Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

L’édition du génome repose sur la création de cassures double brin à un endroit précis du génome à l’aide de nucléases artificielles (ZFN, TALEN, CRISPR/Cas9) et sur les différents systèmes de réparation que la cellule va mettre en place pour réparer ces dommages. Les deux systèmes de réparation principaux sont le NHEJ (Non Homologous End Joining) et la RH (Recombinaison Homologue). Le NHEJ consiste en une ligation directe des extrémités de la coupure pouvant induire de petites insertions ou délétions avant la ligation. Ces mutations, si elles sont introduites dans un exon, vont modifier le cadre de lecture et pouvoir inactiver le gène cible (Knock Out). La RH permet la réparation de la cassure en recopiant les informations présentes sur la chromatide soeur. Si un ADN exogène comportant des homologies avec la séquence à réparer est inséré avec les nucléases artificielles, la cellule peut le prendre comme matrice de réparation, il est ainsi possible d’insérer n’importe quelle mutation ou transgène de manière précise (Knock In). Ici, différentes stratégies ont été développées pour optimiser ces approches d’édition du génome. Le couplage du domaine Nter de la protéine CtIP à la nucléase Cas9 permet d’augmenter le taux d’insertion par homologie d’un transgène au site de coupure. Le couplage de l’exonucléase Trex2 à la nucléase Cas9 nickase permet quant à lui d’augmenter le taux de mutation après coupure. Ces nouvelles approches peuvent être largement utilisées et permettent de faciliter l’édition du génome. / Genome editing relies on the ability of artificial nucleases (TALEN or CRISPR/Cas9 system) to induce double strand break into a precise and unique sequence in a whole genome and on the different DNA repair system. The two major DNA repair systems are NHEJ (Non Homologous End Joining) and HR (Homologous Recombination). NHEJ consists on DNA end direct ligation. This system can lead to deletion or insertion at the cut site. These mutations, when induced in an exon, can induce reading frame change and gene inactivation (Knock out). HR consists on the use of sister chromatid to copy lost information in order to complete the double strand break. If an exogenous DNA with homologies with the targeted DNA is inserted with artificial nucleases, it can be used as a template and can permit to introduce any transgene at the cut site (Knock In). In this work, different strategies were used to optimize genome editing. By fusing Nter part of CtIP to Cas9, the KI rate of an exogenous DNA is increased and by fusing Trex2 exonuclease to Cas9, the mutation rate induced is also increased. These two approaches can be widely used to improve genome editing strategies.

Le génome humain est constamment la cible d'agents qui endommagent l'ADN. Ces dommages sont multiples et variés tels que les cassures simple et double brin (DSB). Les DSBs sont des lésions très toxiques dont l'origine peut être multiple. Les cellules de mammifères réparent les DSBs en utilisant deux mécanismes principaux, la recombinaison homologue (RH) qui est dépendante du cycle cellulaire et utilise la chromatide sœur comme matrice de réparation et la jonction des extrémités non homologues (NHEJ) qui est indépendante du cycle cellulaire et consiste en la ligation des extrémités d'ADN endommagées. Cette réparation a lieu dans un contexte chromatinien qui nécessite un dynamisme pour rendre accessible les sites lésés aux différentes machineries de réparation. Lors de mes travaux, j'ai étudié le remodeleur de la chromatine p400 ainsi que le variant d'histone H2A.Z qui sont deux protéines impliquées dans la dynamique de la chromatine, afin de comprendre leur rôle dans les mécanismes de réparation des DSBs et la stabilité du génome. p400, une ATPase de la famille SWI2/SNF2 participe à l'incorporation du variant d'histone H2A.Z dans la chromatine. Au cours de ma thèse, j'ai montré que la déplétion par siRNA du variant d'histone H2A.Z, dans la lignée d'ostéosarcome humain (U2OS) et dans des fibroblastes humains immortalisées, n'a pas d'effets sur la réparation des DSBs. Ces résultats sont corrélés avec une absence de recrutement de H2A.Z au niveau des cassures après étude par micro irradiation laser ou par immunoprécipitation de chromatine. Cependant, la déplétion de H2A.Z affecte la prolifération cellulaire en influençant l'efficacité de clonage et le cycle cellulaire. L'autre partie de mes travaux a mis en évidence que l'ATPase p400 est un frein à l'utilisation de la voie alternative de jonction des extrémités (alt-EJ) qui est un processus de réparation des DSBs très mutagène. L'augmentation des événements du NHEJ-Alternatif et la génération d'instabilité génétique observés lors de la déplétion de p400 par siRNA semblent tributaires de la résection des DSBs par CtIP. Ces résultats indiquent que p400 joue un rôle post-résection dans les étapes plus tardives de la RH. De plus, la déplétion de p400 conduit au recrutement de la polyADP ribose polymérase (PARP) et de l'ADN ligase 3 à la DSB, ce qui provoque la mort sélective de ces cellules lors d'un traitement par des inhibiteurs de PARP. Ces résultats montrent que P400 agit comme un frein pour empêcher l'utilisation du NHEJ-Alternatif et donc l'instabilité génétique. / The human genome is constantly targeted by DNA damaging agents. These damages are many and varied, such as single and double strand breaks (DSBs). The DSB are highly toxic lesions whose origin can be multiple. Mammalian cells mainly use two DNA repair pathways to repair DSB, homologous recombination (RH), which is dependent on the presence of the intact homologous copy (the sister chromatid) and on the cell cycle stage and the non-homologous end joining (NHEJ) pathway, which is cell cycle independent and performs direct ligation of the two DNA ends. The repair of DNA damage takes place in a chromatin context that needs to be remodeled to give access to damaged sites. During my work, I studied the chromatin remodeler p400 and the histone variant H2A.Z both involved in chromatin remodeling, to understand their role in DSB repair and genome stability. p400, an ATPase of the SWI2/SNF2 family is involved in the incorporation of H2A.Z in chromatin. I have shown that H2A.Z depletion in the osteosarcoma cell line U2OS and in immortalized human fibroblasts did not alter DSB repair. These results are correlated with the lack of H2A.Z recruitment at DSB observed after local laser irradiation or Chromatin Immunoprecipitation. However, H2A.Z depletion affects cell proliferation and the cell cycle distribution. In addition, I have shown that the chromatin remodeler p400 is a brake to the use of alternative End Joining (alt-EJ) which is a highly mutagenic repair process. The increase in alt-EJ events observed in p400-depleted cells is dependent on CtIP- mediated resection of DNA ends. Moreover, p400 depletion leads to the recruitment of poly(ADP) ribose polymerase (PARP) and DNA ligase 3 at DSB, leading to selective cell killing by PARP inhibitors. Altogether these results show that p400 acts as a brake to prevent alt-EJ dependent genetic instability and underline its potential value as a clinical marker.

Les travaux présentés dans ce document retracent mes activités de Recherche dans le domaine de la Biologie Cellulaire et Moléculaire, qui m'ont conduit de la Toxicologie Génétique à la Radiobiologie. L'action des génotoxiques sur le patrimoine héréditaire a toujours constitué le fil conducteur de mes activités. A chaque étape de mon parcours, j'ai développé des modèles biologiques destinés à répondre à des thématiques bien précises. <br />Mon travail de recherche a commencé pendant deux ans à Rhône Poulenc (1985 1986) par le test de la réparation de l'ADN in vitro et in vivo (UDS ou unscheduled DNA synthesis) sur hépatocytes de rats Sprague Dawley et Fischer 344. Ce test de « dommages primaires » permet de prédire l'activité génotoxique des xénobiotiques. Dans l'approche in vivo, mon étude mettait en évidence l'importance du métabolisme intestinal dans l'activation métabolique de certains agents génotoxiques indirects (dérivés dinitrotoluène). J'ai ensuite débutée une approche plus fondamentale au CNRS (1988 1992). En utilisant les outils de la Génétique Moléculaire, j'ai créé un nouveau modèle cellulaire exprimant un système de régulation génique qui permet de détecter rapidement les agents modifiant le profil de méthylation de l'ADN au niveau des sites 5'CpG3'. Ces xénobiotiques, à l'origine des « épimutations » et de la dérégulation de l'expression de certains gènes, ont une contribution importante et souvent sous estimée dans la progression tumorale.<br />En 1992, je me suis orienté vers la Radiobiologie au DKFZ (Deutsches Krebsforschungszentrum ; Heidelberg, Allemagne) puis au CEA (LRA). Il s'agissait d'adapter à la Radiobiologie le modèle de culture de la peau humaine reconstituée in vitro, destiné auparavant à étudier la physiologie des kératinocytes normaux ou pathologiques. L'objectif était (i) d'irradier les spécimens de peau et d'étudier les effets d'une irradiation sur les kératinocytes et les fibroblastes), et (ii) de mimer in vitro la fibrose radioinduite. Ce modèle de culture alternatif prend en compte les interactions entre cellules épithéliales et mésenchymateuses. Au cours de ce travail, je me suis intéressé à la protéine humaine HSAkin17. Mon activité s'est alors recentrée sur cette protéine. Le développement de nombreuses approches cellulaires et moléculaires au laboratoire (LGR) nous a permis de mettre en évidence l'implication de cette protéine dans la réplication de l'ADN, notamment lorsque la progression des fourches de réplication est bloquée par des dommages non réparés de l'ADN. Nous avons démontré que cette protéine était un composant nécessaire au complexe de réplication de l'ADN et qu'elle avait une activité de reconnaissance des origines de réplication endogènes.<br />Depuis la fin 2003, j'ai développé et valider les vecteurs pEBVsiRNA pour une interférence ARN (RNAi) à très long terme (> 500 jours). Ce travail a été mené sur de nombreux gènes (110 gènes ciblés), essentiellement des gènes de la réparation de l'ADN. Un brevet a été déposé en 2005. Cette approche nous permet maintenant de travailler sur les interconnexions entre les mécanismes de réparation de l'ADN dans des lignées isogèniques. A ce jour, je suis le seul à proposer un tel modèle cellulaire cohérent avec un aussi grand nombre de clones stables, maintenus en culture aussi longtemps. La création de clones silencieux, stables à très long terme, m'a permis de participer à l'élaboration de nouveaux projets de Recherche dans le cadre de nombreuses collaborations, dont certaines seront énoncées dans ce rapport. Par ailleurs, ma démarche a aboutit à une valorisation industrielle.

Le facteur TFIIH est un facteur multi-protéique impliqué, via ses dix sous-unités, dans la transcription des gènes de classe II et dans la réparation de l'ADN. Chez l'homme, des mutations dans les gènes codant pour des hélicases XPB et XPD de TFIIH sont à l'origine de trois maladies: le Xeroderma Pigmentosum, la Trichothiodystrophie et le Syndrome de Cockayne. Au cours de mes études doctorales, je me suis intéressée aux liens entre la structure et la fonction du facteur TFIIH humain. Nous avons observé le complexe TFIIH produit sous forme recombinante dans les cellules d'insectes en microscopie électronique et sa structure est identique à celle du facteur endogène. Nous y avons ensuite intégré les données biochimiques d'interaction protéine-protéine et nous proposons un modèle général de l'architecture du complexe. Afin de comprendre le rôle de TFIIH dans l'initiation de la transcription ou dans la réparation de l'ADN, nous avons développé une nouvelle technologie visant à observer les complexes ADN-protéine en microscopie. Nous avons également déterminé un modèle en cryomicroscopie du facteur TFIIE, qui interagit physiquement avec TFIIH, à une résolution de 1.6nm. Finalement, nous avons obtenu des cristaux de l'homologue de l'hélicase XPD chez une archaebactérie.

Dans les cellules cancéreuses, des défauts affectant l'organisation d'ADN en chromatine sont fréquemment observés. L'étude de facteurs impliqués dans cette organisation est donc essentielle pour mieux appréhender leur implication dans la tumorigénèse. Un facteur particulièrement intéressant dans ce contexte est le facteur d'assemblage de la chromatine, le complexe CAF-1 (Chromatin Assembly Factor 1). CAF-1 est impliqué dans l'assemblage en chromatine de l'ADN lors de la réplication et la réparation de l'ADN. Deux sous-unités de CAF-1 sont sous-exprimés dans les cellules non-proliférantes (quiescentes) et constituent des marqueurs de prolifération dans le cancer. De plus, CAF-1 a un rôle au niveau des régions de chromatine dense proches des centromères, l'hétérochromatine péricentrique, par son interaction avec les protéines HP1 (Heterochromatin Protein 1). Il existe trois isoformes de HP1 dans les cellules mammaires (HP1α, β et γ), dont HP1α est le plus spécifiquement associé aux régions d'hétérochromatine péricentrique, impliqués dans la répression des gènes et la ségrégation des chromosomes. Pendant ma thèse, je me suis penchée sur deux questions majeures: Premièrement, est- ce que l'expression des isoformes de HP1 est régulée d'une façon dépendante de la prolifération et de la tumorigénèse ? En combinant des modèles de lignées cellulaires et des échantillons de tissu humain, j'ai pu montrer que l'expression de l'isoforme HP1α, mais pas HP1β ou γ, est dépendante de la prolifération. La déplétion de HP1α, spécifiquement, affecte le passage de la mitose. De plus, HP1α, mais pas HP1β ou γ, est surexprimé dans de nombreux types de cancer comparé aux tissus sains correspondants. La surexpression de HP1α dans le cancer du sein est corrélée de façon significative à la survie des patientes et la formation de métastases. Ces résultats révèlent HP1α comme un marqueur pronostique dans le cancer du sein et potentiellement dans d'autres types de cancer. Nous proposons que la surexpression de HP1α présente un avantage sélectif pour les cellules cancéreuses, liée à l'organisation de l'hétérochromatine péricentrique et le passage de la mitose. Ces résultats ont donné lieu à un brevet et à une publication dans EMBO Molecular Medecine. La seconde question à laquelle je me suis intéressée est : comment des cellules quiescentes, qui expriment peu de CAF-1, gèrent l'assemblage de la chromatine couplé à la réparation de l'ADN ? En effet, une capacité de réparation différente entre cellules proliférantes (tumorales) et quiescentes (saines) aura un impact majeur sur l'efficacité et la toxicité des traitements génotoxiques comme la chimio- et la radiothérapie. J'ai pu montrer que, dans les cellules quiescentes, les irradiations aux ultra-violets (UV) n'induisent pas l'expression de CAF-1. De plus, la faible quantité de CAF-1 est recrutée aux sites des lésions d'UV, suggérant que sa fonction dans la réparation est conservée hors du cycle cellulaire. Cependant, en quiescence, nous observons une réparation retardée d'un type spécifique de lésions, qui reflète potentiellement une difficulté des cellules quiescentes à gérer la prise en charge de ces lésions au sein de la chromatine. Ces résultats font l'objet d'un manuscrit actuellement en préparation. Dans ces deux projets majeurs, j'ai mis en avant comment des facteurs de l'organisation de la chromatine peuvent être impliqués dans la prolifération, la tumorigénèse et la réparation d'ADN suite à des traitements génotoxiques. De plus, nous avons pu proposer un nouvel outil d'intérêt médical pour le pronostique des cancer du sein.

La différenciation des lymphocytes T dans le thymus est strictement contrôlée par le réarrangement des gènes codants pour les chaînes du TCR et leur expression en surface dans le cadre du pré-TCR ou du TCR. Les souris incapables d'assembler un pré-TCR présentent un blocage précoce du développement des thymocytes. Nous avons montré que l'irradiation de souris CD3ε-/-, qui sont déficientes en pré-TCR, restaure la différenciation des thymocytes par des voies différentes selon que p53 soit présente ou non. En réponse à l'irradiation, il existe une dissociation temporelle de l'activation des voies de signalisations contrôlant plusieurs événements co-régulés durant le développement des thymocytes. Ces voies sont cependant toutes deux centralisées au niveau de LAT. L'irradiation induit donc des voies de signalisations mimant les effets de l'activation du pré-TCR.<br />La différenciation radio-induite des thymocytes immatures s'accompagne du réarrangement de novo des gènes TCRA. L'étude des jonctions signal (JS) formées lors du réarrangement des gènes TCRA ne montre pas de différences de structure entre les JS de souris sauvages ou les JS formées suite à l'irradiation. Le réarrangement TCRA radio-induit est donc probablement l'œuvre de la machinerie de recombinaison traditionnelle. Contrairement au modèles actuels de recombinaison V(D)J les JS de souris sauvages analysées présentent des modifications, quels que soient les gènes réarrangés. Nous avons pu montrer une influence de plusieurs protéines impliquées dans la réparation de l'ADN et le maintient de la stabilité du génome sur la structure des JS. Nous proposons que ces modifications ne sont pas le résultat d'un processus de recombinaison aberrant mais constituent une propriété intrinsèque de la recombinaison. <br />Nos travaux permettent donc une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires de la recombinaison V(D)J.

La réparation de l'ADN est un processus cellulaire très important comme le montre son implication dans de nombreuses maladies génétiques et la carcinogenèse. Les mécanismes des différents systèmes de réparation présentent des interactions et des complémentarités. Les tests fonctionnels utilisés jusqu'alors pour étudier les activités de réparation ne prennent pas en compte toute cette complexité.<br />Nous avons développé un test in vitro offrant une mesure parallélisée, fonctionnelle et spécifique d'activités enzymatiques de réparation de l'ADN. Pour ce faire, nous avons adapté un test d'excision resynthèse au format biopuce.<br />Nous avons mis au point les différentes étapes du test : la fabrication de la biopuce, la normalisation et l'analyse des données, les conditions de réactions biologiques. Nous avons ensuite validé le test en démontrant que nous mesurions des activités enzymatiques de réparation. Enfin deux expériences applicatives de ce test ont été réalisées. Nous avons tout d'abord mis en évidence la similitude des profils de réparation de trois souches de fibroblastes humains issus de cultures primaires, mais aussi les différences des capacités de réparation qu'il existe entre les fibroblastes, kératinocytes, et cellules mononuclées du sang périphérique. Par la suite, nous avons démontré que la réparation de l'ADN est impliquée dans la réponse adaptative des cellules au rayonnement ionisant. <br />Les applications futures de ce test sont importantes, tant en recherche fondamentale qu'appliquée pour le criblage de molécules, ou encore dans le domaine diagnostic.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Lors de la vie, des mécanismes de réparation de l'ADN sont mis en oeuvre lors d'agressions, pour protéger le génome. La réparation par excision de nucléotides (NER) est l'un de ces mécanismes. Des mutations des facteurs NER sont à l'origine de 3 maladies génétiques humaines: Xeroderma pigmentosum (XP), la trichothiodystrophie (TTD) et le syndrome de Cockayne (CS). Certains de leurs signes cliniques ne sont pas expliqués par un défaut de réparation de l'ADN. Des études suggèrent que ces facteurs interviennent dans d'autres processus, notamment lors de l'expression des gènes. Durant ma thèse, je me suis intéressé aux rôles des facteurs NER dans la transcription. En effet, j'ai montré que ces facteurs, dit de réparation, étaient recrutés avec la machinerie transcriptionnelle au niveau du promoteur et du terminateur de gènes activés. Ils influencent l'environnement chromatinien des gènes activés (boucles de chromatine et modifications post-­‐ traductionnelles des histones). Ma thèse apporte une meilleure compréhension du processus de transcription des gènes activés, permettant de mieux comprendre certaines anomalies associées aux yndromes XP, CS et TTD.