L’extrémité des chromosomes linéaires est une structure nucléoprotéique très conservée chez les organismes eucaryotes. Elle est constituée du télomère et des régions sous-télomériques répétées (STR) qui sont placées en amont du télomère. Chez la levure bourgeonnante, on trouve deux types de télomère, les télomères XY’ et les télomères X, qui se distinguent par la nature des STR positionnées en amont des répétitions télomériques. Le télomère et les STR sont liés par pas moins de dix protéines qui vont participer au maintien et à la régulation de l’extrémité chromosomique nécessaires à la stabilité du génome. Le télomère protège ainsi le chromosome de dégradations ou encore de fusions avec d’autres chromosomes. Le maintien de la taille du télomère est assuré par la télomérase, une transcriptase inverse, qui permet l’ajout de répétitions pour pallier leur perte lors de la phase de réplication durant le cycle cellulaire. Lorsque la télomérase est absente, deux types particuliers de cellules, les survivants de type I et les survivants de type II, peuvent maintenir leurs télomères grâce aux mécanismes de recombinaison homologue. Chez l’humain, les répétitions télomériques sont également liées par un certain nombre de protéines nécessaires au maintien de la stabilité de l’extrémité chromosomique. L’implication des télomères dans les processus de cancérisation, de vieillissement, mais également dans des maladies congénitales fait de cette structure un pivot dans le domaine de la recherche fondamentale. Dans 10 % des cas de cancers, l’allongement n’est pas dû à une réactivation de la télomérase comme c’est en général le cas, mais est inhérent à des processus de recombinaison homologue, comme chez la levure. Les homologies de séquences, de protéines, mais aussi de mécanismes de régulation des télomères avec les cellules humaines, font de S. cerevisiae un excellent modèle d’étude. Cette thèse se divise en trois chapitres. Les deux premiers traitent de l’interaction du complexe yKu avec les télomères de type XY’ dans le chapitre 1 puis de son interaction avec les télomères de type X dans le chapitre 2. Le chapitre 3 traite du comportement d’un type de survivant chez S. cerevisiae. Le chapitre 1 porte donc sur l’analyse des sites de liaison aux télomères XY’ du complexe yKu par la technique de ChEC in vivo. yKu intervient dans de nombreux processus de régulation des télomères, mais aussi dans un mécanisme de réparation des cassures double-brin de l’ADN (DSBs), la NHEJ (Non homologous end-joining). Les résultats présentés dans cette partie appuient un modèle dans lequel yKu aurait plusieurs sites de liaison aux télomères et dans les répétitions télomériques interstitielles. Nous supposons que la liaison du complexe se ferait lors de la formation d’une cassure de type « one-sided break » générée à la suite du passage de la fourche de réplication à l’intérieur des répétitions télomériques. Le chapitre 2 est également une étude des sites de liaison par la technique de ChEC in vivo du complexe yKu, mais cette fois-ci aux télomères X. Les observations faites dans cette partie viennent corroborer les résultats du chapitre 1 de la liaison de yKu à la jonction entre le télomère et les STRs, de plus elle met en évidence des interactions potentielles du complexe avec les éléments X laissant supposer l’existence d’un potentiel repliement du télomère sur la région sous-télomérique chez la levure. Enfin, le chapitre 3 est axé sur l’étude du comportement des survivants de type I, des cellules post-sénescences qui maintiennent leurs télomères par un processus de recombinaison homologue, le mécanisme de BIR (break-induced replication) en l’absence de télomérase. Les survivants de type I présentent une croissance lente liée à un arrêt du cycle cellulaire en phase G2/M qui dépend de la protéine de contrôle Rad9, dont l’activité est en général induite par des cassures double-brin. Ce chapitre a permis d’apporter des précisions sur la croissance lente probablement inhérente à un berceau télomérique très restreint chez ce type cellulaire.

L'organisation de la chromatine a une importance fonctionnelle pour contrôler le programme d'expression des gènes. Par contre, les liens qui l'unissent au déroulement de la réplication de l'ADN sont beaucoup moins connus. Grâce à des approches basées sur la capture d'interactions chromosomiques et sur l'imagerie cellulaire, nous avons étudié les liens entre le repliement à grande échelle de la chromatine et le timing de réplication. Cette analyse, effectuée dans des cellules humaines lymphoblastoïdes, des cellules mononucléées du sang (PBMC) et des cellules issues d'une leucémie myéloïde à caractère érythrocytaire, a permis l'identification de domaines structuraux du noyau. Ces domaines sont relativement isolés les uns des autres et leurs frontières coïncident avec les zones d'initiation précoce. De plus, notre étude montre que ces zones d'initiation précoce interagissent préférentiellement, aussi bien entre voisins immédiats (séparation génomique de l'ordre de la mégabase) que le long du chromosome entier. Les loci répliqués tardivement interagissent eux-aussi avec leurs homologues, conduisant, dans l'espace nucléaire, à une ségrégation des loci en fonction de leur timing de réplication. Ces résultats sont soutenus par des mesures de distances sur des hybridations in-situ qui montrent que les loci répliqués en début de phase S sont plus proches qu'attendus. Nos travaux révèlent enfin que l'organisation de la chromatine est similaire dans des cellules en phase G0 (PBMC dormantes), démontrant qu'elle n'est pas spécifique des cellules en phase S. Pris ensemble, ces résultats apportent des preuves directes d'une organisation robuste de la chromatine, partagée par les cellules en cycle et dormantes, et corrélée au timing de réplication à différentes échelles. / Chromatin organization is of functional significance to control the gene expression program. However, its interplay with DNA replication program is less known. Though the capture of chromosomal interactions and cell imaging, we studied the links between the high-order folding of chromatin and the replication timing. This analysis, which has been performed in human lymphoblastoid cells, in peripheral blood mononuclear cells (PBMC), and in a myeloid leukemia cell line with erythroid properties, allowed the identification of structural domains in the nucleus. These domains are quite isolated from each other and their boundaries coincide with early-initiation zones. In addition, our study shows that these early-initiation zones preferentially interact with each other. These interactions have been observed between neighboring early-initiation zones (genomic separation around 1 to few megabases) but also along the whole chromosome. The late-replicated loci interact with their counterparts as well, leading to a nuclear segregation of the loci according to their replication timing. These results are sustained by distance measurements in in-situ hybridizations which show that loci replicated at the beginning of S-phase are closer than expected. Our work also reveals that chromatin organization is similar in cells blocked in G0 phase (quiescent PBMC), demonstrating that it does not result from the cells in S-phase. Taken together, these results provide direct clues for a robust chromatin organization, common to cycling and resting cells, and related to the replication timing at different scales.

Le virus d’Epstein-Barr (EBV) est un Herpesvirus humain appartenant à la sous-famille des γ-Herpesvirinae. L’expression des gènes d’EBV est régulée très finement, de manière séquentielle et débute par l’expression des gènes immédiats précoces dont les produits contrôlent l’expression des gènes précoces. Les produits de ces derniers permettent la réplication de l’ADN viral et la synthèse des gènes tardifs. Les mécanismes contrôlant l’expression des gènes immédiats précoces et précoces sont assez bien compris, à contrario de ceux qui contrôlent l’expression des gènes tardifs. En effet, il est connu que ces derniers ne sont exprimés qu’après réplication de l’ADN viral. Par ailleurs, les promoteurs des gènes tardifs présentent une structure différente des promoteurs de gènes immédiats précoces, précoces ou des gènes cellulaires. Ils sont essentiellement caractérisés par la présence d’une boîte TATT à la place de la TATA-box canonique. EBV a la particularité de coder pour une TBP-like, la protéine BcRF1 qui est essentielle mais pas suffisante pour l’expression des gènes viraux tardifs et qui se fixe spécifiquement sur la séquence TATT des promoteurs viraux tardifs. Notre objectif était principalement d’identifier l’ensemble des protéines virales nécessaires à l’expression des gènes tardifs d’EBV. Nous avons ainsi démontré qu’en plus de la protéine BcRF1, EBV code pour cinq autres protéines nécessaires à l’expression des gènes viraux tardifs : BFRF2, BGLF3, BVLF1, BDLF4 et BDLF3.5. Ces six protéines virales forment un complexe qui permet le recrutement de l’ARN polymérase II sur les promoteurs des gènes viraux tardifs. Nous avons nommé ce complexe vPIC (viral Pre-Initiation Complex), par analogie avec le complexe d’initiation de la transcription cellulaire formé autour de la TATA-Binding Protein (TBP). Le vPIC est conservé chez les herpesvirus des sous familles β et γ, mais est absent chez les herpesvirus de la sous famille des α. Par ailleurs, nos résultats suggèrent que le complexe vPIC interagit avec le complexe de réplication viral ce qui peut expliquer la liaison entre réplication de l’ADN viral et transcription des gènes viraux tardifs. Ces résultats permettent ainsi de mieux comprendre les mécanismes de régulation de l’expression des gènes tardifs d’EBV et serviront de base pour la recherche de nouveaux antiviraux. / The Epstein-Barr virus (EBV) is a human Herpersvirus belonging to the subfamily of γ-Herpesvirinae. EBV genes expression is tightly regulated, in a sequential manner and begins with the expression of immediate early genes whose products control the expression of early genes. Products of these allow the viral DNA synthesis and late genes expression. Mechanisms controlling immediate early and early genes expression are well documented, in contrast to those controlling late genes expression. Indeed, it is known that late genes are expressed after viral DNA replication. Furthermore, late genes promoters have a different structure of those of immediate early, early and cellular genes. They are essentially characterized by the presence of a TATT box instead of the canonical TATA-box. EBV has the feature to encode for a TBP-like, BcRF1 protein that is essential but not sufficient for late viral genes expression and that binds specifically to the TATT sequence of the late viral promoters. Our goal was primarily to identify the set of viral proteins necessary for late EBV genes expression. Thus, we have demonstrated that in addition to the BcRF1 protein, EBV encode for five other proteins necessary for late viral genes expression: BFRF2, BGLF3, BVLF1, BDLF4 and BDLF3.5. These six viral proteins form a complex enables to recruit the RNA polymerase II on the late viral promoters. We have named this complex vPIC (viral Pre-Initiation Complex) by analogy with the cellular complex of transcription initiation, formed around the TATA-Binding Protein (TBP). The vPIC is conserved in β- and γ-Herpesvirus subfamilies, but not in the α-Herpesvirus subfamily. Furthermore, our results suggest that vPIC interacts with the viral DNA replication complex, which can explain the link between viral DNA replication and late viral genes transcription. These results bring new insights to the mechanisms regulating late EBV genes expression and provide a basis for the search of new antiviral drugs.

Durant la réplication du chromosome bactérien, le désappariement du double brin d'ADN est réalisé par l'hélicase hexamérique DnaB. Chez Escherichia coli, le positionnement de l'hexamère de DnaB sur l'ADN simple brin dans le sens 5'-3'est permis par le facteur de chargement. La primase DnaG interagit ensuite avec l'hélicase pour former le primosome. Chez Helicobacter pylori, aucun facteur de chargement n'a été identifié, ce qui est également le cas pour la majorité des espèces bactériennes. De plus, DnaB d'H. pylori (HpDnaB) peut complémenter des souches mutantes d'E.coli DnaBts et DnaCts suggérant que HpDnaB peut jouer le rôle des deux protéines. Pour mieux comprendre le mode d'action de HpDnaB, nous avons résolu sa structure cristallographique à une résolution de 6.7 Å. Celle-ci révèle que la protéine s'assemble en dodécamère, formé par deux hexamères interagissant par leurs domaines N-terminaux (NTD). Nos expériences en diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS) montrent que le dodécamère de HpDnaB adopte une conformation modifiée et dynamique en solution. Nous avons ensuite étudié la structure de HpDnaB après interaction avec HpDnaGHBD et/ou l'ADN simple brin par chromatographie d'exclusion stérique couplée à la diffusion de la lumière multi-angles (SEC-MALS) et par SAXS. Ces expériences suggèrent qu'après interaction avec HpDnaGHBD, le double hexamère est dissocié en simples hexamères formant un complexe avec HpDnaGHBD. De plus, HpDnaB forme des hexamères avec l'ADN simple brin en présence d'AMP-PNP. L'ensemble de nos résultats suggère que la formation du primosome d'H. pylori conduit à la dissociation du dodécamère en deux complexes HpDnaB6•HpDnaG3 / During bacterial chromosomal replication, unwinding of double stranded DNA is performed by the hexameric helicase DnaB. In Escherichia coli, the positioning of DnaB hexamers onto replication forks in the 5’to 3’ direction is dedicated by helicase loader. DnaB then interacts with the DnaG primase helicase binding domain (DnaGHBD) to form the primosome. Helicobacter pylori does not encode for a DnaC homologue, which is also the case of most bacterial species. Moreover, H. pylori DnaB (HpDnaB) could complement two temperature–sensitive mutants of E. coli dnaBts and dnaCts, suggesting that the HpDnaB was able to bypass DnaC in these cells. To gain insights into HpDnaB mode of activation, we have solved the crystal structure of HpDnaB at 6.7Å resolution. The structure reveals a novel dodecameric organisation where HpDnaB assembles as planar stack-twisted double hexamers via N-terminal domain (NTD)-rings interactions. Small angle X-ray scattering analysis (SAXS) demonstrates that HpDnaB adopts a modified and dynamic structure in solution but maintains dodecameric architecture. We have then investigated the structure of HpDnaB upon interaction with HpDnaGHBD and/or ssDNA using size exclusion chromatography coupled to multiangle light scattering and SAXS. These experiments show that upon interaction with HpDnaGHBD, HpDnaB double hexamer dissociates into single hexamers to form a complex with HpDnaGHBD. Moreover, we found that HpDnaB also forms hexamers in complex with ssDNA in the presence of AMP-PNP. Collectively, these data suggest that primosome assembly in H. pylori results in the dissociation of the double hexamer into two HpDnaB6•HpDnaG3 sister primosomes

Le matériel génétique contenant l'information des cellules humaines se présente sous forme de chromosomes linéaires dont l'extrémité est protégée par une structure appelée télomères. Les télomères correspondent à une séquence d'ADN répétée, recouverte de protéines spécifiques, qui permettent aux cellules d'étiqueter l'extrémité de leurs chromosomes afin de les différencier des cassures internes de l'ADN nécessitant une réparation. Ainsi, ils jouent un rôle prépondérant dans la protection du génome. Les chromosomes sont organisés et compartimentés dans le noyau de la cellule. Cette organisation est primordiale, la proximité des chromosomes à la membrane nucléaire qui délimite ce noyau est essentielle pour de nombreuses fonctions régulatrices du génome, comme l'activation et la répression des gènes contenant les informations. A chaque division cellulaire, cette organisation est perdue après le désassemblage de la membrane nucléaire et la condensation de la chromatine qui va permettre de correctement répartir les chromosomes entre les cellules filles. Après la division, les noyaux des cellules filles se reforment, la membrane nucléaire est rétablie, et les chromosomes sont repositionnés comme dans la cellule mère. Ce mécanisme de mémoire spatiale est encore inconnu mais est vital au maintien de la stabilité du génome. Une large proportion de télomères sont ancrés à la membrane nucléaire en fin de division, et y restent durant la reformation du noyau. Le laboratoire s'intéresse à cette association afin de caractériser son rôle pendant cette phase clé du cycle cellulaire. Nous cherchons à comprendre ce fonctionnement chez les cellules normales et les cellules de patients atteints de pathologies associées au vieillissement accéléré. Ce projet de thèse à pour but de comprendre l'impact d'une déformation de la membrane nucléaire sur le matériel génétique, et sur l'intégrité des télomères qui protègent l'information génétique. Nous utilisons des techniques de pointe de microscopie, et de biologie cellulaire et moléculaire afin de mieux comprendre le lien entre l'organisation du noyau et le maintien de la stabilité du génome. / The material that contains genetic information of human cells consists in linear chromosomes. The extremities of chromosomes are protected by a specific structure called telomeres. Telomeres are made of repeated DNA sequence, covered by special proteins that prevent cells to recognize extremities of their chromosomes as internal DNA break, thus not to perform unnecessary repair that will result in genome instability. Therefore, telomeres play a major role in genome protection. Chromosomes are spatially organized in the cell nucleus. This organization is important as positioning of chromosomes in the nucleus ensures proper regulatory functions of the genome, such as activation or repression of genes. During the cell division process, this organization is lost after nuclear membrane disassembly and the condensation of DNA, to allow correct segregation of chromosomes between daughter cells. After cell division, the nuclei of daughter cells are reformed, and nuclear membrane is reconstructed. The chromosomes are then relocated as in the mother cell. This mechanism of spatial memory is not well understood yet, but is key to maintain stability of the genome. A large proportion of telomeres are anchored to the nuclear membrane at the end of mitosis, and stay during nuclear envelope reformation. Our laboratory focuses on characterizing the role of telomere anchoring during this important phase of cell cycle. In particular, we want to understand this mechanism in normal cells and cells from patients with premature aging disease. This thesis aims to understand the impact of nuclear envelope abnormalities on the genetic material, in particular on telomere integrity, as telomeres protect genetic information. Here, we use microscopy approaches and techniques of molecular and cellular biology to better understand the link between nuclear organisation and genome stability maintenance.

Le virus du papillome humain (VPH) est l’agent étiologique du cancer du col utérin, ainsi que d’autre néoplasies anogénitales et des voies aérodigestives supérieures. La réplication de son génome d’ADN double brin est assurée par les protéines virales E1 et E2, de concert avec la machinerie cellulaire de réplication. E1 assure le déroulement de l’ADN en aval de la fourche de réplication, grâce à son activité hélicase, et orchestre la duplication du génome viral. Nos travaux antérieurs ont démontré que le domaine N-terminal de E1 contient un motif de liaison à la protéine cellulaire p80/UAF1 qui est hautement conservé chez tous les VPH anogénitaux. L’intégrité de ce motif est essentielle au maintien de l’épisome viral. Les travaux présentés dans cette thèse ont d’abord déterminé que le motif de liaison à UAF1 n’est pas requis pour l’assemblage du pré-réplisome viral, mais important pour la réplication subséquente de l’ADN du VPH. Nous avons constaté qu’en présence de E1 et E2, UAF1 est relocalisé dans des foyers nucléaires typiques de sites de réplication du virus et qu’en outre, UAF1 s’associe physiquement à l’origine de réplication du VPH. Nous avons aussi déterminé que l’inhibition du recrutement de UAF1 par la surexpression d’un peptide dérivé de E1 (N40) contenant le motif de liaison à UAF1 réduit la réplication de l’ADN viral. Cette observation soutient le modèle selon lequel UAF1 est relocalisé par E1 au réplisome pour promouvoir la réplication de l’ADN viral. UAF1 est une protéine à domaine WD40 n’encodant aucune activité enzymatique et présumée exploiter des interactions protéine-protéine pour accomplir sa fonction. Nous avons donc investigué les protéines associées à UAF1 dans des cellules du col utérin et avons détecté des interactions avec les enzymes de déubiquitination USP1, USP12 et USP46, ainsi qu’avec la phosphatase PHLPP1. Nous avons établi que E1 forme un complexe ternaire avec UAF1 et n’importe laquelle des USP associés : USP1, USP12 ou USP46. Ces USP sont relocalisés au noyau par E1 et s’associent à l’ADN viral. De plus, l’activité enzymatique des USP est essentielle à la réplication optimale du génome viral. Au contraire, PHLPP1 ne forme pas de complexe avec E1, puisque leurs interactions respectives avec UAF1 sont mutuellement exclusives. PHLPP1 contient un peptide de liaison à UAF1 homologue à celui de E1. Ce peptide dérivé de PHLPP1 (P1) interagit avec le complexe UAF1-USP et, similairement au peptide N40, antagonise l’interaction E1-UAF1. Incidemment, la surexpression du peptide P1 inhibe la réplication de l’ADN viral. La génération de protéines chimériques entre P1 et des variants de E1 (E1Δ) défectifs pour l’interaction avec UAF1 restaure la capacité de E1Δ à interagir avec UAF1 et USP46, ainsi qu’à relocaliser UAF1 dans les foyers nucléaires contenant E1 et E2. Ce recrutement artificiel de UAF1 et des USP promeut la réplication de l’ADN viral, un phénotype dépendant de l’activité déubiquitinase du complexe. Globalement, nos travaux suggèrent que la protéine E1 du VPH interagit avec UAF1 afin de recruter au réplisome un complexe de déubiquitination dont l’activité est importante pour la réplication de l’ADN viral. / Human papillomaviruses (HPVs) are the etiological agents of cervical cancers, as well as multiple other anogenital and oropharyngeal neoplesias. The viral proteins E1 and E2, in concert with the host DNA replication machinery, mediate the replication of the double-stranded DNA genome of HPV. E1 exploits its helicase activity to unwind DNA ahead of the replication fork and orchestrates synthesis of the viral genome. Our previous work demonstrated that E1 contains in its N-terminus a binding motif for the host protein p80/UAF1, a domain that is highly conserved amongst anogenital HPVs. The integrity of this region was essential for the maintenance of the viral episome. The research presented here first demonstrated that the UAF1-binding motif is not required for the assembly of the E1-E2-Origin pre-replisome, but important for the following viral DNA replication. We have determined that UAF1 is relocalized, in presence of E1 and E2, in nuclear foci reminiscent of viral DNA synthesis sites. UAF1 also physically interacted, through E1-binding, with the viral origin of replication. Moreover, we have shown that inhibition of E1-UAF1 interaction through the overexpression of an E1-derived and UAF1-binding peptide, N40, interferes with HPV DNA replication. This is in agreement with the model according to which E1 recruits UAF1 to the replisome to promote viral DNA replication. UAF1 is a WD40-containing protein with no enzymatic activity and presumed to function through interactions with other cellular factors. We have investigated the UAF1 interaction network in cervical cells and discovered that UAF1 associates with the deubiquitinating enzymes USP1, USP12 and USP46, as well as with the phosphatase PHLPP1. E1 was found to assemble as a ternary complex with UAF1 and any of the associated USPs: USP1, USP12 or USP46. These USPs were also relocalized by E1 to the nucleus and they associated with the viral origin in presence of E2. Moreover, their enzymatic function was essential for optimal viral genome replication. In contrast, PHLPP1 did not associate with E1, and the interactions of the latter proteins with UAF1 were shown to be mutually exclusive. PHLPP1 contains a UAF1-binding motif homologous to the one encoded within E1. This PHLPP1-derived peptide, P1, interacts with the UAF1-USP complex and, similarly to N40, competes with E1-UAF1 interaction. Accordingly, P1 overexpression leads to inhibition of HPV DNA replication. The fusion of the peptide P1 to an E1 protein (E1Δ) defective for UAF1-binding restored its capacity to interact with UAF1 and USP46, as well as to relocalize UAF1 into E1-E2-containing nuclear foci. This artificial recruitment of UAF1 and of the associated USPs increased viral DNA replication, a process that involved the enzymatic activity of the USPs. Collectively, our work suggests that HPV E1 interacts with UAF1 in order to recruit to the replisome a deubiquitinating complex whose activity is required for optimal viral DNA replication.

La synthèse translésionnelle (TLS) est un processus important pour franchir des lésions de l’ADN au cours de la duplication du génome dans les cellules humaines. Le modèle « d’échange de polymérases » suggère que la polymérase réplicative est transitoirement remplacée par une polymérase spécialisée, qui va franchir le dommage et permettre de continuer la synthèse d’ADN. Ces ADN polymérases spécialisées appelées Pol êta (η), iota (ι), kappa (κ), zêta (ζ), et Rev1 ont été bien caractérisées pour leur capacité à franchir différents types de lésions in vitro. Un concept en émergence est que ces enzymes pourraient également être requises pour répliquer des zones spécifiques du génome qui sont « difficiles à répliquer ». Polζ est constituée d’au moins 2 sous-unités : Rev3 qui est la sous-unité catalytique et Rev7 sous-unité augmentant l’activité de Rev3L. Jusqu'ici, la fonction la mieux caractérisée de Polζ était de sa capacité à catalyser l'extension d'un mésappariement en face d'une lésion d'ADN. Cependant, il a été montré que la sous unité catalytique Rev3 de levure et humaine interagissent avec les deux sous-unités accessoires de Polδ que sont pol31 et pol32 chez la levure et p50 et p66 chez l’humain. Il a aussi été mis en évidence que Rev3L est importante pour la réplication des sites fragiles (SFCs) dans les cellules humaines, zones connues pour être à l’origine d’une instabilité génétique et pour être répliquées de manière tardive (en G2/M). Tout ceci suggère que Polζ pourrait jouer un rôle dans la réplication du génome non endommagé, et plus spécifiquement lorsque des barrières naturelles (e.g. ADN non-B) entravent la progression normale des fourches de réplication.Chez la levure S. cerevisiae, l’inactivation du gène rev3 est viable et conduit à une diminution de la mutagenèse spontanée ou induite par des agents génotoxiques suggérant que Polζ est impliquée dans le franchissement mutagène des lésions endogènes ou induite. En revanche, l’inactivation du gène Rev3L chez la souris est embryonnaire létale alors que la plupart des autres ADN polymérases spécialisées ne sont pas vitales. Ceci suggère que Polζ a acquis des fonctions essentielles au cours de l’évolution qui restent inconnues à ce jour. Les fibroblastes embryonnaires murins (MEF) Rev3L-/- présente une grande instabilité génétique spontanée associée une forte augmentation de cassures et de translocations chromosomiques indiquant que Polζ est directement impliquée dans le maintien de la stabilité du génome. Afin de clarifier le rôle de cette polymérase spécialisée au cours de la réplication du génome, nous avons entrepris de procéder à une étude sur les relations structure/fonction/localisation de la protéine Rev3. Notre étude met en évidence que la progression en phase S des cellules Rev3L-/- est fortement perturbée, notamment en fin de phase S. Dans ces cellules invalidées pour Rev3L, on constate des changements dans le programme de réplication et plus particulièrement dans des régions de transition (TTR) répliquées à partir du milieu de la phase S. Nous montrons aussi un enrichissement global en marques épigénétiques répressives (marques associées à l’hétérochromatine et méthylation de l’ADN) suggérant qu’un ralentissement de la progression de la fourche de réplication à des loci particuliers peut promouvoir une hétérochromatinisation lorsque Rev3L est invalidé. De manière intéressante, nous constatons une diminution de l’expression de plusieurs gènes impliqués dans le développement qui pourrait peut-être expliquer la létalité embryonnaire constatée en absence de Rev3L. Enfin, nous mettons en évidence une interaction directe entre la protéine d’organisation de l’hétérochromatine HP1α et Rev3L via un motif PxVxL. Tout ceci nous suggère fortement que Polζ pourrait assister les ADN polymérases réplicatives Polδ et Polε dans la réplication des domaines compactés de la chromatine en milieu et fin de phase S. / DNA polymerase zeta (Polζ) is a key player in Translesion DNA synthesis (TLS). Polζ is unique among TLS polymerases in mammalian cells, because inactivation of the gene encoding its catalytic subunit (Rev3L) leads to embryonic lethality in the mouse. However little is known about its biological functions under normal growth conditions.Here we show that S phase progression is impaired in Rev3L-/- MEFs with a delay in mid and late S phase. Genome-wide profiling of replication timing revealed that Rev3L inactivation induces changes in the temporal replication program, mainly in particular genomic regions in which the replication machinery propagates a slower velocity. We also highlighted a global enrichment of repressive histone modifications as well as hypermethylation of major satellites DNA repeats in Rev3L-deficient cells, suggesting that fork movements can slow down or stall in specific locations, and a delay in restarting forks could promote heterochromatin formation in Rev3L-depleted cells. As a direct or indirect consequence, we found that several genes involved in growth and development are down-regulated in Rev3L-/- MEFs, which might potentially explain the embryonic lethality observed in Rev3L KO mice. Finally we discovered that HP1α directly interacts and recruits Rev3L to pericentromeric heterochromatin. We therefore propose that Polζ has been co-opted by evolution to assist DNA polymerase ε and δ in duplicating condensed chromatin domains during mid and late S phase.

Chez les plantes, les méristèmes ont la capacité de se diviser tout au long de la vie de la plante, qui peut dépasser 1000 ans pour certaines espèces. De plus, la lignée germinale n'est pas définie dès l'embryogenèse mais provient des cellules méristématiques et s’individualise relativement tard au cours du développement. Il est donc crucial que le cycle cellulaire soit finement régulé afin d'éviter une accumulation de mutations au cours de la croissance végétative et de la reproduction. Chez tous les eucaryotes, les protéines CDT1 sont impliquées dans l’initiation de la réplication de l'ADN en permettant la formation du complexe de pré-réplication et l'ouverture de la fourche de réplication avant le recrutement des ADN polymérases. Leur activité est strictement régulée afin que chaque partie du génome soit répliquée une fois et une seule au cours de la phase S. Le génome d’Arabidopsis thaliana code pour deux protéines homologues du facteur d’initiation de la réplication CDT1 (CDC10 Target1) : AtCDT1a et AtCDT1b. La sur-expression de CDT1a stimule la réplication de l’ADN et, chez Arabidopsis, cette protéine aurait une double fonction dans la régulation du cycle cellulaire et dans la division des plastes. Nous avons étudié ici les fonctions respectives de AtCDT1a et AtCDT1b. En utilisant des approches génétiques, nous avons montré que ces deux protéines jouent des rôles partiellement redondants pour maintenir l’intégrité du génome et permettre le développement des gamétophytes. De plus, en réalisant une approche de TAP (Tandem Affinity Purification), nous avons montré qu’elles interagissent avec l’ADN polymérase ε, une ADN polymérase réplicative, ouvrant de nouvelles perspectives de recherche concernant le rôle des protéines CDT1de plantes lors de la réplication de l'ADN. En parallèle, nous avons essayé d'élucider les spécificités de CDT1a et plus précisément de son extension N-terminale qui est absente de CDT1b. Nous avons constaté que ce domaine de CDT1a est requis pour son interaction avec l'ADN pol ε, et que les mutants cdt1a complémentés par une version tronquée de la protéine présentent une croissance considérablement réduite, un arrêt prématuré du méristème racinaire, et un stress de l'ADN constitutif, ce qui suggère que l’interaction CDT1a/pol ε est indispensable à la progression normale de la phase S. L’ensemble de nos résultats ont révélé de nouvelles fonctions pour les homologues de CDT1 de plantes. Une question importante sera de déterminer si celles-ci sont caractéristiques du cycle cellulaire chez les plantes, ou si nous avons identifié de nouveaux mécanismes qui sont conservés chez tous les eucaryotes. / In plants, meristems retain the ability to divide throughout the life cycle of plants, which can last for over 1000 years in some species. Furthermore, the germline is not laid down early during embryogenesis but originates from the meristematic cells relatively late during development. Thus, accurate cell cycle regulation is of utmost importance to avoid the accumulation of mutations during vegetative growth and reproduction. In all eukaryotes, CDT1 proteins are involved in the onset of DNA replication by allowing the formation of the pre-replication complex and subsequent opening of the replication fork. Their activity is strictly regulated to ensure faithful duplication of the genome during S-phase. The Arabidopsis thaliana genome encodes two homologs of the replication licensing factor CDT1 (CDC10 Target 1): AtCDT1a and AtCDT1b. Overexpression of CDT1a stimulates DNA replication, and this protein would have a function both in cell cycle regulation and plastid division.Here, we have investigated the respective roles of Arabidopsis CDT1a and CDT1b. Using genetic approaches, we have shown that the two proteins function partially redundantly to maintain genome integrity and allow gametophyte development. In addition, using Tandem Affinity Purification, we have shown that they interact with DNA pol ε, a replicative DNA polymerase, opening further research prospects regarding the role of plant CDT1 proteins during DNA replication. In parallel, we have tried to elucidate the specificities of CDT1a and more precisely of its N-terminal extension that is absent from CDT1b. We have found that this domain of CDT1a is required for its interaction with DNA pol ε, and that cdt1a mutants complemented with a truncated version of the protein show drastically reduced growth, premature meristem arrest, and constitutive DNA stress, suggesting that the CDT1a/pol ε interaction is indispensible to the normal progression of S-phase. Together, our results have unraveled new functions for plant CDT1 homologues, and one important aspect of future research will be to determine whether these are features of the plant cell cycle, or if we have identified new mechanisms that are conserved in all eukaryotes.

Des liens de caténation sont progressivement crées lors de la réplication de l’ADN et sont responsables de la cohésion des chromatides sœurs. La topoisomérase IV est une topoisomérase de type II impliquée dans la résolution de ces liens de caténation accumulés derrière la fourche de réplication, et lors de la dernière étape de séparation des chromatides sœurs à la fin de la réplication. Nous avons étudié la liaison de la topoIV à l’ADN ainsi que son activité catalytique à l’aide de méthodes de biologie moléculaire et de génomique. Une expérience de ChIPseq a révélé que l’interaction de la topoIV de chez E.coli avec l’ADN est contrôlée par la réplication. Durant la réplication, la topoIV a accès à des centaines de sites sur l’ADN mais ne se lie qu’à quelques sites où elle exerce son activité catalytique. La conformation locale de la chromatine et l’expression des gènes influencent la sélection de certains sites. De plus, une forte liaison et une activité catalytique renforcée a été trouvée au site de résolution des dimers, dif. Le site dif est situé à l’opposé de l’origine de réplication dans le macrodomaine ter. Nous avons montré qu’il existe une interaction physique et fonctionnelle entre la topoIV et la recombinase XerCD, qui agit au site dif. Cette interaction est médiée par MatP, une protéine essentielle dans l’organisation du macrodomaine ter. L’ensemble de ces résultats montre que la topoIV, XerCD/dif et MatP œuvrent ensemble pour permettre l’étape finale de ségrégation des chromosomes lors du cycle cellulaire. / Catenation links between sister chromatids are formed progressively during DNA replication and are involved in the establishment of sister chromatid cohesion. Topo IV is a bacterial type II topoisomerase involved in the removal of catenation links both behind replication forks and after replication during the final separation of sister chromosomes. We have investigated the global DNA-binding and catalytic activity of Topo IV in E. coli using genomic and molecular biology approaches. ChIP-seq revealed that Topo IV interaction with the E. coli chromosome is controlled by DNA replication. During replication, Topo IV has access to most of the genome but only selects a few hundred specific sites for its activity. Local chromatin and gene expression context influence site selection. Moreover strong DNA-binding and catalytic activities are found at the chromosome dimer resolution site, dif, located opposite the origin of replication. We reveal a physical and functional interaction between Topo IV and the XerCD recombinases acting at the dif site. This interaction is modulated by MatP, a protein involved in the organization of the Ter macrodomain. These results show that Topo IV, XerCD/dif and MatP are part of a network dedicated to the final step of chromosome management during the cell cycle.

Les virus bactériens (bactériophages), durant leur co-évolution avec les bactéries, ont su trouver de nombreuses voies pour détourner les machineries cellulaires dans le but de se multiplier efficacement. L’infection par le phage dès son entrée dans le cytoplasme est un bouleversement pour la bactérie en termes de ressources monopolisées à ses dépens et probablement de restructuration de l’espace cytoplasmique. Dans ce travail de thèse, l’impact de l’infection de la bactérie Gram-positive Bacillus subtilis par le bactériophage SPP1 a été étudié.La réplication de l’ADN est initiée par des protéines précoces virales. Elle mène au chargement de l’hélicase virale gp40 sur l’origine de réplication de SPP1 dont les brins d’ADN ont été ouverts par la protéine de liaison à l’origine, gp38. Le réplisome bactérien est ensuite recruté de manière massive au sein de l’usine de réplication formant un foyer défini dans le cytoplasme bactérien. L’interaction de gp40 avec les protéines cellulaires DnaX et DnaG assure fort probablement le recrutement du complexe cellulaire au foyer de réplication. La quantité d’ADN viral synthétisée représente presque 500 copies d’ADN viral par bactérie après 30 minutes d’infection, ce qui est équivalent à la taille de 5 génomes de B. subtilis. Des études de FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) montrent que l’usine de réplication est très dynamique. Ce comportement est inhibé par la présence de HPUra montrant qu’il dépend de la présence d’un réplisome actif.Les concatémères résultant de la réplication de l’ADN viral sont le substrat pour l’encapsidation du génome de SPP1 dans des procapsides préformées. La maturation de ces procapsides en particules virales infectieuses suit une voie d’assemblage spécifique. Deux protéines rapportrices de différentes étapes de cette voie ont été suivies : la protéine d’échafaudage gp11, présente à l’intérieur de la procapside avant encapsidation de l’ADN, et la protéine auxiliaire gp12, qui se fixe à la surface de la capside pendant l’encapsidation. Les procapsides colocalisent partiellement avec l’usine de réplication du génome viral. Après encapsidation de l’ADN, les capsides vont s’accumuler dans des foyers de stockage qui ont une localisation indépendante du foyer de réplication. Cette organisation est également observée dans des bactéries très allongées où deux régions de stockage sont retrouvées situées de part et d’autre de l’usine de réplication mais éloignées des pôles cellulaires. La microscopie électronique combinée à des immuno-marquages révèlent que cette compartimentation corrèle avec une réorganisation majeure de l’ultrastructure du cytoplasme bactérien.L’assemblage et la dynamique des foyers viraux dans la bactérie ont été suivis pendant toute la durée du cycle viral dans un système de microfluidique. Elle montre que les étapes de réplication de l’ADN viral et la formation de la particule du phage sont des processus compartimentés dans le cytoplasme de la bactérie tant spatialement que temporellement. Bien que la croissance cellulaire soit retardée, les bactéries continuent de s’allonger et de se diviser pendant l’infection par SPP1. Le virus exploite donc de manière efficace les machineries cellulaires et l’architecture de la bactérie pour une multiplication optimale. Ces stratégies sont probablement utilisées par de nombreux phages pour remodeler la cellule bactérienne à leur avantage. / During the co-evolution of viruses and cells, viruses exploited numerous ways to hijack cell machineries for their optimal multiplication and dissemination. Phage infection is a major challenge to bacteria, exploiting extensively cellular biosynthetic ressources and possibly re-organizing the cytoplasm space. The work in this thesis investigated the cellular impact of infection by SPP1, a well-characterized model tailed bacteriophage that infects the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis.Viral DNA replication is initiated by early phage proteins whose activity culminates in loading of the SPP1 helicase gp40 at the melted phage origin of replication. The bacterial replisome is then massively recruited to the phage replication factory that is localized at a defined position of the cytoplasm. The interaction of gp40 with its two cellular partners DnaX and DnaG mediates most likely the hijacking of the B. subtilis replication machinery. More than 500 copies of the viral genome are synthesized within 30 minutes after initiation of infection, which is roughly the equivalent to five B. subtilis genomes. FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) experiments showed that the viral DNA factory is highly dynamic, a behavior that depends on active DNA replication.The concatemers resulting from DNA replication are the substrate for encapsidation of the SPP1 genome into preformed procapsids. Maturation of procapsids to infectious viral particles follows a defined pathway. The SPP1 scaffolding protein gp11, that occupies the interior of the procapsid before DNA packaging, and gp12, that binds to capsids during DNA packaging, were followed to dissect the steps of this process. Procapsids partially co-localize with DNA replication factories. After packaging the DNA-filled capsids fully segregate to spatially distinct warehouses where viral particles accumulate. Recruitment of SPP1 proteins to these compartments recapitulates the sequential order of their assembly to build the viral particle. The replication factory is most frequently flanked by two warehouses. Such pattern is also observed in very elongated cells where the viral compartments remain localized nearby each others and far from the bacterial poles. Immuno-electron microscopy of cryo-sections from infected cells highlights a complete remodelling of the bacterial cytoplasm dedicated to virus multiplication.The assembly and dynamics of the SPP1 replication factory and virions warehouses were visualized during the complete phage infection cycle in microfluidics experiments. The viral compartments are well individualized in the cytoplasm both in terms of space and time. Although bacterial growth is retarded, cells continue to elongate and to divide during SPP1 infection. Structuration of viral factories appears as a very efficient way for SPP1 to exploit bacterial resources and cytoplasmic space to optimize its multiplication. This strategy might be widely used by phages for remodelling the bacterial cell.