A cultura do feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.) se destaca como fonte protéica e mineral para as populações humanas, principalmente, para populações de baixa renda. Dentre os agentes patogênicos, o fungo Colletotrichum lindemuthianum (Sacc. & Magnus) Lams. Scrib., causador da antracnose, é considerado o de maior importância devido aos seus efeitos destrutivos para o feijoeiro. Este estudo teve como objetivo avaliar a expressão de genes candidatos a atuarem na defesa da planta durante a interação incompatível do feijoeiro SEL 1308 e raça 73 do C. lindemuthianum, considerando diferentes tecidos (folhas, epicótilo e hipocótilo) e períodos de interação (24, 48, 72 e 96 horas). Além disso, o trabalho visou a validação de bibliotecas de ESTs (Expressed Sequence Tags) de feijoeiro (MELOTTO et al., 2005) e a análise da estabilidade de possíveis genes de referência para as análises de expressão por RT-qPCR. Foram utilizados 20 genes no estudo: 12 possivelmente responsivos ao patógeno e oito candidatos a genes de referência. A eficiência média das curvas de amplificação e valores dos ciclos e de quantificação (Cq) foram definidos no programa LinRegPCR. A estabilidade dos genes de referência foi avaliada nos programas geNorm e NormFinder. A expressão relativa dos genes alvos e normalizadores e as análises estatísticas foram determinadas no programa REST. As combinações de genes de referência Act2/Ukn2 e InsDeg/Act2 foram utilizadas para normalização dos genes-alvo por RT-qPCR. Os dados de expressão relativa dos transcritos entre as bibliotecas de ESTs foram validados pelo RT-qPCR. Os genes-alvo analisados foram todos responsivos ao sistema fitopatogênico avaliado, revelando perfil transcricional específico nos tecidos e período de interação com o patógeno. Os dados permitiram a disponibilização de genes de referência importantes para análise de expressão por RTqPCR em feijoeiro sob estresse biótico; e indícios para melhor entendimento dos processos envolvidos nos mecanismos de defesa do feijoeiro ao patógeno da antracnose / Common bean crop (Phaseolus vulgaris L.) highlight as protein and mineral source to the human population, especially, for low-income populations. Among the pathogens, Colletotrichum lindemuthianum (Sacc. & Magnus) Lams. - Scrib., which causes anthracnose, is considered the most important due to its destructive effects to common bean. This study aimed to evaluate the expression of candidate genes to act in defense of the plant during the incompatible interaction between common bean SEL 1308 and race 73 of C. lindemuthianum, considering different tissues (leaves, epicotyl and hypocotyl) and periods of interaction (24, 48, 72 and 96 hours). Also, this study attempted the validation of ESTs (Expressed Sequence Tags) libraries of common bean (MELOTTO et al., 2005) and the evaluation of candidate reference genes stability for expression analysis in RT-qPCR. Twenty genes were used: 12 candidate genes responsive to the pathogen and eight candidate reference genes. The average efficiency of amplification curves and the values of quantification cycles (Cq) were defined in LinRegPCR software. The stability of reference genes was evaluated using geNorm and NormFinder softwares. Relative expression of target and normalizer genes and statistical analysis were determined by REST software. The Act2/Ukn2 and InsDeg/Act2 reference genes combinations were used for normalization of target genes by RT-qPCR. The data of relative expression of transcripts between the libraries of ESTs were validated by RT-qPCR. All target genes analyzed were responsive to the pathogenic system evaluated, revealing specific transcriptional profiles in tissues and periods of interaction with the pathogen. The data provided the availability of normalizers important for expression analysis by RTqPCR in beans under biotic stress; and evidences to understand the processes involved in defense mechanisms of common bean against the anthracnose pathogen

O presente estudo teve o objetivo de verificar o padrão de expressão dos genes HOXB13 e HHEX em carcinomas epidermóides de boca (CEB) através das técnicas de Transcriptase Reversa em Reação de Cadeia Polimerase (RT- PCR) e Hibridização In situ (ISH). Fragmentos de tecido tumoral e de tecido não tumoral adjacente à lesão foram obtidos de 30 pacientes portadores de CEB no Serviço de Cirurgia de Cabeça e Pescoço do HC - FMUSP. As amostras tiveram seus cDNAs extraí dos e submetidos à amplificação por PCR. Os “ amplicons” foram visualizados sob luz UV por eletroforese em gel de agarose a 1% contendo brometo de etí dio. A amplificação dos genes foram correlacionadas com a classificação UICC, TNM, graduação histológica, localização e espessura tumoral, invasão de tecidos adjacentes, perineural e vascular. Após seqüenciamento dos “ amplicons” e confirmação dos genes foram confecionadas as sondas de mRNA para realização da técnica de hibridização in situ. Os resultados obtidos através da técnica de RT-PCR mostraram que: a amplificação dos transcritos dos genes HOXB13 e HHEX podem ser detectados tanto no carcinoma epidermóide quanto no tecido não tumoral adjacente à lesão; não existindo diferença na amplificação dos transcritos de ambos genes para os dois grupos de tecido estudados; a amplificação do transcrito do gene HOXB13 mostrou relação estatí stica com os fatores prognósticos: espessura tumoral, invasão perineural e invasão vascular; a amplificação do transcrito do gene HHEX mostrou relação estatí stica com os fatores prognósticos: invasão vascular,envolvimento com os tecidos adjacentes e uma relação inversa com a idade do paciente. A expressão dos transcritos dos genes HOXB13 e HHEX, detectados pela técnica de ISH, mostrou um padrão de marcação consistente e invariável para os tecidos analisados, estando expressos tanto em carcinoma epidermóide quanto no tecido não tumoral adjacentes à lesão. Os resultados apontam para uma correlação entre a expressão do HHEX e do HOXB13 e alguns fatores prognósticos importantes podendo representar um indicador prognóstico valoroso para o entendimento do comportamento biológico do CEB. / The aim of this study was to verify the HOXB13 and HHEX genes expression in oral squamous cell carcinoma (OSCC) using Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) and in situ Hybridization techniques. Tumoral tissues and adjacent non-tumoral oral mucosa specimens were obtained from 30 patients with OSCC at the Head and Neck Surgery Service HC (FMUSP). The samples were cDNA extracted and submitted to the RT-PCR technique. The amplicons were visualized in electrophoresis on a 1% agarose gel with ethidium bromide. Genes expressions were correlated with UICC staging, TNM stage, tumor location, tumor thickness, adjacent tissues involvement, vascular and perineural invasion, and cellular differentiation. Finally, direct sequence analysis was performed on PCR products to confirm cDNA sequence. Riboprobes were confectioned for in situ hybridization analysis. RT-PCR results showed HOXB13 and HHEX transcripts in both tumoral and non-tumoral tissue samples; no statistical correlation was verified between HOXB13/HHEX expressions and tumoral or non-tumoral tissues; there was a positive correlation between HOXB13 tumoral expression and tumor thickness, neural invasion, and vascular invasion; there was a positive correlation between HHEX tumoral expression and adjacent tissue involvement, vascular invasion, and a inverse relationship with patients age; ISH technique exhibited a consistent and invariable pattern of expression for both genes on both tumoral and non-tumoral tissue samples. Present results points out to a correlation between HOXB13 and HHEX expressions, and some important prognostic indicators, and this may represent a valuable tool to understand the biological behavior of OSCC.

As doenças respiratórias agudas (DRAs) são as causas mais comuns de morbidez e mortalidade infantil mundial, podendo ser causadas por uma grande variedade de microorganismos. A fim de se detectar os vírus respiratórios mais comumente associados às infecções agudas do trato respiratório e traçar seu perfil epidemiológico, utilizamos um protocolo de GS RT-PCR (GeneScan Transcrição Reversa-Reação em Cadeia da Polimerase) para a rápida detecção simultânea do, vírus influenza A e B, parainfluenzavirus tipo 1, 2 e 3, picornavirus, metapneumovirus e o adenovírus. As amostras clínicas foram colhidas de crianças menores de cinco anos de idade, apresentando sintomas respiratórios, no Hospital Universitário (HU) da Universidade de São Paulo (USP), durante o ano de 2003. O GS RT-PCR se mostrou uma metodologia sensível e específica, capaz de detectar uma diversidade maior de agentes infecciosos do trato respiratório em relação à Imunofluorescência Indireta (IFI), reduzindo neste estudo a porcentagem de amostras negativas de 69,9% (235 amostras) para 22% (74 amostras). / A reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) assay based on automated fluorescent capillary electrophoresis and GeneScan software analysis was used to detect nine common respiratory viruses in clinical specimens from young children. Assays for human respiratory syncytial virus (HRSV), human parainfluenza viruses 1, 2, and 3, influenza A and B viruses, human metapneumovirus, adenovirus and picornavirus were incorporated into a screening PCR standard assay format. The optimized assay panel was used to test 336 respiratory specimens obtained from children hospitalized with acute respiratory illness (ARI) that had been previously tested by viral culture and indirect immunofluorescence staining (IIF). GS RT-PCR showed be a sensitive and specific methodology, able to detect a larger diversity of respiratory viruses regarding IFI, reducing in this study the percentage of negative samples of 69,9% (235 samples) to 22% (74 samples).

A otimização e padronização de métodos moleculares são fundamentais para evitar distorções nos resultados causadas por processamento de ácidos nucleicos da abundância relativa de micro-organismos de uma amostra. Nos estudos sobre identificação microbiana, a etapa de validação é, na maioria dos casos, negligenciada. As principais etapas em que podem ocorrer vieses capazes de alterar a informação sobre a composição da comunidade microbiana são a extração e a RT-PCR. O rRNA é a molécula ideal para identificar os micro-organismos metabolicamente ativos por estar em maior quantidade dentro da célula. A inexistência de um protocolo de extração de RNA gold standard e de kits comerciais específicos para cada tipo de amostra ambiental pode comprometer as etapas posteriores à extração. O protocolo de extração de RNA adaptado neste trabalho mostrou alta eficácia na lise celular e na remoção de contaminantes co-extraidos, garantindo a integridade e a qualidade do rRNA extraído de amostras contendo altas concentrações de contaminantes. Devido as diferentes características químicas das amostras ambientais, o uso deste protocolo adaptado pode preservar a informação sobre os indivíduos metabolicamente ativos de uma comunidade microbiana. Foram utilizados consórcios artificiais na validação da etapa de PCR. O efeito sinérgico do uso de aditivos, da Taq polimerase de alto rendimento, do programa de sub-ciclagem e da limitação do programa de amplificação em 10 ciclos, mantiveram a proporção dos moldes dos consórcios analisados próximo ao esperado. Após a padronização da técnica de ARDRA, foi definido que há necessidade de entre 500 e 550 UFC para uma cobertura completa da diversidade de lodo ativado. O uso de enzimas combinadas MspI/HaeIII e HhaI/RsaI em uma mesma reação double digest proporcionou a separação dos clones de lodo ativado utilizando menos etapas de ARDRA. E o critério de corte em 3% do total agrupamentos, possibilitou selecionar os perfis mais representativos sem a perda de grupos importantes para a análise das bibliotecas. Foi concluído que, o uso de um protocolo inadequado de extração de RNA de amostras complexas pode gerar extratos contendo contaminantes co-extraidos que interferem na atividade da Taq polimerase e nas enzimas de restrição. Após o sequenciamento de nova geração, foi observado que o uso de diferentes iniciadores de PCR e do pré-processamento manual para os dados obtidos, foram essenciais para ampliar a cobertura observada para a amostra de lodo e melhorar a resolução dos resultados e a profundidade de identificação taxonômica, respectivamente. / The optimization and standardization of molecular methods are fundamental to avoid distortions in the results caused by nucleic acid processing of the relative abundance of microorganisms in a sample. In the studies on microbial identification, the validation step is, in most cases, neglected. The main steps in which biases capable of altering the composition of the microbial community can occur are extraction and RT-PCR. The rRNA is the ideal molecule to identify metabolically active microorganisms because they are in the greatest amount within the cell. The lack of a gold standard RNA extraction protocol and specific commercial kits for each type of environmental sample may compromise the post-extraction steps. The RNA extraction protocol adapted in this work showed high efficacy in cell lysis and in the removal of co-extracted contaminants, guaranteeing the integrity and quality of the rRNA extracted from samples containing high concentrations of contaminants. Due to the different chemical characteristics of the environmental samples, the use of this adapted protocol can preserve the information about the metabolically active individuals of a microbial community. Artificial consortia were used to validate the PCR step. The synergistic effect of the use of additives, the high yield Taq polymerase, the sub-cycling program and the limitation of the amplification program in 10 cycles, kept the proportion of the molds of the consortia analyzed close to the expected. After standardization of the ARDRA technique, it was defined that there is a need for between 500 and 550 CFU for a complete coverage of the diversity of activated sludge. The use of MspI / HaeIII and HhaI / RsaI combined enzymes in the same double digest reaction provided the separation of activated sludge clones using fewer ARDRA steps. And the criterion of cut in 3% of the total groupings, allowed to select the most representative profiles without the loss of important groups for the analysis of the libraries. It was concluded that the use of an inadequate RNA extraction protocol from complex samples can generate extracts containing co-extracted contaminants that interfere with Taq polymerase activity and restriction enzymes. After the sequencing of the new generation, it was observed that the use of different PCR primers and manual preprocessing for the obtained data were essential to increase the coverage observed for the sludge sample and to improve the resolution of the results and the depth of taxonomic identification, respectively.

O presente estudo teve o objetivo de verificar o padrão de expressão dos genes HOXB13 e HHEX em carcinomas epidermóides de boca (CEB) através das técnicas de Transcriptase Reversa em Reação de Cadeia Polimerase (RT- PCR) e Hibridização In situ (ISH). Fragmentos de tecido tumoral e de tecido não tumoral adjacente à lesão foram obtidos de 30 pacientes portadores de CEB no Serviço de Cirurgia de Cabeça e Pescoço do HC - FMUSP. As amostras tiveram seus cDNAs extraí dos e submetidos à amplificação por PCR. Os “ amplicons" foram visualizados sob luz UV por eletroforese em gel de agarose a 1% contendo brometo de etí dio. A amplificação dos genes foram correlacionadas com a classificação UICC, TNM, graduação histológica, localização e espessura tumoral, invasão de tecidos adjacentes, perineural e vascular. Após seqüenciamento dos “ amplicons" e confirmação dos genes foram confecionadas as sondas de mRNA para realização da técnica de hibridização in situ. Os resultados obtidos através da técnica de RT-PCR mostraram que: a amplificação dos transcritos dos genes HOXB13 e HHEX podem ser detectados tanto no carcinoma epidermóide quanto no tecido não tumoral adjacente à lesão; não existindo diferença na amplificação dos transcritos de ambos genes para os dois grupos de tecido estudados; a amplificação do transcrito do gene HOXB13 mostrou relação estatí stica com os fatores prognósticos: espessura tumoral, invasão perineural e invasão vascular; a amplificação do transcrito do gene HHEX mostrou relação estatí stica com os fatores prognósticos: invasão vascular,envolvimento com os tecidos adjacentes e uma relação inversa com a idade do paciente. A expressão dos transcritos dos genes HOXB13 e HHEX, detectados pela técnica de ISH, mostrou um padrão de marcação consistente e invariável para os tecidos analisados, estando expressos tanto em carcinoma epidermóide quanto no tecido não tumoral adjacentes à lesão. Os resultados apontam para uma correlação entre a expressão do HHEX e do HOXB13 e alguns fatores prognósticos importantes podendo representar um indicador prognóstico valoroso para o entendimento do comportamento biológico do CEB. / The aim of this study was to verify the HOXB13 and HHEX genes expression in oral squamous cell carcinoma (OSCC) using Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) and in situ Hybridization techniques. Tumoral tissues and adjacent non-tumoral oral mucosa specimens were obtained from 30 patients with OSCC at the Head and Neck Surgery Service HC (FMUSP). The samples were cDNA extracted and submitted to the RT-PCR technique. The amplicons were visualized in electrophoresis on a 1% agarose gel with ethidium bromide. Genes expressions were correlated with UICC staging, TNM stage, tumor location, tumor thickness, adjacent tissues involvement, vascular and perineural invasion, and cellular differentiation. Finally, direct sequence analysis was performed on PCR products to confirm cDNA sequence. Riboprobes were confectioned for in situ hybridization analysis. RT-PCR results showed HOXB13 and HHEX transcripts in both tumoral and non-tumoral tissue samples; no statistical correlation was verified between HOXB13/HHEX expressions and tumoral or non-tumoral tissues; there was a positive correlation between HOXB13 tumoral expression and tumor thickness, neural invasion, and vascular invasion; there was a positive correlation between HHEX tumoral expression and adjacent tissue involvement, vascular invasion, and a inverse relationship with patients age; ISH technique exhibited a consistent and invariable pattern of expression for both genes on both tumoral and non-tumoral tissue samples. Present results points out to a correlation between HOXB13 and HHEX expressions, and some important prognostic indicators, and this may represent a valuable tool to understand the biological behavior of OSCC.

A leprose dos citros, principal doença viral que afeta a citricultura no Brasil, é causada pelo Citrus leprosis virus C (CiLV-C, gênero Cilevirus). CiLV-C possui um genoma bipartido de RNA de fita simples, polaridade positiva, que codifica para seis proteínas. O vírus é transmitido de planta a planta por ácaros Brevipalpus phoenicis e pode infectar mais de 40 espécies vegetais, produzindo lesões localizadas cloróticas ou necróticas ao redor do sítio de inoculação pelo ácaro. Invariavelmente, o patógeno não realiza movimento sistêmico em nenhuma de suas hospedeiras conhecidas. Para se revelar os mecanismos moleculares que determinam a atípica interação vírus/ácaro/planta, as atividades das principais vias de defesa foram avaliadas durante a infestação de A. thaliana com ácaros avirulíferos e virulíferos para o CiLV-C. A expressão de 19 genes marcadores associados às respostas de defesa do hospedeiro foi verificada mediante PCR quantitativo (RT-qPCR) em um experimento de time course (6, 12 e 24 horas após a infestação, e no momento do aparecimento dos sintomas de leprose). As análises demostraram que os genes envolvidos na via do ácido salicílico (SA) foram induzidos durante a interação com o ácaro e com o vírus. O perfil de expressão dos genes desta via durante a infestação com ácaros virulíferos foi similar ao observado com ácaros avirulíferos, porém a resposta da planta a ambos os estímulos foi mais intensa. Ademais, ambas as vias do ácido jasmônico e etileno foram ativadas durante a interação com o ácaro e reprimidas ao longo da infecção com o vírus, sugerindo uma interferência antagonística mediada pela via do SA. O mecanismo de silenciamento de RNA foi regulado de maneira diferencial em resposta à interação com ácaros avirulíferos e virulíferos. Diante da infecção viral, em tempos iniciais da infecção, as plantas responderam com a ativação de uma primeira linha de defesa mediada por AGO1, e depois alternaram para uma segunda linha de defesa mediada por AGO2. Os resultados indicam a ativação de um processo multifatorial em resposta ao CiLV-C e ao ácaro B. phoenicis em A. thaliana. / Citrus leprosis, the main viral disease affecting citrus orchards in Brazil, is caused by Citrus leprosis virus C (CiLV-C, genus Cilevirus). CiLV-C has a bipartite genome of singled stranded positive RNA, which encodes six proteins. CiLV-C is plant-to-plant transmitted by Brevipalpus phoenicis mites and can infect more than 40 plant species, invariably producing localized chlorotic or necrotic lesions around the site of feeding of the viruliferous mites. Viral long distance movement in its hosts is not accomplished. To unveil the mechanisms determining the unique characteristic of the virus/mite/plant interaction, activities of main plant defense pathways were evaluated during aviruliferous and CiLV-C viruliferous mite infestation in Arabidopsis thaliana. The expression of 19 marker genes involved in defense responses along a time course experiment (6, 12 and 24 hours after infestation, and after appearance of leprosis symptoms) was assessed by RT-qPCR. Analyses showed that genes involved in the salicylic acid (SA) pathway were up-regulated during plant interaction with mite and virus. The SA pathway expression profile observed at the infestation by viruliferous mites resembled those observed for the aviruliferous mites, but plant response to both stimuli was stronger. Both the jasmonic acid and ethylene pathways were activated during mite/plant interaction and were repressed at the course of infection with CiLV-C, suggesting an antagonistic effect mediated by the activated SA pathway. Gene silencing mechanism was differentially regulated in response to both aviruliferous and viruliferous mites. Upon viral infection, plants responded with the activation of an AGO1-mediated first defense line, in early times of infection; and then switched to an AGO2-mediated defense. Results indicate the activation of a multifactorial process in response to CiLV-C and B. phoenicis mites in A. thaliana.

Bei konventionellen Mikroarray-Experimenten zur Genexpressionsanalyse wird fluoreszenz- oder radioaktiv-markierte cDNA oder RNA mit immobilisierten Proben hybridisiert. Für ein gut detektierbares und auswertbares Ergebnis werden jedoch pro Array mindestens 15 - 20 &#181;g Hybridisierungstarget benötigt. Dazu müssen entweder 15 - 20 &#181;g RNA direkt durch Reverse Transkription in markierte cDNA umgeschrieben werden oder bei Vorhandensein von weniger Startmaterial die RNA amplifiziert werden (Standard- Affymetrix-Protokolle, Klur et al. 2004). Oft sind damit zeit- und kostenintensive Probenpräparationen verbunden und das Ergebnis ist nicht immer reproduzierbar. Obwohl es inzwischen einige Protokolle gibt, die dieses Problem zu lösen versuchen (Zhang et al. 2001, Iscove et al. 2002, McClintick et al. 2003, Stirewalt et al. 2004), eine optimale, leicht handbare und reproduzierbare Methode gibt es weiterhin nicht, weshalb in dieser Arbeit ein weiterer Lösungsansatz gesucht wurde.<br> In der vorgestellten Arbeit werden zwei einfache Methoden beschrieben, mit denen Gene aus geringen RNA-Mengen nachgewiesen werden können: erstens die On Chip- RT-PCR mit cDNA als Matrize und zweitens diese Methode als One-Step-Reaktion mit RNA als Matrize.<br><br> Beide Methoden beruhen auf dem Prinzip der PCR an immobilisierten Primern auf einer Chipoberfläche. Diese Möglichkeit der exponentiellen Amplifikation ist reproduzierbar und sensitiv.<br><br> In Experimenten zur Etablierung des On-Chip-PCR-Systems wurden für die Immobilisierung der Primer verschiedene Kopplungsmethoden verwendet. Die affine Kopplung über Biotin- Streptavidin erwies sich als geeignet. Die On-Chip-Reaktion an kovalent gebundenen Primern wurde für amino-modifizierte Primer auf Epoxy-Oberflächen sowie für EDC-Kopplung auf silanisierten Oberflächen gezeigt. Für die letztgenannte Methode wurde die On-Chip-PCR optimiert, dass Spottingkonzentrationen der Primer von 5 - 10&#181;M schon ausreichend sind. Der Einsatz von fluoreszenz-markierten Primern während der PCR ermöglicht eine unmittelbare Auswertung nach der Synthese ohne zusätzliche Detektionsschritte. In dieser Arbeit konnte außerdem mit der vorgestellten Methode der simultane Nachweis zweier Gene gezeigt werden. Die Methode kann noch als Multiplex-Analyse ausgebaut werden, um so mehrere Gene in gleichzeitig einem Ansatz nachweisen zu können.<br><br> Die Ergebnisse der Versuche mit Matrizen aus unterschiedlichen Zelltypen deuten darauf hin, dass die On-Chip-RT-PCR eine weitere optimale Methode für den Nachweis von gering exprimierten Genen bietet. / The detection of low quantities of mRNA is often difficult and methods like microarray analysis require large amount of starting material or have to be amplified before application. The reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) is often the chosen method to detect specific RNA sequences on account of its high sensitivity. The solid phase amplification technology by On-Chip-PCR provides a combination of amplification of rare target material and its on chip detection in one step.<br><br> In this report a novel application for the On-Chip-PCR technology is described. It was suitable to identify mRNA sequences and genes, respectively. For this approach we amplified cDNA sequences using immobilized specific primers and fluorescent labeled primers. They were used for genes coding subunits of the mouse muscle acetylcholine receptor (Chrna1, Chrnb1, Chrnd) and the genes coding for myogenin (Myog), muscle creatine kinase (Ckmm) and Atpase (Atp2a2). The cDNA templates were synthesized before the On-Chip application by Reverse Transcription from mRNA. For this application only at most 500 pg of total-RNA preparation was sufficient for detectable results and no pre-amplification steps were needed.<br><br> Furthermore the handling of RT-PCR could be minimized by using a One-step- RT-PCR protocol. This method used immobilized primers on glassy supports detecting specific mRNA sequences from 5 pg or less of total RNA preparations.<br> Moreover to the detection of low quantities of RNA preparation, low abundant genes could be detected by this method.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A utilização de biomarcadores cardioespecíficos vem sendo recomendado como ferramenta útil na monitoração e identificação precoce de lesão cardíaca, em decorrência do potencial de cardiotoxicidade da terapêutica oncologica. O objetivo do presente estudo foi avaliar o nível plasmático do peptídeo natriurético do tipo B (BNP) e da expressão gênica do BNP e outros genes relacionados a sua síntese, a interleucina-6 (IL-6), fator &#946;1 de transformação de crescimento (TGF-&#946;1) e procolágeno tipo I, mediante a associação dos agentes antineoplásicos docetaxel e ciclofosfamida (TC) e da radiação ionizante (IR) no coração de ratas Wistar, 2 meses após o término do tratamento. Para isso, Ratas Wistar (3-4 meses, n=7) foram irradiadas no coração com dose única de 20Gy, em um campo ântero-posterior de 2x2cm2, em acelerador linear com feixe de energia nominal de 6 MeV; outras (n=7) foram tratadas (4 ciclos, com 7 dias de intervalo) com docetaxel (12,5 mg/Kg) e ciclofosfamida (50 mg/Kg) e irradiadas após 7 dias do tratamento quimioterápico. Como controle (n=7), animais não irradiados e não tratados com quimioterápicos. Após 2 meses do fim do tratamento, a eutanásia dos animais foi realizada. Amostras de plasma e tecido cardíaco, ventrículo esquerdo (VE), foram coletadas. Por ensaio ELISA foi quantificada a concentração plasmática de BNP; parte do tecido cardíaco foi fixado, incluído em parafina e cortado em micrótomo, para assinalar a presença de BNP no VE, avaliação qualitativa, pela técnica de imunohistoquímica (IHQ); e a outra parte para a técnica RT-qPCR, onde foram avaliados a expressão relativa de mRNA dos genes do BNP, IL-6, TGF-&#946;1 e procolágeno tipo I. Na IHQ o grupo controle apresentou uma marcação pontual, enquanto que os grupos tratados apresentaram uma marcação mais difusa, sendo que o grupo TC+IR foi o que apresentou maior dispersão na marcação do BNP no tecido cardíaco. Embora não tenha sido observado no ensaio ELISA uma diferença significativa entre as concentrações plasmáticas de BNP dos grupos tratados em relação ao controle, nota-se uma tendência de aumento no grupo TC+IR. Na analise por RT-qPCR, a expressão relativa de BNP foi similar ao apresentado no ELISA. O grupo TC+IR foi o grupo que apresentou maior expressão gênica de BNP, porém a diferença não é significativa em relação ao controle. A única análise em que se obteve diferença na expressão gênica em relação ao controle foi a do gene IL-6 que apresentou expressão reduzida. Todos os demais genes analisados por RT-qPCR apresentaram uma expressão similar ao controle. Assim, os resultados obtidos sugerem que o BNP não se apresentou como um bom biomarcador cardioespecífico para identificação precoce de lesão cardíaca, no período a qual foi avaliado. As ratas Wistar, 2 meses após a submissão do tratamento, não apresentaram um resultado diferenciado em relação ao controle, nos genes TGF-&#946;1 e procolágeno tipo I, sugerindo ausência de um quadro de remodelamento cardíaco. Entretanto, apresentou redução significativa do gene IL-6, no grupo TC+IR, propondo ação anti-inflamatória do BNP, que no mesmo grupo, apresentou uma tendência de aumento em sua expressão gênica. / The use of specific cardiac biomarkers has been recommended as a useful tool in the early identification and monitoring of cardiac injury, due to the potential cardiotoxicity of oncological therapy. The aim of this study is to investigate, analyze and evaluate the reaction of B-type natriuretic peptide (BNP), interleukin-6 (IL-6), transforming growth factor &#946;1 (TGF-&#946;1) and procollagen type I in its expression and release by the association of antineoplastic agents Docetaxel and Cyclophosphamide (TC) and ionizing radiation (IR) in the heart of Wistar rats, 2 months after the end of treatment. For this, Wistar rats (3-4 months, n = 7) were irradiated in the heart with a single dose of 20 Gy, in a anteroposterior field of 2x2cm2 in linear accelerator with nominal energy beam of 6 MeV, other (n = 7) were treated (four cycles with a 7-day interval) with docetaxel (12.5 mg / kg) and Cyclophosphamide (50 mg / kg) and irradiated after 7 days of chemotherapy. As a control (n = 7), non-irradiated animals not treated with chemotherapy. 2 months after the end of treatment, euthanasia was performed. Samples of plasma and heart tissue, left ventricular (LV) were collected. The plasma concentration of BNP was quantified by ELISA, part of the heart tissue was fixed, embedded in paraffin and cut in microtome, to signal the presence of BNP in the LV, qualitative evaluation by immunohistochemistry (IHC), and the other party to technique RT-qPCR were evaluated in the relative expression of mRNA of the genes of BNP, ANP, IL-6, TGF-&#946;1 and procollagen type I. In the control group IHC showed a marking point, while the treated groups showed a more diffuse labeling, and the CT + RT group showed the greatest dispersion. Although it was not observed in the ELISA assay a significant difference between plasma concentrations of BNP treated groups compared to control, there is an increasing trend in the CT + RT group. In the analysis by RT-qPCR, the relative expression of BNP was similar to that shown in the ELISA. The CT + RT group was the group that showed higher gene expression of BNP, but the difference is not significant compared to control. The only analysis that which obtained difference in gene expression compared to control was the IL-6 gene that showed low expression. All other genes analyzed by RT-qPCR showed an expression similar to control. Therefore, the outcome is that BNP did not appear as a good specific cardiac biomarker for early identification of cardiac disease, within 2 months after treatment in Wistar rats, by effect of the action of cardiotoxic selected treatment protocols, since none of their quantitative assessments showed a differentiated result compared to control, however, there was no evidence that, in the meantime, there would be a scenario in development, or advanced of cardiac remodeling.

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Chez la brebis, les BMPs inhibent la synthèse et la libération de FSH. La détection des ARNm de certaines BMPs dans l’hypophyse et de leurs récepteurs sur les cellules gonadotropes suggère une action paracrine/autocrine des BMPs sur la production de FSH. L’objectif de cette thèse a visé à déterminer l’importance des BMPs hypophysaires, en particulier BMP-4, dans la régulation de la sécrétion de FSH chez la brebis. Nous montrons que l’expression des ARNm du système BMP-4,analysée par RT-PCR en temps réel, ne varie pas au cours du cycle oestrien ou in vitro quelque soit le temps d’incubation (6h-48h) et le traitement (GnRH, oestradiol, activine) des cellules hypophysaires.Afin de déterminer si les cellules hypophysaires ovines sécrètent des BMPs, des milieux conditionnés(MC) hypophysaires ont été soumis à un test d’activité biologique reposant sur des cellules embryonnaires transfectées avec un élément de réponse BMPs couplé au gène rapporteur luciférase.Aucun effet des MC n’a été observé sur l’activité luciférase comparé au milieu non conditionnésuggérant l’absence ou la très faible activité BMP des MC, et cela quelque soit le temps d’incubation(6h-48h) et le traitement (GnRH, oestradiol, activine) des cellules hypophysaires. Toutefois, nous détectons une activité inhibitrice de BMPs qui est augmentée par la GnRH et l’oestradiol suggérant l’implication d’inhibiteurs de BMPs dans la régulation de la production de FSH. En conclusion,l’ensemble de nos résultats n’est pas en faveur d’un rôle de BMP-4 hypophysaire dans la synthèse de FSH chez l’adulte. Un rôle des BMPs au niveau hypophysaire via la voie endocrine peut s’envisager puisque nous avons mis en évidence une bioactivité de type BMP dans le sérum ovin. Les inhibiteurs BMPs produits par l’hypophyse, qui restent à identifier, pourraient moduler la biodisponibilité des BMPs atteignant l’hypophyse par la voie sanguine. / BMPs inhibit FSH synthesis and release in ewe. The detection of BMP mRNAs in the pituitary as well as the colocalisation of the two types of BMP receptors on gonadotrope cells suggest that these BMPs can exert paracrine/autocrine actions on FSH production. The aim of this thesis work was to determine the importance of pituitary BMPs in the regulation of FSH production in the ewe. We showed that the level of mRNAs for BMP-4 system, analyzed by real-time RT-PCR, did not vary across the oestrous cycle or in vitro whatever the incubation period (6h-48h) and the treatment (GnRH, oestradiol, activin) of pituitary cells. By using a bioactivity test based on embryonic mesenchymal cells transfected with an expression construct containing a BMP-responsive element fused to firefly luciferase reporter gene,we detected no BMP activity within conditioned media from pituitary cells whatever the incubation period (6h-48h) and the treatment (GnRH, oestradiol, activin) of the pituitary cells. However, we detected a BMP inhibitory activity which is increased by GnRH and oestradiol suggesting the implication of BMP inhibitor(s) in FSH regulation. In conclusion, the results are not in favor of a role for pituitary BMP-4 in the regulation of FSH synthesis in adult ewe. An endocrine action of BMPs at pituitary level can be evoked since BMP bioactivity was detected within ovine serum. BMP inhibitors that remain to be identified can modulate the bioavailability of BMPs reaching the pituitary by the blood way.