Submitted by Ricardo Cedraz Duque Moliterno (ricardo.moliterno@uefs.br) on 2015-10-15T01:03:28Z No. of bitstreams: 1 tese_MarcieneAmorimRodrigues.pdf: 2638970 bytes, checksum: d5ff79afee71b478fcb964476ba3b346 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-15T01:03:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_MarcieneAmorimRodrigues.pdf: 2638970 bytes, checksum: d5ff79afee71b478fcb964476ba3b346 (MD5) Previous issue date: 2015-08-31 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / The finger drop of banana is closely related to the maturation process and involves the softening and weakening of the pedicel. The aim of this study was to evaluate the genetic diversity of banana genotypes with contrasting levels of fruit finger drop by means of molecular markers and evaluate the susceptibility and resistance to finger drop from anatomical studies and analysis of gene expression via real-time quantitative PCR.The genotyping data generated by microsatellites was carried out based on the number of base pairs of each fragment and dendrogram cluster calculated by UPGMA method. Of the 30 microsatellite primer evaluated, 139 alleles were obtained, with the average of 4.66 alleles per locus. No relationship was found between the polymorphism detected by microsatellite markers and the degree of finger drop fruit. For the anatomical characterization, genotypes in the maturation stages 4, 5 and 6, and from different ploidy levels and finger drop resistance patterns, were used. In genotype 017041-01, susceptible, the presence of air parenchyma, was observed, a feature which was not evidenced in the resistant genotypes genotypes BB France, Khai Nai and BRS On Preciosa. Higher values of variable AF and increased deposition of lignin in the vascular bundles, were related to finger drop resistance. The values of Ct (cycle threshold) were used to determine the gene expression difference on cell wall modifier genes (PEL1, EXP1 and XTH4) between different stages of maturation in the finger drop zone (ZD) and in the middle of the fruit (control zone-ZC). To perform the analysis of relative expression, the 2? ?? CT method, was used. RT-qPCR analysis showed that there was a differential expression between the stages of maturation. Ploidy levels and resistance patterns, did not show correlation with the results of the expression. Genes XTH4 and PEL1 showed expression profiles related to finger drop in fruits in different genotypes being good candidates for functional studies in bananas, and may be useful in strategies of genetic improvement aiming the production of banana fruits with resistance to finger drop. / O despencamento natural dos frutos da bananeira est? estreitamente relacionado com o processo de matura??o e envolve o amolecimento e enfraquecimento do pedicelo. O objetivo deste trabalho foi estudar a diversidade gen?tica de gen?tipos de bananeira com n?veis contrastantes ao despencamento dos frutos por meio de marcadores moleculares e avaliar a suscetibilidade e resist?ncia ao despencamento a partir de estudos anat?micos e an?lise de express?o g?nica via PCR quantitativo em tempo real. A genotipagem dos dados gerados pelos microssat?lites foi realizada com base no n?mero de pares de base de cada fragmento e para o agrupamento no dendrograma, utilizou-se o m?todo UPGMA. Dos 30 iniciadores microssat?lites avaliados, obteve-se 139 alelos, com m?dia de 4,66 alelos por loco. N?o foi observada rela??o entre o polimorfismo detectado pelos marcadores microssat?lites e o grau de despencamento dos frutos Para a caracteriza??o anat?mica, foram utilizados gen?tipos nos est?dios de matura??o 4, 5 e 6, de diferentes ploidias e padr?es de resist?ncia ao despencamento. No gen?tipo suscet?vel 017041-01 foi observada presen?a marcante de par?nquima aer?fero, caracter?stica que n?o foi evidenciada nos gen?tipos resistentes BB Fran?a, Khai Nai On e BRS Preciosa. As mudan?as anat?micas, observadas durante o amadurecimento nos est?dios de matura??o, foram mais evidentes no gen?tipo suscet?vel 017041-01. Maiores valores da vari?vel AF e maior deposi??o de lignina nos feixes vasculares mostraram-se relacionados ? resist?ncia ao despencamento. Os valores dos Ct (cycle threshold) foram utilizados para determinar a diferen?a da express?o g?nica relativa dos genes modificadores da parede celular (PEL1, EXP1 e XTH4) entre diferentes est?dios de matura??o na zona de despencamento (ZD) e na regi?o mediana da casca (zona controle - ZC). Para realizar a an?lise de express?o relativa, foi utilizado o m?todo 2? ?? CT. Os resultados finais da an?lise por RT-qPCR mostraram que houve uma express?o diferencial entre os est?dios de matura??o nos gen?tipos estudados. Os genes PEL1 e XTH4 demonstraram perfis de express?o relacionados com o despencamento dos frutos em diferentes gen?tipos sendo bons candidatos para estudos funcionais em bananeira, podendo ser utilizado para direcionar o programa de melhoramento da cultura visando ? produ??o de frutos com resist?ncia para essa caracter?stica.

<p>Dokazivanje virusnih infekcija pĉela od velikog je interesa za pravilnu procjenu odnosa izmeĊu domaćina i potencijalnog patogena. Do izrade ove doktorske teze, na teritoriji Bosne i Hercegovine nije bilo prouĉavanja koja bi dokaz virusnih infekcija pĉela dovela do mogućnosti kliniĉke procjene patolo&scaron;kog odnosa za eko-genotip prilagoĊene pĉelinje zajednice. Evolucijski adaptirani virusi medonosne pĉele Apis mellifera carnica, sa stanovi&scaron;ta veterinarske entomologije, veterinarske virusologije i infektivnih bolesti, te saznanja veterinarskog servisa uop&scaron;te, nisu bili dovoljno prepoznati. Pojava i dostupnost molekularnih dijagnostiĉkih metoda omogućile su senzitivno i specifiĉno dokazivanje dijela genoma virusa koji inficiraju pĉelinje zajednice. Iz ekstrahovanih uzoraka templata razliĉitih uzoraka homogenizata sluĉajno uzorkovanih pĉela, RNK, sa jednim parom prajmera za svaki virus, pojedinaĉno, redoslijedom: BQCV, DWV, SBV, ABPV, KBV, CBPV uraĊeni su amplifikacijski protokoli i dobijeni rezultati za klasiĉan, end point, RT-PCR. Ovom doktorskom disertacijom dobijeni su prvi rezultati koji se odnose na utvrĊivanje prisustva i ra&scaron;irenosti virusnih infekcija kod vrste Apis mellifera u pĉelinjacima Bosne i Hercegovine. Od oko dvadeset virusa koji inficiraju pĉele i pĉelinje zajednice, metodama primjenjive molekularne dijagnostike u ovoj doktorskoj tezi dokazivali smo prisustvo virusnih infekcija za &scaron;est najvi&scaron;e prouĉavanih virusa pĉela. Dobijeni rezultati dokazali su prisustvo pet od &scaron;est traţenih virusa sa razliĉitim kombinacijama koinfekcija te raznolikom prostornom distribucijom virusa. Poznavanje sloţenih mehanizama virusnih infekcija pĉelinjih zajednica neophodnost je koja sa novim saznanjima progla&scaron;ava neke od virusa emergentnim patogenima, koji bitno naru&scaron;avaju opstanak pĉelinje zajednice. U patolo&scaron;ko-sinergistiĉkom odnosu sa nametnikom pĉelinje zajednice Varroa destructor neki pĉelinji virusi uzroci su globalno registrovanih gubitaka. Dio istraţivanja u radu odnosio se na terensko prouĉavanje dinamike prisustva grinje Varroa destructor u pĉelinjim zajednicama. Za pravilno dono&scaron;enje suda o uzroku ugibanja pĉelinjih zajednica, pored postojećih zahtjeva kontrole patogena pĉela definisanih procedurama dijagnostiĉkog manuala i Koda OIE-a, bilo bi potrebno imati i rezultate kojim bi se dokazalo kvalitativno i kvantitativno prisustvo virusa kod vrste Apis mellifera. UvoĊenje i standardizacija molekularno-biolo&scaron;kih metoda u rutinskoj dijagnostici virusnih bolesti pĉela je opravdano. Samo je pitanje vremena kada će virusne infekcije pĉela biti predmet rutinske dijagnostike kojim se kontroli&scaron;ezdravstveni status pĉelinje zajednice.</p> / <p>Evidence of viral infection of bees is of great interest for the proper assessment of the relationship between host and pathogen potential. By making this doctoral thesis on the territory of Bosnia and Herzegovina, where before was no present study of evidence of viral infections, lead to ability on clinical evaluation of pathological relations for eco-genotype adapted colonies. Evolutionarily adapted viruses honeybee Apis mellifera, from the veterinary entomology, veterinary virology and infectious diseases, and knowledge of the veterinary services in general, have not been recognized enough. The appearance and availability of molecular diagnostic methods have allowed sensitive and specific detection part of the genome of the virus that infects the colonies. Templates were extracted from samples of different patterns, homogenisate, randomly sampled bees, RNA, with a pair of primers for each virus, respectively, in the order: BQCV, DWV, SBV, ABPV, KBV, CBPV amplification protocols were done and the results obtained by conventional, end point, RT -PCR. This doctoral dissertation obtained the first results concerning the determination of the presence and spread of viral infections in the species Apis mellifera in Bosnia and Herzegovina. From about twenty viruses that can infect bees and hives using diagnostic methods applicable in this doctoral thesis we demonstrate the presence of viral infections of six most studied viruses of bees. The obtained results showed the presence five of the six essential viruses in forms of co-infection with different combinations and varied virus spatial distribution. Awareness of the complex mechanisms of viral infections in colonies is that the new knowledge proclaimed a virus as &quot;emergent pathogen&quot; that significantly impairs the survival of honeybee colonies. The pathogenic synergistic relationship with the parasite Varroa destructor causes that bee viruses are globally listed as reasons for losses. Part of the research work was related to the field study of the dynamics of the presence of Varroa destructor mites in honey bee colonies. For a accurate judgment of the deaths of bee colonies, in addition to existing requirements bee pathogen control procedures defined by diagnostic Manuals and Code of the OIE, it would be necessary to have the results to prove the qualitative and quantitative presence of the virus in the species Apis mellifera. The introduction and standardization of molecular biological methods in routine diagnosis of viral diseases of bees is justified. It is only a matter of time before the virus infections of bees will be subject to routine diagnostics which controls the health of bee colonies</p>

In den letzten Jahren erreichten viele neue (emerging) Viren Europa, die zum Teil (z.T.) zoonotisch auf den Menschen übertragbar sind. So musste man sich mit Geflügel- und Schweinegrippe, Blauzungenkrankheit, Infektiöser Anämie der Einhufer oder auch SARS (severe acute respiratory syndrome) auseinandersetzen. Bedingt durch verschiedene Faktoren, wie Klimawandel oder zunehmende Globalisierung und damit einhergehendem Verkehr zwischen den Kontinenten verbesserten sich auch die Bedingungen für die Virusverbreitung, so dass viele für Deutschland untypische Krankheitserreger auch hier auftraten. Das West-Nil-Virus (WNV) ist in Europa bereits endemisch verbreitet und könnte somit eine besondere Gefahr für Deutschland darstellen. Es ist ein bekannter Zoonose-Erreger, und sein Eintrag und die rasche Verbreitung des Virus in Amerika 1999 zeigten wie gefährlich neue Viren in naiven Populationen sein können. Über die Verbreitung des Virus in Deutschland gibt es nur wenige Studien z.B. des Robert-Koch-Instituts (LINKE et al. 2007a) und des Friedrich-Loeffler-Instituts (SEIDOWSKI et al. 2010), wobei in keiner Studie tote Vögel als Untersuchungsmaterial genutzt wurden. Da das WNV in Amerika mit einem auffälligen Vogelsterben einherging, ist es naheliegend, den Virusnachweis zuerst bei toten Vögeln zu erbringen.

Legeleistungseinbußen – vor allem mit verminderter Eischalenqualität – stellen in einem Legehennenbetrieb hohe wirtschaftliche Verluste dar. Impfungen gegen entsprechende Erreger, u.a. gegen das aviäre Metapneumovirus (aMPV), sind daher weit verbreitet. AMPV ist seit den 70er Jahren als Auslöser der Rhinotracheitis der Puten (Turkey Rhinotracheitis; TRT) und des sogenannten Swollen Head Syndroms (SHS) der Hühner bekannt. Jedoch liegen nur wenige epidemiologische Studien zu der Verbreitung des Virus und dessen Subtypen in Legehennenbetrieben vor. Ziel der vorliegenden Studie war es daher, die Verbreitung des aMPV, vor allem der Subtypen A und B, zu unterschiedlichen Zeiten der Legeperiode zu untersuchen, um ein besseres Verständnis über den Zeitpunkt der Erstinfektionen sowie evtl. Re- oder Neuinfektionen zu erhalten. Dafür wurden erstmals 18 Legehennenherden in Sachsen alle drei Monate über die gesamte Legeperiode auf das Vorkommen von aMPV-RNA und aMPV-spezifischer Antikörper untersucht. Verschiedene Haltungssysteme wurden berücksichtigt, um ein unterschiedliches seuchenhygienisches Risiko unter Praxisbedingungen bewerten zu können. Pro Herde wurden von je zehn Hühnern Trachealtupfer und Serumproben entnommen. Die Tupferproben wurden mittels duplex nested RT-PCR untersucht, die Serumproben mittels zweier kommerzieller ELISA-Tests. In jeder Herde gelang der aMPV-RNA-Nachweis mindestens einmal zu unterschiedlichen Zeitpunkten. Bereits bei der Einstallung konnten in 17 Herden aMPV-spezifische Antikörper und/oder aMPV-RNA nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse zeigen die hohe Verbreitungsrate des aMPV in Legehennenbetrieben. Bereits in der Aufzucht fand in der Mehrzahl der Herden eine aMPV-Infektion statt; während der Legeperiode kam es zu häufigen Re- oder Neuinfektionen bzw. zu einer langen Persistenz des Virus. Subtyp A kam alleine (51%) mehr als doppelt so häufig vor wie ausschließlich Subtyp B (22%). Doppelinfektionen mit den Subtypen A und B (27%) wurden ungefähr so häufig gefunden wie eine Infektion ausschließlich mit Subtyp B. Ein Wechsel der Subtypen A und B während einer Legeperiode wurde am häufigsten beobachtet: zehn der 18 Herden (56%) zeigten diesen Verlauf. Ausschließlich Subtyp A in allen positiven Entnahmen pro Betrieb wurde in vier von 18 Herden gefunden, ausschließlich Subtyp B in drei von 18 Herden, Subtyp A gemeinsam mit Subtyp B in einer von 18 Herden. Dies verdeutlicht die Dominanz des Subtyps A in Legehennenbetrieben. Obwohl drei Herden während der Aufzucht mit einer Subtyp B-Vakzine geimpft wurden, gelang der aMPV-RNA Nachweis in bis zu vier Probenentnahmen. Der Subtyp A dominierte auch in den geimpften Herden. Neben dem Subtyp B Feldvirus wurde in einer Herde zum Zeitpunkt der Einstallung auch ein Subtyp B ähnlich dem Impfstamm nachgewiesen. Es ist daher davon auszugehen, dass trotz bekannter Kreuzimmunität eine Impfung nicht vor Infektionen schützt, aber die Persistenz von Subtyp B vermindert. Die Analyse der Serumproben mit zwei kommerziellen ELISA-Tests ergab zum Teil konträre Ergebnisse. Da die Diagnose einer aMPV-Infektion häufig nur über diese Methode gestellt wird, ist dies von praktischer Relevanz. Eine Evaluierung des ELISA-Tests mit der höchsten Spezifität und Sensitivität sollte daher folgen.

This thesis addresses critical strategies that have been used, or might be used, to approach Pärt's tintinnabuli music. It has three main objectives: to question prevalent narratives drawn around the tintinnabuli concept, to suggest interpretative frameworks that could yield fresh insights into that concept's 'meaning', and to introduce new and neglected materials to anglophone Pärt discourse. In studying the mediating role of the tintinnabuli scholar, I also confront some of the ethical challenges associated with research on living composers. This project places special emphasis on localised narratives of production and influence in Pärt's music, and draws extensively on Estonian primary source material. A major hermeneutic guide has been the composer's 1994 description of seeking 'the appropriate system for the gesture', and this idea figures in each of the four main chapters. Chapter 1 describes and questions existing knowledge around tintinnabuli, approaching this task through a study of "Wenn Bach Bienen Gezüchtet Hätte ...", a work chosen for its critically fertile 'cusp' status. Chapter 2 concentrates on Pärt's explorations of 'Soviet serialism' from 1960-3, engaging with withdrawn and film scores in addition to the well-known "Nekrolog". I discuss this music in terms of a complex freedom-constraint interplay, and suggest links to the tintinnabuli style. Taking "Sarah Was Ninety Years Old" as a case study, Chapter 3 turns to listener-oriented frameworks of musical meaning. I offer an experiential reading of the piece that places tintinnabuli in dialogue with body-based theories of cognition. Lastly, Chapter 4 addresses texted tintinnabuli. I build up a reading of "Miserere" in terms of 'musical rhetoric', comparing Pärt's compositional strategies to those used by Josquin des Prez in the 1503 motet "Miserere Mei, Deus". I also consider the implications of music-rhetorical analogy for wider understandings of the 'tintinnabuli' concept.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2015-05-12T13:48:40Z No. of bitstreams: 1 Jaqueline Silva Cruz Avaliação...2014.pdf: 1187799 bytes, checksum: fc9ff7db8754a8ac356e1e5a26370207 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2015-05-12T13:48:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Jaqueline Silva Cruz Avaliação...2014.pdf: 1187799 bytes, checksum: fc9ff7db8754a8ac356e1e5a26370207 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-12T13:48:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Jaqueline Silva Cruz Avaliação...2014.pdf: 1187799 bytes, checksum: fc9ff7db8754a8ac356e1e5a26370207 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / A dengue é atualmente um dos principais problemas de saúde pública do mundo e segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS) é a doença que mais acomete o homem na atualidade. Sua incidência vem aumentando e estima-se que 50-100 milhões de pessoas desenvolvam a doença a cada ano no mundo. O diagnóstico laboratorial da dengue é realizado por diferentes tipos de testes, entre eles estão o isolamento viral, o RT-PCR, e a detecção por ELISA ou por meio de testes rápidos do antígeno viral NS1 e de anticorpos IgM específicos contra o vírus. A fim de contribuir para um melhor entendimento sobre a validade destes testes em diferentes circunstâncias, o objetivo principal deste trabalho foi avaliar a validade dos diferentes métodos laboratoriais no diagnóstico da dengue. A sensibilidade dos testes diagnósticos, ELISA IgM, ELISA NS1 e RT-PCR, foi avaliada de forma individual e de forma combinada utilizando amostras de soro de 623 pacientes incluídos em um estudo prospectivo de vigilância de base populacional entre fevereiro e julho de 2010. A sensibilidade destes testes também foi avaliada de acordo com a duração dos sintomas, com o tipo de infecção (primária vs secundária) e, por sorotipo infectante. A especificidade de cada método foi avaliada em um grupo de amostras de pacientes com diagnóstico laboratorial de leptospirose, hepatite, doadores de sangue e indivíduos sadios. Os resultados encontrados mostraram que 240 (38%) dos pacientes com doença febril aguda apresentaram dengue no período do estudo sendo que 194 (81%) dos pacientes com dengue representavam pacientes com infecções secundárias, o sorotipo predominante foi o DENV-2 (70%). As sensibilidades do RT-PCR, do ELISA NS1 e do ELISA IgM na amostra de fase aguda foram de 83,3%, 31,7% e 30%, respectivamente. O uso combinado do teste RT-PCR e do teste ELISA IgM em uma amostra de fase convalescente foi capaz de identificar 100% dos casos confirmados de dengue. As especificidades encontradas variaram de 97% a 100% para o ELISA NS1 e de 55% a 85% para o ELISA IgM. Os resultados indicam que na fase aguda da doença o RT-PCR é mais sensível a detecção de anticorpos IgM e do antígeno NS1 por ELISA, entretanto, o uso de métodos diagnósticos adicionais pode ser necessário em pacientes com uma suspeita da doença e resultado negativo do RT-PCR. / Dengue is currently one of the main problems of public health and the world according to the World Health Organization (WHO) is the disease that affects more men today. Its incidence is increasing and it is estimated 50-100 million people develop the disease each year worldwide. Laboratory diagnosis of dengue is done by testing different types, which include viral isolation, RT-PCR, and detection by ELISA or by rapid viral tests NS1 antigen and specific IgM antibodies against the virus. In order to contribute to a better understanding of the validity of these tests in different circumstances, the aim of this study was to evaluate the validity of different laboratory methods for diagnosis of dengue. The sensitivity of diagnostic tests, IgM ELISA, ELISA NS1 and RT-PCR was evaluated individually and in combination form using serum samples from 623 patients enrolled in a prospective population-based study of surveillance between February and July 2010. The sensitivity of these tests was also evaluated according to the duration of symptoms of infection with the type (primary versus secondary), and the infecting serotype. The specificity of each method was evaluated in a group of samples from patients with laboratory diagnosis of leptospirosis, hepatitis, blood donors and healthy individuals. The results showed that 240 (38%) of patients with acute febrile disease had dengue during the study period of which 194 (81%) of patients with dengue represented patients with secondary infections, the predominant serotype was DENV-2 (70% ). The sensitivity of the RT-PCR of NS1 and IgM ELISA ELISA in the acute phase of the sample were 83.3%, 31.7% and 30%, respectively. The combined use of RT-PCR and ELISA IgM in a sample convalescent phase was able to identify 100% of confirmed cases of dengue fever. The specificities found varied from 97% to 100% for ELISA NS1 and 55% to 85% for the IgM ELISA. The results indicate that the acute phase of the disease the RT-PCR is more sensitive detection of IgM antibodies and NS1 antigen by ELISA, however, the use of additional diagnostic methods may be necessary in patients with a suspicion of disease and negative outcome of RT-PCR.

A glutationa S-transferase (GST) tem a capacidade de conferir resistência do tipo não-alvo aos efeitos danosos de certos herbicidas em várias culturas, principalmente gramíneas. Entretanto, o papel das GSTs em relação aos herbicidas em cana-de-açúcar é desconhecido, e tal elucidação poderia auxiliar na redução de perdas de produtividade e/ou aumento na eficiência de produção. O objetivo desse trabalho foi caracterizar as diversas classes de GST de cana-de-açúcar por análise filogenética e padrão de expressão por amplificação quantitativa de transcritos reversos (RT-qPCR). Foi realizada no banco de dados de Saccharum Gene Index a busca completa das seqüências codificadoras de GST referentes às classes Phi, Tau, Theta e Zeta, baseando-se nos 61 genes de GST de arroz; estas foram traduzidas e empregadas em análise filogenética. Foram identificados 18 agrupamentos de ESTs codificando GSTs, totalizando 355 transcritos das 255.635 seqüências disponíveis no banco de dados. A análise filogenética identificou 7 agrupamentos como pertencentes à classe Phi (denominados ScGSTF), 7 como Tau (ScGSTU), 1 como Theta (ScGSTT), e 3 como Zeta (ScGSTZ); respectivamente. As classes Phi e Tau, consideradas planta-específica, foram as mais representativas em termos de número de agrupamentos de ESTs em relação à Theta e Zeta (mamífero-específica). Os 18 agrupamentos de cana-de-açúcar equivalem aos genes mais expressos em termos de número de ESTs individuais em arroz. Foram extraídos RNA de diversos tecidos/órgãos, e de tecido foliar das cultivares \'SP87-365\' e \'SP80-3280\' coletados a 0 e 48 h após tratamento com herbicidas, seguida da síntese de cDNA e RT-qPCR. O gene da proteína ribossômica rpl35-4 foi determinado como referência nas análises de expressão. A expressão nos tecidos/órgãos mostraram que os genes ScGSTF3, ScGSTU8 e ScGSTU13 foram menos expressos no colmo, inflorescência, meristema e raiz em relação ao limbo foliar; ScGSTF4, ScGSTF6, ScGSTF14 e ScGSTF15 foram mais expressos no colmo; ScGSTF5, ScGSTU1, ScGSTU17, ScGSTU31, ScGSTU39 e ScGSTT1 na inflorescência; e ScGSTZ1 foi único mais expresso no meristema. De forma geral, todas as classes tiveram expressão detectada nos tecidos, mas os genes da Phi e Tau foram os mais expressos. Os genes da classe Phi foram mais expressos no colmo em relação aos demais; os da classe Tau e Theta na inflorescência; e os da Zeta no meristema. A validação a 0 h determinou que os genes ScGSTF3, ScGSTF4, ScGSTU8, ScGSTU13 e ScGSTU17 foram os mais expressos na cultivar \'SP80-3280\' em relação à \'SP87-365\'. As evidentes diferenças na expressão basal entre as cultivares foram dos genes das classes Phi e Tau. Com relação à expressão das GSTs 48 h após aplicação dos herbicidas, foi observado que a aplicação de Ametryn ou Diuron, os genes de GST foram induzidos, enquanto foram reprimidos com Imazapic ou Isoxaflutole. Os genes ScGSTF3, ScGSTF4, ScGSTU13 e ScGSTU17 foram os mais expressos nas cultivares tratadas com os herbicidas; e foram considerados possíveis candidatos a associação em resposta a desintoxicação desses herbicidas. O Southern blot determinou que o maior número de cópias de GST em cana-de-açúcar foi os pertencentes às classes Phi e Tau, sendo nas classes Zeta e Theta, menos freqüentes / Glutathione S-transferase (GST) has the ability to confer non-target tolerance to damaging effects of certain herbicides in various crops, especially grasses. However, the role of GSTs in relation to herbicide tolerance in sugarcane s is unknown, and its elucidation could help in reducing yield losses and/or increase in production efficiency. The objective of this work was to characterize the various classes of sugarcane GSTs by phylogenetic analyses and expression profile using RTqPCR. A complete search at the Saccharum Gene Index database was conducted for sequences encoding GSTs from the classes Phi, Tau, Theta and Zeta, based on 61 rice GST genes; the conceptually translated sequences were used in the phylogenetic analyses. Eighteen EST clusters encoding GSTs were identified, in a total of 355 transcripts out of the 255,635 available sequences at the database. Phylogenetic analysis identified 7 groups as belonging to Phi class (denominated ScGSTF), 7 as Tau (ScGSTU), one as Theta (ScGSTT), and 3 as Zeta (ScGSTZ); respectively. The Phi and Tau classes, considered plant-specific, were the most frequent in terms of number of EST clusters in comparison to Theta and Zeta (mammal-specific). The 18 groups of sugarcane ESTs were equivalent to the mostly expressed ortologues in rice. Total RNA from various tissues and organs, and from leaves from cultivars \'SP87-365\' and \'SP80-3280\', collected at 0 and e 48 h after treatment with herbicides were obtained and converted into cDNA, and analyzed by RT-qPCR. The transcript of the ribosomal protein rpl35-4 was established as gene reference for the RT-qPCR analyses. The analyses of expression in tissues/organs demonstrated that the genes ScGSTF3, ScGSTU8 and ScGSTU13 were less expressed in stem, inflorescence, meristem and roots in relation to leaf blades; ScGSTF4, ScGSTF6, ScGSTF14 and ScGSTF15 were more expressed in stems; ScGSTF5, ScGSTU1, ScGSTU17, ScGSTU31, ScGSTU39 and ScGSTT1 in the inflorescence; and ScGSTZ1 was the only more expressed in the meristem. In general, all classes had gene member expression detected in the tissues, but the genes from Phi and Tau were the most expressed. The genes from class Phi were more expressed in the stem in comparison to the others; genes from classes Tau and Theta were more expressed in the inflorescence; and the ones from Zeta in meristem. Gene expression validation at 0 or 48 h after treatment with herbicides determined that ScGSTF3, ScGSTF4, ScGSTU8, ScGSTU13 and ScGSTU17 were more expressed in cultivar \'SP80-3280\' than \'SP87-365\'. The more evident differences in basal expression between cultivars were for genes from classes Phi and Tau. In response to herbicides treatment, GSTs expression was higher in response to Ametryn or Diuron in comparison to Imazapic or Isoxaflutole. Genes ScGSTF3, ScGSTF4, ScGSTU13 and ScGSTU17 displayed more difference in expression at 48 h between cultivars, and might be associated with differences in herbicide detoxification. Southern blot analyses determined that a larger number of GST gene copies in sugarcane from classes Phi and Tau, with less copies from classes Zeta and Theta

Orientador: Aureo Tatsumi Yamada / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-13T00:51:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Aires_MarluciaBastos_D.pdf: 2189429 bytes, checksum: 72ea45d01e8d2f7c191ae7c71d82c5f8 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A implantação embrionária implica em alterações profundas do ambiente uterino, cujos eventos devem obedecer uma sincronia temporal e espacial com o estágio do desenvolvimento embrionário. Qualquer desequilíbrio nesta sincronia resulta em interrupção da gestação e o desconhecimento dos mecanismos que atuam nas interações materno-fetais inviabilizam as possíveis intervenções buscando controlar as causas que levam às perdas iniciais da gestação. Visando contribuir para a melhor compreensão da biologia da resposta uterina de bovinos, o presente trabalho utilizou úteros de bovinos (Bos spp) não gestantes (NG) e gestantes nos períodos correspondentes à implantação embrionária para a coleta de fragmentos das regiões carunculares (CAR) e intercarunculares (IC). Esses fragmentos foram processadas para embebição em parafina destinadas às análises histológicas e obtenção de RNA total para realização de RT-PCR semi-quantitativo dos morfógenos Bmp2, Wnt2, Wnt5a, Wnt7a, e de seus antagonistas Sostdc1, Noggin, Dkk1 e Sfrp2. Pela análise histológica do desenvolvimento da mucosa uterina da região CAR foram estabelecidos os critérios morfológicos das seqüências de alterações da histoarquitetura endometrial em resposta à implantação embrionária constituindo quatro grupos (P1-P4) definindo os períodos gestacionais correspondentes, quais sejam: P1 (20-26 dg) - adesão das células trofoblásticas na superfície apical das células epiteliais e/ou entremeadas no revestimento epitelial, P2 (28-33 dg) - presença de projeções digitiformes na superfície da região CAR e tecido epitelial uterino constantemente rompido em ambas as regiões CAR e IC, P3 (35-40 dg) - expansão das projeções da região CAR formando uma rede anastomosada, entremeada pelo córion e P4 (50-60dg) - consolidação do placentônio. A ruptura das células epiteliais observada em P2 demonstra a fragilidade da interação epitélio-córion neste período que pode estar diretamente relacionada com a alta freqüência de perdas gestacionais em bovinos particularmente durante a implantação embrionária. A reação imunocitoquímica para anti-PCNA demonstrou uma marcação crescente no epitélio (E) e estrato subepitelial (ES), particularmente nas projeções da CAR de P1 a P4 e em menor proporção no E e estrato compacto (EC) da IC, confirmando a intensa atividade proliferativa associada com a hipertrofia endometrial. As análises da expressão genica através de RT-PCR, demonstraram a presença dos transcritos de Bmp2, Sostdc1, Noggin, Wnt2, Wnt5a, Wnt7a, Sfrp2 e Dkk1, e pela hibridização in situ, confirmaram-se as expressões localizadas dos genes Bmp2, Wnt5a, Wnt7a, Dkk1, Sfrp2, além dos receptores Bmpr1a e Bmpr2 no E+ES da CAR e E+EC da IC no útero NG e gestantes de P1 a P4. A expressào de Bmp2 foi maior na CAR em relação a IC em P1 e P2 o que sugere uma participação importante na ativação da resposta da região CAR relacionada com a implantação embrionária, enquanto o Wnt5a parece não atuar neste período. A redução da expressão de Wnt2 em P1, indica uma regulação negativa na CAR e IC no inicio da implantação, enquanto que a menor expressão de Wnt7a na CAR em relação a IC sugere que este gene não está relacionado com as principais alterações observadas nessa região. A maior expressão de Dkk1 e Sfrp2 na CAR em relação à IC, sugere a participação na atividade celular da região CAR, porém não apresenta relação direta com a expressão dos genes Wnt analisados, assim como a ausência de Sostdc1 no endométrio e a menor expressão de Noggin demonstram não serem estes os antagonistas principais de BMP que atuam no endométrio bovino. A expressão de Wnt e Bmp em conjunto com seus antagonistas simultaneamente nas regiões CAR e IC atesta a dependência da ação múltipla e sinérgica/antagônica de vários fatores na modulação da resposta da mucosa uterina na implantação embrionária e durante o desenvolvimento da placentação sinepitéliocorial. / Abstract: The embryo implantation implies in deep changes of the uterine environment which events must be topologically and chronologically synchronized with embryo development stage. Any imbalance in this synchronization results in disruption of the gestation and the lack of knowledge regarding the mechanisms of maternal-fetal interaction make difficult any potential action intending to control the causes which induce early gestational loss. Aiming to contribute to a better understanding of the biology of bovine uterine response, the present work evaluated the caruncle (CAR) and intercaruncle (IC) regions collected from non-pregnant (NG) and pregnant bovine uteri (Bos spp) and processed for paraffin embedding and submitted to histological analysis, RNA isolation for RT-PCR of Bmp2, Wnt2, Wnt5a and Wnt7a morphogen genes and their antagonists Sostdc1, Noggin, Dkk1 and Sfrp2 gene expression. By histological analysis of CAR uterine mucosa development, the morphological criteria of the endometrial histoarchitecture changes sequences were established and adopted to compose four groups (P1- P4) with corresponding gestational stages: P1 (20-26 gd) - adhesion of throphoblast cells on the apical surface of epithelium cells and/or between them, P2 (28-33 gd) - villous-like projections on the CAR surface and areas of disrupted or absence of epithelial cells on both CAR and IC regions, P3 (35-40 gd) - expansion of villous-like projections resulting in an anastomosis mesh where chorion villi intrude, P4 (50-60 gd) - placentome consolidation. The constant disruption of epithelial cells seen in P2 evidenced the fragility of epithelium-chorion interaction that may be related to the high incidence of bovine pregnancy loss particularly during embryo implantation. The immunocytochemistry for PCNA demonstrated reactivity in epithelium (E) and subepithelium stratum (SS), particularly on CAR villous-like projections from P1-P4 and in a less frequent proportion in the epithelium (E) and compactum stratum (CS) from IC, demonstrating the intense proliferative activity associated with endometrial hypertrophy. The gene expression analysis by RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) confirmed the transcripts for Bmp2, Sostdc1, Noggin, Wnt2, Wnt5a, Wnt7a, Sfrp2 and Dkk1, and by In situ hybridization the localized expression of Bmp2, Wnt5a, Wnt7a, Dkk1, Sfrp2, and also Bmpr1a and Bmpr2 receptors in E+SS and E+CS in NG and P1-P4 uteri. The Bmp2 expression was higher on CAR when compared to IC in P1 and P2 which suggest an important involvement on CAR response activation related to embryo implantation, whereas Wnt5a does not seem to participate at this period. The decreased expression of Wnt2 in P1 point out a negative regulation on CAR and IC in the beginning of implantation, while the lower expression of Wnt7a in CAR when compared to IC suggest that this is not the main gene related to changes of CAR in pregnancy. The highest expression of Dkk1 and Sfrp2 on CAR when compared to IC indicate their participation on the cellular activity on the CAR region, but it is not involved directly with the expression of Wnt genes analyzed, as well as the absence of Sostdc1 on the endometrium and the lowest expression of Noggin demonstrated that they are not the main BMP antagonists acting on bovine endometrium. The expression of Wnt and Bmp together with their antagonists simultaneously on CAR and IC regions attest the multiple and synergic/antagonic action of several factors on the modulation of uterine mucosa response during the embryo implantation and development of synepitheliochorial placentation. / Doutorado / Histologia / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Para determinação da ocorrência de transmissão transplacentária da Theileria equi em neonatos eqüinos foram avaliados 50 potros da raça Puro Sangue Lusitano, machos e fêmeas, bem como suas respectivas mães, logo após o parto. Foram colhidas amostras de sangue total, tanto das mães como dos neonatos, entre as primeiras cinco horas pós parto para pesquisa de Theileria equi e Babesia caballi através da técnica de RT-PCR. Utilizou-se o kit de detecção baseado no fluofóro intercalante de DNA SYBERgreen. Um total de 46% das éguas apresentaram resultado positivo para Theileira equi e 54% se mostraram negativas, enquanto que 66% dos potros apresentaram resultados positivos e 34% negativos, sendo que 73,9% dos potros positivos nasceram de mães também positivas. Já para Babesia caballi, 16% das éguas foram positivas e 84% negativas, assim como 2% dos potros foram positivos e 98% negativos. O teste de RT-PCR é bastante sensível e específico, mas pode resultar em falso negativo, apesar de ser eficaz na detecção da Theileria equi e Babesia caballi nos eqüinos. Estes dados permitem concluir que existe a possibilidade de transmissão transplacentária de Theileria equi. / The occurrence of transplacentary transmission of Theileria equi in horses was determined by evaluating 50 young male and female horses of the breed Lusitano Horses as well as their respective mothers. Colts and fillies were evaluated as soon as they were born. Total blood samples were collected from both mother and offspring within the first five hours right after the parturition to analyse Theileria equi and Babesia caballi through the RT-PCR technique. It was used the kit of detection based on DNA SYBERgreen. This study showed us that 46% of the female horses had positive results for Theileira equi and 54% negative results while 66% of the male horses had positive results and 34% of them, negative ones. Moreover, 73.9% of the positive young horses also had their mothers positive. However, for Babesia caballi 16% of the female horses had positive results and 84% negative ones while 2% of the male horses had positive results and 98%, negative ones. The RT-PCR test is very sensitive and specific but it can occur false-negative results although it is efficient in detecting Theileria equi and Babesia caballi in horses. In conclusion, the data show us that there is a possibility of transplacentary transmission of Theileria equi.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O camarÃo peneÃdeo Farfantepenaeus subtilis à uma importante espÃcie nativa do litoral nordestino que possui uma grande ocorrÃncia na pesca. Dentre os camarÃes marinhos de importÃncia comercial, os peneÃdeos se destacam por constituÃrem um valioso recurso para pesca e aqÃicultura em regiÃes tropicais e subtropicais. Entretanto, a disponibilidade de informaÃÃes sobre essas espÃcies à bastante escassa, principalmente em relaÃÃo à estrutura genÃtica que atua no crescimento muscular desses animais. Tendo como objetivo identificar genes envolvidos na contraÃÃo muscular de camarÃes, neste trabalho foram parcialmente isolados e seqÃenciados os genes de betaactina e miosina de cadeia pesada do camarÃo rosa F. subtilis, a partir do cDNA do mÃsculo abdominal. Para tanto, camarÃes coletados no estuÃrio do rio Pacoti, estado do CearÃ, foram inicialmente identificados taxonomicamente e, depois atravÃs de amplificaÃÃo de DNA seguida por sequenciamento das regiÃes citocromo oxidase subunidade I (COI) e 16S. Utilizando-se os tecidos frescos dos camarÃes, foi extraÃdo o RNA total e foram obtidos os respectivos DNAs complementares (cDNAs). Baseado na construÃÃo de primers especÃficos a partir do alinhamento entre sequÃncias descritas no Genbank/NCBI, os genes foram isolados por meio de RT-PCR (ReaÃÃo em Cadeia da Polimerase atravÃs da transcriptase reversa) e seqÃenciados. Foi obtido um fragmento parcial de 760 pares de base para o cDNA de beta-actina e para o cDNA de miosina de cadeia pesada foi obtido um fragmento de 570 pares de base. AnÃlises das sequÃncias realizadas pela ferramenta BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) revelaram alta similaridade com outras beta-actinas e miosinas de camarÃes, confirmando a identidade das sequÃncias genÃticas isoladas. Como resultado do alinhamento pareado entre as sequÃncias desses genes obtidos no trabalho com as de outras espÃcies presentes no GenBank, pÃde-se observar que as maiores similaridades foram com Penaeus monodon (93%) e com Farfantepenaeus paulensis (88%). Os resultados obtidos neste estudo demonstraram a viabilidade da metodologia utilizada na identificaÃÃo de genes relacionados com caracterÃsticas importantes. Esses dados irÃo facilitar o isolamento completo das sequÃncias desses genes, alÃm de contribuir para incentivar a identificaÃÃo de outros genes importantes em camarÃes, principalmente os nativos do Brasil. AnÃlise de genes que atuam desenvolvimento do tecido muscular do animal poderà fornecer informaÃÃes genÃticas importantes acerca de uma espÃcie nativa que està sendo superexplorada e que poderà ser viÃvel para cultivo. Outrossim, esses dados beneficiarÃo a comunidade cientÃfica, servindo como base para estudos de fisiologia, filogenia e evoluÃÃo em peneÃdeos / The penaeid shrimp Farfantepenaeus subtilis is an important native species for fisheries industry in Brazil. Among marine shrimps of commercial importance, penaeids are recognized as a valuable resource for fishery and aquaculture in tropical and subtropical regions. However, data on these species is extremely reduced, especially concerning genetic elements involved in animal muscle growth. Therefore, aiming at identifying shrimp genes directly associated with muscle contraction in this research, beta-actin and myosin heavy chain genes of the pink shrimp F. subtilis were isolated from its muscular abdominal and partially sequenced. Shrimps collected from Pacoti estuary, CearÃ, were first identified through taxonomy and, then, through DNA amplification followed by sequencing of Cytochrome Oxidase subunit I (COI) and 16S. From fresh shrimp tissues, total RNA was extracted and complementary cDNA was obtained. Based on specific primers designed after sequence alignments performed against sequences at GenBank/NCBI, genes were amplified from RT-PCR (reverse transcriptase - polimerase chain reaction) and sequenced. A 760bp partial F. subtilis beta-actin cDNA fragment was obtained, while the partial F. subtilis myosin heavy chain cDNA was 570bp long. Sequence analyses using the Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) program indicated that F. subtilis beta-actin gene product is very similar to betaactin of other species of shrimps, while the myosin heavy chain protein is highly homologous to crustacean myosins heavy chain, confirming the identity of the isolated gene sequences. Alignment of these gene sequences with other sequences in GenBank showed high similarity with Penaeus monodon (93%) and Farfantepenaeus paulensis (88%). Results have showed the feasibility of partial gene identification as a means to identify genes of strategic interest. These data would help further attempts to elucidate the complete isolation of these genes, as well as the detection of other important genes, especially from shrimp species occurring at the Brazilian coast. Genes analyses involved with muscle growth might provide important genetic information on native species that are overexploited and may be viable for the shrimp cultivation. In addition, these data might also benefit the scientific community, improving a range of research areas such as physiology, phylogeny and evolution of penaeids