La lysine méthyltransférase PR-Set7 est responsable de la monométhylation de la lysine 20 de l'histone H4 (H4K20me1). Son expression varie au cours du cycle cellulaire. D'un niveau peu élevé en phase S, l'enzyme atteint un niveau maximum au cours de la mitose. Mon projet de thèse avait pour but de caractériser les fonctions de PR-Set7 et les raisons de cette régulation au cours du cycle. Présentés sous forme de publication, les résultats de ma thèse montrent que PR-Set7 induit un signal H4K20me1 au niveau des origines de réplication pendant la mitose, ce qui permet le recrutement des complexes de pré-réplication (Pre-RC) contenant les facteurs nécessaires à la formation des fourches de réplication lors la phase S suivante. En effet, la présence de PR-Set7 sur une séquence d'ADN spécifique est suffisante pour induire le co-recrutement des protéines du complexe Pre-RC, tandis que l'inactivation de l'enzyme conduit au contraire à un défaut d'assemblage de ces complexes suivi d'un stress réplicatif. Lors de la phase S, PR-Set7 est dégradée par le complexe Cul4-DDB1, via son interaction avec la protéine PCNA. Cette dégradation permet la disparition du signal H4K20me1 des origines et l'inhibition des complexes Pre-RC, s'assurant ainsi que les origines sont actives une seule fois par cycle cellulaire. La mutation du domaine d'interaction avec PCNA est suffisante pour empêcher la dégradation de PR-Set7, entraînant alors la maintenance du signal H4K20me1 et une activation répétée des origines pendant la phase S (phénotype de sur-réplication). L'ensemble de mes résultats établissent PR-Set7 et le signal H4-K20me1 comme un nouveau mécanisme épigénétique de contrôle des origines de réplication chez les mammifères. / The lysine methyltransferase PR-Set7 is responsible of the monomethylation of lysine 20 of histone H4 (H4K20me1). Its expression is cell-cycle regulated. With weak levels in S phase, this enzyme reach a peak level during mitosis. My PhD project was to characterize the functions of PR-Set7 and the reasons underlying its cell-cycle regulation. Presented as publications, my results show that PR-Set7 induces H4K20me1 on replication origins during mitosis, which allows recruitment of pre-replication complexes (Pre-RC) containing all the factors required to create replication forks during the next S phase. Indeed, the presence of PR-Set7 on a specific DNA sequence is sufficient to induce the co-recruitment of Pre-RC complex proteins, whereas the inactivation of this enzyme leads to defects in the assembly of these complexes followed by a replicative stress. During S phase, PR-Set7 is degraded par the Cul4-DDB1 complex through its association with PCN A. This degradation induces the disappearance of H4K20me1 on origins and inhibition of Pre-RC complexes, ensuring that origins are activated only once per cell cycle. Mutations in the interaction domain with PCNA are sufficient to prevent PR-Set7 degradation, leading to the maintenance of H4K20me1 and a multiple activation of origins during S phase (over-replication phenotype). My results establish PR-Set7 and H4K20me1 as a new epigenetic mechanism to control replication origins in mammals.

HTLV-1 est l’agent étiologique de la leucémie/ lymphome T de l’adulte (ATLL). In vivo, ce virus infecte les lymphocytes T CD4+ et CD8+. Cependant, l’ATLL est presque toujours de phénotype CD4+. HTLV-1 se réplique essentiellement par expansion clonale des cellules T infectées. Cette expansion clonale repose sur deux mécanismes distincts dépendants du phénotype lymphocytaire : HTLV-1 induit la mise en cycle des lymphocytes T CD4+ et la résistance à l’apoptose des lymphocytes T CD8+. En plus d’une prolifération accrue, les cellules T CD4+ infectées in vivo présentent des ponts interchromatiniens caractéristiques d’une instabilité génétique. Ainsi, l’infection par HTLV-1 établit un phénotype préleucémique restreint aux lymphocytes T CD4+ infectés. Les objectifs de ma thèse étaient de comprendre les évènements moléculaires et cellulaires qui sous-tendent l’expansion clonale des cellules T CD4+ et CD8+ au cours de l’infection par HTLV-1. Dans un premier temps, dans l’hypothèse d’un effet général de l’infection sur l’expansion clonale des cellules T infectées et non infectées, nous avons comparé les effets d’une infection in vitro à ceux observés dans des lymphocytes T CD4+ et CD8+ issus d’individus infectés depuis plus de 6 à 26 ans. Cette étude nous a permis de montrer que les interactions directes virus-cellules sont suffisantes pour entraîner une résistance des lymphocytes T CD8+ à l’apoptose mais pas pour l’établissement d’un phénotype préleucémique des lymphocytes T CD4+ in vivo. Dans un deuxième temps, nous avons mis en évidence que les lymphocytes T CD8+ infectés in vivo résistent à l’apoptose médiée par Fas. La surexpression du gène antiapoptotique cIAP-2 mais pas celle de c-FLIP(L) est impliquée dans la résistance à l’apoptose médiée par Fas des lymphocytes T CD8+ infectés et donc dans leur expansion clonale. / HTLV-1 is the etiological agent of Adult T-cell Leukemia/Lymphoma (ATLL). In vivo this virus infects CD4+ and CD8+ T lymphocytes yet ATLL is regularly of the CD4+phenotype. HTLV-1 mainly replicates via the clonal expansion of infected cells. Clonal 3 expansion relies on two distinct mechanisms with respect to the T-cell phenotype: HTLV-1 recruits CD4+ infected T cells into the cell cycle while preventing cell death in CD8+ infected T cells. Furthermore, infected tax-expressing CD4+ lymphocytes display morphological changes characteristic of genetic instability. Therefore, HTLV-1 infection establishes a Tax-dependent CD4+-restricted preleukemic phenotype. The objectives of my work were to investigate the molecular and cellular events that underlie clonal expansion of CD4+ versus CD8+ T cells upon HTLV-1 infection. We hypothesized that the infection could have consequences on both infected and uninfected T cells. Therefore, we first compared the effects of a recent experimental infection performed in vitro with those observed in cloned T cells from patients infected since > 6-26 years. Our findings suggest that the sole virus-cell interactions are sufficient for the resistance to apoptosis in CD8+infected T lymphocytes but not enough for the establishment of a CD4+-restricted preleukemic phenotype in vivo. Next, we evidenced that the CD8+ infected T cells resist to Fas-mediated cell death. Finally, cIAP-2 but not c-FLIP(L) overexpression in these cells appears involved in apoptosis resistance of CD8+ infected T cells and thereby in their clonal expansion.

L’extrémité des chromosomes linéaires est une structure nucléoprotéique très conservée chez les organismes eucaryotes. Elle est constituée du télomère et des régions sous-télomériques répétées (STR) qui sont placées en amont du télomère. Chez la levure bourgeonnante, on trouve deux types de télomère, les télomères XY’ et les télomères X, qui se distinguent par la nature des STR positionnées en amont des répétitions télomériques. Le télomère et les STR sont liés par pas moins de dix protéines qui vont participer au maintien et à la régulation de l’extrémité chromosomique nécessaires à la stabilité du génome. Le télomère protège ainsi le chromosome de dégradations ou encore de fusions avec d’autres chromosomes. Le maintien de la taille du télomère est assuré par la télomérase, une transcriptase inverse, qui permet l’ajout de répétitions pour pallier leur perte lors de la phase de réplication durant le cycle cellulaire. Lorsque la télomérase est absente, deux types particuliers de cellules, les survivants de type I et les survivants de type II, peuvent maintenir leurs télomères grâce aux mécanismes de recombinaison homologue. Chez l’humain, les répétitions télomériques sont également liées par un certain nombre de protéines nécessaires au maintien de la stabilité de l’extrémité chromosomique. L’implication des télomères dans les processus de cancérisation, de vieillissement, mais également dans des maladies congénitales fait de cette structure un pivot dans le domaine de la recherche fondamentale. Dans 10 % des cas de cancers, l’allongement n’est pas dû à une réactivation de la télomérase comme c’est en général le cas, mais est inhérent à des processus de recombinaison homologue, comme chez la levure. Les homologies de séquences, de protéines, mais aussi de mécanismes de régulation des télomères avec les cellules humaines, font de S. cerevisiae un excellent modèle d’étude. Cette thèse se divise en trois chapitres. Les deux premiers traitent de l’interaction du complexe yKu avec les télomères de type XY’ dans le chapitre 1 puis de son interaction avec les télomères de type X dans le chapitre 2. Le chapitre 3 traite du comportement d’un type de survivant chez S. cerevisiae. Le chapitre 1 porte donc sur l’analyse des sites de liaison aux télomères XY’ du complexe yKu par la technique de ChEC in vivo. yKu intervient dans de nombreux processus de régulation des télomères, mais aussi dans un mécanisme de réparation des cassures double-brin de l’ADN (DSBs), la NHEJ (Non homologous end-joining). Les résultats présentés dans cette partie appuient un modèle dans lequel yKu aurait plusieurs sites de liaison aux télomères et dans les répétitions télomériques interstitielles. Nous supposons que la liaison du complexe se ferait lors de la formation d’une cassure de type « one-sided break » générée à la suite du passage de la fourche de réplication à l’intérieur des répétitions télomériques. Le chapitre 2 est également une étude des sites de liaison par la technique de ChEC in vivo du complexe yKu, mais cette fois-ci aux télomères X. Les observations faites dans cette partie viennent corroborer les résultats du chapitre 1 de la liaison de yKu à la jonction entre le télomère et les STRs, de plus elle met en évidence des interactions potentielles du complexe avec les éléments X laissant supposer l’existence d’un potentiel repliement du télomère sur la région sous-télomérique chez la levure. Enfin, le chapitre 3 est axé sur l’étude du comportement des survivants de type I, des cellules post-sénescences qui maintiennent leurs télomères par un processus de recombinaison homologue, le mécanisme de BIR (break-induced replication) en l’absence de télomérase. Les survivants de type I présentent une croissance lente liée à un arrêt du cycle cellulaire en phase G2/M qui dépend de la protéine de contrôle Rad9, dont l’activité est en général induite par des cassures double-brin. Ce chapitre a permis d’apporter des précisions sur la croissance lente probablement inhérente à un berceau télomérique très restreint chez ce type cellulaire.

Les chromosomes sont organisés en plusieurs niveaux hiérarchiques de repliements de la chromatine. Cette organisation spatiale de la chromatine dans le noyau a été impliquée dans la régulation de nombreux processus cellulaires comme la réplication ou la transcription. En effet, différentes expériences suggèrent que la chromatine est organisée en boucles, dont les bases seraient maintenues attachées ensemble, formant une structure qui serait un soutien structurel de la chromatine.Mon projet de thèse a visé à identifier les séquences d'ADN constituant la base de ces boucles de la chromatine par hybridation sur puces. Notre étude a été réalisée sur des MEF asynchrones et synchronisées en G0/G1 afin d'établir la dynamique des MARs au cours du cycle cellulaire.Nos résultats montrent que les MARs constituent des grands domaines, qui sont associés de façon significative avec les domaines d'ADN liées à la Lamine B1 et les domaines tardifs du timing de réplication. L'analyse des MARs ayant été réalisée sur des MEFs synchronisées en G0, les domaines de timing seraient donc déjà définis en G0/G1. L'analyse de plusieurs marques des histones suggère que les MARs sont associées à la chromatine transcriptionnellement inactive. En parallèle, nous avons réalisé une analyse protéomique de la matrice. Celle-ci a permis de valider notre approche expérimentale mais nous a aussi donné l'opportunité de caractériser la matrice nucléaire d'un point de vue protéique.L'ensemble de nos résultats révèle que les séquences d'ADN liées à la matrice nucléaire constituent une zone de répression, tant au niveau transcriptionnel que réplicatif. / Chromosomes are organised into several hierarchical levels of chromatin compaction. This spatial organization of chromatin in the nucleus has been involved in regulating many cellular processes such as DNA replication and transcription. Indeed, different experiments suggest that chromatin is organized in loops, whose bases are kept attached together, forming a structure, often called the nuclear matrix, acting as a structural support of the chromatin. My project was to identify the DNA sequences that belong to the bases of these chromatin loops. Matrix-attached regions (MARs) were mapped by hybridization on microarrays. This study was performed on asynchronous as well as G0/G1-phase synchronized MEFs to establish the dynamics of MARs during the cell cycle. MARs were found in megabase-sized domains, with sequences significantly related to previously-published Lamin B1 associated domains and replication timing domains. Since our analysis of MARs was performed on G0-synchronized MEFs, our data strongly suggest that the timing domains might already be defined in G0/G1. Analysis of several histone marks suggested that MARs were associated with transcriptionally-repressed chromatin. In parallel, we also performed a proteomic analysis of our matrix preparations, and found known "matrix-attached" proteins, thus validating our experimental approach, plus other components that permitted a better characterization of the nuclear matrix. Taken together, our results show that DNA sequences bound to the nuclear matrix constitute a repressive zone, at the transcription and replication levels.

La réplication de l'ADN au cours de la phase S est initiée au niveau de sites spécifiques, appelés origines de réplication, qui sont distribués de manière adéquate le long des chromosomes et actifs une seule fois par cycle cellulaire. Les mécanismes qui contrôlent la position des origines de réplication restent énigmatiques chez les mammifères. Les travaux réalisés pendant cette thèse révèlent que la lysine méthyltransférase PR-Set7 humaine, responsable de la mono-méthylation de la lysine 20 de l'histone H4, induit un réarrangement chromatinien au niveau des nombreuses origines de réplication des gènes actifs. Celui-ci est caractérisé par la mono- et tri-méthylation de la lysine 20 de l'histone H4 et la tri-méthylation de la lysine 4 de l'histone H3. Ce profil de méthylation d'histones constituerait un signal épigénétique pour le recrutement sur la chromatine des facteurs nécessaires à la formation des origines de réplication, indépendamment d'un rôle sur la transcription. En effet, la présence d'une forme active de PR-Set7 en amont d'un gène rapporteur est suffisante pour induire cette cascade de méthylation et la formation d'une nouvelle origine de réplication au niveau de ce gène sans en modifier son expression. De la même manière, l'inactivation de l'enzyme dans une cellule conduit à l'inverse à une diminution du nombre total d'origines sans un effet majeur sur l'expression des gènes. Lors de la phase S, PR-Set7 est dégradée via le complexe E3 ligase CRL4Cdt2 et la protéine PCNA. Cette dégradation permet la disparition au niveau de la chromatine du signal de formation des origines, s'assurant ainsi qu'elles sont actives une seule fois par cycle. La mutation du domaine d'interaction avec PCNA est suffisante en effet pour empêcher la dégradation de PR-Set7, entraînant alors la formation et activation répétées des origines pendant la phase S (phénotype de sur-réplication). Ces résultats établissent la cascade de méthylation initiée par PR-Set7 pendant la mitose comme le mécanisme épigénétique contrôlant la mise en place et l'activation d'au moins la moitié des origines de réplication chez les mammifères. / In order to ensure accurate inheritance of genetic information through cell proliferation, chromosomes must be precisely copied once and only once and then correctly distributed to daughter cells. Chromosome replication occurs during the S phase of the cell cycle and is initiated at discrete chromosomal sites called replication origins. However, the ability to activate replication origins occurs during mitosis of the previous cell cycle and continuing into early G1 phase. This crucial step, called DNA replication licensing, consists of the assembly of a multi-protein pre-Replicative Complex (pre-RC) onto origins, making them competent for replication. During S phase, pre-RC are inhibited by different ways, that ensures that origins are activated only once per cycle and prevents DNA rereplication (multiple initiations from the same origin). In metazoans, functional replication origins do not show defined DNA consensus sequences, thus evoking the involvement of chromatin determinants in the selection of these origins.During my thesis, I have discovered that that the onset of licensing in mammalian cells coincides with an increase in histone H4 Lysine 20 monomethylation (H4K20me1) at replication origins by the methyltransferase PR-Set7. By genome mapping of H4-20me1 signals during the cell cycle, we found that nearly half of origins that fire during S phase are associated with H4-K20me1 during mitosis, when the process of replication licensing is activated. This mitotic H4-K20me1 signature is highly significant for origins located near transcription start sites and promoters that are characterized by the presence of CpG islands and H3-K4me3 signals. Furthermore, tethering PR-Set7 methylase activity to an origin-free genomic locus is sufficient to promote a chromatin remodeling follow by a creation of a functional origin of replication and promotes replication initiation. PR-Set7 and H4K20me1 are cell-cycle regulated, with high levels during M and early G1 and very low in S phase. At the onset of S phase, PR-Set7 undergoes an ubiquitin-mediated proteolysis, which depends on its interaction with the sliding-clamp protein PCNA and involves the ubiquitin E3 ligase CRL4-Cdt2. Strikingly, expression of a PR-Set7 mutant insensitive to this degradation causes the maintenance of H4K20me1 and repeated DNA replication at origins. This photolytic regulation controls the initiation of replication origin.This suggests that a cascade of lysine methylation events, initiated by PR-Set7 during mitosis, would define the position of origins in open chromatin structures.

Les télomères sont des structures nucléo-protéiques présentes à l'extrémité des chromosomes. Ils sont un des facteurs garant de la stabilité génomique. Ils assurent la protection des extrémités des chromosomes et leur entière réplication. Les dysfonctionnements du télomère sont impliqués dans la tumorigénèse et le vieillissement.Un des rôles majeurs des télomères est d'éviter que les extrémités des chromosomes ne soient reconnues comme des cassures double brin de l'ADN et traitées comme telles par la machinerie de réparation. Cependant, de nombreuses protéines impliquées dans la reconnaissance et le métabolisme des cassures double brin, comme la protéine Tel1 et le complexe MRX par exemple, sont présentes au niveau des télomères et participent au maintien de leur taille par la télomérase. En s'appuyant sur cette analogie, j'ai étudié le rôle télomérique de l'endonucléase Sae2 et de l'hélicase Sgs1, impliquées dans l'étape de dégradation du brin 5' qui précède la réparation des cassures double brin de l'ADN par recombinaison.Les rôles des protéines Sae2 et Sgs1 ont été étudiés sur les télomères natifs et sur les télomères érodés lors de la sénescence réplicative. L'ensemble de mes résultats suggèrent que, bien que les télomères érodés en absence de télomérase soient reconnus comme une cassure double brin de l'ADN et traités comme tels par les nucléases et hélicases, le rôle majeur de Sae2 et Sgs1 au niveau des télomères natifs serait de les protéger contre des recombinaisons illégitimes au cours de leur réplication. / Telomeres are nucleoprotein complexes that protect the extremities of linear chromosomes, avoiding end-to-end fusions and nucleolytic degradation of chromosome ends. The failure of cells to properly maintain telomeres can be an important source of chromosome instability involved in cancer progression and aging.A major role of telomeres is to prevent chromosome ends from being recognized as damage-induced double-strand DNA breaks (DSBs). However, many proteins involved in recognition and processing of DSBs are also involved in telomeres maintenance, like Tel1 and MRX. Based on this analogy, I have studied the role at telomeres of the role of the endonuclease Sae2 and the helicase Sgs1, two proteins that have a key function in the processing of DSBs through nucleolytic degradation of their 5' end.The role of protein Sae2 and Sgs1 has been studied at native and eroded telomeres. My results showed that eroded telomeres, in telomerase deficient cells, are recognized and resected as a double-strand break DNA by a set of nucleases and helicases including Sae2 and sgs1. In contrast, the main role of Sae2 and Sgs1 at native telomeres would be to protect telomeres against illegitimate recombination during replication.

Au cours de la division cellulaire, l'information génétique doit être transmise de façon précise et identique de la cellule mère aux cellules filles. Le génome est répliqué au cours de la phase S tandis que la distribution des deux copies entre les cellules filles se fait au cours de la mitose. L'initiation et le maintien de la mitose nécessite un équilibre contrôlé entre les activités des kinases et des phosphatases. La protéine kinase Greatwall est requise pour l'entrée et le maintien de la mitose à travers l'inhibition de la PP2A, la principale phosphatase qui déphosphoryle les substrats du complexe Cdk1-cycline B. Au cours de ce travail, nous avons entrepris l'étude structure/fonction de la protéine kinase Greatwall qui nous a permis de caractériser ses mécanismes d'activation. Nos résultats montrent que Greatwall appartient à la famille des AGC kinases mais qu'elle présente la particularité d'être contrôlée par des mécanismes qui lui sont propres: l'activation de la protéine, qui se fait en deux étapes, est différente de celle décrite pour les autres membres de cette famille de kinases. Par la suite, nous avons identifié deux substrats de la protéine kinase Greatwall, Arpp19 (cAMP-Regulated Phosphoprotein 19) et l'alpha-Endosulfine (ENSA). Nous avons montré qu'une fois phosphorylées par Greatwall, ces deux protéines s'associent à la PP2A et inhibent cette phosphatase. Malgré le fait que ces deux substrats soient capables d'inhiber la PP2A, seul Arpp19 endogène est responsable de l'inhibition de la phosphatase pour promouvoir l'entrée en mitose dans le modèle des extraits d'ovocytes de xénope. Nous nous intéressons à présent à l'étude du rôle d'ENSA. / During cell division, genetic information must be transmitted from the mother cell to the daughter cell in an accurate and identical way. During the S phase the genome is replicated while an equal distribution of two copies of DNA between the daughter cells is made during mitosis. Initiation and maintenance of mitosis require a controlled balance between kinase and phosphatase activities. Greatwall kinase is essential for mitotic entry and maintenance through the inhibition of PP2A, the main phosphatase that dephosphorylates Cdk1/cycline B mitotic substrates. Here we investigate the mechanisms regulating Greatwall. Our results show that Greatwall is a member of the AGC family of kinases that appears to be regulated by a unique two-step mechanism that differs from the other members of this family. Furthermore we identified Arpp19 (cAMP-Regulated Phosphoprotein 19) and alpha-Endosulfine (ENSA) as two substrates of Greatwall that, when phosphorylated by this kinase, associate with and inhibit PP2A. Despite the fact that these two substrates are able to inhibit PP2A, only endogenous Arpp19 is responsible for the phosphatase inhibition at mitotic entry in xenopus egg extratcs. Roles of ENSA are currently under investigation.

Comme pour la plupart des virus à ARN+, le VHC induit des remaniements membranaires appelés membranous web. Les protéines non structurales virales formant le complexe de réplication du virus sont associées à ces membranes néosynthétisées. La compréhension de la mise en place de ces membranes cellulaire est encore actuellement mal connue. Afin d’étudier ce phénomène, nous avons dans un premier temps sélectionné des clones cellulaires Huh7.5 hébergeants un réplicon sous-génomiquedu virus. Nous avons ainsi pu mettre en évidence la présence d’un réseau multivésiculaire semblant provenir de l’induction de mécanismes d’autophagie. Plus récemment l’utilisation du modèle de propagation du virus complet nous a permis de mieux caractériser ce réseau multivésiculaire en déterminant trois sous réseaux vésiculaires structuralement différents. L’analyse de cette étude est effectuée principalement par microscopie électronique avec des techniques innovantes tels que la reconstruction tridimensionnelle et des immunogolds. / As other RNA viruses, HCV induces membrane alterations termed membranous web and its nonstructural proteins forming the viral replication complex are associated to these neo-synthesized membranes. The mechanism underlying these host cell membranes alterations is still currently unknown. To investigate this mechanism, we initially selected Huh7.5 cells clones harbouring a HCV subgenomic replicon. We were able to demonstrate the presence of a multivesicular network apparently linked to the autophagy induction mechanisms. More recently, using the cell culture-adapted HCVsystem, we better characterized this network by determining three multivesiculars vesicles structurally different subnets. This study was carried out mainly by performing electron microscopy observations,with using innovative techniques such as three-dimensional reconstruction and immunogold.

Au cours de la croissance des levures, la cellule doit dupliquer sont génome nucléaire et mitochondrial, le processus de réplication est bien moins étudié dans les mitochondries. Néanmoins, si de multiples ADN polymérases sont impliquées dans les processus de réplication et de réparation dans le noyau, il est considéré jusqu’à aujourd’hui qu’une seule ADN polymérase est impliquée dans ces processus dans la mitochondrie. Des résultats récents mettent en exergue le fait que la situation est bien plus compliquée qu’il n’y apparait au départ. Pour élucider le processus de réplication dans la mitochondrie de levure, j’ai focalisé mon intérêt à tenter de purifier et de caractériser le complexe de réplication. Ce travail était important à développer étant donné la découverte au laboratoire d’une seconde ADN polymérase supplémentaire à la polymérase gamma, dans les mitochondries de levure. Une première partie de ma thèse a été de m’investir afin d’obtenir suffisamment de protéines dans le but d’une identification par spectrométrie de masse, compte tenu de la faible proportion des ADN polymérases dans la cellule et en particulier dans la mitochondrie. Nous avons démontré que cette polymérase est codée par le gène unique POL1. Par des techniques d’ultracentrifugation et d’analyse biochimiques, j’ai réussi à isoler et caractériser un complexe de réplication mitochondrial. Des techniques d’exclusion chromatographiques ont permis d’attribuer une masse native à ce complexe. Sa composition a été étudiée grâce à des colonnes ioniques et hydrophobes, une autre méthode d’analyse repose sur l’utilisation de colonnes d’affinité afin de reconstituer in-vitro les interactions existant entre plusieurs protéines présumées impliquées. Ainsi, un réseau d’interactions impliquant les deux ADN polymérases mitochondriales avec cinq autres protéines a été reconstitué. La masse native de différentes formes stables de ce complexe se situent à 500 kDa ou au-delà de 1 MDa. / During yeast growth, cells must duplicate their nuclear and mitochondrial DNA. The replication process involved is less studied in mitochondria. Nevertheless, if multiple DNA polymerases are implicated in the nuclear replication and repair mechanisms, until now it is believed that only one DNA polymerase is involved in these processes in mitochondria. Recent results pointed out that the situation is more complicated than preliminary believed. To elucidate the replication process in yeast mitochondria I focused my interest in attempts to purify and characterize the replication complexes. This work was important to develop in accord with the discovery in the laboratory of a second DNA polymerase in addition to the polymerase gamma in yeast mitochondria. One first part of my thesis was to hardly purify enough of this enzyme to be allowed to identify it by mass spectrometry as the DNA polymerase alpha, encoded by the unique POL1 gene. By ultracentrifugation and biochemical techniques, I succeeded to purify the complex. Exclusion chromatographies were managed to elucidate the native mass of this complex. In addition ionic and hydrophobic chromatographic columns were carried out to determine its composition. Another way to study the complex was the reconstitution in vitro of the interactions happening with some usual suspect proteins with the help of chromatographic affinity columns. I reconstituted partly an interactions model network, including the two mitochondrial DNA polymerases and 5 others proteins implicated in replication. I determined the mass of different stable forms of the isolated complexes, around 500 kDa and over 1 MDa

Les éléments intégratifs conjugatifs (ICE) sont des îlots génomiques qui codent leur excision du chromosome, leur transfert par conjugaison et leur intégration. Ils présentent une organisation modulaire, chaque module incluant tous les gènes nécessaires pour conférer une fonction biologique. Ce travail a porté sur l'étude de la régulation ainsi que les modalités de transfert et de maintien d'ICESt1 et ICESt3, deux ICE de Streptococcus thermophilus présentant une région core étroitement apparentée et une région variable non apparentée. Les résultats obtenus ont montré que, bien qu'ICESt3 s'excise et se transfère à beaucoup plus haute fréquence qu'ICESt1, l'excision des deux éléments est activée par des stimuli identiques et est dépendante de la souche hôte. Chacun de ces ICE code des homologues de deux types de régulateurs différents, cI et ImmR, ce qui implique un mécanisme de régulation complexe et original qui pourrait être conservée chez de nombreux ICE apparentés identifiés lors de ce travail. Selon la définition initiale, les ICE se maintiendraient uniquement sous forme intégrée et ne se répliqueraient pas de façon intracellulaire. Cependant, les dommages à l'ADN induisent non seulement l'excision et le transfert d'ICESt3, mais aussi sa présence en copies multiples extrachromosomiques. Les résultats obtenus impliquent une réplication sous forme extrachromosomique, réplication codée par la région core et qui serait impliquée dans le maintien de l'élément. Une telle réplication pourrait être impliquée dans le maintien de nombreux ICE en plus de leur intégration. / Integrative and Conjugative Elements (ICEs) are genomic islands, which excise from the chromosome, self-transfer by conjugation and integrate. They harbor a modular organization: genes and sequences involved in the same biological process are grouped in the same region. This work concerns the modality of transfer and maintenance of ICESt1 and ICESt3, two ICEs of Streptococcus thermophilus that share closely related core region. ICESt1 excises much less frequently than ICESt3. Nevertheless, excision of the two elements is activated by the same stimuli (DNA damage, stationary phase and/or cell density) and depends of the host strain. Bioinformatical and transcriptional analyses highlight several differences in their organization. However, each of these two ICEs would encode two different regulators, cI and ImmR, suggesting that a complex and original pathway govern to ICESt1' and ICESt3' regulation. This regulation would be shared with numerous ICEs that we identified in the genome of various commensal or pathogenic streptococci. According to the original definition, ICE's maintenance would be exclusively due to their integration in the host chromosome, and ICEs would not be able of extracellular replication. However, in addition to the induction of ICESt3' excision and transfer, DNA damage cause replication of its extrachromosomal form. This unexpected property is encoded by the core region and would be implicated in the maintenance of the element. Comparision with data recently published on other ICEs suggest that intracellular replication could be involved in the maintenance of numerous ICEs, besides their integration.