As neoplasias mieloproliferativas (NMPs) Filadelfia negativo como a policitemia vera (PV), trombocitemia essencial (TE) e mielofibrose primária (MFP) são desordens clonais da célula tronco hematopoiética caracterizadas pela produção excessiva de células mielóides diferenciadas. Este fenômeno ocorre devido à uma mutação somática (JAK2V617F) que ativa a via JAK-STAT de transdução de forma constitutiva. Esta mutação é mais frequente na PV, ocorrendo em 95% dos casos, e em 50% dos casos de TE e MFP. Outro defeito genético que ocorre é a mutação no receptor de trombopoetina, MPL. As mutações em MPL podem ser germinativas ou somáticas e menos de 10% dos pacientes com TE e MFP apresentam essa alteração genética. Entretanto, grande parte dos pacientes com TE e MFP que não apresentam mutação em JAK2V617F ou MPL podem apresentar mutações somáticas no gene CALR. Em adição às mutações somáticas que causam mieloproliferação, outras alterações genéticas em genes que funcionam como reguladores epigenéticos são encontrados nas NMPs nos genes TET2, IDH1, IDH2 e ASLX1. Objetivo: Estabelecer um perfil genético em pacientes com NMP através da avaliação de mutações nos genes JAK2, CALR, MPL, IDH1, IDH2, TET2 e ASXL1 assim como estabelecer uma correlação laboratorial destas na PV, TE e MFP. Casuística e Métodos: Foram utilizadas amostras de sangue periférico de 104 pacientes que foram enviadas para o Laboratório de Biologia Tumoral do Serviço de Hematologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo para avaliação diagnóstica. Quinze dos 104 pacientes são de pacientes com PV (14,4%), 20/104 (19,2%) com MFP, 20/104 (19,2%) com TE e 49/104 (47,1%) com outras doenças hemtológicas. Foi feita a avaliação da prevalência de mutações somáticas, seja por sequenciamento ou análise de fragmentos, nos genes JAK2 (exon 12 e Y931C), MPL, IDH1, IDH2, CALR, TET2 e ASXL1. PCR-RFLP foi realizada para identificação de mutações em JAK2V617F. Resultados: A mutação JAK2V617F foi observada em 30 (28,8%) pacientes (12 PV, 11 TE e 7 MFP), a mutação JAK2 exon 12 foi observada em apenas um (0,96%) paciente com PV, mutação JAK2Y931C em 4 (3,8%) pacientes (1 PV, 2 TE e 1 MFP) e 8 (7,7%) pacientes apresentaram mutações em CALR (3 TE e 5 MFP). Mutações nos genes epigenéticos como IDH1 foram observadas em 9 (8,7%) pacientes (2 TE, 2 MFP, 1 SMD, e 4 pacientes com suspeita de NMP), mutações em IDH2 estão presentes em 5 (4,8%) pacientes (2 TE, 1 SMD/leucemia e 4 pacientes com suspeita de NMP), mutações em ASXL1 foram identificadas em 13 (12,5%) pacientes (1 PV, 3 TE, 2 MFP, 3 SMD/leucemias e 4 com suspeita de NMP) e finalmente, mutações em TET2 foram encontradas em 33 (31,7%) pacientes (3 PV, 5 TE, 4 MFP, 8 SMD/leucemias e 13 pacientes com suspeita de NMP). Além disso, no caso da PV, os pacientes que apresentam mutações em JAK2V617F apresentam valores aumentados de plaquetas (mediana de 5,41 x 105/mm3 plaquetas) em relação aos pacientes sem a mutação (mediana de 2,06 x 105/mm3 plaquetas), com diferença estatística (p=0,031). Pacientes do mesmo grupo que apresentam mutações em TET2 apresentam, opostamente aos com mutações em JAK2V617F, menores valores de plaquetas (mediana de 1,75 x105/mm3 plaquetas) em relação aos pacientes sem mutações no gene TET2 (mediana de 5,41 x 105/mm3 plaquetas), com diferença estatística (p=0,048). No caso da MFP, os pacientes que apresentam mutações em JAK2V617F apresentam valores maiores de leucócitos (mediana de 1,09 x104/mm3 leucócitos) do que os pacientes que não apresentam a mutação (mediana de 6,99 x103/mm3 leucócitos) com diferença estatística (p=0,046), já os pacientes que apresentam mutações no gene ASXL1 apresentam valores menores de hemácias (mediana de 2,43 x106/mm3 hemácias) em relação aos pacientes que não apresentam mutação (mediana de 3,71 x106/mm3 hemácias) com diferença estatística (p=0,042). Conclusão: O trabalho permitiu fornecer um perfil genético dos pacientes com NMP estudados. Além disso, é possível observar que algumas mutações epigenéticas podem influenciar em diferenças clínicas / Myeloproliferative neoplasms (MPNs) Philadelphia (Ph) chromosome negative, such as polycythemia vera (PV), essential thrombocythemia (ET) and primary myelofibrosis (PMF) are clonal disorders of hematopoietic stem cell characterized by increased proliferation of differentiated myeloid cells. This phenomenon occurs due somatic mutation (JAK2V617F) that constitutively stimulates the JAK-STAT signaling pathway. This mutation is more frequent in PV, around 95%, and between 50% in ET and PMF. Other genetic aberration can be observed in the thrombopoietin (TPO) receptor MPL. Mutations in MPL can be in the germline line or somatic and less than 10% of patients with TE or PMF would harbor this genetic alteration. Otherwise, patients with TE or PMF without JAK2V617F or MPL mutation could present somatic mutations in calreticulin (CALR). In addition to somatic mutations that cause myeloproliferation, other genetic alterations that function as epigenetic regulators were identified in genes as TET2, IDH1, IDH2 e ASLX1 in MPN. Objective: Establish genetic profile in patients with diagnosis of PV, ET, and PMF through genetic alterations in the following genes: JAK2, MPL, CALR, IDH1, IDH2, TET2 e ASXL1, and correlate those alterations with demographic characteristic of the study population. Casuistic and Methods: Peripheral blood samples from 104 patients referred to the Tumor Biology Laboratory of the Department of Hematology of Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo for diagnostic investigation were analyzed. Fifteen out 104 samples were from PV patients (14.4%), 20/104 (19.2%) in PMF, 20/104 (19.2%) in ET and 49/104 (47.1%) with other hematologic diseases. Identification of somatic mutations was made, either by direct sequencing or fragment analysis in JAK2 (exon 12 and Y931C), MPL, IDH1, IDH2, CALR, TET2 and ASXL1. PCR-RFLP was performed to identify JAK2V617F mutation. Results: JAK2V617F mutation was observed in 30 (28.8%) patients (12 PV, 11 ET and 7 PMF), JAK2 exon 12 in only one (0.96%) patient with PV, JAK2Y931C in 4 (3.8%) patients (1 PV, 2 ET and 1 PMF), and 8 patients (7.7%) presented CALR mutation (3 ET and 5 PMF). Mutations in the epigenetic genes as IDH1 were observed in 9 (8.7%) patients (2 ET, 2 PMF, 1 MDS and 4 patients with suspected MPN), IDH2 mutations were present in 5 (4.8%) patients (2 ET, 1 MDS/leukemia, and 4 patients with suspected MPN), ASLX1 mutations were identified in 13 (12.5%) patients (1 PV, 3 ET, 2 PMF, 3 MDS/leukemia and 4 with suspected MPN) and finally, TET2 mutations were present in 33 (31.7%) patients (3 PV, 5 ET, 4 PMF, 8 MDS/leukemia, and 13 with suspected MPN). In addition, patients with PV who harbor JAK2V617F have increased platelet counts (median 5.41 x 105/mm3 platelets) compared to those without the mutation (median 2.06 x 105/mm3 platelets, p=0.031). Patients in the same group with TET2 mutation, as opposed to those with JAK2V617F, presented low platelets counts (median of 1.75 x 105/mm3 platelets) compared to those without TET2 mutation (median 5.41 x 105/mm3 platelets, p=0.048). Presence of JAK2V617F in patients diagnosed with PMF have a greater number of leukocytes (median 1.09 x104/mm3 leukocytes) when compared to patients without the mutation (median 6.99 x 103/mm3 leukocytes, p=0.046). Patients with PMF who presented mutations in ASXL1 gene have a lower number of red blood cells (median of 2.43 x 106/mm3) compared to patients without mutations in the same gene (median 3.71 x 106/mm3, p=0.042). Conclusion: The present study allows us to provide a genetic profile of patients with MPN. Furthermore, it is possible to observe that some epigenetic mutations could influence in some clinical differences

INTRODUÇÃO: O melanoma acral lentiginoso (MAL) tem freqüência expressiva entre os casos de melanoma observados no nosso meio e difere dos outros tipos clinicopatológicos de melanoma cutâneos por não ter a exposição solar como fator predisponente. Poucos trabalhos da literatura enfocam as alterações dos genes supressores de tumores e a expressão de suas proteínas nas lesões de MAL. Por esses motivos propusemo-nos a realizar um estudo retrospectivo visando uma melhor compreensão das proteínas envolvidas na via p16 INK4a /ciclina D1/CDK4/pRb do ciclo celular, no MAL em casuística brasileira. MÉTODOS: Através de técnica de imunoistoquímica foi demonstrada a expressão das proteínas p16, ciclina D1, CDK4 e pRb em 32 lesões de MAL. Comparou-se a freqüência de expressão desses marcadores nos tumores delgados (espessura de até 1,0mm) e espessos (mais de 1,0 mm de espessura), assim como de acordo com a presença ou ausência de ulceração. RESULTADOS: Houve expressão de p16 em 78% das lesões, de ciclina D1 em 61,5%, CDK4 em 84% e pRb em 85% dos MAL analisados. O padrão de imunomarcação das células neoplásicas foi nuclear para todos os anticorpos. Expressão nuclear associada à citoplasmática foi observada em 76% dos tumores positivos para p16 e 81% dos casos positivos para CDK4. Não houve diferenças significativas entre as freqüências de expressão de cada um dos marcadores quando comparados de acordo com sua espessura (delgados e espessos) e presença de ulceração. CONCLUSÕES: A expressão de ciclina D1 e CDK4, nos melanomas acrais lentiginosos, pode ser considerada aberrante e reflexo de provável alteração na via supressora de tumores p16/ciclinaD1/CDK4/pRb. A expressão tecidual de p16 e pRb, demonstrada pela técnica imunoistoquímica, pode não refletir as prováveis alterações da via supressora de tumores estudada. Esses marcadores, isoladamente, não devem ser considerados como fatores prognósticos no melanoma acral lentiginoso / INTRODUCTION: Acral lentiginous melanoma (ALM) has an expressive frequency between melanoma cases in our country, and it differs from the others clinical pathological types of cutaneous melanoma, because it does not have sun exposure as a predisposing factor. There are few publications in the literature addressing the expression of tumor suppressor pathway proteins in ALM. For these reasons we proposed to carry out a retrospective study aiming at a better understanding of p16 INK4a /cyclin D1/CDK4/pRb pathway involvement in ALM lesions. METHODS: Expression of p16, cyclin D1, CDK4 and pRB in 32 ALM lesions was displayed by immunohistochemistry. We compared the frequency of the expression of these markers in thin (thickness up to 1.0 mm) and thick lesions (thickness above 1.0 mm), as well as in accordance with the presence or absence of ulceration. RESULTS: 76% of the tumors were positive to p16 and 81% of the cases were positive to CDK4. There was no significant difference between the frequency of the expression of each marker when comparing in accordance with the thickness (thin and thick lesions) and the presence of ulceration. CONCLUSIONS: The expression of cyclin D1 and CDK4 in acral lentiginous melanoma may be considered aberrant and as reflex of a probable alteration in the p16/cyclin D1/CDK4/pRb tumor suppressor pathway. p16 and pRb tumor expression displayed by immunohistochemistry may not reflect probable alterations of the tumor suppressor pathway studied. The expression of these proteins, per se, may not be considered as prognostic factor in acral lentiginous melanoma

A Doença de Alzheimer (DA) é uma desordem neurodegenerativa progressiva que causa comprometimento cognitivo e demência. O diagnóstico é baseado em parâmetros clínicos, mas sua confirmação é post-mortem, após avaliação patológica durante a autópsia. Os tratamentos disponíveis para a DA são os inibidores da colinesterase (IChEs) e os antagonistas de receptores de N-metil-D-aspartato (NMDA), sendo que os IChEs compõe o principal grupo. Diversos estudos tem mostrado um efeito neuroprotetor dos IChEs, levando a alterações na patogênese da DA. Avaliar e mensurar essas alterações são papeis atribuídos aos biomarcadores. Neste sentido podemos destacar a fosfolipase A2 (PLA2), a principal responsável pelo metabolismo de fosfolípides de membrana, e que tem sido achada diminuída na DA, assim como a glicogênio sintase-quinase (GSK), responsável pela fosforilação da proteína Tau, que é um dos processos alterados na DA. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do tratamento com IChE sobre a atividade da PLA2 e expressão da GSK3B em plaquetas de 30 pacientes com DA após 3 e 6 meses de tratamento. Como grupo controle foram investigados 42 individuos idosos sem doença neurodegenerativa. Encontramos nos pacientes com DA antes do tratamento uma diminuição da atividade da iPLA2 quando comparada ao grupo controle. Após três e seis meses de tratamento a PLA2 aumentou, voltando ao nível dos controles. Os pacientes que apresentaram um aumento maior da iPLA2 apos 3 meses de tratamento apresentaram melhora cognitiva mais marcante após seis meses de tratamento, avaliado pelo CAMCOG. Apos 6 meses de tratamento encontramos um inativação da GSK3B, medida por um aumento em sua forma fosforilada. Nossos resultados sugerem que o donepezil apresenta propriedades modificadoras na doença de Alzheimer, e ainda que a medida da atividade da iPLA2 poderia ser usada como marcador de resposta terapêutica ao donepezil e, possivelmente, a outros IChEs, na doença de Alzheimer / Alzheimer\'s disease (AD) is a progressive neurodegenerative disorder that causes dementia and cognitive impairment. The Diagnosis is based on clinical parameters, but confirmation is post-mortem after pathologic evaluation during autopsy. The treatments available for AD are cholinesterase inhibitors (IChEs) and N-methyl-D-aspartate (NMDA) antagonists. The main group comprises the IChEs. Several studies have shown a neuroprotective effect of IChEs, leading to alterations in the pathogenesis of AD. Evaluate and measure these changes are assigned to biomarkers. In this regard we can highlight the phospholipase A2 (PLA2) the main enzyme in membrane phospholipids metabolism and that has been found decreased in AD as well as Glycogen Synthase kinase (GSK), a major responsible for tau phosphorylation which is one processes altered in AD. The objective of this study was to evaluate the effect of treatment with IChE on PLA2 activity and GSK3B expression in platelet of 30 AD patients after 3 and 6 months of treatment. The control group comprised 42 elderly individuals without neurodegenerative disease The results obtained were a decreased iPLA2 activity in patients with AD before treatment as compared to controls. After 3 and 6 months of treatment, we observed a significant increase in iPLA2 activity, restoring enzymatic activity similar to that observed among control. The patients who showed higher iPLA2 activity in the first three months were those showing cognitive improvement after six months of treatment, measured by CAMCOG. After 6 months of treatment a GSK3B inactivation were found, measured by an increase in its phosphorylated form. Our results suggest that donepezil present modifying properties in Alzheimer disease and that iPLA2 activity measurement could be used as a marker of therapeutic response to donepezil and possibly other IChEs in Alzheimer\'s disease

A melhora na capacidade física e/ou reserva funcional de um indivíduo deve-se, entre outros, a um treinamento sistemático e bem padronizado. O exercício aeróbio é uma modalidade frequentemente empregada em um programa de treinamento, especialmente naqueles com objetivo de melhora do condicionamento físico. Contudo atualmente, o uso da fototerapia tem ganhado espaço no que tange ao aumento de desempenho de atletas. Baseado nisso o objetivo deste estudo foi verificar o efeito do treinamento unipodal, terapia LED e treinamento associado à terapia LED sobre parâmetros ergoespirométricos de performance (VO2max, AT e RCT) e na concentração sanguínea de creatina quinase. Para esse estudo participaram 24 voluntários do sexo masculino, os quais foram submetidos a uma avaliação pré-intervenção, foram submetidos a um período de oito semanas de treinamento em cicloergômetro com irradiação LED ou placebo. Após esse período foram submetidos a uma nova avaliação, pós-treino. Para a aplicação da terapia LED, foi utilizado um arranjo contendo 50 LEDs com comprimento de onda de 850 nm e aplicado por 60 segundos após cada sessão de treino. Os voluntários foram separados nos seguintes grupos experimentais: Não Treinados e LED desligado (Grupo NTLD), Não Treinados e LED ligado (Grupo NTLL), Treinados e LED desligado (Grupo TLD), Treinados e LED ligado (Grupo TLL). A perna que recebeu a intervenção foi eleita por sorteio e foi chamada de perna ativa (A) e a perna contralateral, chamada de controle (C). Durante o teste em exercício crescente, até a fadiga, foram quantificadas as variáveis ergoespirométricas, ventilação (Ve), consumo de oxigênio (VO2), equivalente ventilatório de oxigênio (EqVO2), também foi coletada amostra de sangue para dosagem da lactacidemia e foi mensurada a concentração da enzima creatina quinase (CK). Como resultados das respostas agudas frente ao ato de pedalar com uma perna notou-se que a pedalada unipodal apresentou menor valor de intensidade, VO2, Ve, lactacidemia e maior incremento de CK, quando comparada com a pedalada bipodal (convencional). Ao se concluir as oito semanas de treinamento notou-se que a perna ativa na pedalada unipodal apresentou melhoras nas variáveis mensuradas nos grupos TLL, NTLL e algumas no TLD. Também foi encontrada melhora para a perna controle, em algumas variáveis, dos grupos que receberam a terapia LED. Com esse estudo conclui-se que o treinamento unipodal é capaz de melhorar parâmetros como intensidade, ventilação, consumo de oxigênio, eficiência aeróbia, e ainda minimiza os danos musculares induzido pelo exercício no membro que efetuou o treinamento. A terapia LED é capaz de promover as mesmas melhoras em intensidades, consumo de oxigênio e eficiência aeróbia que o treinamento proporcionou, contudo em magnitudes diferentes, ainda é capaz de proporcionar efeito protetor contra lesão muscular induzida pelo exercício. A terapia LED associada ao treinamento potencializa os efeitos conseguidos com cada um isoladamente. / The improvement in physical capacity and/or functional reserve is due to, among other factors, a systematic and organized training program. Aerobic exercise is a frequently used modality in a training program, especially among those who aim to improve physical fitness. However phototherapy has currently gained space in regard to improving the performance of athletes. Based on this information, the purpose of the study was to verify the effect of one-legged cycling, LED therapy and their association on ergospirometric parameters of performance (VO2max, AT and RCT) and on blood concentration of CK. 24 male subjects volunteered for the study and were submitted to a pre-intervention evaluation and an 8-week period of one-legged cycling with LED therapy or placebo. After the intervention period subjects were submitted to a second evaluation. An arrangement containing 50 LEDs and a wavelength of 850 nm was applied during 60 seconds after each training session. Volunteers were divided into the following experimental groups: untrained and LED off (ULOf), untrained and LED on (ULOn), trained and LED off (TLOf) and trained and LED on (TLOn). The leg that received the intervention (training and/or LED therapy) was selected randomly and named active leg (A) and the contralateral limb was named control (C). During the incremental exercise test to volitional failure the ergospirometric variables ventilation (Ve), oxygen uptake (VO2) and oxygen ventilatory equivalent (EqVO2) were measured and blood samples were collected after each stage for lactate and before and 24 hours after the test for the analysis of blood CK. Acute responses from the pre-intervention evaluation showed that the intensity of one-legged cycling led to lower intensity, VO2, Ve, blood lactate and higher increase in blood CK compared to traditional cycling (two-legged). After the 8 weeks of intervention, the active leg showed improvements in the measured variables for the TLOn, ULOn and TLOf groups and, in some of the variables for the groups that received LED therapy. With these data we conclude that one-legged cycling is capable of increasing parameters such as intensity, ventilation, oxygen uptake, aerobic efficiency and minimizes the blood CK responses to exercise in the exercised limb. The association between exercise and Led therapy potentiates the effects achieved with either of the interventions.

O melanoma é responsável por menos de 5% dos cânceres de pele, porém, 95% das mortes ocorrem devido a ocorrência de metástases. O melanoma metastático é refratário às terapias convencionais e rapidamente adquire resistência às terapias como as oncogene-dirigidas, como o inibidor de BRAF, da via de MAPK. Estudos prévios de screening in silico do nosso grupo, onde se utilizou as bases de dados TCGA e GEO, identificaram o gene adenosina quinase (ADK) como sendo diferencialmente expresso entre o melanoma invasivo e os nevus. A 5-iodotubercidina (5-ITu) é um potente inibidor farmacológico da ADK que dentre os diversos efeitos relatados na literatura destaca-se pelo potencial genotóxico. Os danos no DNA são os principais ativadores de checkpoint do ciclo celular, que levam a parada do ciclo celular transitória ou permanente, além de induzir morte celular, levando a hipótese de que ADK possa ser potencial agente anti-melanoma. Este trabalho objetivou avaliar a expressão do gene ADK em melanomas humanos e quimiorresistentes ao inibidor de BRAF (iBRAF), avaliou os impactos de 5-ITu sobre a proliferação, progressão do ciclo celular e morte celular e por fim avaliamos sua capacidade de aumentar a sensibilidade das células. Foi realizado PCR em tempo real para avaliar os níveis de expressão de mRNA de ADK em linhagens de melanoma e na cultura primária de melanócitos; a fim de avaliar a citotoxicidade de 5-ITu foram realizados os ensaios de exclusão por azul de tripan e de apoptose - Anexina V e PI e em modelo de esferoide, usando live/dead; também foi avaliada a influência de 5-ITu sobre a capacidade clonogênica e seus efeitos sobre a proliferação celular, a partir dos ensaios de ciclo celular e avaliação de marcadores de proliferação por imunofluorescência; as linhagens foram submetidas a diferentes regimes de tratamento com 5-ITu e o iBRAF, a fim de avaliar a curva de crescimento e a sensibilidade ao iBRAF por MTT níveis de expressão de mRNA de ADK maiores nas linhagens tumorais em relação aos melanócitos. 5-ITu mostrou-se capaz de inibir a proliferação (IC50) das linhagens de melanoma em concentrações de 1,9 a 3,5 µM. 5-ITu não foi capaz de induzir inviabilidade celular, apesar de reduzir a quantidade de células viáveis em todas as condições de tratamento, também não foi capaz de induzir aumento significativo de células apoptóticas, nem mesmo necróticas. No entanto, o tratamento com 5-ITu reduziu a capacidade clonogênica de linhagens de melanoma e promoveu parada de ciclo celular nas fases G1 e G2/M, levou ao aumento da população subG1. O tratamento com 5-ITu promoveu a redução da expressão de marcadores de proliferação, como ki67, e a combinação de tratamentos 5-ITu e iBraf foi capaz de aumentar o tempo de dobramento das linhagens de melanoma, embora tenha se mostrado incapaz de sensibilizar as células de melanoma ao tratamento com iBRAF. Desse modo, pode-se concluir que 5-ITu induz o efeito citostático e se mostra um potente agente antiproliferativo para melanoma parental e resistente. / Melanoma accounts for less than 5% of skin cancers, but 95% of deaths occur due to metastases. Metastatic melanoma is refractory to conventional therapies and rapidly acquires resistance to therapies such as oncogene-directed, such as the BRAF inhibitor, of the MAPK pathway. Previous studies of screening in silico of our group, using the databases TCGA and GEO, identified the adenosine kinase gene (ADK) as differentially expressed between invasive melanoma and nevus. 5-iodotubercidin (5-ITu) is a potent pharmacological inhibitor of ADK that among the several effects reported in the literature stands out for the genotoxic potential. DNA damage is the main activator of the cell cycle checkpoint, which leads to transient or permanent cell cycle arrest, in addition to inducing cell death, leading to the hypothesis that ADK may be a potential anti-melanoma agent. This work aimed to evaluate the expression of the ADK gene in human melanomas and chemoresistants to the BRAF inhibitor (iBRAF), evaluated the impacts of 5-ITu on proliferation, cell cycle progression and cell death and finally we evaluated its ability to increase the sensitivity of cells. Real-time PCR was performed to assess the levels of ADK mRNA expression in melanoma lines and primary melanocyte culture; in order to evaluate the cytotoxicity of 5-ITu, the trypan blue and apoptosis - Annexin V and PI exclusion and blue spheroid models were performed using live / dead; the influence of 5-ITu on the clonogenic capacity and its effects on cell proliferation, from the cell cycle assays and the evaluation of proliferation markers by immunofluorescence; the cell lines were submitted to different treatment regimens with 5-ITu and iBRAF in order to evaluate the growth curve and the sensitivity to iBRAF by MTT levels of mRNA expression of ADK higher in the tumor lines in relation to the melanocytes. 5-ITu was able to inhibit the proliferation (IC 50) of melanoma lines at concentrations of 1.9 to 3.5 181;M. 5-ITu was not able to induce cell non-viability, although it reduced the amount of viable cells in all treatment conditions, nor was it able to induce a significant increase in apoptotic or even necrotic cells. However, treatment with 5-ITu reduced the clonogenic capacity of melanoma cells and promoted cell cycle arrest in the G1 and G2 / M phases, leading to an increase in the subG1 population. Treatment with 5-ITu promotes the reduction of expression of proliferation markers, such as ki67, and the combination of 5-ITu and iBRAF treatments was able to increase the doubling time of melanoma cells, although it has been shown to be unable to sensitize melanoma cells to treatment with iBRAF. Thus, it can be concluded that 5-ITu induces the cytostatic effect and shows a potent antiproliferative agent for parental and resistant melanoma.

O transplante de ilhotas humanas, utilizado como reposição das células produtoras de insulina em pacientes portadores de diabetes mellitus tipo 1, está se tornando uma importante prática clínica. Entretanto, eventos inflamatórios não específicos presente nas ilhotas, são responsáveis pela vulnerabilidade das mesmas, e contribuem à diminuição do número celular durante o processo de isolamento e posterior transplante. CD40 é um membro da família do receptor de necrose tumoral, descrito em uma variedade de células. Em condições fisiológicas, o CD40 presente nas células apresentadoras de antígenos participa como molécula co-estimulatória na ativação dos linfócitos T. Porém, o CD40 também foi descrito em condições patológicas, como psoríase, aterosclerose e fibrose cística, onde sua expressão está envolvida em eventos crônicos inflamatórios. É interessante ressaltar que, o CD40 também tem sido descrito em neurônios, células que apresentam uma variedade de moléculas similares às expressas nas células M pancreáticas. Em vista desses achados, tentou-se determinar se a células M também poderiam expressar o receptor de CD40, e se presente, determinar possíveis conseqüências próinflamatórias após a sua ativação. Utilizaram-se diversas técnicas como RT-PCR, western blot, citometria de fluxo, imuno-histoquímica assim como imunofluorescência, para detectar a expressão de CD40 em ilhotas de camundongo, macaco e humano, e também na linhagem de células M NIT-1. Determinaram-se as vias de transdução de sinais de CD40 por western blot e ensaios com gene repórter. Foi determinada por tecnologia luminex, a secreção de citocinas e quimiocinas dependente de CD40 em ilhotas humanas, estimuladascom a proteína recombinante CD40L e em alguns casos confirmada por RT-PCR e imunofluorescência. Os resultados demonstram a expressão de CD40 nas células M, que pode ser aumentada pela ação de citocinas pró-inflamatórias, cuja ativação induz a secreção de mais citocinas e quimiocinas (IL-6, IL-8, MCP-1 e MIP-1M) dependentes das vias de transdução de sinais Raf/MEK/ERK e NF-VB. A interação CD40-CD40L aumentou a expressão de ICAM-1 e a induziu morte celular nas células M pancreáticas. Nesse sentido, a ativação de CD40 induz a secreção de mediadores solúveis próinflamatórios que podem comprometer a viabilidade das células M. O cenário próinflamatório sustentando pela ação de CD40 sugere que o mesmo poderia ter um papel ativo orquestrando um processo inflamatório

O objetivo do presente trabalho foi avaliar os efeitos da corrente interferencial na sensibilidade dolorosa e no torque muscular dos músculos flexores e extensores do joelho após a realização de um protocolo de exercícios excêntricos. A amostra foi constituída de 41 indivíduos saudáveis do sexo masculino com idade entre 18 e 33 anos, que foram divididos aleatoriamente em dois grupos experimentais: grupo corrente interferencial (n=21) e grupo placebo (n=20). Para indução da microlesão muscular, ambos os grupos realizaram 100 contrações musculares isocinéticas excêntricas máximas (10 séries de 10 repetições) dos músculos flexores e extensores do joelho na velocidade angular de 60°.s-1. No dia seguinte, os voluntários receberam tratamento com corrente interferencial ou tratamento placebo em ambos os grupos musculares. O tratamento foi realizado durante 30 minutos utilizando-se 4 kHz de frequência portadora (modulação de 80-150 Hz) e 125 μs de duração do pulso. O limiar de dor mecânica, o pico de torque e a concentração da proteína creatina cinase foram avaliados em quatro momentos diferentes: antes da indução da microlesão, imediatamente após o exercício, 24 horas após a indução e após o tratamento com corrente interferencial ou tratamento placebo. Tanto para os músculos flexores quanto extensores do joelho, ambos os grupos experimentais apresentaram uma redução significativa no pico de torque e no limiar de dor mecânica após a realização dos exercícios excêntricos, assim como uma elevação na concentração de proteínas marcadoras de lesão, mostrando que o protocolo de exercícios foi efetivo na indução da microlesão. Após o tratamento, apenas o grupo experimental, que recebeu a corrente interferencial, apresentou um aumento significativo no limiar de dor mecânica para ambos os grupos musculares avaliados, mostrando que a corrente foi efetiva na diminuição da sensibilidade dolorosa. Os valores de torque e a concentração das proteínas não sofreram alteração após o tratamento. Os resultados indicam que a corrente interferencial foi efetiva no tratamento da dor relacionada com microlesão muscular induzida por exercício excêntrico a partir de um aumento do limiar de dor mecânica nos músculos flexores e extensores do joelho. / The goal of the work presented here was to evaluate the effects of the interferential current in the pain sensibility and muscular torque of the flexor and extensor knee muscles after the performance of an eccentric exercise protocol. The sample was comprised of 41 healthy male individuals aged 18 to 33 years old, randomly divided into two experimental groups: interferential current group (n=21) and placebo group (n=20). To induce muscle soreness, both groups performed a hundred maximal isokinetic eccentric muscular contractions (10 series of 10 repetitions) in the flexor and extensor knee muscles, with an angular velocity of 60°.s- 1. On the following day volunteers were treated with interferential current or with the placebo treatment in both muscular groups. Treatment was carried out for 30 minutes using a 4 kHz carrier frequency (80-150 Hz) and a pulse duration of 125 μs. Mechanical pain threshold, peak torque and creatine kinase protein concentration were evaluated at four different times: before muscle soreness induction, immediately after exercise, 24 hours after induction and after the interferential current treatment or the placebo treatment. For both flexor and extensor knee muscles, both experimental groups presented a significant reduction in peak torque and mechanical pain threshold after performing the eccentric exercises, as well as a rise in injurysignaling protein concentration, demonstrating the efficiency of the exercise protocol in inducing muscle soreness. After treatment, only the experimental group that received the interferential current presented significant increases in mechanical pain threshold for both evaluated muscular groups, thus showing that the current was effective in diminishing pain sensitivity. Torque values and protein concentration underwent no changes after the treatment. The results pointed out that the interferential current was effective in the treatment of pain related to muscle soreness induced by eccentric exercise through an increase in mechanical pain threshold in the flexor and extensor knee muscles.

Muitas evidências demonstram que o peptídeo liberador de gastrina (GRP) é um fator de crescimento que afeta funções neuroendócrinas, incluindo proliferação e diferenciação celular, comportamento alimentar, formação de memória, respostas a estresses, desenvolvimento de neoplasias, desordens neurológicas e psiquiátricas. Porém, os eventos moleculares pelos quais isso ocorre ainda não são totalmente compreendidos. No presente estudo, nós avaliamos as interações entre o receptor do peptídeo liberador de gastrina (GRPR) e a via de sinalização celular da PKA, tanto na proliferação celular de glioblastoma humano (in vitro) quanto na consolidação da memória no hipocampo de ratos Wistar (in vivo). Mostramos que o GRP age em sinergismo com agentes que estimulam a via do cAMP/PKA, promovendo a proliferação de células de glioblastoma humano, pois o tratamento com GRP combinado com um ativador de adenilil ciclase (AC), forskolin, ou um análogo de cAMP, 8-Br-cAMP, ou um inibidor do tipo IV de fosfodiesterase, rolipram, aumentaram a proliferação das células de U- 138MG, quando avaliadas pelo método de MTT. Nenhum destes compostos teve efeito sozinho. O mRNA de GRPR e a expressão protéica em U-138MG foram detectados pelas técnicas de RT-PCR e imuno-histoquímica. No estudo in vivo a bombesina em baixas doses induziu um aumento na consolidação da memória. O resultado foi potencializado na combinação com um ativador do receptor de dopamina D1/D5 (D1R), além de ser prevenido quando combinado com um inibidor da via da PKA. Os resultados sugerem que GRP e GRPR interagem com a via de sinalização cAMP/PKA tanto na estimulação da proliferação celular em linhagem de câncer humano quanto na modulação da memória no hipocampo de ratos. / Increasing evidence indicates that gastrin-releasing peptide (GRP) acts as an autocrine growth factor for brain tumors as well as been implicated in memory formation, however, underlying molecular events are poorly understood. In the present study, we examined interactions between the GRPR and cellular signaling pathways in influencing memory consolidation in the hippocampus and on proliferation of glioblastoma cell in vitro. We show here that GRP acts synergistically with agents that stimulate the cAMP/PKA pathway to promote proliferation of human gliobastoma cells. Treatment with GRP combined with the adenylyl cyclase (AC) activator forskolin, the cAMP analog 8-Br-cAMP, or the phosphodiesterase type IV (PDE4) inhibitor rolipram increased proliferation of U138-MG cells in vitro measured by MTT assay. None of the compounds had an effect when given alone. GRP receptor (GRPR) mRNA and protein expression in U138-MG cells was detected by reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) and immunohistochemistry. We investigated the interactions between the GRPR and the PKA pathway in male Wistar rats. BB-induced enhancement of consolidation was potentiated by co infusion of activators of the dopamine D1/D5 receptor (D1R) pathway and prevented by a PKA inhibitor. The results suggest that GRP and the GRPR interact with the cAMP/PKA signaling pathway in stimulating a cancer cell line proliferation and in memory modulation by hippocampal.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:42:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1636951 bytes, checksum: 5c4c3aea8b56b9b0913479b27b012cea (MD5) Previous issue date: 2007-08-01 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Proteins of the family of LRR-RLKs (receptor-like-kinases with leucine-rich repeats) have a conceptual relevance in signaling events but in plants information regarding function is limited to a few members of this family. The receptors NIK1, NIK2 and NIK3 of Arabidopsis thaliana belong to the sub-family LRRII-RLK and were initially identified by their capacity to interact with the geminivirus NSP protein. In response to an unknown stimulus, NSP-interacting kinases (NIKs) are activated after the formation of dimmers and intermolecular autophosphorylation. The inhibition of autophosphorylation of NIK by NSP and the activation of NIK genes increase the susceptibility to viral infection, suggesting that this protein is involved in a defense pathway against geminivirus infection. The downstream components of this pathway, mediated by the protein NIK, have yet to be identified. In the present study, the biochemical and functional characterization of two ribosomal proteins, L10 and L18 were described, these being capable of interacting with the protein NIK via the yeast two-hybrid system. In vitro studies demonstrated that the protein NIK is capable of phosphorylating the protein L10, but not L18. Of the members of the LRRIIRLK family, the protein NIK2 phosphorylates L10, while NIK3 presents a low capacity for phosphorylation of the substrate. However, the development protein SERK1 does not use L10 as a substrate. Assays of transient expression in tobacco plants, revealed that the L18 protein is located in the cytoplasm, as well as around the nucleus and the nucleoli of some cells. In turn, in 97% of the cells, L10 was localized only in the cytoplasm, although it was also found in the nucleus, in approximately 3% of the observed cells. The transient expression of NIK1 and NIK2 redirects the L10 protein to the nucleus in approximately 30% of the cells. In contrast, NIK3 does not relocalize the L10 protein to the nucleus, and L18 does not change its localization in the presence of the NIKs. In plants infected with TGMV, a change only in the cytoplasmic localization of L10 was observed, accumulating in points of the cytoplasm when not co-localized with NIK. To prove genetically the interactions of L10-NIK and L18-NIK, null alleles for the genes L10 and L18 de Arabidopsis, containing T-DNA insertion, were obtained and inoculated with CaLCuV. The inactivation of the genes L10 and L18 restored the elevated susceptibility phenotype of nik1 and the knockout plants, principally l10, presented severe symptoms and high rates of infection when compared with the wild columbia plants. The results of this work are consistent with a model that places the ribosomal proteins L10 and L18 as functional components of the defense signaling pathway mediated by the protein NIK, L10 being a component immediately downstream of the transmembrane receptor. / As proteínas da família das LRR-RLKs (receptor-like-quinases com repetições ricas em leucina) possuem uma relevância conceitual em eventos de sinalização mas, em plantas, a informação funcional ainda é restrita a alguns membros desta família. Os receptores NIK1, NIK2 e NIK3 de Arabidopsis thaliana pertecem à sub-familia LRRII-RLK e foram inicialmente identificados pela sua capacidade de interagir com a proteína NSP de geminivírus. Em resposta a um estímulo desconhecido, NSP-interacting kinases (NIKs) são ativadas após a formação de dímeros e autofosforilação intermolecular. A inibição da autofosforilação de NIK por NSP e a inativação de genes NIKs aumenta a suscetibilidade à infecção viral, sugerindo que esta proteína estaria envolvida em uma via de defesa contra a infecção por geminivírus. Os componentes downstream dessa via de sinalização, mediada pela proteína NIK, ainda não foram identificados. No presente estudo foi descrita a caracterização bioquímica e funcional de duas proteínas ribossomais, L10 e L18, as quais foram capazes de interagir com a proteína NIK através do sistema de duplo híbrido de leveduras. Estudos in vitro demonstraram que a proteína NIK é capaz de fosforilar a proteína L10, mas não L18. Entre os membros da família LRRII-RLK, a proteína NIK2 fosforila L10, enquanto NIK3 apresenta uma baixa capacidade de fosforilação do substrato. No entanto, a proteína de desenvolvimento SERK1 não utiliza L10 como substrato. Ensaios de expressão transiente, em plantas de tabaco, revelaram que a proteína L18 está localizada no citoplasma, bem como ao redor do núcleo e no nucléolo de algumas células. Por sua vez, em 97% das células, L10 foi localizada apenas no citoplasma, embora tenha sido encontrada no núcleo, em aproximadamente 3% das células observadas. A expressão transiente de NIK1 e NIK2 redireciona a proteína L10 para o núcleo em aproximadamente 30% das células. Em contraste, NIK3 não relocaliza a proteína L10 para o núcleo, e L18 não muda sua localização na presença das NIKs. Em plantas infectadas com TGMV, observou-se mudança apenas na localização citoplasmática de L10, acumulando-se em pontos do citoplasma quando não colocalizada com NIK. Para se comprovar geneticamente as interações de L10-NIK e L18- NIK, alelos nulos para os genes L10 e L18 de Arabidopsis, contendo inserção de T-DNA, foram obtidos e inoculados com o CaLCuV. A inativação dos genes L10 e L18 recapitulou o fenótipo de suscetibilidade aumentada de nik1 e as plantas knockout, principalmente l10, apresentaram sintomas severos e taxa de infecção alta quanto comparados com as plantas selvagens columbia. Os resultados deste trabalho são consistentes com um modelo que posiciona as proteínas ribossomais L10 e L18 como componentes funcionais da via de sinalização de defesa mediada pela proteína NIK, sendo L10 um componente imediatamente downstream ao receptor transmembrana.

Em homens, com o avanço da idade ocorre declínio dos níveis plasmáticos de androgênios, enquanto os níveis de estrogênio permanecem constantes ou aumentados. Isto leva à diminuição da razão androgênio/estrogênio, sugerindo que os estrogênios podem ter um papel no desenvolvimento do câncer de próstata. Os estrogênios estão relacionados à indução da proliferação celular através da sua ligação aos receptores clássicos (ERs) e ao receptor não clássico GPER. Ambos receptores podem ativar as vias de sinalização PI3K e MAPK relacionadas à sobrevivência celular e ter importância no desenvolvimento do câncer de próstata (CaP) e da hiperplasia prostática benigna (HPB). Objetivo: Avaliar a relação dos receptores de estrogênio GPER, ERα, ERβ e suas isoformas com as vias PI3K e MAPK pela análise da expressão gênica e proteica dos receptores de estrogênio ERα, ERβ e GPER, pela análise da expressão de proteínas da via MAPK e PI3K e do estrogênio tecidual nos grupos HPB e CaP. Métodos: Tecidos prostáticos provenientes de CaP e de HPB foram submetidos à extração de RNA, o RNA foi reversamente transcrito para cDNA e avaliado usando q-PCR para a expressão dos receptores de estrogênio GPER, ERα, ERβ e suas isformas. A expressão proteica de GPER, ERα, ERβ, mTOR, PI3K e c-JUN e a ativação da p38α, ERK1/2, JNK, AKT e GSK3β foram analisadas por Western blot. A técnica de imunofluorescência foi utilizada para verificação da colocalização dos receptores GPER e ERα em estroma e epitélio de HPB e CaP. Resultados: Comparações entre os tecidos hiperplásico e de carcinoma indicaram uma maior expressão gênica e proteica de ERα e GPER em amostras de CaP comparadas à HPB. Além disso, a ativação da AKT, GSK3β e JNK e a expressão proteica da PI3K e c-JUN foram significativamente aumentadas nos tecidos de CaP enquanto que a expressão proteica de mTOR e a ativação de p38α e ERK estão diminuídas neste grupo. A expressão gênica do ERβ está aumentada no CaP porém não há diferença na expressão proteica entre os grupos. A análise da expressão gênica das isoformas do ERβ mostrou diminuição de ERβ1 e ERβ6 e aumento das isoformas ERβ2 e ERβ5 no CaP. Não foram detectadas as expressões das isoformas ERβ3 e ERβ4 em ambos os grupos. Nossos resultados também mostraram que os receptores GPER e ERα estão colocalizados no núcleo de células estromais de HPB e CaP. Além disso, o GPER está expresso com maior intensidade no epitélio de ambos os grupos enquanto o ERα está expresso com maior intensidade no estroma do CaP. A medida do estrogênio tecidual mostrou aumento deste no tecido de CaP em relação ao de HPB. Conclusões: O presente estudo mostrou aumento do estrogênio e de seus receptores ERα e GPER no CaP em relação ao HPB indicando que há modulação estrogênica na próstata. Além disso, proteínas das vias MAPK e PI3K que podem ser moduladas pela ação estrogênica estão expressas de maneiras diferentes em ambos os grupos. O estudo da ação estrogênica parece ser importante para o entendimento da progressão das doenças prostáticas. / In men with advancing age decline in plasma levels of androgens occurs while estrogen levels remain constant or increased. This leads to the decrease of the androgen / estrogen, suggesting that estrogens may play a role in the development of prostate cancer. Estrogens are related to the induction of cell proliferation by binding to classical receptors (ERs) and non-classical receptor GPER. Both receptors can activate signaling pathways PI3K and MAPK related to cell survival and have importance in the development of prostate cancer (PCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH). Objective: To evaluate the relationship of estrogen receptors GPER, ERα, ERβ with the PI3K and MAPK pathways was performed analysis of gene and protein expression of ERα, ERβ and GPER, analysis of protein expression to MAPK and PI3K pathways and tissue estrogen in PCa and BPH groups. Methods: Prostatic tissues from PCa and BPH underwent RNA extraction, RNA was reverse transcribed to cDNA and evaluated using q-PCR for the expression of estrogen receptors GPER, ERα, ERβ and their isformas. Protein expression of GPER, ERα, ERβ, mTOR, PI3K and c-JUN and activation of p38α, ERK1/2, JNK, AKT and GSK3β were analyzed by Western blot. The immunofluorescence technique was used to verify the colocalization of GPER and ERα receptors in epithelium and stroma of BPH and PCa. Results: Comparisons between the hyperplastic tissue and carcinoma showed a higher gene and protein expression of ERα and GPER in samples of CaP compared to BPH. Furthermore, activation of AKT and GSK3β and JNK protein expression of PI3K and c-JUN were significantly increased in CaP tissues while mTOR protein expression and ERK activation p38α and are decreased in this group. ERβ gene expression is increased in PCa but there is no difference in protein expression between the groups. The analysis of gene expression of ERβ isoforms showed decreased ERβ1 and ERβ6 and increased isoforms ERβ2 and ERβ5 in CaP. Expressions were not detected isoforms and ERβ3 ERβ4 in both groups. Our results also showed that the GPER and ERα receptors are positively colocalized in nucleus of stromal cells of BPH and PCa. In addition, the GPER is expressed more intensely in the epithelium of both groups while ERα is expressed with greater intensity in the stroma of PCa. The extent of this tissue revealed increased estrogen in PCa tissue compared to BPH. Conclusions: The present study showed an increase of estrogen and its receptors ERα and GPER in CaP compared to BPH indicating that there is involvement modulation of estrogen in the prostate. Moreover, proteins of MAPK and PI3K pathways can be modulated by estrogenic activity are expressed differently in both groups. The study of estrogen action appears to be important for understanding the progression of prostatic diseases.