Le corégulateur transcriptionnel RIP140 est un facteur ubiquitaire majeur impliqué dans la régulation de nombreux processus physiopathologiques, qui possède la capacité d’être un coactivateur ou un corépresseur des voies de signalisation selon son recrutement sur les gènes cible. Des résultats du laboratoire ont montré que RIP140 est un facteur de bon pronostic de la tumorigenèse intestinale sporadique. Ce travail s’intéresse à l’implication de ce facteur de transcription dans les cancers colorectaux familiaux et, plus particulièrement, en lien avec le syndrome de Lynch (LS). Le syndrome de Lynch est une prédisposition héréditaire aux cancers, majoritairement colorectaux, caractérisés par un défaut du système de réparation des mésappariements de l’ADN (Mismatch Repair, MMR), dû à une première mutation germinale d’un des gènes de ce système. La perte de fonctionnalité MMR est responsable du phénotype d’instabilité microsatellitaire (MSI). Cependant, il existe des formes familiales de cancers colorectaux, avec MSI, où il n’est pas retrouvé d’atteinte germinale ou somatique de l’un des gènes du système MMR. Ce sont les syndromes apparentés au syndrome de Lynch (Lynch Like Syndrome, LLS) dont la prise en charge est identique à celle du LS. L’utilisation de modèles murins et de lignées cellulaires colorectales, présentant des modulations d’expression de RIP140 ont permis de mettre en évidence l’effet positif de ce corégulateur sur la régulation transcriptionnelle de l’expression des gènes du système MMR, MSH2 et MSH6. La validité fonctionnelle de cette régulation a été explorée par des analyses d’instabilité microsatellitaire et de sensibilité à différentes molécules cytotoxiques. Des cohortes de tumeurs ont permis de confirmer la corrélation d’expression entre RIP140 et les gènes MSH2 et MSH6 chez les patients. En outre, la régulation de l’expression par RIP140 d’une polymérase translésionnelle particulière, la polymérase Polκ, a été étudiée. Cette polymérase assure la réplication des séquences microsatellitaires du génome. Nous avons démontré que RIP140 stimule l’expression du gène POLK dans nos modèles cellulaires et que son expression est corrélée à celle de RIP140 au sein des tumeurs colorectales humaines. Enfin, par séquençage de différentes lignées cellulaires, nous avons mis en évidence une mutation de RIP140 qui entraîne un décalage du cadre de lecture et génère une protéine tronquée avec perte de deux domaines répresseurs de la protéine. Un séquençage à très haut débit nous a permis de rechercher cette mutation parmi des échantillons de tumeurs colorectales avec MSI. Cette mutation est retrouvée dans 19% des tumeurs, notamment LLS (16,2%), où elle est associée à une moins bonne survie globale. Elle affecte les propriétés antiprolifératives et transrépressives de RIP140 ainsi que les régulations positives des gènes MSH2, MSH6 et POLK. Le développement d’un outil anticorps spécifique de cette mutation serait extrêmement utile pour suivre l’expression de la forme mutée au sein des tumeurs et des premiers essais ont été réalisés en ce sens. En conclusion de ce travail, RIP140 contrôle l’expression de gènes majeurs impliqués dans le maintien de l’intégrité du génome et une mutation de ce corégulateur transcriptionnel pourrait être responsable de l’instabilité microsatellitaire de certaines tumeurs où des altérations des gènes MMR ne sont pas retrouvées. Des études cliniques sur des cohortes plus conséquentes seront nécessaires pour valider son intérêt en tant que marqueur utilisable dans la prise en charge des patients. / The transcriptional coregulator RIP140 is an ubiquitous cofactor playing a major role in the regulation of many physiopathological processes. It can either act as a coactivator or as a corepressor of signaling pathways depending on its recruitment on target genes. It has been shown that RIP140 is a good prognostic marker in sporadic intestinal tumorigenesis. This work focuses on its role in familial colorectal cancers and particularly in relation to the Lynch syndrome (LS). Lynch syndrome is a hereditary cancer predisposition, mostly colorectal, characterized by a defect in the Mismatch Repair (MMR) system, due to a first germline mutation of one gene of this system. Loss of MMR function induces a microsatellite instability (MSI) phenotype. However, there are some MSI familial colorectal cancers, where neither germinal nor somatic alteration of one MMR gene is found. They are referred to as Lynch like Syndrome (LLS) and their overall management is identical to that of LS. Murine models and colorectal cell lines, harboring modulations of RIP140 expression, allowed us to demonstrate the positive transcriptional regulation of the MMR genes, MSH2 and MSH6 by RIP140. Functional validation of this regulation was explored by microsatellite instability and sensitivity to various cytotoxic drugs analyses. A positive correlation has been confirmed between RIP140 and MSH2 and MSH6 gene expression in a cohort of 396 patients. Moreover, the transcriptional regulation by RIP140 of a specialized translesional DNA polymerase, the Polκ polymerase, has been investigated. Polκ ensures microsatellite sequences replication. We have demonstrated that RIP140 positively stimulates the expression of the POLK gene in our cell models and which appears correlated with that of RIP140 in human colorectal tumors. Finally, by sequencing different cell lines, we found a frameshift mutation of RIP140, generating a truncated protein with loss of the last two repression domains. High-throughput sequencing allowed us to look for this mutation in patient MSI colorectal tumor samples. This mutation was found in 19% of these tumors, especially LLS (16,2%), where it has been associated with lower overall survival. This mutation affects the antiproliferative and transrepressive properties of RIP140, as well as the positive regulation of the MSH2, MSH6 and POLK gene. Development of a specific antibody for this mutation would be extremely useful in following the expression of this mutated form within tumors and first tests have been already carried out. In conclusion, RIP140 controls expression of major genes involved in genome integrity maintenance and a mutation of this transcriptional coregulator could be responsible for microsatellite instability of some tumors where alterations of MMR genes are not found. Clinical studies on larger cohorts will be necessary to validate its interest as a marker usable in patient management.

Mon travail de thèse s’est axé sur deux projets, le premier a porté sur l’étude fonctionnelle de la sous unité TTDA de TFIIH, un facteur général de transcription impliqué dans la réparation NER, afin d’identifier de nouveaux partenaires de la sous unité TTDA nous avons réalisé un crible double hybride et ainsi sélectionné ZBTB38, une protéine impliqué dans la répression de gènes portant des methylations CpG, nous avons confirmé son interaction avec TTDA, et son implication dans la réparation NER. La deuxième partie a porté sur l’étude du recrutement des facteurs NER sur la chromatine en absence de lésions de l’ADN. En utilisant le système rapporteur LacO/LacR nous avons observé que l’immobilisation de l’un des facteurs NER sur la chromatine non endommagée permet l’assemblage du PInC de façon séquentielle et ordonnée. Nous avons aussi révélé que TTDA, connue pour être impliquée dans la trichothiodystrophie, joue un rôle clé dans la complétion du PInC. / During my thesis I worked on two projects, the first one was focused on the functional study of TTDA subunit of TFIIH, which is a general transcription factor involved in NER, we made a double hybrid screening to identify new interactants of TTDA subunit, and we could select ZBTB38, which is known to be implicated in methyl dependant gene repression; we confirmed its interaction with TTDA and its involvement in NER. The second project was entiteled Molecular Insights into the formation of the nucleotide excision repair complex revealed on undamaged chromatin. we analyzed the formation of the PInC independently of DNA damage by using the LacO-LacR system. We observed a sequential and ordered self-assembly of the PInC operating upon immobilization of individual NER factors on undamaged chromatin and mimicking that functioning on a bona fide NER substrate. We also revealed that the recruitment of TTDA, involved in Trichothiodystrophy disorder, was key in the completion of the PInC.

Les composants cellulaires sont constamment exposés à un stress oxydatif, lié à l’environnement et au métabolisme cellulaire. Les espèces réactives de l’oxygène produites par ce stress induisent de nombreuses lésions dans l’ADN, telles que l’oxydation des bases, la formation de sites abasiques ou la cassure de brins d’ADN. Ces dommages sont corrigés par un panel de systèmes de réparation, qui jouent un rôle critique dans la survie cellulaire et dans la prévention de pathologies telles que les maladies neurodégénératives ou le cancer. La modification de bases est le type de dommage le plus abondant, généré spontanément ou par des agents exogènes. Notre laboratoire s’intéresse ainsi au système de réparation par excision de base (BER), qui élimine les bases nucléotidiques altérées. Des études antérieures ont montré la formation « d’usines de réparation du BER » suite à des traitements induisant l’oxydation des bases dont la forme la plus courante est la 8-oxoguanine (8-oxoG). Dans le cas de cette lésion mutagène, l’assemblage du complexe BER dépend du recrutement d’OGG1 à la chromatine, l’enzyme qui reconnaît et excise la 8-oxoG. Cependant, ce recrutement ne nécessite pas la reconnaissance de la 8-oxoG, indiquant que d’autres signaux interviennent pour initier la réparation de la 8-oxoG par OGG1. Un crible à haut débit a été réalisé dans des cellules humaines pour rechercher des protéines impliquées dans le recrutement d’OGG1. Deux complexes ont été identifiés, les cohésines et le médiateur de la transcription.Dans ce projet de recherche, nous avons exploré le rôle de ces protéines dans la relocalisation d’OGG1 suite à un stress oxydatif. Nos études ont tout d’abord permis d’identifier des protéines essentielles au recrutement d’OGG1 : les protéines formant l’anneau de cohésines (SMC1, SMC3 et RAD21), plusieurs sous-unités du médiateur dont MED14, ainsi que le module CDK (MED12, MED13, Cycline C et CDK8). De plus, ces protéines sont nécessaires pour le recrutement d’OGG1 tout au long du cycle cellulaire. Nos résultats montrent que la relocalisation d’OGG1 sur la chromatine est liée à sa fonction de réparation de la 8-oxoG. Nous avons d’autre part montré que deux sous-unités du médiateur (MED12 et CDK8) sont relocalisées dans l’euchromatine, comme OGG1, de façon dépendante du corps du médiateur et des cohésines. Enfin, l’association d’OGG1 avec ses partenaires a été validée par microscopie FLIM-FRET et co-immunoprécipitation dans des conditions de stress oxydatif.En conclusion, ces résultats montrent pour la première fois un lien entre la réparation des bases oxydées et les complexes du médiateur et des cohésines, tous deux connus pour leur participation à d’autres voies de réparation de l’ADN. L’identification des mécanismes moléculaires et de nouveaux facteurs impliqués dans la réparation des bases oxydées pourrait fournir à terme des éléments essentiels pour la prise en charge de maladies telles que le cancer ou les maladies neurodégénératives. / Our laboratory focuses on the base excision repair (BER) mechanism that is responsible for the removal of damaged bases in DNA. Oxidative DNA damage is generated spontaneously by the endogenous metabolism of the cells or induced exogenously by chemical or physical agents. Our aim is to understand how BER complexes are assembled in the context of the cell nucleus in response to genotoxic stress. We previously found that after treatments generating oxidized bases into cellular DNA BER complexes are assembled on the chromatin. In the case of the 8-oxoguanine (8-oxoG) mutagenic lesion, assembly of the BER complex depends on the recruitment to the chromatin of OGG1, the DNA glycosylase that recognizes and excises the lesion. Surprisingly, characterization of OGG1 mutants that are not able to recognize 8-oxoG showed that the recruitment of this initiator protein does not require the recognition of the damaged base. This suggests that there are other mechanisms that allow recruitment of the enzyme to chromatin and thus initiation of the repair of the 8-oxoG by the BER. We performed a high-throughput siRNA screen in human cells to identify proteins required for the recruitment of OGG1 to chromatin. Among the candidates issued from the screen, two groups of proteins were selected for further study: members of the mediator and cohesin complexes.In this project, we explored the role of these proteins in OGG1 relocalization after an oxidative stress. Our studies confirmed the requirement of essential proteins for OGG1 recruitment: cohesins subunits (SMC1, SMC3 and RAD21), mediator subunits including the central protein MED14, and CDK subunits (MED12, MED13, Cyclin C and CDK8). Requirement of all these proteins is independent of the cell cycle. Furthermore we show that recrutement of OGG1 is essential for its 8-oxoG repair function. Microscopy studies revealed recruitment and colocalization of two mediator subunits (MED12 and CDK8) with OGG1 on euchromatin domains after an oxidative stress. Finally, the association between OGG1 and its partners, specifically after an oxidative stress, was validated by FLIM-FRET microscopy and co-immunoprecipitation.To conclude, these results show for the first time a link between repair of oxidized bases and mediator and cohesin complexes, both of them being already involved in other DNA repair pathways. The identification of molecular mechanisms and new factors involved in the repair of oxidized bases may ultimately provide new elements for the management of diseases such as cancer and neurodegenerative diseases.

Dans le contexte de la chimiothérapie, la réparation de l’ADN réduit les dommages induits par les agents alkylants de l’ADN dont le témozolomide (TMZ), conduisant à la chimiorésistance. Une des voies principales de réparation de l’ADN est la voie par excision de base (BER) au sein de laquelle une enzyme clée, APE1 (endonucléase AP 1), clive les sites abasiques générés suite aux traitements par les agents alkylants et initie la réparation de la coupure simple-brin. Ce mécanisme représente une source majeure de chimiorésistance dans certains cancers. Plusieurs études ont ainsi validé la voie BER et plus particulièrement APE1 comme une cible importante dans le but d’améliorer l’efficacité des agents anticancéreux; pour ces raisons, de nombreux inhibiteurs d’APE1 ont été développés. Cependant, à la place d’une inhibition directe de l’enzyme, une stratégie alternative consiste à cibler le substrat de cette dernière : les sites abasiques. Les composés macrocycliques de type naphtalénophane ont montré la capacité à se lier fortement et sélectivement aux sites abasiques. Ce processus interfère avec la reconnaissance de ces derniers par APE1 et conduit in vitro à deux effets : l’inhibition du clivage enzymatique d’APE1 et le clivage du site AP par les macrocycles par un mécanisme différent de celui d'APE1, de type β-élimination. Ainsi, une nouvelle série de naphtalénophanes fonctionnalisés, composée de neuf nouveaux dérivés, a été synthétisée et étudiée. La plupart des macrocycles démontre la capacité à se lier fortement et sélectivement aux sites abasiques de l’ADN ainsi qu’à inhiber l’activité d’APE1 in vitro, avec des constantes d’inhibition s'étalant de 39 nM à 25 µM. De plus, l’activité d’inhibition d’APE1 par les ligands, caractérisée par les valeurs de Kı, a pu être corrélée avec leur affinité et leur sélectivité pour les sites abasiques. La structure moléculaire des macrocycles montre une forte influence sur l’activité de clivage de ces derniers pouvant conduire à une abolition ou à une très haute activité de clivage des sites abasiques. De façon intéressante, la formation d’un adduit covalent ADN – ligand avec un des macrocycles a été caractérisée. Enfin, l’activité biologique des naphtalénophanes sur la lignée cellulaire de glioblastome T98G résistante au TMZ a été étudiée. La plupart des ligands affiche une cytotoxicité élevée, avec des GI₅₀ de l’ordre du micromolaire. De plus, un remarquable effet synergique lors du traitement des cellules avec le TMZ et le MMS en combinaison avec un ligand (2,7-BisNP-O4Me) a été démontré. Ce macrocycle augmente également le nombre de sites abasiques et le nombre de coupures double-brins après un co-traitement cellulaire avec les agents alkylants suggérant ainsi l'inhibition d'APE1 attendue. Ces résultats mettent ainsi en évidence le fort intérêt thérapeutique de ce composé. / In the context of chemotherapy, DNA repair reduces the DNA damage induced by DNA-alkylating drugs such as temozolomide, leading to chemoresistance. One of the most important pathways of DNA repair is Base Excision Repair (BER), where a key enzyme, APE1 (AP endonuclease 1), cleaves abasic sites generated following treatment with DNA-alkylating drugs and initiates the repair of the single-strand break. The DNA repair activity of APE1 was identified as the major source of chemoresistance in certain cancers. Several studies validated the BER pathway and, particularly, the APE1 enzyme as important drug targets for improvement the efficacy of anti-cancer drugs; for this reason, several APE1 inhibitors have been developed. However, instead of direct inhibition of the enzyme, an alternative strategy can rely on targeting its substrate: the AP sites in DNA. Macrocyclic compounds, namely naphthalenophanes, show a strong and selective binding to abasic sites in the DNA. This process interferes with the recognition of the latter by APE1 and leads in vitro to two effects: inhibition of the APE1-induced DNA cleavage and macrocycle-induced DNA cleavage by a mechanism different from that of APE1, namely β-elimination. Herein, a novel serie of functionalized naphthalenophanes, composed of nine novel derivatives, has been synthesized and studied. Most ligands demonstrate a strong and selective binding to AP-sites in DNA and an inhibition of APE1 activity in vitro, with inhibitory constants from 39 nM to 25 µM. Moreover, the inhibitory activity of ligands, as characterized by Kı values, could be directly related to their affinity and selectivity to AP-sites. The molecular design of macrocycles has a crucial influence on their intrinsic AP-site cleavage activity leading either to total abolition, or to an exceptionally high AP-site cleavage activity. Interestingly, an unprecedented formation of a covalent DNA-ligand adduct with one of the ligands have been characterized. Finally, the biological activity of naphthalenophanes was assessed in the TMZ-resistant glioblastoma cell line T98G. Most compounds are highly active, with GI₅₀ values in sub-micromolar or low-micromolar range. In addition, a remarkable synergic effect upon co-treatment of TMZ or MMS with one ligand (2,7-BisNP-O4Me) was demonstrated. This ligand was found to increase the number of AP-sites and the number of double-strands break in DNA upon co-treatment with TMZ and MMS suggesting APE1 inhibition as excepted. These observations highlight the hight therapeutic interest of this compound.

Les télomères sont des structures nucléoprotéiques spécialisées dont l'un des rôles est d'empêcher le raccourcissement progressif de l'extrémité des chromosomes suite à la réplication et à l'instabilité génomique due à la recombinaison de l'extrémité de chromosomes. Malgré le rôle des télomères dans la protection de l'extrémité des chromosomes contre les mécanismes de réparation de l'ADN et de recombinaison, de nombreuses protéines de ces voies jouent des rôles essentiels dans l'homéostasie télomérique et la stabilité des chromosomes. Parmi elles, la protéine RAD50 appartenant au complexe MRE11/RAD50/XRS25(NBS1) et l'endonucléase structure spécifique XPF/ERCC1 sont localisées aux télomères ; ces deux complexes connus pour leur rôle dans les voies de réparation de l'ADN ainsi que dans les études sur la recombinaison. Nous avons identifié deux rôles différents pour la protéine RAD50 dans la maintenance télomérique et dans la protection des extrémités des chromosomes, en contexte de présence et absence de la télomérase. L'absence d'AtRAD50 augmente significativement le nombre de fusions chromosomiques impliquant des télomères raccourcis. Nous proposons que ce rôle protecteur des télomères raccourcis de RAD50 est le résultat de sa fonction de contraindre la recombinaison entre chromatides soeurs et ainsi d'éviter les évènements de fusions par les extrémités. Nous avons recherché le ou des mécanismes impliqué(s) dans ces évènements de fusions chromosomiques chez les mutants atrad50 en réalisant des croisements entre les plantes déficientes pour ATRAD50 et des plantes déficientes pour des gènes codant des protéines des voies de réparation par recombinaison non-homologue et homologue. Au contraire de la situation en cellules de mammifères, nous n'avons pas observé d'instabilité chromosomique chez les plantes mutantes correspondantes pour XPF (AtRAD1) or ERCC1 (AtERCC1). Cependant, en absence de la télomérase, la mutation de l'un de ces deux gènes entraîne une augmentation précose et significative de l'instabilité chromosomique sans accélération générale de la perte des répétitions télomériques, mais associée à la présence de fragments ADN extrachromatiques visibles en cytologie. Une analyse intensive par FISH a permis d'identifier ces ADN comme des bras entiers spécifiques de deux chromosomes. Nos données indiquent un rôle protecteur de RAD1/ERCC1 comme l'invasion de l'ADN simple brin télométrique dans des séquences télomériques interstitielles. Le fait que les mutations de rad1 (ou ercc1) augmentent dramatiquement l'instabilité chromosomique des mutants télomérase a des implications très importantes pour les modèles des rôles de la recombinaison aux télomères.

Les rayons UV du soleil causent une variété de dommages dans l'ADN, parmi lesquels les dimères cyclobutilyques de pyrimidines (CPD) sont considérés comme hautement toxiques et dommageables pour un organisme. Par conséquent, il est important de comprendre comment la machinerie de réparation par excision des nucléotides (la NER), assure la réparation in vivo des CPD présents dans l'ADN empaqueté sous forme de chromatine. Il est connu que la présence du nucléosome inhiberait la NER, mais les détails fonctionnels demeurent mal compris, de même que les mécanismes cellulaires nécessaires pour contourner cette inhibition offerte par la chromatine. Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, les gènes SIR (SIR1, SIR2, SIR3 et SIR4 ) permettent la formation d'une structure hétérochromatique sur le locus du type sexuel et les télomères. Cependant, l'impact de cette hétérochromatine sur la réparation des CPD est très peu étudié.Les travaux présentés dans cette thèse de doctorat ont permis de caractériser l'impact des gènes SIR dans la survie des cellules après irradiation aux rayons UV, de même que dans la réparation de l'ADN des régions hétérochromatiques. Premièrement, à l'aide d'une méthode basée sur le suivi de la croissance en milieu de culture liquide, nous avons démontré que les mutants sir[delta] sont plus résistants aux rayons UV par rapport aux cellules de types sauvages. Ce phénotype serait relié à l'effet de pseudo-diploïdie présent dans ces mutants, et plus précisément à la recombinaison homologue en phase G2/M du cycle cellulaire.Les protéines Sir ne joueraient donc pas un rôle directement dans la réparation des CPD. Par la suite, nous avons procédé à l'analyse de la cinétique de réparation de l'ADN du locus du type sexuel et des télomères dans des cellules de type sauvage et des mutants si2r[delta], sir3[delta], et rad26[delta] . À partir des résultats obtenus, nous avons pu tirer différentes conclusions préliminaires laissant croire que la présence de l'hétérochromatine faite par les protéines Sir n'inhiberait pas davantage la réparation par rapport à la présence des nucléosomes, du moins dans les régions sous-télomériques. De plus, nos résultats démontreraient que la réparation couplée à la transcription pourrait jouer un rôle important dans la réparation de ces régions. Ces hypothèses devront évidemment être testées.

L'ADN subit en permanence des agressions modifiant l'information pour laquelle il code. Plusieurs mécanismes, dont la réparation par excision de bases (BER) et la réparation par excision de nucléotides (NER), permettent à la cellule de restaurer la séquence de l'ADN. Le Xeroderma pigmentosum est une maladie caractérisée par une déficience pour la réparation par la voie NER. L'objectif de ce travail était de proposer un test fiable et rapide pour le diagnostic de cette maladie comme alternative au test existant, l'UDS. Les activités de réparation de l'ADN de lignées XP ont été quantifiées à l'aide de tests in vitro miniaturisés et multiparamétriques afin d'établir les phénotypes de réparation de l'ADN de cellules déficientes pour la protéine XPA ou XPC. L'avantage des tests utilisés dans cette étude réside dans la mesure conjointe soit de l'excision soit de l'excision-resynthèse (ER) de plusieurs lésions à partir d'un seul lysat cellulaire. <br />Nous montrons que l'importance relative de l'ES des différentes lésions dépend fortement de la concentration protéique du lysat nucléaire testé. Ainsi, lorsque la concentration protéique augmente, il devient possible de discriminer le phénotype XP du phénotype témoin, ce qui est impossible en dessous d'une concentration seuil. D'autre part, alors que l'irradiation des cellules témoins aux UVB stimule leurs activités de réparation, cet effet n'est pas observé pour les cellules XP.<br />Cette étude apporte donc de nouvelles informations quant aux rôles des protéines XPA et XPC lors des mécanismes de réparation BER et NER et souligne la complexité des régulations mises en jeu.

L'objectif de ce travail est de mieux comprendre le mécanisme intime de réparation de lésions photoinduites de l'ADN (dimères de type cyclobutane et adduits pyrimidine (6-4) pyrimidone) par les enzymes redox de type photolyase, en utilisant les outils et les concepts de l'électrochimie moléculaire.<br />L'étude par voltamétrie cyclique de modèles des lésions de type cyclobutane nous a permis d'une part de mimer l'étape clef de la réparation enzymatique (transfert d'électron dissociatif) et d'autre part de suivre dans le temps la réparation des lésions modèles par la photolyase ADN d'Escherichia coli. A partir des résultats obtenus, nous avons pu discuter le mécanisme de réparation, en particulier le caractère concerté ou séquentiel des réactions à l'oeuvre.<br />Le mécanisme de réparation des adduits (6-4) n'est pas encore élucidé mais une voie possible implique comme précédemment un transfert d'électron couplé à la coupure de deux liaisons vers la forme fermée des lésions (oxétanes). L'étude par voltamétrie cyclique d'une part de la réduction et de l'oxydation d'oxétanes modèles et d'autre part de leur réparation par la photolyase ADN d'E. coli nous a permis de rassembler une série de preuves expérimentales qui confirment le mécanisme initialement proposé et permettent de mieux le comprendre.

Les tumeurs primitives du système nerveux central les plus fréquentes sont les gliomes et se classent en deux grandes catégories : les astrocytomes et les oligodendrogliomes. La survie des patients porteurs d'oligodendrogliomes est de 70 % à 5 ans alors qu'elle ne dépasse pas une année en moyenne pour les glioblastomes. La divergence de pronostic observée entre ces deux types de gliomes résulte d'une différence de sensibilité aux traitements conventionnels. La chimiothérapie classique appliquée à ces tumeurs permet en effet d'obtenir une réponse pour 90 % des oligodendrogliomes contrastant avec moins de 10 % pour les glioblastomes. La chimio-sensibilité particulière des oligodendrogliomes peut être la conséquence des altérations géniques survenant lors du processus oncogène. Elle résulterait de l'absence d'expression de gènes de résistance des régions chromosomiques 1p et 19q, gènes ainsi distinctement exprimés entre les deux entités tumorales. Les gènes de réparation de l'ADN peuvent rendre compte de la résistance aux traitements, puisque responsables de la correction des adduits créés par la chimiothérapie. Nous avons recherché grâce à une évaluation fonctionnelle in vitro, quels gènes de réparation de la région 1p/19q sont impliqués dans la correction des adduits du CDDP. Quatre gènes ont ainsi été identifiés : ercc1, ercc2, mutyh et pnkp. Ces résultats ont été vérifiés avec du témozolomide, la drogue de référence dans le traitement des gliomes. L'expression des ces gènes a été mesurée dans des extraits de tumeurs de patients, résistantes (glioblastomes) et sensibles (oligodendrogliomes) à la chimiothérapie, et les 3 premiers sont effectivement surexprimés dans les glioblastomes. Ces gènes définissent ainsi les cibles d'un traitement chimio-sensibilisant. Nous avons entrepris l'étude préclinique de ce traitement basé sur l'utilisation concomitante de siRNA dirigés contre les gènes d'intérêt et de chimiothérapie. Des modèles de gliomes humains sous-cutanés et intra-cérébraux résistants à la chimiothérapie ont été utilisés chez les souris. Le traitement chimio-sensibilisant ciblant ercc1 a significativement augmenté l'effet du témozolomide sur les tumeurs, permettant ainsi de diminuer leur volume. Il pourrait faire prochainement l'objet d'essais cliniques. Nos travaux, menés de l'in silico au stade préclinique, d'une part démontrent la validité de notre hypothèse, c'est-à-dire l'implication des gènes de réparation du 1p/19q dans la chimio-résistance, et conduisent surtout à une opportunité thérapeutique nouvelle de chimio-sensibilisation.

A l'origine de l'hématopoïèse se trouve les cellules souches hématopoïétiques (CSH). Elles constituent un pool de cellules rares présentes dans la moelle osseuse aux niveaux de zones particulières de l'os appelées niche. Les cellules de la niche produisent des cytokines, telles que la thrombopoïétine (TPO), qui régulent les CSH en contrôlant leur quiescence et leur auto-renouvellement. Peu de choses sont connues sur les mécanismes mis en place par la CSH et son environnement pour faire face aux dommages de l'ADN, notamment induits lors de radio- ou chimio-thérapies. Durant cette étude, nous avons mis en évidence un nouveau rôle de la TPO et de son récepteur Mpl dans la réparation de l'ADN des CSH en réponse à des stress génotoxiques. Les CSH déficientes ou haplo-insuffisantes pour Mpl, ou les CSH sauvages et cultivées en absence de TPO, présentent un défaut de réparation et une instabilité génomique. En réponse à l'irradiation, la TPO potentialise l'activation de la voie NF-kB qui permet l'induction du gène précoce Iex-1. La TPO est également l'activateur majeur de la voie ERK dans les CSH. IEX-1 et pERK forment un complexe tripartite avec DNA-PK, une protéine clé de la voie Non Homologous End Joining (NHEJ). La DNA-PK est fortement activée par la TPO, ce qui augmente la fidélité et l'efficacité de la voie NHEJ et permet d'améliorer l'intégrité génomique des CSH. Par ailleurs, nous montrons qu'une simple injection de TPO ou de son agoniste Romiplostim, avant irradiation ou injection de doxorubicine, limite la mutagénèse des CSH et leur perte de fonction associée. Cet effet est spécifique de la TPO, d'autres cytokines comme le SCF et le Flt3-L, n'ont aucun effet sur la réparation. Ces résultats montrent que la TPO contrôle directement les voies de signalisation aboutissant à la réparation de l'ADN des CSH. Ils ouvrent des perspectives nouvelles pour l'utilisation des agonistes de la TPO comme adjuvant protecteur avant radio- ou chimiothérapie pour minimiser les risques de développement de leucémies aigües myéloïdes secondaires. L'expression de Mpl étant haploinsuffisante pour la fonction de réparation de l'ADN, ces résultats suggèrent que Mpl pourrait être tumeur suppresseur en réponse aux traitements chimio-ou radio-thérapeutiques.