Comme dans tout système juridique, la démonstration de l’existence d’une relation de causalité entre le dommage subi et le fait générateur de responsabilité est une condition de l’obligation de réparer en droit international public. L’octroi d’une indemnité, ou d’une autre mesure de réparation, est subordonné à la preuve de ce lien ; la « réparation intégrale » du dommage ne s’impose que pour « effacer toutes les conséquences de l’acte illicite et rétablir l’état qui aurait vraisemblablement existé si ledit acte n’avait pas été commis » (CPJI, Usine de Chorzów (1928), Rec. Série A, n°17, p. 47). L’enjeu pratique de cette exigence est important, car elle conditionne la possibilité pour la personne lésée d’obtenir un dédommagement pour les conséquences dommageables d’un fait internationalement illicite. Cette thèse s’attache à modéliser une définition de la condition du lien de causalité en droit international. Jusqu’où l’obligation de réparer pesant sur l’État responsable s’étend-elle ? En réalité, le droit international n’impose pas d’effacer toutes les conséquences, chose radicalement impossible, mais toutes les conséquences suffisamment reliées au fait illicite par une relation causale. Cette étude propose une démarche méthodologique permettant, à la lumière de la pratique internationale, d’opérer cette distinction. / In international law, as well as domestic legal systems, reparation is conditioned upon the demonstration of a causal nexus between the wrongful act and the harm suffered. This principle flows directly from the famous Factory at Chorzow (1928) formulation that « reparation must, as far as possible, wipe out all the consequences of the illegal act and reestablish the situation which would, in all probability, have existed if that act had not been committed » (PCIJ, Series A, n°17, p. 47). In other words, it is a constituent element of the « full reparation » principle, a part of its very definition. Causation (and remoteness of damage) is therefore a prominent practical question in the field of international responsibility. However, it is clear that a line must be drawn between recoverable and non-recoverable damages, because human actions cause remote effects. Drawing on precedents and legal sources, this thesis inquiry is to establish a methodological and legal framework for doing so.

La thèse aborde plusieurs problématiques liées à la conservation, l'entretien et la restauration des édifices en Grèce aux époques classique et hellénistique, à partir des cas de Delphes et de Délos, deux sites qui ont fourni une riche documentation épigraphique et archéologique. D'un point de vue pratique, il est question des techniques et méthodes utilisées pour prévenir les dégâts et réparer ou entretenir les bâtiments. Les différents acteurs de l'entretien des édifices sont identifiés, ainsi que leurs rôles respectifs. D'un point de vue économique, sont étudiés les sources et moyens de financement et la part des dépenses que constitue, pour un sanctuaire ou une cité, l'entretien de ses bâtiments. Le vocabulaire des inscriptions est étudié en détail afin, notamment, de mieux cerner les enjeux sociaux et politiques liés aux restaurations architecturales. / Doctorat en Histoire, histoire de l'art et archéologie / info:eu-repo/semantics/nonPublished

En réponse aux dommages de son génome, le choix par la cellule de la voie de réparation de l'ADN est un crucial par ses conséquences en termes de mutagénèse et de survie. Pour faire face aux cassures double-brin de l'ADN (CDB), les cellules humaines possèdent deux voies principales qui consistent soit à rejoindre les extrémités de la cassure par jonction d'extrémités non-homologues (voie conventionnelle C-NHEJ), soit à reconstituer par recombinaison homologue la séquence clivée en copiant son double non endommagé présent après la réplication (voie RH). La RH nécessite de dégrader l'un des brins d'ADN de part et d'autre de la cassure. Cette dégradation produit de courts fragments d'ADN simple-brin, connus pour aider à signaler le dommage à la cellule. Dans ce travail, nous avons évalué directement l'effet de ces fragments d'ADN simple brin sur la réparation des CDB dans des expériences biochimiques et cellulaires. Nous montrons que de courts fragments d'ADN simple-brin inhibent la C-NHEJ en inactivant sa protéine clef Ku, tout en stimulant une forme minoritaire de jonction des cassures dite NHEJ alternative (A-EJ). Ces travaux permettent de mieux comprendre comment la réparation par la voie peu connue A-EJ peut s'exprimer dans les cellules mais aussi d'envisager des stratégies pour piloter la réponse des cellules cancéreuses aux thérapies induisant des CDB. / In response to DNA damage, the choice made by the cells between DNA repair mechanisms is crucial for mutagenic and survival outcomes. In humans, DNA double-strand breaks are repaired by two mutually-exclusive mechanisms, homologous recombination or end-joining. Among end-joining mechanisms, the main process is classical non-homologous end-joining (C-NHEJ) which relies on Ku binding to DNA ends and DNA Ligase IV (Lig4)-mediated ligation. Mostly under Ku- or Lig4-defective conditions, an alternative end-joining process (A-EJ) can operate and exhibits a trend toward microhomology usage at the break junction. Homologous recombination relies on an initial MRN-dependent nucleolytic degradation of one strand at DNA ends. This process, named DNA resection generates 3' single-stranded tails necessary for homologous pairing with the sister chromatid. While it is believed from the current literature that the balance between joining and recombination processes at DSBs ends is mainly dependent on the initiation of resection, it has also been shown that MRN activity can generate short single-stranded DNA oligonucleotides (ssO) that may also be implicated in repair regulation. In this work, we evaluate the effect of ssO on end-joining at DSB sites both in vitro and in cells. Under both conditions, we report that ssO inhibit C-NHEJ through binding to Ku and favor repair by the Lig4-independent microhomology-mediated A-EJ process. Our data bring new clues in the understanding of the cellular response to DNA double-strand breaks.

Parmi les dommages de l'ADN, la cassure double-brin (CDB) constitue la lésion la plus toxique, puisqu'une seule CDB non réparée ou réparée de façon incorrecte peut conduire à la mort cellulaire. Cette toxicité est justement exploitée en clinique pour éradiquer les cellules tumorales. Parmi l'arsenal des molécules utilisées en chimiothérapie, les poisons de topoisomérase I (TOPO1), tel que la camptothécine (CPT), sont capables d'induire un type particulier de CDBs à une seule extrémité, générées lors de la collision entre la fourche de réplication et la TOPO1 bloquée sur l'ADN. Ces cassures sont réparées par recombinaison homologue (RH) puisqu'en absence de seconde extrémité, elles ne peuvent être substrats de la jonction d'extrémités non homologues (JENH) qui, pour ligaturer en nécessite deux. L'hétérodimère Ku, initiateur de la JENH est à la fois un détecteur majeur des CDBs de par son abondance nucléaire et sa forte affinité, et un puissant inhibiteur de la RH. Ainsi, pour la compréhension des mécanismes déterminants le choix de la voie de réparation adaptée à chaque type de CBD, la régulation de la liaison de Ku aux CDBs à une extrémité est donc une question cruciale. Dans ce contexte, mon premier projet de thèse a concerné la compréhension moléculaire du choix de la voie de réparation des CDBs à une extrémité. Par une technique de microscopie à haute résolution, j'ai d'abord montré que l'hétérodimère Ku et son partenaire la DNA-PKcs sont rapidement recrutés au niveau de ces dommages dans l'ADN de cellules humaines. J'ai ensuite démontré que grâce à la phosphorylation de CtIP par ATM et à l'action coordonnée des activités nucléases de MRE11 et CtIP, Ku est relargué des CDBs à une extrémité. La dissociation de la DNA-PKcs des CDBs à une extrémité dépend de sa phosphorylation par ATM au niveau du cluster ABCDE. A l'aide d'un mutant non phosphorylable de ce cluster, j'ai montré que le défaut de dissociation de la DNA-PKcs prévient le relargage de l'hétérodimère Ku dépendant de MRE11. Mes travaux suggèrent toutefois l'existence d'une voie additionnelle pouvant éliminer Ku de plus 50% des CDBs à une extrémité. Enfin, j'ai démontré que la persistance de Ku et de la DNA-PKcs aux extrémités de la cassure ne perturbe ni la résection longue distance ni la formation de filament de RAD51 mais compromet la survie cellulaire. Mon second projet de thèse a consisté à perturber les mécanismes contrôlant le choix de la voie de réparation des CDBs dans le but de potentialiser l'effet de la CPT. Comme l'inhibition d'ATM induit une sensibilisation dramatique des cellules en réplication à la CPT, il devrait être possible d'identifier d'autres sensibilisateurs à la CPT qui désorganiseraient la réparation des CDBs à une extrémité. Sur la base d'un test de cytotoxicité, j'ai réalisé un criblage phénotypique de la chimiothèque du NIH et identifié un antibiotique, la nitrofurantoïne (NTF) et l'hydrocortisone acétate (HCA) capables de potentialiser l'effet de la CPT. Si la sensibilisation par la NTF semble plutôt associée à la génération d'espèces oxygénées réactives (ROS) par nitroréduction de la molécule, celle induite par l'HCA n'a pas été reproduit et est toujours en cours d'investigation. Mes travaux de thèse contribuent à la compréhension des mécanismes du choix de la voie de réparation impliqués dans la tolérance des cellules à la CPT et ouvrent des perspectives de ciblage pour potentialiser son pouvoir anti-cancéreux. / DNA double-strand break (DSB) is the most toxic DNA damage, because a single mis- or un-repaired DSB can lead to cell death. This toxicity is exploited in clinics to eradicate tumoral cells. So, among molecules currently used in chemotherapy, topoisomerase 1 (TOPO1) poisons such as camptothecin (CPT), are able to generate a particular type of DSB bearing one single end (seDSBs); these lesions are created when a replication fork collides with the TOPO1 blocked on the DNA. They are repaired by homologous recombination (HR) because, devoid of a second end, they cannot be ligated by non-homologous end-joining (NHEJ). The Ku heterodimer, the initiator of the NHEJ is both a major detector of the DSBs due to its nuclear abundance and strong affinity, and a powerful HR inhibitor. Therefore, the regulation of Ku binding to one-ended DSB is a crucial question for the understanding of mechanisms determining the choice of the suitable DSB repair pathway. In this context, my first thesis project aimed at deciphering the molecular mechanisms responsible for the DNA repair pathway choice at seDSBs. Firstly, using High Resolution Microscopy, I demonstrated that Ku and DNA-PKcs are rapidly recruited on seDSBs. Then, I showed that ATM-dependent phosphorylation of CtIP and the epistatic and coordinated actions of MRE11 and CtIP nuclease activities are required to limit the stable loading of Ku on seDSBs. I established that DNA-PKcs removal from seDSBs relies on ATM-dependent phosphorylation of the ABCDE cluster. Using a non-phosphorylable mutant of this cluster, I demonstrated that impaired DNA-PKcs removal prevents MRE11 from releasing Ku. However, my work also suggested the existence of an additional mechanism that contributes to prevent Ku accumulation at 50% of seDSBs. Finally, I demonstrated that Ku and DNA-PKcs persistence on seDSBs does not impair long range resection and RAD51 recruitment but compromises cell survival. My second thesis project was dedicated to target the DSB repair pathway choice mechanisms in order to potentiate the effect of CPT. Indeed, since ATM inhibition increases drastically the death of replicative cells treated with CPT, we may identify others sensitizers able to disrupt the repair pathway choice. On the basis of a cytotoxicity assay on mouse embryonic fibroblasts (MEFs), I performed a phenotypic screening of the NIH Clinical Collection and identified the antibiotic nitrofurantoin (NTF) and hydrocortisone acetate (HCA) as a sensitizer of MEFs to CPT. However, sensitization induced by NTF does not depend on Ku but rather seems to rely on Reactive Oxygen Species (ROS) generation by nitroreduction of the molecule and sensitization induced by HCA is not reproducible and is still under investigation. My work contributes to extend the knowledge of the repair pathway choice mechanisms involved in cell tolerance to CPT and opens new opportunities to potentiate its anticancerous property.

L’ADN est constamment exposé à des insultes génotoxiques endogènes et exogènes. Plusieurs mécanismes de réparations de l’ADN sont mis en œuvre pour préserver la stabilité du génome et de l’épigénome. La recombinaison homologue (RH) joue un rôle central dans la réparation des cassures double brin de l’ADN (DSBs) et le redémarrage des fourches de réplication en réponse à un stress réplicatif. Ces deux processus sont tous deux couplés à l’assemblage de la chromatine. Le facteur d’assemblage de la chromatine 1 (CAF-1) est un chaperon d’histone conservé au cours de l’évolution qui fonctionne dans le processus d’assemblage des nucléosomes couplé à la réparation de l’ADN et à la réplication, en déposant sur l’ADN les tétramères d’histones (H3-H4)2 nouvellement synthétisés. Chez la levure Schizosaccharomyces pombe, le complexe CAF-1 est constitué de trois sous-unités, Pcf1, Pcf2 et Pcf3. Il a été montré que CAF-1 agit dans l’étape de synthèse de l’ADN durant le processus de réplication dépendante de la recombinaison (RDR) et protège le désassemblage des D-loop par l’hélicase Rqh1, membre de la famille des hélicases RecQ. Dans cette étude, nous avons adressé le rôle de CAF-1 pendant la réparation de l’ADN par recombinaison homologue chez la levure Schizosaccharomyces pombe. Par l’utilisation d’approches in vivo et in vitro, nous avons validé des interactions protéines-protéines au sein d’un complexe contenant Rqh1, CAF-1, PCNA, et l’Histone H3. Nous avons montré que Rqh1 interagit avec Pcf1 et avec Pcf2 indépendamment l’un de l’autre, et que l’interaction Rqh1-Pcf1 est stimulée par des dommages à l’ADN. Nous avons mis en place une méthode d’analyse de liaison à la chromatine pour suivre l’association de CAF-1 à la chromatine en réponse aux dommages à l’ADN. Nous avons observé qu’un stress réplicatif, mais pas l’induction de cassures double brin de l’ADN, favorise l’association de CAF-1 à la chromatine. Nous avons identifié plusieurs facteurs de la RH nécessaire pour l’association de CAF-1 à la chromatine en réponse à un stress réplicatif. De plus, nous avons mis en évidence des interactions physiques entre Pcf1 et des facteurs de la recombinaison homologue, parmi lesquels RPA et Rad51. Nos données suggèrent que CAF-1 pourrait s’associer aux sites de synthèse d’ADN dépendent de la recombinaison via son interaction avec des facteurs de la RH. L’ensemble des données de cette étude contribuent à renforcer le role de CAF-1 couplé à réparation de l’ADN, et révèlent une interconnexion entre les facteurs de la RH et l’assemblage de la chromatine. / DNA is constantly exposed to both endogenous and exogenous genotoxic insults. Multiple DNA repair mechanisms are exploited to guard the genome and epigenome stability. Homologous recombination (HR) plays a major role in repairing DNA double strand breaks (DSBs) and restarting stalled replication forks under replicative stress. These two processes are both coupled to chromatin assembly. Chromatin assembly factor 1 (CAF-1) is a highly conserved histone chaperone known to function in a network of nucleosome assembly coupled to DNA repair and replication, by depositing newly synthesized histone (H3-H4)2 tetramers onto the DNA. The fission yeast CAF-1 complex consists of three subunits Pcf1, Pcf2 and Pcf3. CAF-1 has been previously reported to act at the DNA synthesis step during the process of recombination-dependent replication (RDR) and protects the D-loop from disassembly by the RecQ helicase family member, Rqh1. In this study, we addressed the role of CAF-1 during homologous-recombination-mediated DNA repair in fission yeast.Using in vivo and in vitro approaches, we validated interactions within a complex containing Rqh1, CAF-1, PCNA, and Histone H3. We showed that Rqh1 interacts with both Pcf1 and Pcf2 independently of each other, and the Pcf1-Rqh1 interaction is stimulated by DNA damage. We developed an in vivo chromatin binding assay to monitor the association of CAF-1 to the chromatin upon DNA damage. We observed that replication stress but not double strand break favors CAF-1 association to the chromatin. We identified that several HR factors are required for CAF-1 association to the chromatin upon replication stress. In support of this, we have identified physical interactions between Pcf1 and HR factors, including RPA and Rad51. Our data suggest that CAF-1 would associate with the site of recombination-dependent DNA synthesis through physical interactions with HR factors. Put together, this work contributes to strengthening the role of CAF-1 coupled to DNA repair, and reveals the crosstalk between HR factors and chromatin assembly.

En 2017, Statistique Canada a rapporté qu'un Canadien sur quatre mourra d’un cancer. Chaque jour, nous sommes confrontés à des facteurs environnementaux qui imposent à notre ADN un stress génotoxique. Ce stress peut avoir de graves conséquences au point de menacer notre intégrité génomique, comme les cassures d'ADN double-brin (DSBs). Heureusement, nos cellules ont deux voies principales pour combattre ce type de lésions : la recombinaison homologue (HR) et la Classical Non-Homologous End-Joining (CNHEJ). La voie HR, un type de réparation sans erreur utilisé dans la phase-S du cycle cellulaire, assure une réparation fidèle de la zone endommagée et conserve l'intégrité de l'information génétique. Les individus porteurs de mutations dans les protéines de cette voie, telles que BRCA1 et BCRA2, sont plus susceptibles de développer des cancers du sein et de l'ovaire. Récemment, la clinique a connu une percée majeure dans le traitement du cancer de l'ovaire. Une nouvelle classe de médicaments a été autorisée par la US Food and Drug Administration (FDA) pour traiter les cancers de l'ovaire récurrents qui présentent une HR défective. Ces médicaments inhibent un des acteurs les plus précoces dans la réponse aux dommages à l'ADN (DDR): la PARP-1 (Poly(ADP-ribose) polymerase-1). Lors de l'induction de dommages à l'ADN, la PARP-1 devient fortement activée, conduisant à la production massive de polymères de poly(ADP-ribose) (PAR) générés à partir de l'hydrolyse du nicotinamide adénine dinucléotide. Ce polymère agira comme une plateforme pour recruter des facteurs de réparation de l'ADN au site de réparation. L'application clinique réussie des inhibiteurs de la PARP (PARPi) vient des observations où les mutations ou l'extinction de BRCA1/2 entraînent une diminution de l'activité HR. L'inhibition de la PARP-1 combinée à cette déficience en HR favorise la mort cellulaire, un phénomène appelé létalité synthétique. Trois PARPi sont actuellement autorisés par la FDA et sont utilisés pour le traitement du cancer gynécologique. Malgré l'efficacité thérapeutique de ces inhibiteurs, les mécanismes induisant une régression tumorale ne sont pas complètement compris. Ainsi, il devient extrêmement important de déchiffrer davantage ces mécanismes pour atteindre le plein potentiel des PARPi. Pour ce faire, une recherche fondamentale sur les fonctions des PARPs, et de leurs partenaires dans la DDR, est essentielle et constitue l'objectif général de cette thèse. Durant mon doctorat, nous avons étudié l'influence de la PARP-1 dans la voie HR au moment de l'étape initiale de la résection, qui est essentielle pour l'élimination de l'ADN endommagé. Certaines études ont montré l'implication de la PARP-1 dans le recrutement de la protéine de résection MRE11. Ici, nous démontrons que la PARP-1 a une nouvelle fonction dans la résection des DSBs et nous proposons un nouveau modèle pour expliquer la létalité synthétique observée dans les tumeurs avec une HR défective. Pour compléter l'objectif de ce doctorat, nous avons étudié les rôles régulateurs de la PARP-1 au cours du processus HR, mais plus tard dans la résolution des lésions, c'est-à-dire au maximum de la formation des foyers RAD51, une étape cruciale pour la réparation efficace des DSBs via la HR. Nous avons observé que le PAR-interactome (PARylome) est, à ce moment, fortement enrichi en protéines impliquées dans le métabolisme de l'ARN. Plusieurs des protéines les plus abondantes étaient constituées d’hélicases d’ADN et d’ARN, et de facteurs de transcription. Puisque certains de ces gènes sont mutés dans les tumeurs, ils pourraient théoriquement être des cibles prioritaires pour une utilisation conjointe avec des PARPi. Nous avons également étendu notre étude de la PARylation à la chromatine, au niveau des histones. Nous avons constaté que les queues d'histones ne sont pas les seules cibles de la PARP-1 et que les domaines globulaires centraux sont également PARylés. Finalement, le grand intérêt clinique de la PARP-1 méritait une analyse approfondie de son expression systémique. Ainsi, j'ai terminé mes études en décrivant la distribution et l'abondance tissulaire de la PARP-1 dans les organes simiens, avec l'objectif principal de fournir des informations précieuses quant à l'efficacité potentielle des PARPi ou sa résistance, dans un tissu donné et maladies apparentées. En résumé, cette thèse fournit de nouvelles informations importantes sur les mécanismes orchestrés par la PARP-1 lors de la réponse aux DSBs, y compris les réseaux protéiques complexes engagés dans le remodelage des fonctions cellulaires nécessaire au maintien de l'intégrité génomique. / In 2017, Statistics Canada reported that one out of four Canadians will die of cancer. Every day, we face environmental factors that burden our DNA with genotoxic stress. This stress can lead to severe types of DNA damage that can threaten our genomic integrity, namely double-strand breaks (DSBs). Fortunately, our cells have evolved with different repair mechanisms to deal with such lesions. There are two primary types of repair against DSBs: Homologous Recombination (HR) and Classical Non-Homologous End-Joining (CNHEJ). The HR pathway is an error-free repair mechanism used in the S-phase of the cell cycle to ensure faithful repair of the damaged area and thus preserve our genetic information. Individuals that bear mutations in proteins involved in this pathway, such as BRCA1 and BCRA2, have been associated with the development of breast and ovarian cancers. Almost 4 years ago, the field went through a major breakthrough in ovarian cancer care. A new class of drugs was accepted by the US Food and Drug Administration (FDA) to manage recurrent ovarian cancers that display HR-deficiencies. These drugs consist of inhibitor molecules against one of the earliest sensors of DNA damage in the cell: PARP-1 (poly(ADP-ribose) polymerase-1). Upon DNA damage induction, PARP-1 becomes highly activated, leading to the massive production of poly(ADP-ribose) (PAR) polymers, from the hydrolysis of nicotinamide adenine dinucleotide, which in turn modify several proteins posttranslationally and act as a scaffold to recruit DNA repair factors to the repair site. The successful application of PARP inhibitors (PARPi) arose from the observations that mutations or silencing of BRCA1/2, resulted in diminished HR activity. In the context of HR deficiency, the concomitant inhibition of PARP resulted in cell-death, an effect called synthetic lethality. Three PARPi are currently accepted by the FDA and are being clinically used for the treatment of gynaecological cancers. Notwithstanding the great promise of these inhibitors for other types of cancers, the mechanism by which these are inducing cancer lethality is not fully understood. Thus, it becomes of extreme importance to further decipher its mechanistic ways, to achieve full potential of PARPi in the clinic. To achieve this, fundamental research on the functions of PARPs and their protein partners in the DNA damage response is indispensable and constitutes the general aim of this thesis. During my doctoral work, we investigated the influence of PARP-1 during the HR pathway, primarily during the initial step of resection, which is essential for the removal of damaged DNA. Early reports of PARP-1 involvement in resection described the recruitment of the resection protein MRE11 to sites of damage in a PARP-1 dependent manner. Here, we demonstrate that PARP-1 has a novel function in DSB resection and we propose a new model for the synthetic lethality observed in HR-deficient tumors. To further complement the general aim of this doctorate, we investigated the regulatory roles of PARP-1 during the HR pathway, however in a later stage of HR resolution, at the peak formation of RAD51 foci, which is a crucial step for the efficient repair of DSBs through HR. We observed that the PAR-interactome (PARylome) at this stage was abundantly enriched with RNA-processing factors. Several of the most abundant proteins consisted of DNA and RNA helicases, as well as transcription factors, some of which were found to be mutated in tumors, and thus can be seen as potentially druggable targets to be used in combination with PARPi. We also extended our PARylome study to the chromatin proteome and investigated the histone PARylome upon DNA damage. Interestingly, we found that histone tails are not the only targets of PARP-1 and that globular domains are also targets of PARylation. Lastly, the high clinical interest of PARP-1 warrants studies addressing PARP-1 organ distribution. Thus, I finalized my studies by extensively describing and reporting PARP-1 tissular and cellular distribution and abundance in monkey organs, with the main objective of providing valuable information to any study assessing PARP inhibition efficacy and resistance in any given tissue and related diseases. In summary, this thesis provides important new information on the mechanisms PARP-1 is regulating during the response to DSBs, including the networks PARP-1 is orchestrating to potentially help reshape the cell environment, to efficiently repair the most lethal lesion our genome faces.

Les protéines et les voies impliquées dans la réponse aux dommages de l'ADN (DDR), permettant de maintenir la stabilité génétique et de préserver la fidélité de la réplication, agissent non seulement comme l'initiation de la cancérogenèse mais peuvent également jouer un rôle majeur dans la progression tumorale et dans la résistance aux thérapies. La voie FANC joue un rôle central dans la stabilité génétique lors d'un stress réplicatif. La perte de fonction de cette voie est la cause d'un syndrome de fragilité chromosomique et de prédisposition au cancer appelé Anémie de Fanconi (FA).Nous avons démontré que les protéines FANC était surexprimées et suractivées dans les mélanome métastatiques exprimant le facteur de transcription MITF, un oncogène exprimé dans 80% des cas de mélanome. Nous avons identifié MITF comme un régulateur majeur de l'expression des transcrits codant les protéines de la voie FANC dans les cellules de mélanomes et montré que les cellules déplétées pour MITF présentaient les caractéristiques des cellules FA, i.e., une hypersensibilité aux agents pontants l'ADN. De plus, la voie FANC module également la migration des cellules de mélanome. Nos observations montrent le rôle central de cette voie de réparation dans la résistance des cellules de mélanomes aux dommages de l'ADN. Cette voie serait donc une nouvelle cible thérapeutique dans le traitement du mélanome.Nous avons également observé que la perte de fonction de la voie FANC augmente l'expression de MiTF dans des cellules FA et des cellules déplétées pour les protéines FANC. Nous avons montré que la voie FANC régule négativement l'expression de MITF au niveau transcriptionnel. Des résultats préliminaires montre que FANCD2 pourrait être associés au promoteur de MiTF au niveau d'un site de fixation de NF-kB, où il pourrait empêcher son action. La déplétion de MiTF conduit à une sensibilité aux agents pontants l'ADN dans des cellules contrôles mais pas dans des cellules FA, suggérant que MITF jouerait un rôle dans la DDR en régulant l'expression des protéines FANC. Enfin, nous avons montré que l'expression de MiTF est induite en réponse aux stimuli pro-inflammatoire. Enfin, l'expression altérée de MITF pourrait expliquer des défauts de pigmentation et la microphthalmie rapportés chez les patients FA. L'ensemble de ces données, à la fois validée et préliminaire, supporte l'existence d'une relation épistatique entre MiTF et la voie FANC. Cet voie aurait un rôle important à la fois dans la résistance au mélanome métastatique et dans certaines caractéristiques pathologiques de l'anémie de Fanconi. / Proteins and pathways involved in DNA damage response (DDR), maintaining genetic stability and safeguarding DNA replication, act not only as caretakers against cancer initiation but also play a major role in sustaining cancer progression and resistance to pharmacological-based therapies. The FANC pathway is central in maintaining genetic stability under conditions of replication stress and its loss-of-function is causative of the cancer predisposition and chromosome fragility syndrome Fanconi Anemia (FA).We demonstrate here that FANC proteins are over-expressed and over-activated in metastatic melanoma cells expressing the oncogenic microphthalmia-associated transcription factor (MiTF), which high expression is maintained in 80% of melanoma cases. We identified MiTF as a critical regulator of the expression of the mRNAs coding key proteins of the FANC pathway in melanoma cells and demonstrated that MiTF-silenced cells display the primary characteristics of FA cells, i.e., the cellular and chromosomal hypersensitivity to DNA interstrand crosslink- inducing agents. Moreover, FANC pathway also modulates melanoma cell migration. Our observations point to a central role of the FANC pathway in cellular and chromosomal resistance to DNA damage in melanoma cells. Thus, the FANC pathway appears as a promising new therapeutic target for melanoma treatment.Inversely, we observed that FANC pathway loss-of-function is associated to increased expression of MiTF in both FA patient-derived and siRNA-downregulated cells. We demonstrated that the FANC pathway negatively regulates MiTF expression at the mRNA level and have obtained preliminary data suggesting that FANCD2 associates to the MiTF promoter, impeding the action of the NF-kB transcription factor. MiTF depletion increases MMC sensitivity in FANC pathway proficient cells, but does not modify the sensitivity of FA cells, supporting the hypothesis that MiTF acts on the DDR by regulating the expression of FANC proteins. Finally, we demonstrated that MiTF expression is induced in response to inflammatory stimuli, like TNF-a. Thus, altered MiTF expression in FA could be involved in the pigmentation defects and microphthalmia reported in patients.In conclusion, we will present a corpus of both validated and yet preliminary data that strongly supports the existence of an epistatic relationship between MiTF and the FANC pathway. This circuitry appears to have an important role in melanoma resistance to chemotherapies and in some FA pathological traits.

Les cellules utilisent deux stratégies principales pour réparer les cassures double-brin (CDB) de l’ADN : la recombinaison homologue (RH) et la ligature d’extrémités non homologues (NHEJ). D’autres voies de réparation plus minoritaires existent qui mènent nécessairement à des altérations génétiques : Single Strand Annealing (SSA) et Alternative End Joining (A-EJ). Nous avons proposé que le choix entre les mécanismes de réparation des CDB nécessite deux étapes : 1) la compétition entre C-NHEJ et la résection, 2) sur les extrémités d’ADN résectées, la compétition entre RH, A-EJ et SSA. Ici, nous avons étudié la régulation de la deuxième étape de ce choix. En outre, la létalité synthétique a été décrite entre RAD52 et BRCA2/PALB2. Étant donné que BRCA2 et PALB2 sont nécessaires pour le chargement de RAD51 sur l’ADN simple brin, cela suggère que la formation d’un nucléofilament RAD51/ADNsb ordonné et RAD52 sont des acteurs essentiels dans le choix de la réparation à la deuxième étape. Nous avons trouvé que l’extinction de RAD51 ou BRCA2 stimule à la fois le SSA et EJ, d’une manière épistatique et que RAD52 contrôle la stimulation de SSA et A-EJ, en absence de RAD51. De plus, par séquençage haut débit, nous montrons que l’inhibition de RAD51 induit une instabilité génomique médiée par la microhomologie au niveau du génome. Cependant l’inhibition de RH n’est pas la réparation directe suffisante vers SSA et A-EJ. En effet, en utilisant des mutants dominants négatifs de RAD51, nous avons trouvé que les mutants du site de fixation/hydrolyse de l’ATP inhibent la RH et stimulent le SSA et que la chimère SMRAD51, qui inhibe la RH, inhibe également le SSA et EJ. Par TEM, nous avons observé que SMRAD51 perturbe spécifiquement la structure de l’ADNsb/SMRAD51. De l’autre côté, deux mutants d’hydrolyse de l’ATP de RAD51 ont montré que la liaison à l’ATP et l’hydrolyse d’ATP sont nécessaires pour une charge efficace de RAD51 sur l’ADN endommagé, dans les cellules vivantes. Ces deux mutants d’ATP ne se fixent pas à l’ADN en opposition à SMRAD51. Enfin, nous montrons que RAD51 n’empêche pas la résection étendue, mais que, in vitro, la protéine RAD51 empêche l’annealing de l’ADNsb complémentaire. Au total, les données montrent que RAD51 joue effectivement un rôle crucial dans la deuxième étape du choix de la voie de réparation des CDB à travers deux mécanismes distincts : 1- il déclenche la RH par son activité catalytique, 2- mail il empêche également les mécanismes non conservateurs dépendants de RAD52, SSA et A-EJ, en altérant l’étape de l’annealing. Par conséquent, le choix en deuxième étape entre la RH et les mécanismes mutagènes, SSA et A-EJ, est orchestré par un antagonisme entre RAD51 et RAD52. / Cells use two primary strategies to repair DNA double-strand break (DSB): Homologous Recombination (HR) and Non-homologous end joining (NHEJ). Beside other mechanisms exist that necessarily lead to genetic alterations: Single Strand Annealing (SSA) and Alternative End Joining (A-EJ). We have proposed that the choice between DSB repair mechanisms requires two steps: 1) competition between C-NHEJ and resection; 2) on resected DNA ends, competition between HR, A-EJ and SSA. Herein we investigated the regulation of the second step of this choice. Furthermore, synthetic lethality has been described between RAD52 and BRCA2/PALB2. Since BRCA2/PALB2 are required for the loading of RAD51 onto the ssDNA, suggesting that both the formation of an ordered RAD51/ssDNA nucleofilament and RAD52 are central players in the choice of repair at the 2nd step.We found that silencing RAD51 or BRCA2 stimulate both SSA and EJ, in an epistatic manner and that silencing RAD51 induced microhomology mediated genomic instability at a genome wide level. Moreover, we show that RAD52 controls the stimulation of SSA and A-EJ, upon RAD51 silencing. However inhibition of HR is not sufficient redirect repair toward SSA and A-EJ. Indeed, using dominant negative mutants of RAD51 we found that the chimera SMRAD51, which inhibits HR, also inhibits SSA and EJ. By TEM we observed that SMRAD51 specifically disrupts the structure of the ssDNA/SMRAD51. On the other side, two ATP hydrolysis mutants of RAD51 showed that ATP binding and hydrolysis is required for efficient loading of RAD51 on damaged DNA, in living cells. These two ATP mutants that do not bind DNA in opposition to SMRAD51, do not inhibit A-EJ and stimulate SSA. Finally we show RAD51 do not prevents extended resection, but that, in vitro, RAD51 protein prevents the annealing of complementary ssDNA.Altogether the data show that RAD51 indeed plays a pivotal role in the second step of DSB repair pathway choice through two separable mechanisms: 1- it triggers HR through its catalytic HR activity 2- but it also prevents RAD52-dependent non-conservative mechanisms SSA and A-EJ, by impairing the annealing step. Therefore, the choice between HR and alternative mutagenic mechanisms A-EJ and SSA (2nd step) is orchestrated by an antagonism between RAD51 and RAD52

Les cancers du poumon non à petites cellules (CPNPC) restent une cause majeure de mortalité par cancer, malgré l’apport de thérapies moléculaires ciblées et des immunothérapies. La survie des patients aux stades avancés reste limitée et la mise au point de biomarqueurs pronostiques permettant de stratifier les patients ou prédictifs de réponse à différents types de traitement constitue un enjeu important pour la prise en charge des patients.La mise au point de biomarqueurs obéit à des enjeux spécifiques tenant à la connaissance de la biologie tumorale dans des domaines complexes tels que celui de la réparation de l’ADN, aux caractéristiques des outils disponibles pour créer ces biomarqueurs et à leur applicabilité dans le contexte clinique.Dans le cadre de cette thèse, il a été étudié la manière dont l’expression de la protéine PARP1 peut s’intégrer aux biomarqueurs pronostiques de réparation de l’ADN dans les CPNPC. Il a par ailleurs été étudié le rôle de la protéine MMS19, identifiée à partir d’études d’expression génique, comme biomarqueur prédictif potentiel de réponse au cisplatine dans les CPNPC. Enfin, l’utilisation des cellules tumorales circulantes pour le développement de biomarqueurs a été étudiée dans le cadre de la détection des remaniements du gène ALK, une altération oncogénique constituant une cible thérapeutique dans les CPNPC. / Non-small cell lung cancers (NSCLC) remain a leading cause of cancer-related death despite the advent of targeted therapies and immunotherapies. At advanced stages, patient survival remains limited and establishment of new biomarkers, either prognostic for patient stratification or predictive of response to various therapies, is an important goal for patient’s treatment.Development of biomarkers is dependent on many components among which: knowledge of cancer cell biology in complex cellular processes such as DNA repair, characteristics of tools available to create biomarkers and applicability in daily medical practice.In this thesis, expression of PARP1 has been evaluated as a prognostic biomarker in NSCLC, in the broader context of DNA repair biomarkers. The biological and clinical relevance of MMS19 protein, identified in gene expression analysis , as a biomarker for cisplatin sensitivity in NSCLC has also been studied. Finally, the use of circulating tumor cells for biomarker development has been studied through the detection of ALK gene rearrangment, an oncogenic targetable alteration in NSCLC.

A l’heure où le diabète prend des proportions pandémiques, nous nous sommes intéressés dans le cadre de cette thèse à l’étude de l’impact du diabète de type 2 (TD2M) sur l’os. Il y a peu d’études documentant l’impact de T2DM sur les os maxillo-faciaux d’origine endomembranaire et leurs réparations. Après une introduction bibliographique sur l’os, le diabète et les modèles d’études animaux, nous exposerons nos résultats sur (i) l’étude de la réparation vasculaire et osseuse des défauts de calvaria de rats diabètiques ZDF; (ii) l’impact du T2DM sur la structure osseuse et vasculaire des fémurs de rats ZDF; et (iii) l’altération des propriétés angiogéniques et du sécrétome des cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse (BMSC) par le T2DM. Ces études ont permis de mettre en évidence l’altération de la réparation osseuse dans les défauts de taille-critique et l’altération de la réparation vasculaire dans les défauts de tailles critique et sous-critique de la calvaria de rats T2DM. De même, la microarchitecture osseuse (corticale et trabéculaire) et la vascularisation se trouvent significativement altérées par le T2DM dans les fémurs de rats ZDF. Au niveau cellulaire, le sécrétome des BMSCs de rat ZDF présente un profil angiogénique différent de celui des rats ZL contrôles, ce qui peut apporter des éléments de réponses permettant la compréhension de la vascularisation paradoxale dans un contexte T2DM. Ces résultats devraient permettre d’améliorer la compréhension de l’effet du T2DM sur la cicatrisation osseuse, afin d’améliorer les stratégies thérapeutiques. / Now that diabetes reaches pandemic proportions, this thesis focuses on the effect of T2DM on bone. Very few studies document the effect of T2DM on maxillo-facial bone and their endomembraneous repair.After a short review on bone, diabetes and animal study models, we will showcase our results of the impact of T2DM on, (i) vascular and bone repair of calvarial defects in ZDF rats; (ii) the vascular and bone microarchitechture of ZDF rat’s femur; (iii) the secretome and angiogenic properties of zdf rat’s bone marrow stromal cells (BMSC). These studies showed an alteration of bone repair in critical size defects, and an impaired vascular repair in critical and subcritical T2DM defects. We also found evidences of bone and vascular microarchitechture impairement in ZDF femur. At a cellular level, T2DM BMSCs have an unique angiogenic profile. These findings may contribute to the better understanding of the adverse vascular healing in T2DM and provide successful bone healing therapies for patients with T2DM.