O melanoma cutâneo é a neoplasia de pele de maior mortalidade. A imprevisibilidade de sua evolução é uma de suas características principais, o tratamento do tumor primário é, atualmente, de pouca morbidade e, na doença disseminada, as opções terapêuticas são pouco eficazes. É fundamental a pesquisa de marcadores tumorais que permitam a previsão da evolução, melhor compreensão da patogênese do melanoma e possibilitem a descoberta de alvos moleculares. Nesse contexto, estudos genéticos mostraram a importância da regulação do ciclo celular, especialmente a passagem da fase G1-S. Importantes fatores envolvidos compõem a cascata da proteína Rb (p16, ciclina D1, CDK4 e pRb) e da proteína p53 (p53 e p21). Objetivo: verificar a frequência da expressão de p16, ciclina D1,CDK4, pRb, p53 e p21 em melanomas cutâneos de cabeça, pescoço e tronco e sua relação com prognóstico. Métodos: Estudo retrospectivo envolvendo 46 pacientes (sendo 67,3% homens, idade média 57,7 ± 15,8 anos) com melanoma cutâneo de cabeça, pescoço e tronco que foram tratados pela mesma equipe com seguimento mínimo de dois anos. Foram estudados fatores clínicos (topografia do tumor primário, tempo de seguimento, ocorrência de metástases e óbito relacionado), histopatológicos (tipo histológico, índice de Clark, índice de Breslow) e análise imuno-histoquímica pela técnica de micro-array para as proteínas reguladoras do ciclo celular p16, ciclina D1, CDK4, pRb, p53 e p21. Resultados: Houve proporção igualitária entre as topografias (23 casos em tronco, 23 em cabeça e pescoço). Treze pacientes com Clark I (29,5%), cinco com II (11,3%), 16 com III (36,5%), 10 com IV (22,7%) e nenhum com Clark V. A média das medidas de Breslow foi 0,96 (DP=1,01). O seguimento médio foi de 77 meses (DP=47). Oito dos 46 pacientes (17,3%) tiveram evolução desfavorável, com seis óbitos relacionados. A idade foi mais elevada no grupo com evolução desfavorável (p=0,04). Houve expressão de p16 em 80%, ciclina D1 em 58,9%, CDK4 em 43,5%, pRb em 58,5%, p53 em 53,6% e p21 em 52,3% dos melanomas. Em análise univariada, a expressão do p21 foi relacionada com evolução desfavorável (p=0,04), o que não foi observado com a expressão dos outros marcadores (p>0,05). Conclusão: A expressão da proteína p21 nos melanomas cutâneos de cabeça, pescoço e tronco foi relacionada com evolução desfavorável, o que não ocorreu com outros fatores envolvidos na regulação do ciclo celular / Melanoma is the most lethal skin cancer. The outcome of melanoma is not predictable in most cases. Although the treatment for the primary tumor is well tolerated, there are no effective therapeutic options in disseminated disease. Efforts are being made in the search for tumoral markers that may predict outcome, increase the comprehension of melanoma pathogenesis, and may also help the search for molecular targets. In this issue, genetic studies concerning the regulation of cell cycle, including the G1-S checkpoint, are important. The retinoblastoma protein (pRb) pathway (p16, cyclin D1, CDK4 and pRb) and the p53 pathway (p53 and p21) are part of this regulation. Objectives: to verify the expression of p16, cyclin D1, CDK4, pRb, p53 and p21 in head, neck and trunk melanomas, and its correlation with prognosis. Method: Retrospective study approved by institution ethics committee. Fourtysix head, neck and trunk melanoma patients (67.3% men, mean age 57.7±15.8) treated by a single surgeon with minimum 2-years follow-up were enrolled. Clinical factors (primary tumor location, follow-up period, metastasis or related deaths), pathologic (histological subtype, Clark and Breslow index) and microarray immunohystochemical analysis of the cell cycle proteins p16, cyclin D1, CDK4, pRb, p53 and p21. Results: Location of the primary tumor was equal for head/neck and trunk (50% each). Thirteen patients were classified as Clark I (29.5%), five as Clark II (11.3%), 16 as Clark III (36.5%), 10 as IV (22.7%), none as Clark V. Mean Breslow measure was 0.96±1.01. Mean follow-up was 77±47 months. Eight patients (17.3%) had bad outcome, with six related deaths. Patients with worse outcome had a higher mean age at diagnosis (p=0,04). Expression of p16 was positive in 80%. Cyclin D1 was positive in 58.9%. CDK4 was positive in 43.5%. pRb was positive in 58.5%. p53 was positive in 53.6%. p21 was positive in 52.3%. Univariated analysis showed that p21 expression was related to worse outcome (p=0,04), while the other markers were not (p>0,05). Conclusion: p21 expression in head, neck and trunk melanomas was related to worse outcome. Expression of the other cell cycle regulators proteins was not

Introdução: Pearlman e colaboradores relacionou a presença de mutações ativadoras no gene MAP3K1 com o desenvolvimento testicular anormal em pacientes com disgenesia gonadal 46,XY familial, embora os estudos em camundongos tenham demonstrado que o gene Map3k1 não é essencial para a determinação testicular. No desenvolvimento gonadal masculino, a ligação do MAP3K1 à proteína RHOA promove uma fosforilação normal de p38 e ERK1/2, o que determina um bloqueio da via da beta-catenina pela MAP3K4. Já no desenvolvimento feminino, ocorre uma hiper fosforilação de p38 e ERK1/2, o que determina a ativação da via da beta-catenina e o bloqueio da via de retroalimentação positiva do SOX9 e o desenvolvimento testicular. Objetivos: Pesquisar a presença de variantes alélicas do gene MAP3K1 em pacientes portadores de distúrbios do desenvolvimento sexual (1) 46,XY por anormalidades do desenvolvimento gonadal e avaliar a repercussão funcional das variantes identificadas. Casuística e Métodos: Quarenta e sete pacientes com disgenesia gonadal 46,XY (17 com a forma completa e 29 com a forma parcial) e uma paciente com DDS 46,XY de causa etiológica não conhecida foram estudados. As regiões codificadoras do gene MAP3K1 foram amplificadas e sequenciadas pelo método de Sanger ou painel customizado de genes-alvo associados ao DDS. Estudo in vitro utilizando o método de detecção colorimétrica In-Cell ELISA com anticorpos específicos para detecção de ERK1/2 e AKT, fosforilado e não fosforilado foi realizado em fibroblastos obtidos por biópsia de pele e mantidos em cultura celular de 3 indivíduos portadores de variantes no MAP3K1. A quantificação da fosforilação de p38 e ERK por ensaio de citometria em células linfoblastóides mutadas foram realizados em amostras de 4 indivíduos portadores de variantes no MAP3K1 em estudo realizado em colaboração. Imunohistoquímica com anticorpos anti Caspase-3 foram realizadas em tecidos gonadais parafinados das pacientes portadoras de variantes alélicas nos genes MAP3K1 e FGFR2. Resultados: Vinte e uma variantes alélicas, sete das quais ainda não descritas na literatura, foram identificadas no gene MAP3K1. Quatro novas variantes alélicas exônicas e não sinônimas (p.Leu639Pro, p.Leu447Trp, p.Thr657Arg e p.Cys691Arg) foram identificadas em heterozigose; todas foram classificadas como deletérias para a proteína nos estudos de predição \"in silico\", não foram identificadas em indivíduos controles brasileiros estudados e não estão descritas nos bancos de dados populacionais. A variante p.Leu639Pro foi identificada em duas irmãs com disgenesia gonadal 46,XY portadoras da variante p.Ser453Leu no gene FGFR2 identificada previamente. A variante intrônica c.834+1G >T identificada em heterozigose foi classificada como deletéria à proteína na análise no site de predição para alteração de \"splicing\". Os ensaios colorimétricos para detecção de ERK1/2 e AKT, fosforilado e não fosforilado foram inconclusivos. Os estudos in vitro de avaliação dos níveis de fosforilação de p38 e ERK evidenciaram uma maior fosforilação nas culturas celulares mutantes para o MAP3K1 quando comparado com a linhagem celular selvagem, resultado estatisticamente significativo ( p < 0,001) e que corrobora com os dados publicados previamente. A imunohistoquímica com anticorpos anti Caspase-3 mostrou uma maior marcação em células germinativas nos tecidos gonadais das pacientes portadoras das variantes no MAP3K1 e FGFR2 do que no tecido testicular normal, porém marcações foram identificadas também em células germinativas de tecidos testiculares de indivíduos com DDS 46,XY de outras etiologias. Conclusões: Os achados sugerem fortemente a participação das mutações identificadas no MAP3K1 na etiologia dos distúrbios do desenvolvimento sexual dos pacientes estudados. Porém, uma melhor compreensão dos mecanismos de participação da via MAPK nas redes gênicas de regulação do processo de determinação testicular humano ainda é necessário / Introduction: Pearlman et al. associated the presence of activating mutations in MAP3K1 gene with abnormal testicular development in patients with familial 46,XY gonadal dysgenesis, although studies in mice have shown that the Map3k1 gene is not essential for testicular determination. In male gonadal development, the binding of MAP3K1 to the RHOA protein promotes a normal phosphorylation of p38 and ERK1/2, and a blockade of the beta- catenin pathway is determined by MAP3K4. In the female development, hyperphosphorylation of p38 and ERK1/2 occurs. p38 and ERK1/2 hyperphosphorylated determine the activation of the beta-catenin pathway, the blockade of the positive feedback pathway of SOX9 and the testicular development. Objectives: To investigate the presence of allelic variants of the MAP3K1 gene in patients with 46,XY disorders of sex development (DSD) due to abnormalities of gonadal development and to evaluate the functional repercussion of the identified variants. Patients and Methods: Forty-seven patients with 46,XY gonadal dysgenesis (17 patients with complete form and 29 with partial form) and one patient with 46,XY DSD of unknown cause were studied. The MAP3K1 coding regions were amplified and sequenced by Sanger method or by custom panel of target genes associated with DSD. In-Cell ELISA assay with specific antibodies for the detection of phosphorylated and non-phosphorylated ERK1/2 and AKT was performed on fibroblasts obtained by skin biopsy and kept in cell culture of 3 individuals with MAP3K1 variants. Quantification of p38 and ERK phosphorylation by cytometric assay on mutated lymphoblastoid cells were performed on samples from 4 subjects with MAP3K1 variants in a collaborative study. Immunohistochemistry with anti-Caspase-3 antibodies were performed on paraffinembedded gonadal tissues of patients with MAP3K1 and FGFR2 allelic variants. Results: Twenty-one allelic variants, seven of them have not yet been described in the literature, were identified in the MAP3K1. Four novel exonic and non-synonymous allelic variants (p.Leu639Pro, p.Leu447Trp, p.Thr657Arg and p.Cys691Arg) were identified in heterozygous state; all of them were classified as deleterious in silico prediction sites; they were not identified in Brazilian control subjects and they were not described in the human genetic variation databases. The p.Leu639Pro variant was identified in two sisters with 46,XY gonadal dysgenesis carrying the previously identified FGFR2 variant (p Ser453Leu). The intronic c.834+1G > T variant identified in heterozygous state was classified as deleterious in the prediction sites. Colorimetric assays for the detection of phosphorylated and nonphosphorylated ERK1/2 and AKT were not significant. In vitro studies to evaluate p38 and ERK phosphorylation levels evidenced increased phosphorylation in the MAP3K1 mutant cells when compared to the wild type cells line; a statistically significant result (p < 0.001) that confirmed previously published data. The immunohistochemistry study with anti-Caspase-3 antibodies showed that the gonadal tissues of patients with MAP3K1 and FGFR2 variants exhibited more apoptotic germ ceIls than normal testicular tissue, but stained germ cells were also identified in the testicular tissues of the 46,XY DSD controls.Conclusions: These findings strongly suggest the participation of MAP3K1 mutations in the etiology of the testicular abnormalities of the 46,XY DSD patients of this study. However, a better understanding of the mechanisms of MAPK pathway in the gene regulatory networks of the human testicular determination process is still necessary

Introdução: Pearlman e colaboradores relacionou a presença de mutações ativadoras no gene MAP3K1 com o desenvolvimento testicular anormal em pacientes com disgenesia gonadal 46,XY familial, embora os estudos em camundongos tenham demonstrado que o gene Map3k1 não é essencial para a determinação testicular. No desenvolvimento gonadal masculino, a ligação do MAP3K1 à proteína RHOA promove uma fosforilação normal de p38 e ERK1/2, o que determina um bloqueio da via da beta-catenina pela MAP3K4. Já no desenvolvimento feminino, ocorre uma hiper fosforilação de p38 e ERK1/2, o que determina a ativação da via da beta-catenina e o bloqueio da via de retroalimentação positiva do SOX9 e o desenvolvimento testicular. Objetivos: Pesquisar a presença de variantes alélicas do gene MAP3K1 em pacientes portadores de distúrbios do desenvolvimento sexual (1) 46,XY por anormalidades do desenvolvimento gonadal e avaliar a repercussão funcional das variantes identificadas. Casuística e Métodos: Quarenta e sete pacientes com disgenesia gonadal 46,XY (17 com a forma completa e 29 com a forma parcial) e uma paciente com DDS 46,XY de causa etiológica não conhecida foram estudados. As regiões codificadoras do gene MAP3K1 foram amplificadas e sequenciadas pelo método de Sanger ou painel customizado de genes-alvo associados ao DDS. Estudo in vitro utilizando o método de detecção colorimétrica In-Cell ELISA com anticorpos específicos para detecção de ERK1/2 e AKT, fosforilado e não fosforilado foi realizado em fibroblastos obtidos por biópsia de pele e mantidos em cultura celular de 3 indivíduos portadores de variantes no MAP3K1. A quantificação da fosforilação de p38 e ERK por ensaio de citometria em células linfoblastóides mutadas foram realizados em amostras de 4 indivíduos portadores de variantes no MAP3K1 em estudo realizado em colaboração. Imunohistoquímica com anticorpos anti Caspase-3 foram realizadas em tecidos gonadais parafinados das pacientes portadoras de variantes alélicas nos genes MAP3K1 e FGFR2. Resultados: Vinte e uma variantes alélicas, sete das quais ainda não descritas na literatura, foram identificadas no gene MAP3K1. Quatro novas variantes alélicas exônicas e não sinônimas (p.Leu639Pro, p.Leu447Trp, p.Thr657Arg e p.Cys691Arg) foram identificadas em heterozigose; todas foram classificadas como deletérias para a proteína nos estudos de predição \"in silico\", não foram identificadas em indivíduos controles brasileiros estudados e não estão descritas nos bancos de dados populacionais. A variante p.Leu639Pro foi identificada em duas irmãs com disgenesia gonadal 46,XY portadoras da variante p.Ser453Leu no gene FGFR2 identificada previamente. A variante intrônica c.834+1G >T identificada em heterozigose foi classificada como deletéria à proteína na análise no site de predição para alteração de \"splicing\". Os ensaios colorimétricos para detecção de ERK1/2 e AKT, fosforilado e não fosforilado foram inconclusivos. Os estudos in vitro de avaliação dos níveis de fosforilação de p38 e ERK evidenciaram uma maior fosforilação nas culturas celulares mutantes para o MAP3K1 quando comparado com a linhagem celular selvagem, resultado estatisticamente significativo ( p < 0,001) e que corrobora com os dados publicados previamente. A imunohistoquímica com anticorpos anti Caspase-3 mostrou uma maior marcação em células germinativas nos tecidos gonadais das pacientes portadoras das variantes no MAP3K1 e FGFR2 do que no tecido testicular normal, porém marcações foram identificadas também em células germinativas de tecidos testiculares de indivíduos com DDS 46,XY de outras etiologias. Conclusões: Os achados sugerem fortemente a participação das mutações identificadas no MAP3K1 na etiologia dos distúrbios do desenvolvimento sexual dos pacientes estudados. Porém, uma melhor compreensão dos mecanismos de participação da via MAPK nas redes gênicas de regulação do processo de determinação testicular humano ainda é necessário / Introduction: Pearlman et al. associated the presence of activating mutations in MAP3K1 gene with abnormal testicular development in patients with familial 46,XY gonadal dysgenesis, although studies in mice have shown that the Map3k1 gene is not essential for testicular determination. In male gonadal development, the binding of MAP3K1 to the RHOA protein promotes a normal phosphorylation of p38 and ERK1/2, and a blockade of the beta- catenin pathway is determined by MAP3K4. In the female development, hyperphosphorylation of p38 and ERK1/2 occurs. p38 and ERK1/2 hyperphosphorylated determine the activation of the beta-catenin pathway, the blockade of the positive feedback pathway of SOX9 and the testicular development. Objectives: To investigate the presence of allelic variants of the MAP3K1 gene in patients with 46,XY disorders of sex development (DSD) due to abnormalities of gonadal development and to evaluate the functional repercussion of the identified variants. Patients and Methods: Forty-seven patients with 46,XY gonadal dysgenesis (17 patients with complete form and 29 with partial form) and one patient with 46,XY DSD of unknown cause were studied. The MAP3K1 coding regions were amplified and sequenced by Sanger method or by custom panel of target genes associated with DSD. In-Cell ELISA assay with specific antibodies for the detection of phosphorylated and non-phosphorylated ERK1/2 and AKT was performed on fibroblasts obtained by skin biopsy and kept in cell culture of 3 individuals with MAP3K1 variants. Quantification of p38 and ERK phosphorylation by cytometric assay on mutated lymphoblastoid cells were performed on samples from 4 subjects with MAP3K1 variants in a collaborative study. Immunohistochemistry with anti-Caspase-3 antibodies were performed on paraffinembedded gonadal tissues of patients with MAP3K1 and FGFR2 allelic variants. Results: Twenty-one allelic variants, seven of them have not yet been described in the literature, were identified in the MAP3K1. Four novel exonic and non-synonymous allelic variants (p.Leu639Pro, p.Leu447Trp, p.Thr657Arg and p.Cys691Arg) were identified in heterozygous state; all of them were classified as deleterious in silico prediction sites; they were not identified in Brazilian control subjects and they were not described in the human genetic variation databases. The p.Leu639Pro variant was identified in two sisters with 46,XY gonadal dysgenesis carrying the previously identified FGFR2 variant (p Ser453Leu). The intronic c.834+1G > T variant identified in heterozygous state was classified as deleterious in the prediction sites. Colorimetric assays for the detection of phosphorylated and nonphosphorylated ERK1/2 and AKT were not significant. In vitro studies to evaluate p38 and ERK phosphorylation levels evidenced increased phosphorylation in the MAP3K1 mutant cells when compared to the wild type cells line; a statistically significant result (p < 0.001) that confirmed previously published data. The immunohistochemistry study with anti-Caspase-3 antibodies showed that the gonadal tissues of patients with MAP3K1 and FGFR2 variants exhibited more apoptotic germ ceIls than normal testicular tissue, but stained germ cells were also identified in the testicular tissues of the 46,XY DSD controls.Conclusions: These findings strongly suggest the participation of MAP3K1 mutations in the etiology of the testicular abnormalities of the 46,XY DSD patients of this study. However, a better understanding of the mechanisms of MAPK pathway in the gene regulatory networks of the human testicular determination process is still necessary

O melanoma cutâneo é a neoplasia de pele de maior mortalidade. A imprevisibilidade de sua evolução é uma de suas características principais, o tratamento do tumor primário é, atualmente, de pouca morbidade e, na doença disseminada, as opções terapêuticas são pouco eficazes. É fundamental a pesquisa de marcadores tumorais que permitam a previsão da evolução, melhor compreensão da patogênese do melanoma e possibilitem a descoberta de alvos moleculares. Nesse contexto, estudos genéticos mostraram a importância da regulação do ciclo celular, especialmente a passagem da fase G1-S. Importantes fatores envolvidos compõem a cascata da proteína Rb (p16, ciclina D1, CDK4 e pRb) e da proteína p53 (p53 e p21). Objetivo: verificar a frequência da expressão de p16, ciclina D1,CDK4, pRb, p53 e p21 em melanomas cutâneos de cabeça, pescoço e tronco e sua relação com prognóstico. Métodos: Estudo retrospectivo envolvendo 46 pacientes (sendo 67,3% homens, idade média 57,7 ± 15,8 anos) com melanoma cutâneo de cabeça, pescoço e tronco que foram tratados pela mesma equipe com seguimento mínimo de dois anos. Foram estudados fatores clínicos (topografia do tumor primário, tempo de seguimento, ocorrência de metástases e óbito relacionado), histopatológicos (tipo histológico, índice de Clark, índice de Breslow) e análise imuno-histoquímica pela técnica de micro-array para as proteínas reguladoras do ciclo celular p16, ciclina D1, CDK4, pRb, p53 e p21. Resultados: Houve proporção igualitária entre as topografias (23 casos em tronco, 23 em cabeça e pescoço). Treze pacientes com Clark I (29,5%), cinco com II (11,3%), 16 com III (36,5%), 10 com IV (22,7%) e nenhum com Clark V. A média das medidas de Breslow foi 0,96 (DP=1,01). O seguimento médio foi de 77 meses (DP=47). Oito dos 46 pacientes (17,3%) tiveram evolução desfavorável, com seis óbitos relacionados. A idade foi mais elevada no grupo com evolução desfavorável (p=0,04). Houve expressão de p16 em 80%, ciclina D1 em 58,9%, CDK4 em 43,5%, pRb em 58,5%, p53 em 53,6% e p21 em 52,3% dos melanomas. Em análise univariada, a expressão do p21 foi relacionada com evolução desfavorável (p=0,04), o que não foi observado com a expressão dos outros marcadores (p>0,05). Conclusão: A expressão da proteína p21 nos melanomas cutâneos de cabeça, pescoço e tronco foi relacionada com evolução desfavorável, o que não ocorreu com outros fatores envolvidos na regulação do ciclo celular / Melanoma is the most lethal skin cancer. The outcome of melanoma is not predictable in most cases. Although the treatment for the primary tumor is well tolerated, there are no effective therapeutic options in disseminated disease. Efforts are being made in the search for tumoral markers that may predict outcome, increase the comprehension of melanoma pathogenesis, and may also help the search for molecular targets. In this issue, genetic studies concerning the regulation of cell cycle, including the G1-S checkpoint, are important. The retinoblastoma protein (pRb) pathway (p16, cyclin D1, CDK4 and pRb) and the p53 pathway (p53 and p21) are part of this regulation. Objectives: to verify the expression of p16, cyclin D1, CDK4, pRb, p53 and p21 in head, neck and trunk melanomas, and its correlation with prognosis. Method: Retrospective study approved by institution ethics committee. Fourtysix head, neck and trunk melanoma patients (67.3% men, mean age 57.7±15.8) treated by a single surgeon with minimum 2-years follow-up were enrolled. Clinical factors (primary tumor location, follow-up period, metastasis or related deaths), pathologic (histological subtype, Clark and Breslow index) and microarray immunohystochemical analysis of the cell cycle proteins p16, cyclin D1, CDK4, pRb, p53 and p21. Results: Location of the primary tumor was equal for head/neck and trunk (50% each). Thirteen patients were classified as Clark I (29.5%), five as Clark II (11.3%), 16 as Clark III (36.5%), 10 as IV (22.7%), none as Clark V. Mean Breslow measure was 0.96±1.01. Mean follow-up was 77±47 months. Eight patients (17.3%) had bad outcome, with six related deaths. Patients with worse outcome had a higher mean age at diagnosis (p=0,04). Expression of p16 was positive in 80%. Cyclin D1 was positive in 58.9%. CDK4 was positive in 43.5%. pRb was positive in 58.5%. p53 was positive in 53.6%. p21 was positive in 52.3%. Univariated analysis showed that p21 expression was related to worse outcome (p=0,04), while the other markers were not (p>0,05). Conclusion: p21 expression in head, neck and trunk melanomas was related to worse outcome. Expression of the other cell cycle regulators proteins was not

A Leucemia Mielóide Crônica (LMC) é uma neoplasia mieloproliferativa resultante da expansão clonal de células mielóides positivas para o cromossomo Philadelphia. A patogênese da LMC está associada à expressão do oncogene BCR-ABL1, que codifica a proteína Bcr-Abl com constitutiva atividade da tirosina quinase, promovendo a mieloproliferação exacerbada e a resistência à apoptose das células leucêmicas. Os pacientes com LMC são tratados principalmente com inibidores de tirosina quinase (TKI), mas a resistência aos inibidores e a refratariedade tem sido relatada em alguns pacientes na fase crônica e na maioria dos pacientes em fases avançadas da doença. Assim sendo, continua a ser de suma importância a elucidação da patogênese da LMC e a busca de novos alvos terapêuticos, como os membros da via de sinalização Hippo e reguladores do ciclo celular, da família Aurora quinase. O presente estudo quantificou o nível de expressão de genes que codificam componentes da via de sinalização Hippo (MST1, MOB1B, MOBKL1B, LATS1, LATS2, YAP e TAZ) e Aurora quinases A e B em: 1) pacientes com LMC em diferentes fases da doença, resistentes ou sensíveis à terapia com mesilato de imatinibe (MI), em indivíduos saudáveis e 2) linhagens celulares HL-60, HL-60.Bcr- Abl tratadas com TKI (imatinibe, dasatinibe e nilotinibe), KCL22 e LAMA84 resistentes e sensíveis ao MI. Os níveis de expressão dos genes alvo foram correlacionados com o índice de prognóstico de Sokal. Os principais resultados revelaram que há alteração nos genes MST1, MOB1B, MOBKL1B, LATS1, LATS2, TAZ, AURKA e AURKB em pacientes com LMC em relação aos controles. Não houve correlação entre o índice de Sokal e a expressão gênica dos genes da via Hippo, MST1, MOB1B, MOBKL1B, LATS1, LATS2 e TAZ, assim como os genes Aurora quinases A e B. Pacientes com LMC em fases avançadas apresentaram maiores valores de expressão dos genes TAZ e AURKB, comparado aos pacientes na fase crônica. Os pacientes resistentes ao TKI apresentaram as expressões dos genes MST1, TAZ e AURKB, significativamente mais elevadas, comparado aos pacientes sensíveis ao MI. Os resultados dos estudos em linhagens celulares indicaram principalmente que a expressão do gene LATS1 pode ser modulada pela atividade de tirosina quinase Bcr-abl e que o oncogene BCR-ABL1 induz a expressão de AURKA, AURKB, LATS1 e TAZ. Em conjunto os dados obtidos revelam que a alteração da expressão dos genes da família Aurora quinase, A e B, e dos genes que codificam proteínas da via Hippo contribui para a patogênese e progressão da LMC. O desenvolvimento de fármacos e/ou a identificação de marcadores tumorais para a via de sinalização Hippo e família Aurora quinase, podem otimizar o tratamento da LMC, aumentando a susceptibilidade das células leucêmicas a apoptose e levando a um melhor prognóstico da doença / Chronic myeloid leukemia (CML) is a myeloproliferative neoplasm resulting from clonal expansion of myeloid cells positive for the Philadelphia chromosome. The CML pathogenesis is associated with BCR-ABL1 oncogene expression, which encodes the Bcr-Abl protein with a constitutive tyrosine kinase activity, leading to leukemic cell high proliferation and resistance to apoptosis. CML patients are mainly treated with tyrosine kinase inhibitors (TKI), but some of CML patients in chronic phase are resistant and in advanced phases are refractory to TKI. Thus, it is still relevant to elucidate the CML pathogenesis and seek to new therapeutic targets, including the Hippo signaling pathway members and cell cycle regulatory genes such as those encoding the Aurora kinase family. The present study quantified the RNA expression level of genes encoding components from the Hippo cell signaling pathway (MST1, MOB1B, MOBKL1B, LATS1, LATS2, YAP, and TAZ) and Aurora kinase A and B in: 1) CML patients at different stages of the disease, in CML patients resistant or sensitive to imatinib mesylate therapy, healthy individuals and 2) in cell lines HL-60, HL-60.Bcr-Abl treated with TKI (imatinib mesylate, dasatinib and nilotinib), KCL22 and LAMA84 resistant and sensitive to IM. The RNA expression levels of the target genes were also correlated to the CML Sokal\'s prognostic score values. The main results revealed that there are alterations in the genes MST1, MOB1B, MOBKL1B, LATS1, LATS2, TAZ, AURKA and AURKB in patients with CML in relation to the controls. There was no correlation between the Sokal index and the gene expression of the Hippo, MST1, MOB1B, MOBKL1B, LATS1, LATS2 and TAZ genes, as well as the Aurora kinase genes A and B. Patients with advanced phase CML had higher values of expression of the TAZ and AURKB genes, compared to the patients in the chronic phase. Patients resistant to TKI had significantly higher MST1, TAZ and AURKB gene expression compared to MI-sensitive patients. The results of the studies in cell lines indicated primarily that the expression of the LATS1 gene can be modulated by the Bcr-abl tyrosine kinase activity and the BCR-ABL1 oncogene induces the expression of AURKA, AURKB, LATS1 and TAZ. Together, the data show that altered expression of Aurora kinase family genes, A and B, and genes coding for Hippo pathway proteins contribute to the pathogenesis and progression of CML. The development of drugs and/or identification of tumor markers for the Hippo signaling pathway and the Aurora kinase family can optimize CML treatment by enhancing the susceptibility of leukemic cells to apoptosis and leading to a better disease prognosis

A Doença de Alzheimer (DA) é uma desordem neurodegenerativa progressiva que causa comprometimento cognitivo e demência. O diagnóstico é baseado em parâmetros clínicos, mas sua confirmação é post-mortem, após avaliação patológica durante a autópsia. Os tratamentos disponíveis para a DA são os inibidores da colinesterase (IChEs) e os antagonistas de receptores de N-metil-D-aspartato (NMDA), sendo que os IChEs compõe o principal grupo. Diversos estudos tem mostrado um efeito neuroprotetor dos IChEs, levando a alterações na patogênese da DA. Avaliar e mensurar essas alterações são papeis atribuídos aos biomarcadores. Neste sentido podemos destacar a fosfolipase A2 (PLA2), a principal responsável pelo metabolismo de fosfolípides de membrana, e que tem sido achada diminuída na DA, assim como a glicogênio sintase-quinase (GSK), responsável pela fosforilação da proteína Tau, que é um dos processos alterados na DA. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do tratamento com IChE sobre a atividade da PLA2 e expressão da GSK3B em plaquetas de 30 pacientes com DA após 3 e 6 meses de tratamento. Como grupo controle foram investigados 42 individuos idosos sem doença neurodegenerativa. Encontramos nos pacientes com DA antes do tratamento uma diminuição da atividade da iPLA2 quando comparada ao grupo controle. Após três e seis meses de tratamento a PLA2 aumentou, voltando ao nível dos controles. Os pacientes que apresentaram um aumento maior da iPLA2 apos 3 meses de tratamento apresentaram melhora cognitiva mais marcante após seis meses de tratamento, avaliado pelo CAMCOG. Apos 6 meses de tratamento encontramos um inativação da GSK3B, medida por um aumento em sua forma fosforilada. Nossos resultados sugerem que o donepezil apresenta propriedades modificadoras na doença de Alzheimer, e ainda que a medida da atividade da iPLA2 poderia ser usada como marcador de resposta terapêutica ao donepezil e, possivelmente, a outros IChEs, na doença de Alzheimer / Alzheimer\'s disease (AD) is a progressive neurodegenerative disorder that causes dementia and cognitive impairment. The Diagnosis is based on clinical parameters, but confirmation is post-mortem after pathologic evaluation during autopsy. The treatments available for AD are cholinesterase inhibitors (IChEs) and N-methyl-D-aspartate (NMDA) antagonists. The main group comprises the IChEs. Several studies have shown a neuroprotective effect of IChEs, leading to alterations in the pathogenesis of AD. Evaluate and measure these changes are assigned to biomarkers. In this regard we can highlight the phospholipase A2 (PLA2) the main enzyme in membrane phospholipids metabolism and that has been found decreased in AD as well as Glycogen Synthase kinase (GSK), a major responsible for tau phosphorylation which is one processes altered in AD. The objective of this study was to evaluate the effect of treatment with IChE on PLA2 activity and GSK3B expression in platelet of 30 AD patients after 3 and 6 months of treatment. The control group comprised 42 elderly individuals without neurodegenerative disease The results obtained were a decreased iPLA2 activity in patients with AD before treatment as compared to controls. After 3 and 6 months of treatment, we observed a significant increase in iPLA2 activity, restoring enzymatic activity similar to that observed among control. The patients who showed higher iPLA2 activity in the first three months were those showing cognitive improvement after six months of treatment, measured by CAMCOG. After 6 months of treatment a GSK3B inactivation were found, measured by an increase in its phosphorylated form. Our results suggest that donepezil present modifying properties in Alzheimer disease and that iPLA2 activity measurement could be used as a marker of therapeutic response to donepezil and possibly other IChEs in Alzheimer\'s disease

O aproveitamento biotecnológico do glicerol representa uma alternativa para a redução dos problemas ambientais derivados do acúmulo de glicerol originado do processo de produção de biodiesel. O glicerol bruto (70,6% p/p) resultante do processo de transesterificação do óleo de soja e metanol foi submetido a tratamento com ácidos inorgânicos, com o objetivo de remover impurezas e reduzir a alcalinidade resultante do excesso de catalisador (KOH). A fração glicerínica resultante foi caracterizada quanto à concentração de glicerol, ésteres e íons metálicos; e empregada como fonte de carbono e energia para crescimento de bactérias probióticas. Os probióticos são organismos vivos que, quando administrados em quantidades adequadas, conferem benefício à saúde do hospedeiro. Quinze estirpes de Lactobacillus, com características probióticas, foram avaliadas quanto à capacidade de crescimento em meio contendo glicerol de biodiesel tratado (20 g/L) como principal fonte de carbono, sob condições de pHinicial=6,0 e 37 °C. Os resultados demonstraram a eficácia do ácido fosfórico para remoção de impurezas do glicerol bruto, o que permitiu a obtenção de uma fração contendo 900 a 964 g/L de glicerol. A avaliação de formulações de meios de cultivo contendo glicerol tratado revelou que treze estirpes de Lactobacillus mostraram capacidade de crescimento em glicerol de biodiesel, sendo os maiores rendimentos (YX/S) de 0,34, 0,28 e 0,26 g/g para as estirpes L. delbrueckii UFV-H2b20, L. acidophilus ATCC 4356 e L. plantarum ATCC 8014, respectivamente. A cinética de crescimento das estirpes selecionadas foi estudada em meio MRS modificado (ausência de glicose) contendo glicerol (10 g/L) suplementado ou não com citrato de amônio (2 g/L) e acetato de sódio (5,0 g/L), pH 6,0; 37 °C e 150 rpm. Os maiores rendimentos foram alcançados quando se utilizou meio MRS modificado contendo citrato de amônio e acetado de sódio; gerando valores de rendimentos correspondentes a 0,46, 0,38 e 0,46 g/g para L. delbrueckii UFV-H2b20, L. acidophilus ATCC 4356 e L. plantarum ATCC 8014, respectivamente. No tocante a atividade das enzimas envolvidas na assimilação de glicerol, glicerol quinase (EC. 2.7.1.30) e glicerol desidrogenase (EC.1.1.1.72), os resultados mostraram que, nos extratos livres de células de L. plantarum ATCC 8014, L. delbrueckii UFV-H2b20 e L. acidophilus ATCC 4356, os valores de atividade específica de glicerol quinase após 24 h de cultivo foram 91,1; 232,5 e 228,7 U/mg, respectivamente. Os valores da constante de Michaelis-Menten (Km) foram de 3,7; 1,2 e 2,5 mM para glicerol quinase e 19,2; 12,8; 33,3 e mM para glicerol desidrogenase de L. plantarum ATCC 8014, L. delbrueckii UFV-H2b20 e L. acidophilus ATCC 4356, respectivamente. Os valores de velocidades máximas (Vmáx) da reação foram de 46,4; 115,1 e 119,4 µM/min para glicerol quinase e 1,23; 1,03 e 2,7µM/min para glicerol desidrogenase de L. plantarum ATCC 8014, L. delbrueckii UFV-H2b20 e L. acidophilus ATCC 4356, respectivamente. A avaliação da técnica de encapsulamento de células de Lactobacillus probióticos em alginato-amido de banana verde (2%/2%) pela técnica de emulsificação em óleo vegetal e gelificação ionotrópica, permitiu a sobrevivência das células encapsuladas superior a 65%, na presença de fluído gástrico simulado, bem como sob condições de armazenagem a 4 °C. Os resultados do presente trabalho revelaram a potencialidade da utilização de glicerol de biodiesel como fonte de carbono e energia para o crescimento de bactérias lácticas que apresentam propriedades probióticas, visando a obtenção de um produto microencapsulado em matriz polimérica natural. / Biotechnological utilization of biodiesel-derived glycerol represents an alternative for the reduction of the environment concerns associated with the accumulation of this byproduct. Crude glycerol (70.6% w/w), obtained from the transesterification process of soybean oil and methanol; was treated with inorganic acids in order to remove impurities and decrease the alkalinity derived from the excess of catalyst (KOH). The glycerine fraction obtained was characterized regarding the final glycerol concentration, esters and metallic ions; and it was utilized as source of carbon and energy for growth of probiotic bacteria. Probiotics are live microorganisms that, when administered in adequate amounts, confer a health benefit on the host. Fifteen probiotic bacterial strains were screened to evaluated their capabilities to assimilate treated-glycerol (20 g/L) as main carbon source, at pH=6.0 and 37 °C. The results showed the effectiveness of the phosphoric acid for the removal of impurities from crude glycerol; allowing to attain a glycerol fraction containing 964 g/L. The evaluation of media containing treated glycerol revealed that thirteen strains of Lactobacillus showed capability to grow in biodiesel-derived glycerol, with yieds (YX/S) of glycerol conversion of 0.34, 0.28 and 0.26 g/g for L. delbrueckii UFV-H2b20, L. acidophilus ATCC 4356 and L. plantarum ATCC 8014, respectively. Kinetics of growth of the selected strains was studied in modified MRS medium containing glycerol(10 g/L) supplemented with or in the absence of ammonium citrate (2 g/L) and sodium acetate (5 g/L), pH 6.0; 37 °C and 150 rpm. The highest yields were attained in modified MRS containing ammonium citrate and sodium acetate; with 0.46, 0.38 and 0.46 g/g for L. delbrueckii UFV-H2b20, L. acidophilus ATCC 4356 and L. plantarum ATCC 8014, respectively. The free-cell extract of L. plantarum ATCC 8014, L. delbrueckii UFV-H2b20 and L. acidophilus ATCC 4356 showed activity for glycerol kinase (EC.2.7.1.30) and glycerol dehydrogenase (EC1.1.1.72). The maximal glycerol kinase activity was attained at the late exponential phase of growth, with 91.1; 232.5 and 228.7 U/mg for L. plantarum ATCC 8014, L. delbrueckii UFV-H2b20 and L. acidophilus ATCC 4356, respectively. The Michaelis-Menten (Km) values were 3.7; 1.2 and 2.5 mM for glycerol kinase and 19.2; 12.4 and 33.2 mM for glycerol dehydrogenase of L. plantarum ATCC 8014; L. delbrueckii UFV-H2b20 and L. acidophilus ATCC 4356, respectively. The maximum reaction rates (Vmáx) were 46.5; 115.1 and 119.4 µM/min for glycerol kinase and 1.23; 1.03 and 270 µM/min for glycerol dehydrogenase of L. plantarum ATCC 8014; L. delbrueckii UFV-H2b20 and L. acidophilus ATCC 4356, respectively. Furthermore, the results of the evaluation of probiotic Lactobacillus cell encapsulation in alginate-unripe banana starch (2%/2%) obtained by emusification in soybean oil and ionotropic gelification with calcium chloride, showed a cell survival rate higher than 65%, regarding the initial cell concentration in simulated gastric fluid,and during 28 days stored at 4 °C. The results revealed that, glycerol from biodiesel production process represents a potential carbon and energy source for the growth of probiotic bacteria.

Neste trabalho foi utilizado um esquema multi-técnicas para estudar as interações moleculares no mecanismo de ação de clorocatecol 1,2-dioxigenase e da tirosina quinase FGFR2. Na primeira parte desta tese, descrevemos uma série de experimentos envolvendo a interação da enzima clorocatecol 1,2- dioxigenase (1,2-CCD) com seus ligantes naturais e também com miméticos de membranas biológicas (micelas de surfactantes, monacamadas lipídicas e lipossomos). Utilizamos a técnica de calorimetria de titulação isotérmica (ITC) para mostrar que tanto o substrato, quanto o produto da reação inibem a cinética enzimática mediada por 1,2-CCD. Resultados obtidos com as técnicas de calorimetria de varredura diferencial (DSC) e ressonância paramagnética eletrônica (RPE) confirmaram que a inibição se dá devido à ligação direta do produto da reação no sítio catalítico da enzima. Sendo assim, nossos dados indicam que o produto da reação exerce um papel relevante na catálise mediada por 1,2-CCD, devendo ser levado em consideração para estudos futuros que versem sobre a regulação da atividade desta enzima. Em outra vertente, investigamos a capacidade de 1,2-CCD de se ligar a modelos de membranas. Para isso, utilizamos as técnicas de RPE, DSC e de monocamadas de Langmuir no monitoramento das alterações nos miméticos de membranas (micelas dos surfactantes SDS e CTABr, monocamdas de DPPC e lipossomos de DPPC e DMPC) quando da adição de 1,2-CCD. Este conjunto de dados aponta claramente para a existência da referida interação, o que pode representar, junto com a inibição por produto, outro mecanismo de regulação do metabolismo desta enzima dentro da célula. Na segunda parte de nosso estudo, utilizamos a técnica de ITC para acessar as cinéticas de autofosforilação de FGFR2 quinase e de fosforilação, catalisada por FGFR2 quinase, da isoforma p52 da proteína Shc. A fosforilação reversível da cadeia lateral de aminoácidos é um princípio de regulação da atividade de enzimas e sinalização de proteínas largamente utilizado pelas células. Para tornarem-se ativas, proteínas tirosina quinase (PTK) autofosforilam-se hidrolisando moléculas de ATP em ADP em uma reação sequencial e precisamente ordenada. Uma vez ativas, interagem com proteínas adaptadoras, como Shc, que são fosforiladas pelo intermédio de PTK. Assim que é fosforilada, Shc torna-se apta a interagir com outras proteínas importantes no processo de sinalização celular para formar os complexos de sinalização primários (ESC). Nossos resultados mostram que o processo de autofosforilação da FGFR2 é governado por uma cinética cooperativa e com a ordem de fosforilação dos resíduos de tirosina provavelmente idêntica àquela previamente determinada para FGFR1. Já para a fosforilação de Shc, a cinética tende a mudar com a temperatura, sendo que a 10oC ocorre segundo um mecanismo de Michaelis- Menten, enquanto que a 15oC podemos identificar uma indefinição de comportamento deste sistema, uma vez que os dados podem ser ajustados pelos modelos de Michaelis-Menten e Hill. Já para 20oC, vemos uma mudança no perfil catalítico, mostrando um certo grau de cooperatividade. Estes resultados, além de estabelecerem características da cinética de fosforilação de FGFR2 e Shc ainda não reportadas, também validam o método calorimétrico utilizado para determinar os parâmetros cinéticos associados àquele processo. / In this thesis we have used a muti-technique approach to study the molecular interactions relevant in the reaction mechanism of two enzymes: chlorocatechol 1,2 dioxygenase (1,2-CCD) and tyrosine kinase FGFR2. In the first part, we have described a series of experiments involving the interaction of 1,2-CCD with its natural ligands and also with models of biological membranes (micelles, lipid monolayer, and liposomes). Isothermal titration calorimetry (ITC) has shown that both substrate and product of the reactions inhibit 1,2-CCD kinetics. The results from differential scanning calorimetry (DSC) and electron paramagnetic resonance (EPR) have confirmed that inhibition is due to the direct binding of product to the enzyme catalytic site. Thus, our data has indicated that the product of reaction plays a relevant role in the 1,2-CCD catalysis, and should be taken into account in studies related to activity regulation of this class of enzymes. In other study, we have investigated the 1,2-CCD capability of binding to model membranes. For that, EPR, DSC and Langmuir monolayer have been used to monitor changes in the mimetic systems (SDS and CTABr micelles, DPPC monolayer and DMPC liposomes) upon addition of 1,2-CCD to the system. Taken together our data points to existence of the such interaction, which means that this behaviour, along with the product inhibition, could be another mechanism for regulating this enzyme metabolism inside the cell. In the second part of our work, we have used ITC to assess the kinetics of phosphorylation of both FGFR2 kinase and the p52 isoform of Shc. The reversible phosphorilation of tyrosine residues is a widely used mechanism for regulating enzyme activity and protein signalling into the cell. To become active, Tyrosine kinase (PTK) phosphorylates itself by hydrolysing ATP into ADP molecules in a sequential and precisely ordered reaction. When active, PTK interacts with protein partners, like Shc, thus phosphorylating them. After its phosphorylation, Shc interacts with other important proteins in signalling events in order to form the so-called early signalling complexes (ESC). Our results have shown that the FGFR2 kinetics of autophosphorilation happened in a cooperative manner and probably following a phosphorilation order of the Tyr residues similar to that previously reported for FGFR1 kinase. As for the Shc phosphorilation mediated by FGFR2 kinase, it changes with temperature from a regular Michaelis-Menten kinetics at 10oC to an unclear behaviour, adjustable to both Michaelis-Menten and to Hill model, at 15oC. At 20oC, we can see that the kinetics shows some degree of cooperativity. These results provide the kinetic parameters for the FGFR2 authophosphorilation as well as p52Shc phosphorilation that have not been reported before, and also validate the calorimetric methods as a very useful tool to perform kinetics studies related to kinase signalling processes.

A família proteína quinases C (PKC) é composta por dez isoenzimas, as quais são capazes de fosforilar resíduos de serina e treonina. A ativação dessas quinases envolve mudanças conformacionais, como a remoção do pseudo-substrato do sítio ativo e associação dessas enzimas com lipídeos em membranas biológicas. Além disso, três fosforilações são importantes para a maturação/ enovelamento da enzima e não estão associadas com o estado de ativação das cPKCs. Apesar dessas quinases estarem envolvidas em vários processos patológicos, como carcinogênese e doenças cardiovasculares, ainda não se estabeleceu a relação entre estado de ativação das PKCs com essas doenças. Isso se deve, em parte, à ausência de ferramentas que possibilitam a distinção das formas ativas e inativas das PKCs. Na presente tese, baseando-se em mudanças conformacionais sofridas pelas PKCs durante o processo de ativação, dois anticorpos contra cPKCs ativas foram racionalmente desenvolvidos, sendo um anticorpo policlonal (anti-C2Cat) e outro monoclonal (4.8E). O anticorpo anti-C2Cat foi desenvolvido a partir de imunização de coelhos com um peptídeo localizado na região de interação entre os domínios C2 e catalítico na PKC inativa. Já o anticorpo monoclonal 4.8E foi produzido após a imunização de camundongos Balb/ C com extrato de proteínas proveniente de células HEK293T superexpressando formas constitutivamente ativas da PKC&#946;I. A seletividade de anti-C2Cat e 4.8E por cPKCs ativas foi demonstrada por ensaios de ELISA e de imunoprecipitação, sendo que os anticorpos sempre apresentaram maior afinidade por cPKCs ativas purificadas, superexpressas ou mesmo as endógenas. O anticorpo anti-C2Cat foi capaz de monitorar a dinâmica espaço-temporal da ativação das cPKCs em linhagens de neuroblastoma (Neuro-2A e SK-N-SH) estimuladas com PMA, morfina, ATP ou glutamato por diferentes tempos. Ainda, um maior conteúdo de cPKCs ativas foi detectado por anti-C2Cat na linhagem de câncer de mama MDA-MB-231 (triplo- negativa) do que em células MCF-7 (ER+). Em acordo com esses dados, anti-C2Cat identificou uma maior ativação de cPKCs em tumores mais agressivos de câncer de mama (subtipo triplo-negativo) do que em tumores menos agressivos (ER+, subtipo luminal). Os anticorpos conformacionais anti-C2Cat e 4.8E foram aplicados para elucidar vias de sinalização que levam à carcinogênese em células MDA-MB-231, por meio da realização de ensaios de co-imunoprecipitação, seguida pela identificação das proteínas por espectrometria de massas. Usando essa abordagem, os resultados sugerem que as cPKCs ativas possam estar envolvidas com a tradução de proteínas envolvidas na migração celular, como actina. Em conjunto, os resultado obtidos na presente tese demonstram duas formas racionais de desenvolver anticorpos contra cPKCs ativas, sendo que algumas aplicações para estas ferramentas foram demonstradas. Estratégias baseadas em mudanças conformacionais, similares às apresentadas aqui, poderão ser utilizadas para a produção racional de anticorpos contra outras quinases ou proteínas / The protein kinase C family (PKC) is composed of ten isoenzymes, which are capable of phosphorylating serine and threonine amino acid residues. PKC activation involves conformational changes, such as removing the pseudo-substrate from the active site and binding of the enzyme to lipids in biological membranes. In addition, PKC undergoes three phosphorylations that are important for the maturation/ folding of the enzyme and are not linked with activation status. Despite the fact that these kinases are involved in various pathological processes, such as carcinogenesis and cardiovascular disease, a relationship between PKC activation status with these diseases has not yet been established. This is partly due to the lack of tools to detect active PKC in tissue samples. In this thesis, based on conformational changes suffered by PKC during its activation, two antibodies against active cPKCs were rationally developed; a polyclonal antibody (anti-C2Cat) and a monoclonal (4.8E). Anti-C2Cat was produced after immunization of rabbits with a peptide located at the interface between the C2 and catalytic domains of cPKCs in an inactive PKC. The monoclonal antibody 4.8E was produced after immunization of Balb/C mice with total lysates from HEK293T cells overexpressing constitutively active forms of PKC&#946;I. The anti-C2Cat and 4.8E specificity by active cPKCs was demonstrated by ELISA and immunoprecipitation assays, where the antibodies always showed higher affinity to active cPKCs. Anti-C2Cat was able to detect the temporal and spatial dynamics of cPKC activation upon receptor (morphine, ATP or glutamate) or phorbol ester stimulation in neuroblastoma lines (Neuro-2A and SK-N-SH). Futhermore, anti-C2Cat is able to detect active PKC in human tissues. Higher levels of active cPKC were observed in the more aggressive triple negative breast cancer tumors as compared to the less aggressive estrogen receptor positive tumors. Also, both antibodies were applied to study signaling pathways that lead to carcinogenesis in MDA-MB-231 cells by performing co-immunoprecipitation and mass spectrometry. Using this approach, the results suggest that active cPKCs may be involved in translation of proteins involved in cell migration, such as actin. Taken together, the results obtained in this thesis showed two rational ways to develop antibodies against active cPKCs and some applications for these tools were demonstrated. Strategies based on conformational changes, similar to those presented herein may be used for rational production of antibodies against other kinases and proteins.

Objetivamos investigar o papel da quinase ativada por adenosina monofosfato (AMPK) na doença renal crônica. Induzimos nefrite túbulo-intersticial (NTI) em camundongos C57BL/6 e LyzM-cre AMPKflox/flox através de ração com adenina, e tratamos com metformina (Met) 200 mg/kg/dia. Avaliamos ainda o efeito da Met sobre a transição epitélio-mesenquimal (TEM) em células tubulares epiteliais renais murinas (linhagem MM55.K). Os C57BL/6 tratados apresentaram preservação da função renal; maior frequência de macrófagos (MØ) M1, em detrimento dos M2; e redução de marcadores de fibrose. Os LyzM-cre AMPK-/- não diferiram dos LyzM-cre AMPK+/+ quanto à intensidade da lesão, por a molécula já se encontrar infrarregulada na NTI. Contudo, ao serem tratados com Met, os LyzM-cre AMPK+/+ evoluíram melhor do que os não tratados, o mesmo não se verificando nos LyzM-cre AMPK-/-, sugerindo que a ação da Met nos MØ é dependente de AMPK. As MM55.K, após estímulo com Met, exibiram maior captação de glicose, expressão do transportador Glut-2, ativação da glicólise, e resistência à TEM. / We aimed to investigate the role of adenosine monophosphate activated kinase (AMPK) on chronic kidney disease. We induced tubulointerstitial nephritis (TIN) in C57BL/6 and LyzM-cre AMPKflox/flox mice by feeding them adenine diet, and then treating with metformin (Met) 200 mg/kg/day. We also evaluated the effect of Met on epithelium-to-mesenchyma transition (EMT) of murine epithelial renal tubular cells (lineage MM55.K). Met-treated C57BL/6 mice presented preserved kidney function, greater frequency of M1 macrophages (MØ) compared to M2 ones, and reduced markers of fibrosis. Disease severity on LyzM-cre AMPK-/- and AMPK+/+ mice did not differ, since the molecule was already downregulated on TIN. However, by treating them with Met, LyzM-cre AMPK+/+ improved in comparison to the non-treated mice. The same did not happen with LyzM-cre AMPK-/- mice, suggesting that Met effect on MØ is AMPK-dependent. MM55.K cells, after stimulus with Met, showed increased glucose uptake, greater expression of the transporter Glut-2, activation of glycolysis, and resistance to EMT.