Le traitement utilisé actuellement contre le virus de l’hépatite C présente une efficacité limitée et induit d’importants effets secondaires. La délivrance de molécules antivirales spécifiquement dans les cellules infectées devrait permettre d’améliorer leur efficacité.Ce travail présente le développement d’une nouvelle approche utilisant à son profit la machinerie de réplication virale pour délivrer une molécule antivirale aux seules cellules infectées. Cette stratégie repose sur l’utilisation d’ARN non codants réplicables (nrRNA) portant les structures reconnues par le complexe de réplication du VHC, encadrant la séquence complémentaire d’un gène antiviral. Le complexe de réplication du VHC réplique le nrRNA comme s’il s’agissait du génome viral, permettant ainsi la synthèse d’un ARN codant à partir duquel la molécule antivirale est exprimée. Les cellules non-infectées n’exprimant pas le complexe de réplication, cette machinerie spécifique peut être utilisée et détournée, de façon à cibler les cellules infectées sans impact sur les cellules saines.Nous montrons ici que cette approche s’avère efficace contre le réplicon (génotype 1b) et le virus JFH-1 (génotype 2a) : les nrRNA induisent une forte baisse de la quantité d’ARN et de complexe de réplication viral. Ces effets sont corrélés à une forte activation de la transcription de différents gènes de la réponse IFN de type I.Nous avons également vérifié l’innocuité de ce système sur les cellules non infectée en utilisant des nrRNA RicineA. La réplication et la traduction de ces nrRNA conduit à la mort cellulaire par inactivation des ribosomes. Mais la viabilité des cellules non infectées par le VHC n’est pas perturbée, signe que les nrRNA RicineA ne sont ni répliqués ni traduits en absence du complexe de réplication viral.La vectorisation des nrRNA a également été développée au moyen de particules lentivirales modifiées. Nous testons désormais la réplication et la traduction des nrRNA dans un modèle murin, en vectorisant ces ARN par injection hydrodynamique ou par l’intermédiaire des particules lentivirales. / The current treatment used against Hepatitis C Virus has a limited efficacy and is often hampered by the induction of side-effects. The specific delivery of antiviral proteins in infected cells should increase their efficiency and reduce their impact on healthy cells.Here, we describe the development of a new approach which takes advantage of the viral replication machinery to specifically target the antiviral protein expression to the infected cells. The strategy is based on the delivery of a non-coding replicative RNA (nrRNA) carrying the structures required for the binding of the viral replication complex, flanking the complementary sequence of an antiviral gene. The HCV replication complex replicates the nrRNA similarly to the viral genome to give a coding RNA from which the antiviral protein will be expressed. As non-infected cells do not express the replication complex, this specific machinery can be used to target virus-infected cells without affecting healthy cells.We show that this approach can be successfully applied in both replicon-harboring cells (genotype 1b) and JFH-1 infected cells (genotype 2a) : nrRNAs induced a strong decrease in genomic RNA and viral protein NS5A. These effects were correlated with a strong activation of several interferon stimulated genes.We also verify the harmlessness of the system in uninfected cells by transfecting a RicinA nrRNA. The replication and translation of this nrRNA lead to the cell death by ribosomes inactivation. But nothing occurs in non?infected cells, showing that nrRNA are neither replicated nor translated in absence of the HCV replication complex.The vectorisation of nrRNa was also developed by the use of modified lentivirale particles. We now test the efficient replication and translation of nRNAs in a murin model by using hydrodynamic transfection or the lentiviral delivery of nrRNAs.

Le génome est sans cesse menacé dans sa structure par des stress génotoxiques d’origine endogène (stress oxydant, blocage de la réplication…) ou exogène (irradiations, produits chimiques, métaux lourds…). La voie de réponse aux dommages de l’ADN coordonne un réseau d’événements en cascades qui incluent les points de surveillance du cycle cellulaire, la réplication/réparation/recombinaison de l’ADN et la mort cellulaire programmée. Ces voies collaborent pour assurer la transmission fidèle du génome et empêcher la prolifération des cellules qui aurait accumulé des altérations génétiques. En général, des défauts dans une de ces voies entraînent un changement de sensibilité aux agents génotoxiques, une instabilité génétique et une prédisposition au cancer. La recombinaison homologue (RH) est une voie essentielle pour la réparation de l’ADN ; elle joue un rôle fondamental dans le maintien de la stabilité du génome. Le stress oxydant, résultant d’une augmentation de la concentration intracellulaire de ERO, est une des causes majeures de dommages aux lipides, aux protéines et à l’ADN et pour cela, il représente un défi pour la survie cellulaire et pour la stabilité du génome. Les ERO apparaissent physiologiquement lors de la respiration cellulaire ou résultent d’un stress environnemental, comme l’exposition aux radiations UV ou agents chimiques oxydants. Elles contribuent à certains processus comme la croissance cellulaire, l’activité et au repliement des protéines, la sénescence et la mort cellulaire programmée. Il est important de souligner qu’un état redox altéré est souvent associé à un fonctionnement anormal des cellules, comme il est observé pour les cellules cancéreuses et les cellules sénescentes. L’objectif de ce projet a été d’analyser l’interface entre les voies DDR et SAPK (Stress activated protein kinase) évolutivement conservées et d’en étudier les conséquences sur la stabilité du génome en utilisant comme organisme modèle la levure à fission. Nos résultats montrent que la voie SAPK joue un rôle sur la RH en promouvant la phosphorylation de Rad52, une protéine impliquée dans différentes sous-voies de la RH. Nous avons aussi montré que Rad52 est phosphorylée sur différents acides aminés, parmi lesquels certains sont les cibles de kinases inconnues qui n’ont aucun lien avec la voie SAPK. Nous avons observé que Rad52 est phosphorylée soit après un stress oxydant, soit dans des cellules génétiquement sujettes à des perturbations de la RH. Nous avons identifié deux sites de phosphorylation de la protéine Rad52, dont un seul est dépendant de la voie SAPK. En étudiant la phosphorylation de Rad52 dans les cellules invalidées pour la voie SAPK ou mutées pour un des sites de phosphorylation de Rad52, nous avons pu montrer que la RH est modulée par la voie SAPK même en absence de insulte externe. Notre travail ouvre le chemin vers une nouvelle compréhension des mécanismes fondamentaux du maintien de l’intégrité du génome. / Genomes are routinely submitted to injuries from either endogenous stress (oxidative stress, DNA replication block…) or from exogenous sources (radiations, chemicals, heavy metals…). The DNA damage response (DDR) coordinates a network of pathways including cell cycle checkpoints, DNA replication/repair/recombination, and programmed cell death, ensuring faithful genome transmission and preventing from the proliferation of cells bearing genetic alterations. Defect in one of these pathways generally results in altered sensitivity to genotoxins, genetic instability and cancer predisposition. Homologous recombination (HR) is an essential DNA repair pathway playing pivotal role to maintain genome stability.Oxidative stress, resulting from increased intracellular concentration of ROS, is one of the major causes of lipid, protein and DNA damage, and therefore a challenge for cell survival and genome stability. ROS are generated physiologically as by-products of cellular respiration, or as result of environmental stresses, such as exposure to solar UV radiations or to oxidant chemicals, and they actively participate in processes such as cellular growth, protein activity and folding, senescence and programmed cell death. It is noteworthy that an altered redox homeostasis is often associated to abnormally functioning cells, such as cancer and senescent cells. The aim of this project was to study the interface between two major evolutionarily conserved pathways, DDR and SAPK (Stress activated protein kinase) and the consequences on genome stability using fission yeast as a model organism. We report data showing that SAPK pathway impinges on HR by promoting phosphorylation of Rad52, a key protein involved in all sub-pathways of HR. We also revealed that Rad52 is phosphorylated at multiple different sites some of which are substrate for unidentified kinases unrelated to the SAPK pathway. Rad52 phosphorylation occurs either after oxidative stress or in cells genetically prone to HR perturbation. We identified two sites of phosphorylation, one of which is dependent on functional SAPK pathway. By studying Rad52 phosphorylation in cells mutated in the SAPK pathway or mutated at the Rad52 site of phosphorylation, we showed that HR is modulated by SAPK even in the absence of external insults. Our work pave the way to a novel understanding of fundamental mechanisms required for genome integrity maintenance.

Le virus de la vaccine (VACV) est un grand virus à ADN, modèle du genre orthopoxvirus, et partage plus de 97% d'identité de séquence avec le virus de la variole (VARV), un pathogène humain majeur éradiqué en 1977 grâce au programme de vaccination mondial avec le VACV. Celle-ci ayant été stoppée dans les années 80, un pourcentage significatif de la population mondiale est aujourd'hui considérée comme immunologiquement naïf vis à vis du virus de la variole, ce qui fait de lui un agent bioterroriste potentiel. De plus, la vaccination implique un grand nombre de complications, particulièrement graves chez les personnes immunodéprimées ; et les antiviraux disponibles sont peu développés, ce qui souligne le besoin de nouvelles molécules. Le complexe de réplication apparait comme étant une cible privilégiée, de par son importance dans le cycle viral mais aussi par sa localisation cytoplasmique qui le rend plus accessible aux molécules antivirales. Nous nous sommes intéressés à 4 protéines essentielles de ce complexe : l'ADN polymérase E9, le facteur de processivité composé de la protéine A20 et de l'uracile ADN glycosylase D4 et l'hélicase-primase D5. Nous avons pu exprimer ces protéines de manière recombinante, seules ou en complexe ainsi que les caractériser biochimiquement et biophysiquement. Nous avons finalement abouti à une reconstruction strcuturale du complexe A20D4E9 à basse résolution grâce à la technique de SAXS, ce qui nous a permis de proposer le premier modèle structural de la fourche de réplication du virus de la vaccine. / Vaccinia virus (VACV) is a large DNA virus, prototypic virus of the orthopoxvirus genus, and shows over 97% amino acid sequence identity with the variola virus (VARV), a major human pathogene eradicated in 1977 thanks to the universal vaccination program with VACV. As this vaccination was halted in the 1980s, a significant percentage of the world population is now immunologically naïve, which makes the VARV a potent bioterrorist agent. Vaccination against smallpox may result in a variety of complications, particularly in immunologically depressed patients, and the available antiviral therapeutics are rare, which enhance the need of new molecules. The replication complex appears as an ideal target because of its importance in the viral cycle and its cytoplasmic localization, more accessible for the molecules. We have focused our study on 4 essential proteins of this complex: the DNA polymerase E9, the processivity factor composed by the A20 protein and the uracil DNA glycosylase D4 and the helicase-primase D5. We could express these recombinant proteins, alone and in complex, and characterize them biochemically and biophysically. Using the SAXS technic, we finally reached a low resolution model of the A20D4E9 complex which allow us to propose the first structural model of the vaccinia virus replication fork.

Chez la levure à bourgeon, l’établissement de domaines silencieux pour la transcription nécessite la formation d’une structure, de type hétérochromatine, formée par le complexe SIR (Silencing Information Regulator). Les gènes soumis à la répression transcriptionnelle par ce complexe se trouvent aux sites cryptiques de détermination du type sexuel (HM) et dans les régions subtélomériques localisées à la périphérie nucléaire. Le recrutement des protéines Sir à ces sites nécessite la présence de séquences en cis comme les silencers ou les répétitions télomériques. Mon travail de thèse s’est attaché à l’étude d’une nouvelle voie d’établissement de la répression transcriptionnelle des gènes. En effet, nous avons démontré que la répétition en tandem de protéines fortement liées à l’ADN constitue un stress pour la fibre de chromatine. Ce stress induit le recrutement du complexe SIR favorisant ainsi la formation d’hétérochromatine et la mise en silence des gènes dans des régions normalement actives du génome. De plus, nous avons observé qu’en absence de l’ADN hélicase Rrm3, dont la fonction est de faciliter la progression de la fourche de réplication le long de la fibre de chromatine, la répression induite par ces complexes est exacerbée. Ce lien entre stress réplicatif et établissement de la répression transcriptionnelle a été observé, dans un premier temps, grâce à l’utilisation de systèmes artificiels (systèmes d’étiquetage des gènes : lacO/LacI et tetO/TetR). En outre, nous avons montré qu’un site naturel de pause de la réplication, tel qu’un gène codant un ARN de transfert, peut également favoriser la répression par les protéines Sir. De manière intéressante, à l’échelle du génome, nous avons pu observer le recrutement des protéines Sir dans des régions où la progression de la fourche de réplication est ralentie. Ainsi, nos données révèlent une nouvelle voie de mise en silence des gènes liant stress réplicatif et répression transcriptionnelle. / In budding yeast, the heterochromatin-like structure formed by the SIR complex (Silencing Information Complex) represses transcription. SIR mediated repression occurs at the cryptic mating type loci (HM) and subtelomeric regions localized at the nuclear periphery. The recruitment of the Sir proteins is induced by the presence of cis-acting elements as silencers or telomeric repeats.My doctorate work was focused on the characterization of a novel pathway of silencing establishment. Indeed, we have shown that arrays of tight DNA-proteins complexes lead to a chromatin stress. This stress induces the recruitment of the SIR complex and the establishment of stable heterochromatin-like domain at ectopic sites in the budding yeast genome. Moreover, this heterochromatinization is enhanced in cells mutated for Rrm3, a specialized DNA helicase acting ahead the fork to remove replication-impeding structures. Thus, we first observed a link between replication stress and silencing establishment by using artificial systems (gene tagging systems: lacO/LacI and tetO/TetR). Further, we have shown that tRNA genes, which are known to act as replication pause sites, can favor SIR-mediated repression. Interestingly, we found that Sir proteins are recruited where the replication fork progression is impeded at the genome wide scale. All together, these data reveal a novel mechanism for heterochromatin formation linking replication stress with gene repression.

L’interleukine 26 (IL-26) a initialement été décrite comme une molécule surexprimée par des lymphocytes humains transformés par un virus. L’IL-26 a ensuite été classée comme cytokine pro-inflammatoire en raison de sa capacité à induire la production de cytokines par les cellules myéloïdes et épithéliales. Toutefois, ses fonctions biologiques restent méconnues, notamment en raison de l’absence d’orthologue chez le rat et la souris. Le laboratoire avait précédemment rapporté que l’IL-26 est surexprimée chez les patients présentant une inflammation hépatique associée à une infection chronique par le virus de l’hépatite C (HCV) et qu’elle participe à l’immunité antivirale, notamment en conférant aux cellules NK la capacité de tuer des hépatocytes infectés par le virus. Les résultats montraient également que l’IL-26 s’accumule dans les hépatocytes infectés en l’absence d’expression du transcrit. Cette observation, suggérant un rôle non conventionnel pour une cytokine associé à une localisation inhabituelle, a constitué la base de ce projet de recherche. Utilisant un modèle original de réplication du virus HCV in vitro, nos travaux montrent que l’IL-26 protège les hépatocytes de l’infection par HCV en inhibant la réplication de l’ARN viral. Cette propriété repose notamment sur la capacité de l’IL-26 à se lier à l’ARN viral. Ces données identifient l’IL-26 comme un nouvel acteur de l’arsenal antiviral, agissant notamment en inhibant la réplication du virus HCV, et suggèrent que cette molécule peut être classée dans la famille des kinocidines. / Initially identified as a molecule over expressed in virus-transformed human T cells, IL-26 has been classified as a pro inflammatory cytokine due to its capacity to induce inflammatory cytokines production by myeloid and epithelial cells. Nevertheless, its biological functions remain largely unknown, in part because of its absence of orthologs in rat and mouse.Our team has previously reported that IL-26, overexpressed in HCV-infected patients, activates NK cells, rendering them able to kill HCV-infected hepatocytes. Results also showed that IL-26 accumulates in hepatocytes of HCV-infected patients, a localization that is not usual for a cytokine. This observation led us to evaluate whether IL-26 may exhibit non-conventional properties. In this study, we demonstrate that IL-26 protects in vitro hepatocytes from HCV infection. Confocal microscopy revealed that IL-26 colocalizes with viral dsRNA. This direct antiviral activity appears to rely on the capacity of IL-26 to bind to viral RNA and to inhibit its replication. Moreover, we investigated the capacity that IL-26 complexed to viral RNA could trigger an antiviral response by immune cells. Collectively, results show that IL-26 may have a manifold protective role during HCV infection: (i) an indirect role via its capacity to confer NK cell the capacity to kill HCV-infected cells, (ii) a direct role through its ability to inhibit viral replication, and (iii) a stimulatory role by rendering viral DNA inflammatory.

Cette thèse étudie l'effet de deux processus cellulaires essentiels, la réplication et la transcription, sur la composition en nucléotides des séquences d'ADN. Ces mécanismes ont un fonctionnement asymétrique par rapport aux deux brins d'ADN, et ils ont comme conséquence une composition asymétrique dans les séquences.<br /> Nous avons étudié la co-orientation entre réplication et transcription chez les procaryotes. Nous proposons une méthode pour l'étude des biais de composition qui découple ces deux sources d'asymétrie. Nous montrons que les biais associés à la réplication sont très variables, même entre espèces proches.<br /><br /> Nous avons ensuite analysé le patron de substitution dans les régions transcrites et autour des origines de réplication du génome humain, et notamment l'effet du contexte 5'-3'. Les biais de voisinage sont similaires pour l'asymétrie associée à la réplication et à la transcription. La variation des taux de substitutions en fonction du patron d'expression des gènes suggère qu'un biais de réparation asymétrique et contexte-dépendant pourrait être en jeu.<br /><br /> Enfin, nous avons proposé une méthode de calcul du patron de substitution dans des séquences à composition biaisée: les microsatellites. Nous avons démontré que les microsatellites transcrits sont sujets au mêmes processus asymétriques que les régions non-répétées.

Les systèmes d'édition collaborative permettent à plusieurs utilisateurs d'éditer simultanément un document. Aujourd'hui, l'édition collaborative massive est une réalité. Il ne s'agit plus d'éditer à quelques utilisateurs mais à des milliers d'utilisateurs répartis dans le monde. Les éditeurs collaboratifs actuels n'ont pas été conçus pour supporter un nombre si important d'utilisateurs. Les problèmes soulevés ne sont pas d'ordre technologique, ils remettent en cause les fondements algorithmiques des éditeurs. L'objectif de cette thèse est de proposer des algorithmes adaptés à l'édition collaborative massive. Nous montrons qu'un tel algorithme doit assurer trois critères : convergence des données, préservation des intentions et passage à l'échelle. Au regard de l'état de l'art, seul le modèle des transformées opérationnelles (OT) peut concilier ces trois critères.<br />La première contribution de cette thèse montre que l'approche OT conçue pour des éditeurs temps réel peut être utilisée pour réaliser des outils asynchrones. Nous avons réalisé un gestionnaire de configurations dénommé SO6. La seconde contribution est une approche formelle à la conception et à la vérification de fonctions de transformation pour le modèle OT. Cette approche repose sur un démonstrateur automatique de théorème. Avec cette approche, nous montrons que toutes les fonctions de transformation proposées jusqu'ici sont fausses. La troisième et dernière contribution de ce travail est un nouvel algorithme de réplication optimiste (WOOT) adapté à l'édition collaborative massive de structures linéaires. Ce modèle repose sur le calcul monotone d'une extension linéaire des ordres partiels formés par les relations entre les différents éléments de la structure.

Longtemps considéré comme une structure stable hautement optimisée, le génome des procaryotes nous apparaît, au regard de récentes découvertes, comme extrêmement changeant au cours du temps. Chez certaines bactéries, les gènes acquis récemment d'espèces distantes par transmission horizontale sont estimés à plus de 15 % du génome et les phylogénies construites à partir de différents gènes présentent fréquemment des incongruences importantes. De ce point de vue, la cohérence interne des génomes et la durabilité des interactions entre gènes au cours des temps évolutifs sont mises en question. Certains auteurs proposent que les transferts horizontaux se produisent à une fréquence telle que le concept même d'histoire des espèces ne s'applique pas aux procaryotes. Cependant, il a été suggéré que certaines catégories de gènes pouvaient être plus ou moins sensibles au transfert. Nous avons testé cette hypothèse au moyen de méthodes phylogénétiques et tenté de reconstruire une phylogénie des procaryotes en utilisant les génomes complets. Les résultats suggèrent que certains gènes conservent une information congruente sur l'histoire des bactéries et que la combinaison de ces informations peut permettre de reconstruire une phylogénie des bactéries. La nature des gènes détectés comme ayant été acquis récemment pose également problème. En effet, plusieurs auteurs ont remarqué que ces gènes avaient tendance à être enrichis en nucléotides A et T en comparaison du reste du génome. Nous avons analysé la structuration en nucléotides de nombreux génomes complets et montré que certaines caractéristiques intrinsèques aux génomes pourraient, dans certains cas, conduire à une surestimation de la quantité de gènes acquis par transferts horizontaux. Si d'un point de vue qualitatif, l'importance des transferts horizontaux dans l'évolution des procaryotes a été amplement démontrée, nous pensons qu'elle a été surestimée du point de vue quantitatif du fait de problèmes méthodologiques. Détectés par une méthode phylogénétique, les gènes récemment acquis montrent des caractéristiques qui les rapprochent de séquences parasites (phages notamment) ou non fonctionnelles, suggérant que certaines catégories de gènes pourraient être « spécialisées » dans le transfert horizontal.

Le problème que je traite dans la thèse est comment offrir de<br />manière efficace les contraintes de cohérence et les requis de temps de<br />réponse, demandés par des services repliqués hétérogènes, accédés à large échelle.<br />La réplication est une technique classique utilisée pour améliorer la performance des applications<br />Internet populaires, surtout quand elles sont accédées concurremment<br />par un grand nombre de clients, dispersés à travers le monde. <br />Les travaux existants ne prennent pas en compte la diversité des demandes des services<br />pour différentes ressources système et réseau. Cette hypothèse relève une difficulté importante du problème de l'estimation du temps de réponse.<br />Une autre difficulté est déterminée par la hétérogénéité des capacités des ressources et par la variabilité des disponibilités des ressources. <br />Nous proposons une approche d'estimation, où le temps de réponse est décomposé dans des composants indépendants (temps de service et temps<br />d'attente), et chaque composante est approximée séparément, en prenant<br />en compte les capacités et les utilisations courantes des ressources demandées par le service.<br />Le requis sur le temps de réponse est spécifié par le fournisseur du<br />service, par un seuil qui correspond à la moyenne de temps de<br />service des requêtes, ou comme critère d'optimisation, demandant le meilleur temps de réponse. <br />Le requis est realisé par un protocole générique qui détermine quel<br />est le réplicat approprié à choisir pour répondre aux requêtes de<br />chaque client, parmi tous les réplicats existants. Nous avons implementé cette solution et les résultats expérimentaux obtenus ont montrés la satisfaction du requis sur le temps de réponse, à un coût raisonnable.<br /><br />Les approches existantes pour la gestion de la cohérence des<br />réplicats, offre un ensemble limité des garanties pour tous les<br />services. Tout de même, la variété des sémantiques des services,<br />demande des combinaisons des garanties différentes d'un service à<br />l'autre. Nous proposons un meta-modèle de cohérence, qui réifie les<br />garanties de cohérence existantes, en identifiant les paramètres qui<br />caractérisent chaqu'une des trois dimensions de la cohérence: contrôle<br />de divergence, contrôle de concurrence et contrôle de dépendances.<br />Le meta-modèle est attaché un protocole de cohérence générique, qui réalise des modèles de cohérence spécifiques aux services. Un modèle de cohérence, spécifié par le fournisseur du service, contient<br />des contraintes de sûreté, nécessaires pour que le service fonctionne<br />correctement lorsqu'il est répliqué, et des contraintes de vivacité,<br />nécessaires pour limiter la discrépance entre l'état d'un réplicat<br />particulier et l'état du réplicat idéal. Le protocole de cohérence<br />assemble trois briques de base indépendantes, qui correspondent aux<br />trois dimensions orthogonales de la cohérence. <br /><br />Le message de la thèse c'est que notre approche de réplication gère la hétérogénéité des<br />services en terme de sémantiques des opérations et de demandes de<br />ressources, en satisfaisant les contraintes appropriées concernant la cohérence des réplicats<br />et la performance observé par les requetes des clients.

Mes travaux traitent essentiellement des marchés financiers incomplets. J'ai choisi de les regrouper en trois parties. La première traite de la caractérisation de l'hypothèse d'absence d'opportunité d'arbitrage et de ses implications en termes d'évaluation. La seconde explore deux pistes possibles pour l'évaluation et la couverture d'actifs dérivés en marché incomplet : la sur-réplication et l'exploitation de la condition de No Good Deal. Enfin, le dernière partie s'intéresse aux comportements limites ainsi qu'à la stabilité des choix optimaux des agents par rapport à des perturbations de leur évaluation du risque. Dans ce contexte, nous nous intéressons aussi à d'autres règles d'évaluation : les prix d'utilités.