der Auswirkungen der Krankheit auf die Zellbiologie selbst bereits komplex sind. Der Wert der Plattform „Studies of Islets in Living Donors' wurde durch das translationale Potenzial erhöht, das durch die verfügbaren klinischen Daten und die präoperative Erstellung von Stoffwechselprofilen definiert wird, die ansonsten durch den rechtlichen Rahmen für Organspenden stark eingeschränkt sind. In dieser Dissertation wurden LCM-Inseln von lebenden chirurgischen Spendern mit Hilfe von drei Hochdurchsatzmodalitäten profiliert: RNA-Sequenzierung, ungezielte massenspektrometrie-basierte Proteomik und enzymatische Methylierungssequenzierung. Für sich betrachtet, brachte jeder dieser Ansätze neue Erkenntnisse, und im Falle der RNA-Sequenzierung und der Proteomik wurden ausgewählte frühere Ergebnisse bestätigt. Die High-Level-Analyse der Insel-Transkriptome identifizierte eindeutig eine Untergruppe der Proben, die besonders stark mit Betazellen angereichert war, was durch die Dekonvolutionsanalyse bestätigt wurde. Dies ermöglichte vor allem die Identifizierung von differenziell regulierten Genen in den Inselzellen von Patienten mit gerstörten Glukosetoleranz, was einen neuen Einblick in die Entwicklung der Krankheit und nicht nur in die bereits vorhandene Krankheit bietet. Bei der differenziellen Expressionsanalyse wurde eine allgemeine Hochregulierung von Genen festgestellt, während die Gene-Set-Enrichment-Analyse dieser Daten auf Störungen bei Prozessen im Zusammenhang mit dem Energiestoffwechsel, der Translation und extrazellulären Interaktionen hinwies. Die gewichtete Genkorrelationsnetzwerkanalyse identifizierte ein Gen-Koexpressionsmodul, das stark mit der längerfristigen Blutzuckerkontrolle, gemessen durch HbA1c, korreliert. Das Proteom-Profiling deckte eine herausragende Ähnlichkeit zwischen den Proteomen der ND-Inseln und eine bemerkenswerte Streuung der T2D-Proben auf. Die Ergebnisse der differenziellen Abundanzanalyse sowie der anschließenden Anreicherungsanalysen bestätigten weitgehend die Ergebnisse der Transkriptomanalyse, obwohl die Korrelation zwischen den Transkriptomen und Proteomen insgesamt gering war. Dennoch wurden einige der interessanten Targets, die in der Transkriptomanalyse identifiziert wurden, wie z.B. ALDOB oder ACADS, durch die Proteomanalyse bestätigt, wobei zusätzliche Targets neu identifiziert wurden (z.B. CD90). Obwohl die aus den Methylierungssequenzierungsexperimenten gewonnenen Informationen höchstwahrscheinlich aufgrund der relativ geringen Anzahl der untersuchten Personen begrenzt sind, konnten dennoch aussagekräftige Beobachtungen gemacht werden. Das eindeutige Vorherrschen hypomethylierter Regionen in T2D-Inseln unterstützt die durch die anderen Analysen gewonnenen Erkenntnisse und unterstreicht die scheinbar unselektive Lockerung der Zügel bei der Genexpression, die zuvor angenommen wurde. Ausgewählte Targets aus den oben erwähnten bioinformatischen Analysen wurden in vitro untersucht, um ihre Rolle in der Betazellbiologie in T2D zu validieren. Die Überexpression von ALDOB unter in vitro Bedingungen ergab keinen dramatischen Phänotyp, und diese Ergebnisse können bestenfalls als Hinweise auf die Richtung der Stoffwechselstörung in Betazellen in T2D interpretiert werden. Insbesondere scheint die Histonacetylierung in T2D überzeugend verändert zu sein, was möglicherweise auf den veränderten Spiegel von ACADS und/oder seinem Paralogon ACADSB zurückzuführen ist und im Einklang mit der beobachteten allgemeinen Hochregulierung der Genexpression in T2D steht. Wichtig ist, dass Immunfluoreszenzexperimente, bei denen die CD90-Expression vollständig außerhalb des endokrinen Zellbereichs identifiziert wurde, die Bedeutung von Validierungsbemühungen in Verbindung mit omics-Experimenten zur Vermeidung von Interpretationen auf der Grundlage falsch positiver Ergebnisse hervorheben. Schließlich wurden Gewebeschnitte einer Untergruppe von Patienten, die durch RNA-Sequenzierung profiliert worden waren, mit einer maßgeschneiderten Bildanalyse-Pipeline auf das Vorhandensein von Insel-Amyloidose untersucht. Diese Daten wurden mit den klinischen Daten und mit einmalig verfügbaren transkriptomischen Profilen integriert. Sowohl die differentielle Expressionsanalyse als auch die GSEA identifizierten Signaturen, die im Zusammenhang mit der Inselamyloidose von Interesse sind (Zytokinrezeptorinteraktion, Proteintranslation und -verarbeitung). Diese Befunde sind jedoch nur begrenzt spezifisch für die Insel-Amyloidose, da sie meist auch in der Hauptanalyse zum Diabetes-Status zu finden sind. Die Identifizierung von traskriptomischen Veränderungen, die spezifisch für die Inselamyloidose sind und nicht direkt mit der Krankheit selbst zusammenhängen, ist daher mit dem derzeitigen Ansatz fraglich. Nichtsdestotrotz wurde ein Gen-Koexpressionsmodul identifiziert, das in signifikanter, wenn auch schwacher Weise mit der Inselamyloidose korreliert, was für künftige Studien zu dieser Entität spricht.

Die Behandlung von Fettleibigkeit mittels Ernährungsumstellung und Änderung des Lebensstils zeigt keinen großen Erfolg bei der Eindämmung der Adipositas-Epidemie. Weitere Untersuchungen von Adipositas und der damit verbundenen Prozesse eröffnen die Möglichkeit, die Pathophysiologie der Fettleibigkeit besser zu verstehen und so neue therapeutische Ansätze und neue metabolische Regulatoren entwickeln zu können. Da Adipositas eine metabolische Erkrankung ist, wurde in dieser Arbeit untersucht, ob und wie sich die Veränderungen, die mit Adipositas assoziiert sind und während dieser Erkrankung nicht nur im Fettgewebe, sondern in dem gesamten Organismus entstehen, auf den Metabolismus der Monozyten und auf ihre Funktionen auswirken. Mit den beschriebenen Methoden wurden Unterschiede im Metabolismus und in der ROS-Produktion zwischen den Monozyten von normalgewichtigen Kontrollen und Adipositas-Patienten nachgewiesen, während sich die anderen untersuchten Zellfunktionen, wie Phagozytose und Zytokinproduktion (angesehen von IL-8) nicht voneinander unterschieden. Die Resultate zeigten, dass Adipositas und die damit einhergehende chronische Entzündung zu einer Veränderung des Metabolismus der peripheren Monozyten führt. In Monozyten von Adipositas-Patienten konnten ein verändertes Proteinexpressionsmuster, eine erhöhte Glykolyse und ATP-Produktion sowie daraus resultierend eine gesteigerte Bildung von Lipidtropfen festgestellt werden. Abgesehen von Hexokinase I zeigten die Monozyten von Adipositas-Patienten eine niedrige Proteinexpression der glykolytischen Enzyme und der Enzyme des Pentosephosphatweges sowie des Citratzyklus und sie erreichten trotzdem eine hohe Konzentration von intrazellulären Metaboliten des zentralen Kohlenhydratstoffwechsel und eine erhöhte Glykolyse, was sicherlich auf das erhöhte Glukose-Angebot zurückzuführen ist. Der verstärkte Pentosephosphatweg steigert die NADPH-Konzentration, die mit Diabetes assoziiert ist und zur Zunahme der Fettsäuresynthese und der ROS-Produktion führen kann. Die exzessive Lipidakkumulation ist ein mit der Fettleibigkeit assoziiertes Merkmal, welches nicht nur im Fettgewebe, sondern auch in nicht-adipösen Geweben beobachtet wird. Die erhöhte Lipidtropfenanzahl, die in Monozyten von Adipositas-Patienten nachgewiesen wurde, kann zu dem aus einer verstärkten Fettsäuresynthese resultieren, die vor allem dann aktiviert wird, wenn der Zelle genügend Energie und Kohlenhydrate zur Verfügung stehen. Diese Fettsäurereserven werden dann von Zellen unter glukosearmen Bedingungen für die Energiegewinnung verwendet. In aktivierten Monozyten von Adipositas-Patienten konnte unter glukosearmen Bedingungen trotz des verringerten Kohlenhydratstoffwechsels eine erhöhte ATP-Produktion im Vergleich zu den gesunden, normalgewichtigen Kontrollen nachgewiesen werden, was darauf schließen lässt, dass vorhandene Lipidtropfen für die Energiegewinnung verwendet wurden. Die bei Adipositas-Patienten beobachteten metabolischen Veränderungen in den Energiegewinnungsprozessen bzw. Stoffwechselprozessen zeigten keine Wirkung auf die funktionellen Fähigkeiten der Monozyten wie phagozytische Aktivität oder auf die Zellviabilität. Ein funktioneller Unterschied wurde lediglich im oxidativen Burst bzw. in der Produktion von ROS, die als Signalmoleküle wirken, detektiert. Da Adipositas mit erhöhten Entzündungswerten sowie gesteigerter Produktion von proinflammatorischen Zytokinen assoziiert ist, wurde vermutet, dass Monozyten von Adipositas-Patienten eine veränderte Zytokinfreisetzung im Vergleich zu gesunden, normalgewichtigen Kontrollen aufweisen. Dies konnte in Rahmen dieser Arbeit jedoch nicht bestätigt werden. Da im adipösen Fettgewebe die meisten proinflammatorischen Zytokinen produziert werden, könnte sich die weitere Forschung auf anderen Immunzellen wie T-Zellen oder M1-Makrophagen, die einen großen Anteil aller Immunzellen des Fettgewebes ausmachen, fokussieren, um den Effekt von Immunzellen auf den Verlauf der Fettleibigkeit sowie die immunmetabolischen und funktionellen Veränderungen dieser Zellen infolge der chronischen Entzündung gezielter zu untersuchen. Dazu könnten Monozyten vor ihrer Differenzierung zu Makrophagen oder dendritischen Zellen aus dem Fettgewebe isoliert und näher untersucht werden, um immunmetabolische Veränderungen im Vergleich zu primären Monozyten aufzudecken. Die durch diese Arbeit gewonnenen Ergebnisse zeigen, dass die metabolische sowie chronische Erkrankung Adipositas beträchtliche Auswirkungen auf Immunzellen und eine Bedeutung für ihren Immunmetabolismus sowie für die angeborene und adaptive Immunität hat. Der Immunmetabolismus, der eine aktive Rolle bei der Entwicklung und Funktion der Immunzellen sowie bei der Regulierung der Immunantwort spielt, stellt einen wichtigen Aspekt der pathologischen Veränderungen bei dieser Erkrankung dar. Durch therapeutische Regulierung des Immunmetabolismus könnten proinflammatorische Effektormechanismen des Immunsystems, welche zum Pathomechanismus der Adipositas beitragen, besser kontrolliert werden. Ein Beispiel dafür ist die signifikant erhöhte TNF-α-Produktion bei einem reduzierenden Kohlenhydratstoffwechsel unter glukosearmen Bedingungen. Die Resultate zeigen auch, dass die Energiegewinnungs- und Stoffwechselprozesse als therapeutische Targets bei Adipositas darstellen können. Ein Beispiel könnte die Regulierung der erhöhten Glykolyse, ATP-Synthese und ROS-Produktion durch die Inhibierung des zentralen Kohlenhydratstoffwechsels sein, wodurch die Aktivierung der proinflammatorischen M1-Makrophagen und das Fortschreiten des Diabetes bei Adipositas, günstig beeinflusst werden könnten. Außerdem könnten sich zukünftige Experimente auf die Fettsäuresynthese und der Lipidakkumulation in den Lipidtropfen fokussieren, die mit einer erhöhten Lagerung von Entzündungsmediatoren, erhöhten Infektionsrate und somit auch erhöhter Mortalität verbunden sind.:INHALTSVERZEICHNIS Abbildungsverzeichnis………………………………………………………………………. i Tabellenverzeichnis…………………………………………………………………………vii Abkürzungsverzeichnis………………………………………………………………........viii 1. EINLEITUNG 1 1.1. Adipositas – eine chronische Erkrankung 1 1.2. Das adipöse Fettgewebe und das Immunsystem 3 1.3. Monozyten 5 1.3.1. Monozyten – „Schlüsselakteure“ der angeborenen Immunität 5 1.3.2. Aktivierung von Monozyten während Entzündungsprozessen 6 1.4. Das NLRP3-Inflammasom 8 1.5. Immunmetabolismus und metabolische Veränderungen in aktivierten Immunzellen 9 1.6. Zielstellung 12 2. MATERIAL UND METHODEN 14 2.1. Materialien 14 2.2. Methoden 22 2.2.1. Spender und Adipositas-Patienten 22 2.2.2. Isolierung von mononukleären Zellen (PBMCs) aus dem peripheren Blut mittels Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation 22 2.2.3. Bestimmung der Zellzahl 23 2.2.4. Negative Separation von Monozyten über magnetische MACS-Separation 24 2.2.5. Zelllyse 25 2.2.6. Proteinbestimmung 25 2.2.7. Proteomik 26 2.2.9. Seahorse-Analyse der Glykolyse und oxidativen Phosphorylierung 31 2.2.10. Bestimmung intrazellulärer polarer Metaboliten mittels Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) 35 2.2.11. Bestimmung der extrazellulären Glukose- und Laktatkonzentration mittels Blutgasanalysator 37 2.2.12. Bestimmung des intrazellulären ATP- und AMP-Gehalts 38 2.2.13. Bestimmung der intrazellulären NADH- und NADPH-Konzentration 39 2.2.14. Lipidtropfenbestimmung und Untersuchung der Phagozytose mittels ImageStream 40 2.2.15. Durchflusszytometrische Analyse der Latexbeads-Phagozytose und der Zellvitalität 42 2.2.16. Nachweis des oxidativen Bursts mittels Luminol 43 2.2.17. Zytokinbestimmung mittels ELISA 44 2.2.18. Statistische Auswertung und Software zur Datenanalyse 45 3. ERGEBNISSE 46 3.1. Verändertes Proteinexpressionsmuster in Monozyten von adipösen und übergewichtigen Probanden 46 3.1.1. Glykolyse und Pentosephosphatweg 49 3.1.2. Oxidative Phosphorylierung, Citratzyklus, ß-Oxidation 51 3.1.3. Weitere Signalwege und Stoffwechselprozesse 55 3.1.4. Untersuchung des Expressionsmusters von Hexokinase I und Hexokinase II mittels Western Blot 57 3.2. Veränderter Metabolismus der Monozyten von Adipositas-Patienten: Veränderung in den Energiegewinnungsprozessen 60 3.2.1. Erhöhte glykolytische und veränderte mitochondriale Aktivität der Monozyten von Adipositas-Patienten 61 3.2.2. Erhöhung der intrazellulären Metaboliten des zentralen Kohlenhydratstoffmetabolismus in Monozyten von Adipositas-Patienten 67 3.2.3. Keine Unterschiede in der extrazellulären Glukose- und Laktatkonzentration…. 74 3.2.4. Monozyten von Adipositas-Patienten zeigten erhöhten ATP-Gehalt bzw. niedriges AMP/ATP-Verhältnis 76 3.2.5. Veränderter NADH- und NADPH-Gehalt in Monozyten von Adipositas-Patienten 77 3.2.6. Steigende Lipidtropfenbildung in Monozyten von Adipositas-Patienten 80 3.3. Funktionelle Veränderungen der Monozyten von Adipositas-Patienten 84 3.3.1. Unveränderte phagozytische Aktivität der Monozyten von Adipositas-Patienten… 84 3.3.2. Erhöhter oxidativer Burst als Reaktion auf LPS bei Monozyten von Adipositas-Patienten 88 3.3.3. Freisetzung von Zytokinen unter glukosearmen und glukosereichen Bedingungen 90 3.3.4. Kein Unterschied in der Zellvitalität zwischen Monozyten von normalgewichtigen Kontrollen und Adipositas-Patienten 93 4. DISKUSSION 96 4.1. Verändertes Proteinexpressionsmuster in Monozyten von Adipositas-Patienten im Vergleich zu denen von gesunden, normalgewichtigen Kontrollen 97 4.1.1. Glykolytische Enzyme und andere Stoffwechsel-Enzyme 98 4.1.2. Hexokinase I spielt eine zentrale Rolle in Monozyten von Adipositas-Patienten 99 4.1.3. Histonexpression und -modifikation 100 4.1.4. mTOR-Signalweg 101 4.1.5. Immunologisch relevante Proteine 101 4.2. Veränderter Metabolismus in Monozyten von Adipositas-Patienten 102 4.2.1. Monozyten von Adipositas-Patienten weisen eine verstärkte Glykolyse und veränderte oxidative Phosphorylierung auf 103 4.2.2. ATP-Produktion 107 4.2.3. Konzentrationserhöhung der intrazellulären Metaboliten des zentralen Kohlenhydratstoffwechsels in Monozyten von Adipositas-Patienten 108 4.2.4. NADH- und NADPH-Konzentration 111 4.2.5. Lipidtropfen (LD) – ein relevanter Unterschied zwischen Monozyten von Adipositas-Patienten und normalgewichtigen Kontrollen 113 4.3 Funktionelle Veränderungen in Monozyten von Adipositas-Patienten 117 4.3.1. Phagozytose 117 4.3.2. Oxidativer Burst 117 4.3.3. Zytokinproduktion 119 4.3.4. Zellvitalität 121 4.4. Fazit 122 5. ZUSAMMENFASSUNG 125 6. LITERATURVERZEICHNIS 134 7. ANHANG 163 SELBSTSTÄNDIGKEITSERKLÄRUNG I DANKSAGUNG II

Die vorliegende Arbeit untersucht die Rolle des Metabolismus in der Entstehung und Progression des Hepatozellulären Karzinoms (HZK). Der Schwerpunkt der Studie liegt auf Veränderungen zentraler Stoffwechselwege, unter anderem der Glykolyse, der Gluconeogenese, des Citratzyklus und anderer Prozesse des Zellstoffwechsels. Umfassende Multiomikanalysen, wie etwa Proteomik, Metabolomik und gezielte Genomsequenzierung wurden angewandt, um in vivo die Mechanismen der HZK Entstehung zu verstehen. Es wurden zwei Systeme untersucht: das ASV-B Mausmodell und klinische Patientenproben. Die Kohorte bestehend aus Biopsien und Resektaten von 95 Patienten umfasste 47 Fälle von HZK und 48 Fälle ohne HZK. Das Proteom des Mausmodells und der Patientenkohorte zeigen eine deutliche Herabregulierung wesentlicher Energie bereitstellender Kreisläufe im HZK: Glykogenstoffwechsel, de novo Synthese von Glukose, Glutaminaufnahme in den Citratzyklus, des weiteren sind 60% der Enzyme des Citratzyklus, und des Transports von Pyruvat in Mitochondrien im HZK herabreguliert. In dieser Arbeit wurde ein Isoformenwechsel auf mehreren Ebenen des zentralen Kohlenstoffmetabolismus gezeigt. Sowohl das Mausmodell, als auch die Gewebeproben von HZK-Patienten weisen Isoformenwechsel der Phosphoglyzeratmutasen und der Pyruvatkinasen auf. Die Hauptmerkmale finden sich sowohl in Modellmäusen, als auch in Patienten, und stellen so einen universalen metabolomischen Fingerabdruck des HZK dar. Darüber hinaus demonstriert diese Studie, dass die Proteomanalyse von bioptischen Material ein aussagekräftiges und ausreichendes molekular-diagnostisches Instrument für die Krebsforschung ist: die Proteomanalyse von Lebermaterial erlaubt die Unterscheidung von Tumorgewebe und tumorfreien Proben und die Dokumentation des Krankheitsverlaufs. / The present work evaluates the role of metabolism in development and progression of hepatocellular carcinoma (HCC). This study focuses on changes of central metabolic pathways, including glycolysis, gluconeogenesis, tricarboxylic acid (TCA) cycle and other processes involved in cellular metabolism and known to be dysregulated during cancer formation. Comprehensive multiomics analyses, such as proteomics, metabolomics and targeted genome sequencing, were applied in order to better understand HCC developmental mechanisms in vivo. Two main systems were studied: the ASV-B mouse model and clinical samples from human patients. The human cohort was composed of biopsy and surgery material from 95 patients: 47 HCC and 48 non-HCC. Proteomic data from both mice and humans show a clear downregulation of the main energy-producing pathways in HCC. Glycogen metabolism, de novo glucose synthesis, glutamine uptake to the TCA cycle, approximately 60% of enzymes of TCA cycle, and transport of pyruvate to mitochondria are downregulated in HCC. An isoform switch at various levels of central carbon metabolism was demonstrated in this work. Both mice and humans with HCC reveal isoform switches at the level of phosphoglycerate mutases and pyruvate kinases. The key features are found in both mouse and human, showing a universal metabolic HCC fingerprint. This study also demonstrates that proteomic analysis of the bioptate material is a strong and sufficient molecular diagnostic tool for research in cancer: the proteomic analysis of liver material allows the distinction of tumor samples from non-tumor samples and also to track the level of disease progression. Targeted genome sequencing revealed that no clear distinction between cancer and precancerous conditions could be made exclusively from the mutation analysis. Human metabolomic data remains inconclusive, possibly due to the different sources of tissue samples.

Hexokinase 2 (Hxk2) of Saccharomyces cerevisiae is a dual function hexokinase, acting as a glycolytic enzyme and being involved in the transcriptional regulation of glucose-repressible genes. Relief from glucose repression is accompanied by phosphorylation of Hxk2 at serine 15, which has been attributed to the protein kinase Tda1. To explore the role of Tda1 beyond Hxk2 phosphorylation, the proteomic consequences of TDA1 deficiency were investigated by difference gel electrophoresis (2D-DIGE) comparing a wild type and a Δtda1 deletion mutant. To additionally address possible consequences of glucose repression/derepression, both were grown at 2% and 0.1% (w/v) glucose. A total of eight protein spots exhibiting a minimum twofold enhanced or reduced fluorescence upon TDA1 deficiency was detected and identified by mass spectrometry. Among the spot identities are—besides the expected Hxk2—two proteoforms of hexokinase 1 (Hxk1). Targeted proteomics analyses in conjunction with 2D-DIGE demonstrated that TDA1 is indispensable for Hxk2 and Hxk1 phosphorylation at serine 15. Thirty-six glucose-concentration-dependent protein spots were identified. A simple method to improve spot quantification, approximating spots as rotationally symmetric solids, is presented along with new data on the quantities of Hxk1 and Hxk2 and their serine 15 phosphorylated forms at high and low glucose growth conditions. The Δtda1 deletion mutant exhibited no altered growth under high or low glucose conditions or on alternative carbon sources. Also, invertase activity, serving as a reporter for glucose derepression, was not significantly altered. Instead, an involvement of Tda1 in oxidative stress response is suggested.

In der vorliegenden Arbeit werden drei neue Klassen von modular zugänglichen Elektrophilen für die Biokonjugation von Cystein vorgestellt. Diethynyl-phosphinate (DPs) wurden als bisreaktive Elektrophile für die cysteinselektive Markierung von Peptiden, Proteinen und Antikörpern entwickelt. In diesen Molekülen können beide elektronenarmen Dreifachbindungen unter physiologischen Bedingungen mit Thiol-Nukleophilen reagieren und die erhaltenen Konjugate sind in menschlichem Plasma und in Gegenwart großer Mengen an reduziertem Glutathion stabil. Darüber hinaus wurden DPs in der selektiven Herstellung verschiedener Protein-(Doppel)-Konjugate angewandt. Neben der klassischen Proteinmodifikation können DPs auch zur kovalenten Verbrückung der Disulfidbrücken von Antikörpern eingesetzt werden. Weiters wurde mit Hilfe von Dichtefunktionaltheorie-Berechnungen werden Ethinyl-triazolyl-phosphinate (ETP) als eine neue Klasse hochreaktiver Elektrophile für die Cystein-Biokonjugation entdeckt. Die Berechnungen zeigen, dass sowohl die elektronenziehenden als auch die π-Elektronen donierenden Eigenschaften des Triazolrings die Reaktivität erhöhen. Vor allem aber wird gezeigt, dass ETP-Elektrophile über die chemoselektive Cu(I)-katalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition in ein azidhaltiges Molekül eingebaut werden können. Da diese Reaktion problemlos in wässrigen Puffersystemen abläuft, konnte eine Vielzahl funktioneller Elektrophile, einschließlich elektrophiler Peptide und Proteine, aus DPs erzeugt werden. Schließlich wurden Diethinylphosphinoxide als chemoselektive Reagenzien zur Disulfidvererbrückung untersucht. Insbesondere Diethinyl-Triazolyl-Phosphinoxide (DTP) sind vielversprechende Kandidaten, da sie die modulare Synthese von ETP-Elektrophilen mit den beiden reaktiven Gruppen in DPs kombinieren. Die Fähigkeit der DTP-Reagenzien, Disulfide zu verbrücken, wurde durch die Bildung mehrerer funktioneller Antikörperkonjugate gezeigt. / The present work introduces three new classes of modular accessible electrophiles for cysteine bioconjugation. Diethynyl-phosphinates (DPs) were developed as bisreactive electrophiles for the cysteine-selective modification of peptides, proteins and antibodies. Both electrophilic alkynes can react with thiol-nucleophiles under physiological conditions. The corresponding double-conjugates are stable in human plasma and in the presence of a large excess reduced glutathione. Furthermore, the general applicability of diethynyl phosphinates for cysteine selective bioconjugation was established by the generation of various protein-(double)-conjugates and their application in cell experiments. Additionally, DPs can be employed to covalently rebridge the interchain disulfides of therapeutically relevant IgG1 antibodies. Furthermore, with the help of density functional theory based calculations, ethynyl-triazolyl-phosphinates (ETP) were discovered as a new class of highly reactive electrophilic warheads for cysteine bioconjugation. According to the calculations, both the electron withdrawing as well as the π-electron donating properties of the triazole-ring enhance the reactivity of the electrophile. Most importantly, it was demonstrated that ETP electrophiles can be incorporated into a given azide containing molecule via the chemoselective CuI-catalyzed azide alkyne cycloaddition. ETP-reagents were used to obtain functional peptide-, protein- and antibody-conjugates, as well as site-specifically linked diubiquitins. Finally, diethynyl phosphine oxides were explored as chemoselective reagents for disulfide rebridging. Especially diethynyl-triazolyl-phosphine oxides (DTP) are promising candidates since they combine the modular synthesis of ETP-electrophiles with the two reactive groups present in diethynyl phosphinates. The capability of DTP-reagents to rebridged disulfides was proven by the formation several functional antibody conjugates.