L'ADN, support de l'information génétique, subit chaque jour de nombreuses attaques pouvant induire différents types de lésions. Que ce soit d'origine environnementale (agents chimiques), rayonnements ionisants) ou d'origine endogène (métabolisme de L'ADN, radicaux libres), chacun de ces agents peut provoquer des cassures simple ou double-brin dans la molécule d'ADN. Ces lésions doivent être détectées rapidement et réparées fidèlement, afin d'éviter d'engendrer une mutation pouvant déclencher une maladie telle le cancer, ou encore éviter de se transmettre à la descendance. Au cours de l'évolution, la cellule eucaryote a développé différentes voies spécifiques pour répondre à un stress génotoxique. Ainsi il existe un véritable réseau de surveillance et d'évaluation des dommages permettant à la cellule lésée de réparer l'ADN ou d'entrer en apoptose si les dommages sont trop importants. La poly(ADP-ribosyl)ation des protéines est une modification post-traductionnelle qui intervient rapidement dès qu'une cassure dans la molécule d'ADN est détectée. Le polymère est synthétisé à partir du NAD+ par une famille d'enzymes appelées PARP (poly(ADP-ribose)polymérase), dont le rôle principal est la maintien de l'intégrité du génome. Cette modification affecte les propriétés physico-chimiques ainsi que la fonction des protéines cibles. Celle-ci permet, entre autre, le recrutement des enzymes de réparation de l'ADN. Ce signal demeure toutefois transitoire, le polymère formé étant rapidement dégradé par la PARG (poly(ADP-ribose)glycohydrolase. Ce travail présente une analyse structurale de la PARP-3, un membre peu caractérisé de la famille PARP, ainsi qu'une analyse fonctionnelle de mutants de phosphorylation de la PARP-1 (premier article) qui montre que la phosphorylation du premier doigt de zinc de cette protéine altère son recrutement et sa persistance aux sites de cassure de l'ADN. Par ailleurs, de nombreuses évidences montrent que que la poly(ADP-ribosyl)ation des protéines peut survenir dans un contexte autre que les dommages à l'ADN, le second article présente les métabolismes qui peuvent être associés aux PARP-1 et 2 ainsi qu'à la PARG et monte un possible nouveau rôle biologique pour la PARP-1.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2015-2016 / Divers évènements d’épissage alternatif ont été identifiés pour certains gènes de la famille FANC, notamment pour FANCE. La voie de réparation de l’ADN FANC-BRCA nécessite l’intégrité de l’ensemble des protéines Fanconi afin d’assurer l’efficacité de la réparation des pontages inter-brins. Nous avons alors étudié l’impact de l’expression du variant d’épissage alternatif FANCE∆4 au niveau de la voie FANC-BRCA. Son expression exclusive dans des cellules déficientes en FANCE (EUFA130) n’est pas suffisante pour restaurer l’activation de la voie de réparation. À la suite d’un traitement avec un agent pontant (mitomycine C), les cellules EUFA130 complémentées avec FANCE∆4 demeurent bloquées en phase G2/M du cycle cellulaire, la viabilité n’est pas augmentée et la monoubiquitination de FANCD2 et FANCI est absente, contrairement aux cellules EUFA130 complémentées avec FANCE. Ce projet a particulièrement permis de déterminer que FANCE∆4 n’est pas en mesure de se substituer lors de la perte de FANCE. / Several alternative splicing events were identified for some genes of the FANC family, such as FANCE. The integrity of the proteins of the FANC-BRCA DNA repair pathway is necessary to maintain efficient ICL repair. We studied the impact of the expression of an alternative splicing isoform, FANCE∆4. Its exclusive expression in FANCE-deficient cells (EUFA130) is not sufficient to restore the activation of the pathway. Following treatment with crosslink agent (mitomycin C), EUFA130 cells complemented with FANCE∆4 are blocked in G2/M phase of the cell cycle, the viability is not increased and the monoubiquitination of FANCD2 and FANCI is absent, in contrast to EUFA130 cells complemented with FANCE. This project highlights FANCE∆4 that cannot replace FANCE in regard to DNA repair.

Thèse en cotutelle, Doctorat en biologie cellulaire et moléculaire, Université Laval, Québec, Canada et Université de Nantes, Nantes, France / Les cellules humaines sont soumises à des stress induisant des cassures double-brin de l’ADN (CDB). Ces CDB sont réparées notamment par la recombinaison homologue, impliquant les protéines RAD51 et RAD52. Une stratégie thérapeutique émergente est de développer des molécules inhibant RAD51 ou RAD52 afin d’accentuer l’instabilité génétique et la mort de la cellule cancéreuse. En effet, dans certains cancers, l’activité de RAD51 est dérégulée promouvant la prolifération tumorale. Il existe plusieurs molécules inhibitrices de RAD51 et nous nous sommes intéressés au DIDS dont le mode d’action n’a pas encore été déterminé. Concernant RAD52, une létalité synthétique a été montrée lorsque celle-ci est inactivée dans des cellules déficientes en BRCA1, BRCA2 ou PALB2, trois gènes mutés dans de nombreux cancers. Récemment, trois types de molécules inhibitrices de RAD52 ont été mis en évidence. Nous avons tout d’abord étudié l’impact du DIDS ainsi que des molécules dérivées afin de comprendre le mécanisme mis en jeu. Nous avons montré que le DIDS, ainsi que ses dérivés inhibent la liaison de RAD51 à l’ADN. Ces molécules empêchent la formation du nucléofilament entrainant une diminution du nombre de foyers RAD51. Nous avons développé une méthode de criblage par fluorescence pour évaluer l’effet d’une banque de 696 molécules sur la capacité de RAD52 à hybrider deux ADNsb. Deux molécules capables d’inhiber la fonction d’hybridation de RAD52 ont été mises au jour. In vivo, elles entrainent une diminution de la survie de cellules déficientes en PALB2. La recherche et le développement de nouveaux inhibiteurs de RAD51 et RAD52 constituent des stratégies thérapeutiques d’avenir. / Human cells are subjected to stress inducing DNA double-strand breaks (DSB). DSB are repaired in particular by homologous recombination, involving RAD51 and RAD52 proteins. An emerging therapeutic strategy is to develop RAD51 or RAD52 inhibitors that promote genetic instability and induce cancer cell death. In some cancers, the activity of RAD51 is deregulated promoting tumor proliferation. There are several RAD51 inhibitors and we focused on DIDS, whose mechanism of action has not been yet determined. Concerning RAD52, a synthetic lethality has been shown when its gene is inactivated in BRCA1, BRCA2 or PALB2 deficient cells, those genes being mutated in various cancers. Recently, three types of molecules inhibiting RAD52 were highlighted. We studied the impact of DIDS and its derivatives to understand the mechanism involved in the inhibition. We showed that DIDS and its derivatives inhibit RAD51 DNA binding function. These molecules prevent the formation of nucleofilament leading to a decrease in RAD51 foci formation. We have developed a fluorescent method of screening to evaluate the effect of a library of 696 molecules on the RAD52 ability to hybridize two ssDNA. Two molecules were able to inhibit the RAD52 hybridization function. In vivo, they induce a decrease in PALB2 deficient cell survival. Research and development of new RAD51 and RAD52 inhibitors represent promising therapeutic strategies.

Le complexe Histone Acétyltransféranse (HAT) NuA4 s'inscrit comme un élément clef dans le contrôle de plusieurs fonctions cellulaires essentielles chez les eucaryotes. L'implication maintenant connu de NuA4 dans la transcription et dans la réponse aux dommages à l'ADN nous ont poussé à approfondir la caractérisation fonctionnelle des diverses sous-unités de NuA4, notamment au niveau des rôles que peuvent occuper les différents domaines protéiques retrouvés au sein de ce complexe. Une première série d'analyses a démontré l'importance de plusieurs résidus du chromodomaine de Esa1, la sous-unité catalytique de NuA4. La mutation de ces résidus engendre des défauts majeurs d'acétylation de la chromatine, suggérant ainsi un rôle du chromodomaine dans l'activité catalytique de Esa1. Parallèlement, d'autres études ont permis d'approfondir la fonction du domaine SANT de la protéine Eaf2, du PHD finger de Yng2 et du domaine PI-3 kinase de Tra1. Ce dernier domaine intéragit avec le complexe MRX, un complexe de levure recruté directement au site de cassure de l'ADN. Des recherches menées autour de l'étude de l'activité kinase de cette protéine ont permis de suggérer l'implication de NuA4 dans les événements précoces survenant suite à un bris double brin, précisant ainsi le rôle de ce complexe dans la réparation de l'ADN.

Les dommages directs induits à l'ADN par les radiations ultraviolettes (UV) sont éliminés grâce à la réparation par excision de nucleotides (NER). La poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) est une enzyme impliquée dans différentes voies de réparation de l'ADN. Notre laboratoire a montré que la PARP-1 était activée par les dommages directs dus aux UV et que son absence retarde significativement la réparation de ces dommages dans un gène rapporteur viral. Le but de ce projet était de déterminer si la PARP-1 affectait le NER de l'ADN génomique des cellules eucaryotes. Nous avons observé un délai dans la réparation des dommages directs à l'ADN causés par les UV dans les cellules eucaryotes n'exprimant pas la PARP-1. De plus, la PARP-1 immunoprécipite in vivo avec des protéines impliquées dans la phase de reconnaissance de ces dommages. Nos résultats montrent donc que la PARP-1 joue aussi un rôle dans le NER.

L’ADN dans nos cellules est exposé continuellement à des agents génotoxiques. Parmi ceux-ci on retrouve les rayons ultraviolets, les agents mutagènes chimiques d’origine naturelle ou synthétique, les agents radiomimétiques, et les dérivés réactifs de l’oxygène produits par les radiations ionisantes ou par des processus tels que les cycles métaboliques redox. Parmi les dommages infligés par ces agents, les plus dangereux sont les cassures simples- et double-brin de l’ADN qui brisent son intégrité et doivent être réparées immédiatement et efficacement afin de préserver la stabilité et le fonctionnement du génome. Dans la cellule, ces cassures sont formées et réparées au niveau de la chromatine, où l'environnement moléculaire et les évènements impliqués sont plus complexes et les systèmes expérimentaux appropriés pour leur exploration sont peu développés. L’objectif de ma recherche visait ainsi l’exploration de ces processus et le développement de nouveaux modèles qui nous permettraient d’étudier plus précisément la nature de la formation et de la réparation des cassures simple- et double-brin de l’ADN in vivo. J’ai utilisé comme modèle un minichromosome (l’episome du virus Epstein-Barr) d’environ 172 kb, qui possède toutes les caractéristiques de la chromatine génomique. Nous avons observé que la radiation gamma induit un changement conformationnel de l’ADN du minichromosome par la production d’une seule cassure double-brin (CDB) localisée de façon aléatoire. Une fois linéarisé, le minichromosome devient résistant à des clivages supplémentaires et par la radiation ionisante et par d’autres réactifs qui induisent des cassures, indiquant l’existence d’un nouveau mécanisme qui dépend de la structure chromatinienne et par lequel une première CSB dans le minichromosome confère une résistance à la formation d’autres cassures. De plus, la reformation des molécules d’ADN du minichromosome surenroulées après l’irradiation indique que toutes les cassures simple-brin (CSB) et CDB sont réparées et les deux brins fermés de façon covalente. Nos découvertes indiquent que la réparation par ligature d'extrémités d'ADN non homologues est le principal mécanisme responsable de la réparation des CDB, alors que la réparation des CSB est indépendante de la polymérase poly-ADP ribose-1 (PARP-1). La modélisation mathématique de la cinétique de réparation et le calcul des vitesses de réparation a révélé que la réparation des CSB est indépendante de la réparation des CDB, et représente l’étape limitante dans la réparation complète des minichromosomes. Globalement, nous proposons que puisque ce minichromosome est comparable en longueur et en topologie aux boucles d’ADN sous contrainte de la chromatine génomique in vivo, ces observations pourraient fournir une vision plus détaillée de la cassure et de la réparation de la chromatine génomique. / DNA in our cells is exposed continually to DNA-damaging agents. These include ultraviolet light, natural and man-made mutagenic chemicals, and reactive oxygen species generated by ionizing radiation or processes such as redox cycling by heavy metal ions and radio-mimetic drugs. Of the various forms of damage that are inflicted by these mutagens, the most dangerous are the single- and double-strand breaks (SSBs and DSBs) which disrupt the integrity of DNA and have to be repaired immediately and efficiently in order to preserve the stability and functioning of the genome. In the cell, induction and repair of strand breaks takes place in the context of chromatin where the molecular environment and the events involved are more complex and suitable experimental systems to explore them are much less developed. A major focus of my research was therefore aimed towards exploring these processes and developing new models which will allow us to look more precisely into the nature of induction and repair of SSBs and DSBs in DNA in vivo. We used as a model the naturally-occurring, 172 kb long Epstein-Barr virus (EBV) minichromosome which posses all the characteristics of genomic chromatin and is maintained naturally in Raji cells. Gamma-irradiation of cells induces one, randomly-located DSB and several SSBs in the minichromosome DNA, producing the linear form. The minichromosome is then resistant to further cleavage either by ionizing radiation or by other break-inducing reagents, suggesting the existence of a novel mechanism in which a first SSBs or DSBs in the minichromosome DNA results in a conformational change of its chromatin which confers insensitivity to the induction of further breaks. Supercoiled molecules of minichromosome DNA were reformed when cells were incubated after irradiation, implying that all SSBs and DSBs were repaired and both strands were covalently closed. Using specific inhibitors or siRNA depletion of repair enzymes, we found that Non Homologous End Joining was the predominant pathway responsible for DSB repair, whereas repair of SSBs was PARP-1 independent. We could also show clearly that topoisomerases I and II are not required for repair. Mathematical modeling of the kinetics of repair and calculation of rate constants revealed that repair of SSBs was independent of repair of DSBs and was the rate-limiting step in complete repair of minichromosomes. Overall, we propose that since this minichromosome is analogous in length and topology to the constrained loops which genomic chromatin is believed to form in vivo, these observations could provide more detailed insights into DNA breakage and repair in genomic chromatin.

Titre de l'écran-titre (visionné le 5 septembre 2023) / L'instabilité génomique est considérée comme l'une des « caractéristiques du cancer ». Au cours des dernières décennies, divers processus de réparation de l'information génétique ont été découverts, nous permettant de mieux comprendre comment la dérégulation de ces processus peuvent conduire au développement du cancer. Notre groupe de recherche s'intéresse particulièrement au processus de réparation des cassures double-brin (DSBs) de l'ADN, la forme la plus nocive de dommages à l'ADN. La jonction d'extrémités non homologues canonique (c-NHEJ) et la recombinaison homologue (HR) sont les principales voies de réparation des DSBs. Afin d'enclencher la réparation des DSBs, les cellules régulent soigneusement le choix entre ces deux processus de réparation. Le processus de résection de l'ADN facilite le choix entre ces voies de réparation. La résection de l'ADN est caractérisée par la dégradation de l'ADN pour créer un long substrat d'ADNsb favorisant la réparation par HR. En revanche, l'inhibition de la résection de l'ADN favorise la réparation des DSB par la voie c-NHEJ. Les mutations de perte de fonction des protéines impliquées dans la facilitation de la résection de l'ADN conduisent souvent à des troubles génétiques et au développement de cancers. Le développement du cancer a souvent été associé à des mutations de BRCA1, une protéine impliquée dans la résection de l'ADN et le processus de réparation des RH. La létalité synthétique est devenue un concept important dans la réparation de l'ADN et la recherche sur le cancer. Il décrit le phénomène par lequel l'inactivation simultanée de deux événements conduit à la létalité cellulaire, même si chaque événement individuellement est toléré. Le traitement contre le cancer basé sur la létalité synthétique le plus efficace qui ait été développé jusqu'à présent utilise les inhibiteurs de PARP (PARPi). PARP-1 dans une protéine impliquée dans divers processus cellulaires, dont la régulation de la réparation de l'ADN. Il a été constaté que l'inhibition de PARP-1 est synthétiquement létale avec un déficit en HR. Les tumeurs déficientes en HR, sont sensibles aux PARPi alors que leurs homologues cellulaires normaux HR-compétents tolèrent le traitement. Cependant, bien qu'il s'agisse d'une option de traitement prometteuse, de nombreux patients développent encore une résistance aux PARPi. Une façon par laquelle les tumeurs déficientes en BRCA1 développent une résistance à PARPi est la réactivation de la résection de l'ADN. En l'absence de BRCA1 fonctionnel, les inhibiteurs de la résection de l'ADN empêchent l'utilisation de HR pour la réparation des DSBs. Des mutations de perte de fonction dans ces inhibiteurs de la résection de l'ADN entraînent la réactivation de la résection de l'ADN et de la HR. Par conséquent, il est important de comprendre la relation entre les protéines qui facilitent la résection de l'ADN et celles qui l'inhibent. Avec cette compréhension, de meilleures approches pour atténuer le développement de la résistance peuvent être développées. Dans cette thèse, nous approfondissons la relation entre l'inhibition de la résection de l'ADN et le développement de la résistance aux PARPi. Nous discutons du processus de résection de l'ADN et de la façon dont divers inhibiteurs de la résection de l'ADN fonctionnent pour inhiber la réparation par RH. Nous décrivons une méthode pour développer de nouveaux inhibiteurs chimiques qui peuvent être utilisés pour cibler MRE11, une composante importante de la machinerie de résection de l'ADN. De plus, nous avons identifié un nouvel inhibiteur de la résection de l'ADN, DYNLL1, et caractérisons son rôle dans l'inhibition de la résection de l'ADN. Enfin, nous contribuons davantage à la compréhension du mécanisme d'action d'un inhibiteur connu de la résection de l'ADN, RIF1. En outre, nous identifions une nouvelle interaction synthétique létale entre RIF1 et MRE11 qui pourrait être avantageuse dans le développement d'un nouveau traitement contre le cancer avec un défaut dans l'une ou l'autre des protéines. En résumé, nous décrivons de nouveaux mécanismes d'action pour la régulation négative de la résection de l'ADN impliquant DYNLL1 et RIF1. De plus, ces résultats placent MRE11 au cœur de la régulation de la résection de l'ADN, soulignant l'importance du développement de nouveaux inhibiteurs chimiques qui le ciblent. / Genomic instability is considered to be one of the "Hallmarks of Cancer". In recent decades, research on the topic has uncovered various DNA repair processes that cells use to maintain genome stability. This has also given us a better understanding of how errors from and dysregulation of these processes can lead to cancer development. Our research group is particularly interested in the repair process for DNA double-strand breaks (DSBs), the most harmful form of DNA damage. Canonical Non-Homologous End-Joining (c-NHEJ) and Homologous (HR) Recombination are the major DSB repair pathways. In order to facilitate proper DSB repair, cells carefully regulate the choice between these two repair processes. One manner in which cells facilitate the choice between these two pathways is through the process of DNA resection. DNA resection is the degradation of DNA following DSB induction to create a long ssDNA substrate that favours HR repair. In contrast, inhibition of DNA resection favours DSB repair through the c-NHEJ pathway. Loss-of-function mutations of proteins involved in facilitating DNA resection often lead to genetic disorders and cancer development. Cancer development has often been associated with mutations in BRCA1, a protein involved in the DNA resection and HR repair process. Synthetic lethality has become an important concept in DNA repair and cancer research. It describes the phenomenon wherein the simultaneous occurrence of two events leads to unviability or lethality, in this case of the cell, even though each event individually is tolerated. In cancer research, this has been taken advantage of when developing novel treatments particularly in cancer types with a frequently occurring mutation. The most successful synthetic lethality-based cancer treatment that has been developed thus far has been PARP inhibitors (PARPi). PARP-1 in a protein involved in various cellular processes, including the regulation of DNA repair. It was found that PARP-1 inhibition is synthetically lethal with a deficiency in HR. It was found that HR-deficient tumours, especially those with a loss-of-function mutations in BRCA1, are sensitive to PARPi treatment whereas their HR-proficient normal cell counterparts tolerated the treatment. In the clinic, this meant that patients with cancers that are BRCA1-deficient can be effectively treated with PARPi. However, although a promising treatment option, many of the patients still develop PARPi resistance requiring the need for other treatment options. It has been found that one manner in which BRCA1-deficient tumours develop PARPi-resistance is through the reactivation of DNA resection. In the absence of functional BRCA1, DNA resection inhibitors prevent the use of HR for the repair of DSBs. One of the ways these tumours develop PARPi-resistance is by developing loss-of-function mutations in these DNA resection inhibitors. These mutations lead to the reactivation of DNA resection and HR. Therefore, it is important to understand the relationship between proteins that facilitate DNA resection and those that inhibit it. With this understanding, better approaches for mitigating development of resistance can be developed. To further understand the relationship between DNA resection inhibition and PARPi-resistance development, we discuss what is known in the literature about the DNA resection process and how various DNA resection inhibitors work in order to inhibit HR repair. We describe a method for developing novel chemical inhibitors that can be used to target DNA repair proteins using MRE11--an important component of the DNA resection machinery--as an example. Furthermore, we identify a novel DNA resection inhibitor, DYNLL1, and characterize its role in DNA resection inhibition. Lastly, we contribute further to the understanding of the mechanism of action of a known DNA resection inhibitor, RIF1. Furthermore, we identify a novel synthetic lethal interaction between RIF1 and MRE11 that could be advantageous in the development of novel cancer treatment with defect in either protein. In summary, we describe novel mechanisms of action for the negative regulation of DNA resection involving DYNLL1 and RIF1. Furthermore, these results put MRE11 at the heart of DNA resection regulation highlighting the importance of development of novel chemical candidates that target it.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L’objectif de ce travail est de permettre à une équipe de robots autonomeshétérogènes d’effectuer une mission complexe dans un environnement réel et sous contraintede communication. Cette thèse a donc consisté à créer et à valider une architecturedistribuée à bord des robots et intégrant planification, supervision de l’exécution du planet réparation de ce plan suite à l’occurrence d’aléas. Ce manuscrit présente la conceptiond’un algorithme de planification hybride, dénommé HiPOP, utilisé pour calculer un planinitial, avant le début de la mission, et pour réparer le plan en cours de mission quandun événement perturbateur survient. Il présente aussi la conception d’un algorithme desupervision, dénommé METAL, utilisé pour suivre l’exécution du plan sur chaque robot et,le cas échéant, faisant appel à HiPOP pour réparer le plan. Ces deux algorithmes ont étéimplémentés et ont permis de réaliser des missions de surveillance allant jusqu’à impliquer12 robots, à la fois en simulation et avec de vrais robots. / The goal of this work is to enable a team of heterogeneous autonomous robotsto perform a complex mission in a real environment with communication constraints. Thisapproach was therefore to create and validate a distributed embedded architecture ableto plan, to monitor the execution of a plan and to repair a plan when an unexpectedevent occurs. This document shows the conception of an hybrid planning algorithm, namedHiPOP, used to compute initial plans before the beginning of the mission and to repair theplan during the mission when something unexpected happens. It also shows the conceptionof a monitoring algorithm, named METAL, used to monitor the execution of the planon each robot and, when needed, which calls HiPOP to repair the plan. Both algorithmswere implemented and used to carry out surveillance missions up to 12 robots, both insimulation and in a real life scenario.

Les blessures psychiques ont été présentes au détour de chacun des conflits qui ont jalonné l’Histoire. La première partie de ce travail porte sur la découverte de la névrose traumatique, sa perception dans le cadre militaire, et sur la distinction qui existe entre l’approche psychanalytique européenne centrée sur le trauma et l’entité américaine qui s’est imposée pour se fonder essentiellement sur le stress. Les législations canadiennes et françaises qui encadrent le vétéran et l’ancien combattant atteint de psychosyndrome traumatique vont constituer le sujet de la seconde partie. L’historique du cadre juridique contemporain ; les étapes de la demande d’indemnisation avec leurs caractéristiques et leurs écueils respectifs ; les notions de preuve et d’imputabilité, enfin les particularités de l’expertise médicale sont présentées selon la perspective propre à chaque pays. Des sujets variés issus d’une trame commune qui, relatant l’expérience du vétéran blessé psychiquement pour lequel l’exercice de son droit à réparation prend l’allure d’un second combat, vont permettre de déterminer si, au-delà de la reconnaissance de l’institution ou des attentes déçues, la législation actuelle encadre de manière satisfaisante – ou pas – le droit à réparation.