A regulação da expressão gênica ocorre como um fenômeno essencial nos processos celulares em resposta a dinamicidade mútua estabelecida entre um organismo e seu meio. Além dos elementos reguladores já conhecidos, como fatores de transcrição ou modificações pós-transcricionais, observa-se um crescente interesse no papel de regulação desempenhado por moléculas de RNA não codificadores (ncRNA), que podem atuar em vários níveis de processamento da informação biológica. Organismos modelos oferecem uma forma conveniente de pesquisa e diferentes grupos buscam direcionar seus estudos para um entendimento mais amplo no que se refere aos mecanismos celulares presentes nesses organismos. Apesar da existência de alguns elementos conhecidos para o organismo modelo Halobacterium salinarum, acreditamos que nem todos seus elementos de ncRNAs foram identificados. Nesse contexto, desenvolvemos uma análise in silico para a identificação de novos ncRNAs em H. salinarum NRC-1 e aplicamos metodologias para a predição de possíveis interações RNA-Proteína. Com base em uma pespectiva de integração de dados e diferentes metodologias existentes, modelos de Aprendizado de Máquina (AM) foram criados e utilizados para a definição de regiões candidatas a ncRNAs. De acordo com os resultados, 42 novos ncRNAs puderam ser identificados e possibilitaram completar o catálogo de genes ncRNAs de H. salinarum NRC-1 e aumentar o universo conhecido destes em 82%. A análise dos resultados obtidos por outras abordagens disponíveis para a identificação de ncRNAs corroboram com alguns dos candidatos sugeridos neste trabalho. Adicionalmente, foram aplicados e avaliados métodos, também baseados em AM, para a identificação de candidatos à interação com a proteína de interesse LSm, presente no organismo em estudo, no intuito de incluir uma possível caracterização funcional de ncRNAs. Os resultados alcançados na aplicação metodologias para a predição de interações RNA-Proteína não foram suficientes para a criação de um modelo com predições de alto grau de acurácia porém, contribuem como estudos preliminares e discussões para o desenvolvimento de outras estratégias. / The gene expression regulation occurs on different cell levels in response to dynamics established between an organism and its environment. In addition to the regulatory elements already known, for instance, transcription factors or post-translation modifications, there is growing interests in the regulatory role played by non-coding RNA molecules (ncRNA) whose functions can be performed on different level of biological information processing. Model organisms allow a convenient way to work on laboratory and different research groups aiming to guide their studies for a mutual and wide understanding of the cellular mechanisms present on these organisms. Although some ncRNAs elements have been found in Halobacterium salinarum model organism we believe that not enough is knowing about these genomic regions. In these context, an in silico analysis for ncRNAs identification and RNA-protein prediction approach were applied to H. salinarum NRC-1. Considering a data integration perspective and some available methodologies, several machine learning models was built and used to designate candidate ncRNAs genome regions. According to achieve results, 42 new ncRNAs could be identified, increasing 82% the total of known ncRNAs in H. salinarum NRC-1. Combing analysis with other available tools, it had been observed that some suggested candidates also was found with different methodologies and thus, it highlights the proposed results. Additionally, we developed and analyzed methods, also machine learning based, to predict ncRNAs candidates to interact with LSm protein, present on the interested model organism aiming a basic ncRNA characterization. The achieved results in this part was not satisfactory since the applied models were not substantially accurate predictions. However, we believe that these preliminary results can contribute with some discussions to new different approaches.

Estudos recentes têm revelado que uma fração significativa do transcriptoma de eucariotos é composta por RNAs não codificadores longos (lncRNAs). Este trabalho investigou o padrão de expressão de um conjunto de lncRNAs originados a partir de regiões intrônicas de genes codificadores de proteínas em três linhagens celulares tumorais humanas utilizando microarranjos de DNA customizados. Realizamos uma série de análises in silico com a perspectiva de identificar propriedades globais desses transcritos, tais como a abundância relativa em diferentes tecidos, características evolutivas, estruturais e regulatórias, além de possíveis funções celulares. Avaliamos também a contribuição da metilação do DNA, um mecanismo de silenciamento epigenético da expressão de genes codificadores de proteínas, na regulação da expressão de lncRNAs intrônicos. Observamos que uma fração dos lncRNAs intrônicos detectados nas linhagens estudadas são conservados evolutivamente, tem padrão de expressão tecido específico, e está enriquecida em elementos regulatórios na sua extremidade 5\'. Foram identificados subconjuntos de lncRNAs intrônicos possivelmente atuando sobre genes associados a vias regulatórias importantes para o controle do desenvolvimento de organismos e ciclo celular. Comparativamente a mRNAs, uma menor proporção de lncRNAs intrônicos possui ilhas CpGs (CGIs) na vizinhança de seu início de transcrição. Apesar disso, observamos que um subconjunto desses transcritos teve sua expressão sensível ao tratamento com o agente desmetilante de DNA 5-AZA, demonstrando que lncRNAs intrônicos transcritos podem estar sujeitos a regulação transcricional mediada por metilação do DNA. Dentre os lncRNAs intrônicos regulados por metilação do DNA, destaca-se o lncRNA AS-APP, cuja expressão aumentou em 25 a 80 vezes nas linhagens celulares DU-145 e HEK293, respectivamente, após tratamento com 5-AZA. Este lncRNA possui uma CGI metilada e um promotor ativo a cerca de 4 kb de distância do seu início de transcrição conhecido. O aumento da transcrição do lncRNA AS-APP após desmetilação do DNA correlacionou-se a uma diminuição significativa dos níveis de expressão do mRNA do gene APP. Este resultado sugere uma possível ação regulatória em cis do lncRNA AS-APP no locus APP, um importante gene envolvido na doença de Alzheimer e com expressão associada ao prognóstico de alguns tipos de câncer. Os resultados obtidos neste trabalho reforçam a ideia de que lncRNAs intrônicos constituem unidades transcricionais independentes que se encontram sobre controle regulatório nos diferentes tipos celulares. Foi gerado também um catálogo de lncRNAs intrônicos regulados por metilação que permitirá a seleção de candidatos com maior potencial de relevância funcional para caracterização detalhada. / Recent studies have revealed that a significant fraction of the eukaryotic transcriptome is composed of long noncoding RNAs (lncRNAs). This work investigated the expression pattern in three human tumor cell lines of a set of lncRNAs originated from intronic regions of protein coding RNAs, using custom DNA oligoarrays. In silico analyses were performed to identify global properties of these transcripts such as relative abundance in different human tissues, regulatory, evolutionary and structural aspects, as well as their possible cellular functions. In addition, we evaluated the contribution of DNA methylation, an important epigenetic mechanism that control the expression of protein coding genes, in the regulation of intronic lncRNAs expression. We found that a fraction of the intronic lncRNAs detected in the cell lines are evolutionarily conserved, show a tissue specific expression pattern, and is enriched in regulatory elements at their 5\' end region. Subsets of intronic lncRNAs possibly acting on genes associated to important regulatory pathways controlling organism development and cell cycle were identified. A smaller proportion of intronic lncRNAs relative to mRNAs displayed CpG islands (CGI) in the vicinity of the transcription start site. Notwithstanding, we observed that a subset of these transcripts responded to treatment with the DNA demethylation agent 5-AZA, demonstrating that intronic lncRNAs may be under transcriptional regulation mediated by DNA methylation. Among intronic lncRNAs regulated by DNA demethylation, stands out AS-APP lncRNA, which was up regulated 25 to 80 times in DU-145 and HEK293 cell lines following 5-AZA treatment, respectively,. This lncRNAs has a methylated CGI and an active promoter at 4-kb upstream from its known transcription start site. Increased AS-APP lncRNA transcription following DNA demethylation correlated with a significant decrease of APP gene messenger RNA levels. This finding suggests a possible cis-regulatory action of the lncRNA AS-APP in the APP locus, an important gene involved in Alzheimer disease and whose expression is associated with prognosis of different cancer types. The results obtained in this study reinforce the idea that intronic lncRNAs constitute independent transcriptional units under regulatory control in the different cell types. It was generated a catalog of intronic lncRNAs regulated by DNA methylation that will allow the selection of candidates with higher potential of functional relevance for detailed characterization

Os genes MGC16121 e CR596471 localizam-se no cromossomo X (Xq26) entre os loci HPRT1 e PLAC1, uma região rica em genes associados com a reprodução humana. A importância de tais genes reside na possibilidade de estarem envolvidos no desenvolvimento placentário e fetal e de serem expressos em poucos tecidos normais. Camundongos portadores de deleções próximas do gene ortólogo HPRT1 de humanos apresentam cerca de um terço do tamanho dos camundongos selvagens ou em alguns casos são natimortos. No entanto, este fenótipo não é observado quando o gene está mutado. Assim, pode-se supor que o fenótipo anormal das cobaias não é resultado da deficiência do HPRT1, mas sim de genes e/ou microRNAs (miRNAs) próximos a ele. Estes resultados abrem perspectivas em relação ao estudo dos genes MGC16121, CR596471 e miRNAs das vizinhanças. O objetivo deste trabalho foi caracterizar a estrutura, a expressão e o mecanismo de regulação por metilação dos genes MGC16121 e CR596471. Adicionalmente foram analisados quanto ao perfil de expressão e regulação por metilação os miRNAs das vizinhanças (miR-424, 503, 450a, 450b-5p e 542-3p). O gene MGC16121 mostrou-se específico de placenta e também expresso em 50% das 18 linhagens tumorais analisadas. Já CR596471 e os miRNAs das vizinhanças foram mais expressos em placenta do que qualquer outro tecido normal analisado, sendo o primeiro expresso também em 100% das linhagens tumorais avaliadas. Houve correlação positiva e significativa entre todos os genes e miRNAs em relação à expressão em tecidos normais, porém o mesmo não foi observado para linhagens tumorais. A respeito da regulação, os genes CR596471 e MGC16121 e os miRNAs miR-424, 503 e 450a foram regulados negativamente por metilação do DNA em pelo menos uma das três linhagens tratadas com o agente demetilante 5-aza-2-deoxicitidina. Apoiando este fato, os dinucleotídeos CpG das ilhas CpGs situadas próximas às regiões 5 dos genes CR596471 e MGC16121 foram pelo menos em parte desmetilados após o mesmo tratamento.Os dados relativos à estrutura primária dos genes indicam que os transcritos, apesar de serem lncRNAs apresentaram características de mRNAs. Para MGC16121 foi determinado um transcrito composto de 3 éxons e, para CR596471, um transcrito composto de 3 éxons e outro composto de 2 éxons. Os transcritos aqui determinados são relativamente conservados quando comparados a sequências de RNA encontradas em outros mamíferos, principalmente em primatas. Adicionalmente, o transcrito de MGC16121 possui subestruturas secundárias visivelmente semelhantes com aquelas dos transcritos homólogos encontrados em alguns primatas. De acordo com os resultados, o gene MGC16121 pode ser considerado um possível bom marcador para diagnóstico, prognóstico e talvez para terapias contra cânceres. Todavia, mais experimentos devem ser realizados para verificar a função dos genes MGC16212 e CR5976471, além de avaliar mais robustamente a capacidade do gene MGC16121 ser utilizado como ferramenta na medicina contra o câncer. / CR596471 and MGC16121 genes lie on chromosome X (Xq26) between the HPRT1 and PLAC1 loci, a region rich in genes associated with human reproduction. The importance of such genes is the possibility that they might be involved in placental and fetal development, aware that they are expressed in few normal tissues. Deletions in mice around the orthologous gene of human HPRT1 affect their development or lead to stillbirth. However, this phenotype is not observed when this gene is mutated. So we can assume that the abnormal phenotype of mice cannot be due to HPRT1 deficiency, but to genes and/or microRNAs (miRNAs) nearby. These results support the idea of investigating the mechanisms involved in the regulation of the MGC16121 and CR596471 genes, and their neighbor miRNAs. This study aimed to characterize the structure, expression and regulation mechanism by methylation of genes MGC16121 and CR596471. In addition, the expression profile and methylation regulation of the neighbor miRNAs (miR-424, 503, 450a, 450b-5p and 542-3p) were analyzed. MGC16121 was demonstrated to be placenta specific and expressed in 50% of 18 tumor cell lines analyzed. CR596471 and the neighbor miRNAs were more expressed in placenta than in any other normal tissue analyzed. The former was also expressed in all tumor cell lines evaluated. There was significant and positive correlation between all genes and miRNAs regarding normal tissue expression. However, the same was not observed for the tumor cell lines. With respect to regulation, the genes CR596471 and MGC16121, and miRNAs miR-424, 503 and 450a were negatively regulated by DNA methylation at least in one of the three cell lines treated with the demethylating agent 5- aza-2-deoxycytidine. Supporting these results, the CpG dinucleotides from CpG islands located near the CR596471 and MGC16121 5 regions were at least partially demethylated after the same treatment. The data concerning to genes primary structures indicate that the transcripts, despite of being considered lncRNAs, presented mRNAs characteristics. It was determined one transcript for MGC16121 gene which consisted of three exons, and for CR596471 gene, two transcripts were found, one with three exons and other composed of two exons. The transcripts herein determined are relatively conserved when compared to RNAs sequences found in other mammals, mostly in primates. Besides, the MGC16121 transcript presents similar secondary substructures to those found in homologous transcripts from other primate species. According to the results, MGC16121 gene could be considered a possible good biomarker to diagnosis, prognosis and perhaps to therapies against cancers. Nevertheless, more experiments must be accomplished in order to verify the functions of MGC16121 and CR596471 genes, in addition to evaluate more robustly the competence of MGC16121 gene to be used as a tool in medicine against cancer.

A dengue é uma infecção viral sistêmica que pode se manifestar clinicamente de diversas formas, desde febres leves a hemorragia e síndrome do choque, condições potencialmente fatais. Diversos estudos já foram publicados investigando as mudanças globais de expressão que ocorrem durante a evolução da doença nesses diferentes quadros clínicos. Porém, nenhum desses estudos analisou o papel dos RNAs não codificadores longos (lncRNAs) na progressão da doença. Neste projeto, foi realizada uma metanálise dos dados de expressão provenientes desses estudos de dengue focando na expressão de lncRNAs e seus possíveis mecanismos de regulação gênica. Foram identificados dezenas de lncRNAs cuja expressão aumenta ou diminui em pacientes infectados com dengue comparado com pessoas saudáveis. Através de análise de \"guilty-by-association\", procurou-se identificar genes codificadores de proteína possivelmente regulados por esses lncRNAs ou genes que os regulem. Nossos resultados fornecem evidência de novos mecanismos de regulação entre lncRNAs e mRNAs. / Dengue fever is a systemic viral infection that can manifest clinically in a variety of ways, from mild fever to potentially fatal conditions such as hemorrhage and shock syndrome. Several studies have already been published investigating the global changes in expression that occur during the evolution of the disease in these different clinical settings. However, none of these studies analyzed the role of long non-coding RNAs (lncRNAs) in disease progression. In this project, we performed a meta-analysis of transcriptome data obtained from these dengue studies and focused on the expression of lncRNAs and their possible mechanisms of gene regulation. Dozens of lncRNAs have been identified whose expression increases or decreases in patients infected with dengue compared to healthy individuals. Through guilty-by-association analysis, we identified several lncRNAs that possibly regulate protein coding genes. Our results provide evidence of novel regulatory mechanisms between lncRNAs and mRNAs.

RNAs não codificadores longos (lncRNAs) compõem uma fração significativa do transcriptoma. Alterações na expressão de lncRNAs já foram observadas em vários cânceres humanos, mas ainda não foram exploradas no adenocarcinoma pancreático ductal (PDAC), uma doença devastadora e agressiva para a qual faltam métodos para diagnóstico precoce e tratamentos efetivos. Utilizando uma plataforma de microarranjo de cDNA com sondas para 984 lncRNAs e 2371 mRNAs, o presente estudo identificou conjuntos de lncRNAs expressos em 38 amostras clínicas pancreáticas. O enriquecimento de (i) elementos regulatórios associados às regiões promotoras (H3K4me3); (ii) possíveis inícios de transcrição (CAGE-tags); (iii) presença de elementos conservados sugere que ao menos uma fração desses RNAs seja originada a partir de unidades transcricionais independentes, reguladas e possivelmente funcionais. Foram identificadas assinaturas de expressão gênica compostas por mRNA e lncRNAs associadas ao tumor primário e à metástase pancreática. A assinatura gIenica associada à metástase apresentou enriquecimento RNAs intrônicos de loci gênicos associados à via MAPK quinase. O aumento de expressão dos transcritos intrônicos dos loci PPP3CB, MAP3K14 e DAPK1 foi confirmado por qPCR em metástases. Em conjunto, este trabalho aponta para a importância de lncRNAs intrônicos no PDAC e para a necessidade de estudos mais aprofundados para uma melhor compreensão do papel dessa classe de transcritos na biologia da doença. / Long noncoding RNAs (lncRNAs) compose a significant fraction of transcriptome. Altered expression of lncRNAs has been observed in diverse human cancers, but has not being investigated in pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC), a devastating and aggressive disease that lack early diagnosis methods and effective treatments. Using a cDNA microarray platform with probes interrogating 984 lncRNAs and 2371 mRNA, the present study identified subsets of lncRNAs expressed in 38 pancreatic clinical samples. Enrichment of (i) regulatory elements associated to promoter region (H3K4me3); (ii) putative transcription start site (CAGEtags) and (iii) conserved elements, suggest that at least a fraction of these RNAs could be independent transcriptional unit, regulated, an possibly functional. Gene expression signatures comprised of mRNAs and lncRNAs and associated to primary or metastatic tumors were found. A gene signature associated to metastasis was enriched in intronic ncRNAs mapping to gene loci associated to the MAPK pathway. Over expression of intronic RNAs from PPP3CB, MAP3K14 and DAPK1 was confirmed by qPCR in metastatic samples. Taken together, this study points to the importance of intronic lncRNAs in PDAC and for the need to study this class of ncRNAs in greater detail to better understand its role in the biology of PDAC.

O câncer de próstata é o quinto tipo mais comum de câncer no mundo e o mais comum em homens. Fatores clínicos e anatomopatológicos atualmente usados na clínica não são capazes de distinguir entre a doença indolente e a agressiva. Existe uma grande necessidade de novos marcadores de prognóstico, a fim de melhorar o gerenciamento clínico de pacientes de câncer de próstata. Além das anormalidades em genes codificadores de proteínas, alterações em RNAs não codificadores (ncRNAs) contribuem para a patogênese do câncer e, portanto, representam outra fonte potencial de biomarcadores de câncer de próstata. Entretanto, até o momento, poucos estudos de perfis de expressão de ncRNAs foram publicados. Este projeto teve como principal objetivo identificar perfis de expressão de genes codificadores e não codificadores de proteína correlacionados com recorrência de tumor de próstata, a fim de gerar um perfil prognóstico com potencial uso como biomarcadores e elucidar o possível papel de ncRNAs no desenvolvimento do câncer. Para isso, foram analisados os perfis de expressão de genes codificadores e não codificadores de proteína de um conjunto de 42 amostras de tecido tumoral de câncer de próstata de pacientes de amostras de pacientes submetidos à prostatectomia radical, com longo acompanhamento clínico (cinco anos) e conhecida evolução da doença Nós utilizamos microarranjos por nós desenhados e fabricados pela Agilent sob encomenda, interrogando aproximadamente 18.709 transcritos não codificadores longos (>500 nt), sem evidência de splicing, que mapeiam em regiões intrônicas dentro de 5.660 loci genômicos. Os dados de expressão foram extraídos de cada arranjo, normalizados entre todas as 42 amostras de pacientes. Usando uma estratégia de múltipla amostragem, foi identificado um perfil de expressão de mau prognóstico, contendo 51 transcritos intrônicos não codificadores de proteína. O perfil prognóstico de ncRNAs foi aplicado a um conjunto teste independente de 22 pacientes, classificando corretamente 82% das amostras. Uma análise de Kaplan-Meier dos pacientes do conjunto teste indicou que as curvas de sobrevida dos grupos de alto e baixo risco foram significativamente distintas (Log-rank test p = 0,0009; Hazard ratio = 23,4, 95% CI = 3,62 a 151,2), confirmando assim que este classificador é útil para identificar pacientes com alto risco de recorrência. Além disso, estas descobertas indicam um potencial papel destes RNAs intrônicos não codificadores na progressão do tumor de próstata e apontam para os RNAs intrônicos como potenciais novos marcadores de câncer / Prostate cancer is the fifth most common type of cancer in the world, and the most common in men. Clinical and anatomo-pathological factors currently used in clinic are not able to distinguish between the indolent and the aggressive disease. There is a major need of new prognostic makers in order to improve the clinical management of prostate cancer patients. Apart from abnormalities in protein-coding genes, changes in non-coding RNAs (ncRNAs) contribute to the pathogenesis of cancer and thus represent another potential source of prostate cancer biomarkers. However, few studies of expression profiles of ncRNAs have been published. This project aimed to identify expression profiles of protein-coding and non-coding genes correlated to prostate cancer biochemical recurrence. For this, we analyzed the expression profile of 42 prostate cancer samples from patients undergoing radical prostatectomy, with long follow-up (five years), and know disease outcome. We used a custom microarray designed by us and printed by Agilent, that probes 18,709 long (>500 nt) ncRNAs mapping to intronic regions within 5,660 genomic loci. The expression data were extracted from each array and normalized across all 42 samples. Using a multiple random sampling validation strategy, we identified an expression profile of poor prognosis, comprising 51 ncRNAs. The prognostic profile of ncRNAs was applied to an independent test set of 22 patients, correctly classifying 82% of the samples. A Kaplan-Meier analysis of the test set of patients indicated that the survival curves of high and low risk groups were significantly different (Log-rank test p = 0.0009, Hazard ratio = 23.4, 95% CI = 3.62 to 151.2) thus confirming that this classifier is useful for identifying patients at high risk of recurrence. Furthermore, these findings indicate a potential role of these intronic non-coding RNAs in the progression of prostate tumors and points to the intronic ncRNAs as potential new markers of cancer.

A dengue é uma infecção viral sistêmica que pode se manifestar clinicamente de diversas formas, desde febres leves a hemorragia e síndrome do choque, condições potencialmente fatais. Diversos estudos já foram publicados investigando as mudanças globais de expressão que ocorrem durante a evolução da doença nesses diferentes quadros clínicos. Porém, nenhum desses estudos analisou o papel dos RNAs não codificadores longos (lncRNAs) na progressão da doença. Neste projeto, foi realizada uma metanálise dos dados de expressão provenientes desses estudos de dengue focando na expressão de lncRNAs e seus possíveis mecanismos de regulação gênica. Foram identificados dezenas de lncRNAs cuja expressão aumenta ou diminui em pacientes infectados com dengue comparado com pessoas saudáveis. Através de análise de \"guilty-by-association\", procurou-se identificar genes codificadores de proteína possivelmente regulados por esses lncRNAs ou genes que os regulem. Nossos resultados fornecem evidência de novos mecanismos de regulação entre lncRNAs e mRNAs. / Dengue fever is a systemic viral infection that can manifest clinically in a variety of ways, from mild fever to potentially fatal conditions such as hemorrhage and shock syndrome. Several studies have already been published investigating the global changes in expression that occur during the evolution of the disease in these different clinical settings. However, none of these studies analyzed the role of long non-coding RNAs (lncRNAs) in disease progression. In this project, we performed a meta-analysis of transcriptome data obtained from these dengue studies and focused on the expression of lncRNAs and their possible mechanisms of gene regulation. Dozens of lncRNAs have been identified whose expression increases or decreases in patients infected with dengue compared to healthy individuals. Through guilty-by-association analysis, we identified several lncRNAs that possibly regulate protein coding genes. Our results provide evidence of novel regulatory mechanisms between lncRNAs and mRNAs.

RNAs não codificadores longos (lncRNAs) compõem uma fração significativa do transcriptoma. Alterações na expressão de lncRNAs já foram observadas em vários cânceres humanos, mas ainda não foram exploradas no adenocarcinoma pancreático ductal (PDAC), uma doença devastadora e agressiva para a qual faltam métodos para diagnóstico precoce e tratamentos efetivos. Utilizando uma plataforma de microarranjo de cDNA com sondas para 984 lncRNAs e 2371 mRNAs, o presente estudo identificou conjuntos de lncRNAs expressos em 38 amostras clínicas pancreáticas. O enriquecimento de (i) elementos regulatórios associados às regiões promotoras (H3K4me3); (ii) possíveis inícios de transcrição (CAGE-tags); (iii) presença de elementos conservados sugere que ao menos uma fração desses RNAs seja originada a partir de unidades transcricionais independentes, reguladas e possivelmente funcionais. Foram identificadas assinaturas de expressão gênica compostas por mRNA e lncRNAs associadas ao tumor primário e à metástase pancreática. A assinatura gIenica associada à metástase apresentou enriquecimento RNAs intrônicos de loci gênicos associados à via MAPK quinase. O aumento de expressão dos transcritos intrônicos dos loci PPP3CB, MAP3K14 e DAPK1 foi confirmado por qPCR em metástases. Em conjunto, este trabalho aponta para a importância de lncRNAs intrônicos no PDAC e para a necessidade de estudos mais aprofundados para uma melhor compreensão do papel dessa classe de transcritos na biologia da doença. / Long noncoding RNAs (lncRNAs) compose a significant fraction of transcriptome. Altered expression of lncRNAs has been observed in diverse human cancers, but has not being investigated in pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC), a devastating and aggressive disease that lack early diagnosis methods and effective treatments. Using a cDNA microarray platform with probes interrogating 984 lncRNAs and 2371 mRNA, the present study identified subsets of lncRNAs expressed in 38 pancreatic clinical samples. Enrichment of (i) regulatory elements associated to promoter region (H3K4me3); (ii) putative transcription start site (CAGEtags) and (iii) conserved elements, suggest that at least a fraction of these RNAs could be independent transcriptional unit, regulated, an possibly functional. Gene expression signatures comprised of mRNAs and lncRNAs and associated to primary or metastatic tumors were found. A gene signature associated to metastasis was enriched in intronic ncRNAs mapping to gene loci associated to the MAPK pathway. Over expression of intronic RNAs from PPP3CB, MAP3K14 and DAPK1 was confirmed by qPCR in metastatic samples. Taken together, this study points to the importance of intronic lncRNAs in PDAC and for the need to study this class of ncRNAs in greater detail to better understand its role in the biology of PDAC.

O câncer de próstata é o quinto tipo mais comum de câncer no mundo e o mais comum em homens. Fatores clínicos e anatomopatológicos atualmente usados na clínica não são capazes de distinguir entre a doença indolente e a agressiva. Existe uma grande necessidade de novos marcadores de prognóstico, a fim de melhorar o gerenciamento clínico de pacientes de câncer de próstata. Além das anormalidades em genes codificadores de proteínas, alterações em RNAs não codificadores (ncRNAs) contribuem para a patogênese do câncer e, portanto, representam outra fonte potencial de biomarcadores de câncer de próstata. Entretanto, até o momento, poucos estudos de perfis de expressão de ncRNAs foram publicados. Este projeto teve como principal objetivo identificar perfis de expressão de genes codificadores e não codificadores de proteína correlacionados com recorrência de tumor de próstata, a fim de gerar um perfil prognóstico com potencial uso como biomarcadores e elucidar o possível papel de ncRNAs no desenvolvimento do câncer. Para isso, foram analisados os perfis de expressão de genes codificadores e não codificadores de proteína de um conjunto de 42 amostras de tecido tumoral de câncer de próstata de pacientes de amostras de pacientes submetidos à prostatectomia radical, com longo acompanhamento clínico (cinco anos) e conhecida evolução da doença Nós utilizamos microarranjos por nós desenhados e fabricados pela Agilent sob encomenda, interrogando aproximadamente 18.709 transcritos não codificadores longos (>500 nt), sem evidência de splicing, que mapeiam em regiões intrônicas dentro de 5.660 loci genômicos. Os dados de expressão foram extraídos de cada arranjo, normalizados entre todas as 42 amostras de pacientes. Usando uma estratégia de múltipla amostragem, foi identificado um perfil de expressão de mau prognóstico, contendo 51 transcritos intrônicos não codificadores de proteína. O perfil prognóstico de ncRNAs foi aplicado a um conjunto teste independente de 22 pacientes, classificando corretamente 82% das amostras. Uma análise de Kaplan-Meier dos pacientes do conjunto teste indicou que as curvas de sobrevida dos grupos de alto e baixo risco foram significativamente distintas (Log-rank test p = 0,0009; Hazard ratio = 23,4, 95% CI = 3,62 a 151,2), confirmando assim que este classificador é útil para identificar pacientes com alto risco de recorrência. Além disso, estas descobertas indicam um potencial papel destes RNAs intrônicos não codificadores na progressão do tumor de próstata e apontam para os RNAs intrônicos como potenciais novos marcadores de câncer / Prostate cancer is the fifth most common type of cancer in the world, and the most common in men. Clinical and anatomo-pathological factors currently used in clinic are not able to distinguish between the indolent and the aggressive disease. There is a major need of new prognostic makers in order to improve the clinical management of prostate cancer patients. Apart from abnormalities in protein-coding genes, changes in non-coding RNAs (ncRNAs) contribute to the pathogenesis of cancer and thus represent another potential source of prostate cancer biomarkers. However, few studies of expression profiles of ncRNAs have been published. This project aimed to identify expression profiles of protein-coding and non-coding genes correlated to prostate cancer biochemical recurrence. For this, we analyzed the expression profile of 42 prostate cancer samples from patients undergoing radical prostatectomy, with long follow-up (five years), and know disease outcome. We used a custom microarray designed by us and printed by Agilent, that probes 18,709 long (>500 nt) ncRNAs mapping to intronic regions within 5,660 genomic loci. The expression data were extracted from each array and normalized across all 42 samples. Using a multiple random sampling validation strategy, we identified an expression profile of poor prognosis, comprising 51 ncRNAs. The prognostic profile of ncRNAs was applied to an independent test set of 22 patients, correctly classifying 82% of the samples. A Kaplan-Meier analysis of the test set of patients indicated that the survival curves of high and low risk groups were significantly different (Log-rank test p = 0.0009, Hazard ratio = 23.4, 95% CI = 3.62 to 151.2) thus confirming that this classifier is useful for identifying patients at high risk of recurrence. Furthermore, these findings indicate a potential role of these intronic non-coding RNAs in the progression of prostate tumors and points to the intronic ncRNAs as potential new markers of cancer.

Leishmania é um gênero de protozoários tripanossomatídeos, dimórficos, causadores das leishmanioses. As espécies do subgênero Viannia, como Leishmania (Viannia) braziliensis, são causadoras da leishmaniose cutânea e cutâneo-mucosa nas Américas Central e do Sul. A regulação da expressão gênica em Leishmania ocorre preferencialmente no nível póstranscricional com a participação de elementos regulatórios de ação cis e trans e proteínas ligantes de RNA. Neste contexto, RNAs não codificadores (ncRNAs) conhecidos por seus papéis regulatórios em diversos organismos, ainda são pouco explorados em Leishmania. Sendo assim, o presente estudo analisou o transcriptoma de L. braziliensis explorando o conteúdo codificador e não codificador do parasita. A investigação de expressão diferencial (DE), incluindo análises de enriquecimento de ontologias gênicas, confirmou padrões de expressão, por categoria funcional, como os já reportados para outras espécies de Leishmania durante o desenvolvimento. No entanto, a avaliação do conjunto desses genes DE, empregando a ortologia como parâmetro, sugeriu uma possível contribuição de genes parálogos para a diversidade entre espécies de Leishmania. Para a análise de ncRNAs, um pipeline desenvolvido por Patrícia C. Ruy possibilitou a identificação e caracterização de 11372 ncRNAs putativos em L. braziliensis. Análises acerca dos padrões de expressão diferencial foi conduzido e trinta e cinco ncRNAs putativos foram categorizados, selecionados e submetidos a Northern blotting para avaliação do tamanho e confirmação do padrão de expressão; seis genes foram selecionados para análises funcionais subsequentes. Para avaliação de uma possível função para os ncRNAs a serem investigados, foram gerados parasitos nocaute de cinco desses ncRNAs. O crescimento dos parasitos nocaute em cultura axênica não foi afetado pela ausência dos genes mas o perfil de infecção de macrófagos in vitro foi afetado em 4 dos 6 transfectantes; sugerindo que os ncRNAs sejam funcionais. Cinco ncRNAs foram submetidos a ensaios de pull-down e o conjunto de proteínas ligantes desses transcritos foi identificada. Esse estudo do transcriptoma de L. braziliensis contribui para o entendimento da modulação da expressão dos genes codificadores de proteínas, revela o conteúdo de ncRNA putativos, sua expressão diferencial durante o seu desenvolvimento e ensaia os primeiros estudos funcionais sobre os últimos / Leishmania is a genus of trypanosomatid protozoan parasites, causative agents of leishmaniases. Viannia sub-genera species as Leishmania (Viannia) braziliensis are the causative agents of cutaneous and muco-cutaneous leishmaniasis in Central and South America. The gene expression in this parasites is regulated via post-transcriptional mecanisms comprising the action of cis and trans regulatory elements and RNA binding proteins. In this context, non coding RNAs poorly explored as putative factors involved in regulation of gene expression in Leishmania must be investigated. In this study the transcriptome of coding and ncRNAs of L. braziliensis were analysed. Differential expression analysis, including gene ontology enrichment analysis, during the parasite development revealed the expected paterns for gene expression in Leishamnia spp. A comparative analysis, considering up-regulated genes suggested a contribution of paralogues genes to diversity between Leishmania. spp. To uncover putative ncRNAs, a computational pipeline was previous designed identifying and characterizing 11,372 putative ncRNAs in L. braziliensis, allowing a classification into different ncRNAs classes. The differential expression analysis revealed similar patterns to those observed for protein coding genes. Thirty-five putative ncRNAs were categorized, selected and subjected to Northern blotting being 6 of them selected to functional analysis. These selected group was investigated conducting and stablishing knockout lines, that revealed phenotypic differences concerning diminishing in promastigote growth and in vitro macrophage infection, suggesting possible functional roles of ncRNAs in L. braziliensis. Finnaly, the protein interactions of these ncRNAs were revealed and must be explored in the future to uncover possible regulatory roles of this ncRNAs until now, putative in L. braziliensis. This work represents an outline of L. braziliensis transcriptome contributing to improve the understanding of coding and noncoding RNA content in the parasite