Hinsichtlich einer effizienten Nachsorge von Melanompatienten existieren entsprechende Empfehlungen, aber auch widersprüchliche Stellungnahmen hinsichtlich Intervalllänge und Umfang der Nachsorge. Das Melanom ist einer der malignen Tumoren mit den am schnellsten steigenden Inzidenzraten, was auch eine Steigerung der Mortalität bedingt. In der vorliegenden Arbeit werden neue diagnostische Strategien geprüft und in ein vorbestehendes Melanomnachsorgeschema aufgenommen, um Patientenbetreuung, die frühe Entdeckung von Metastasen, aber auch die Raten an rezidivfreiem - und Gesamtüberleben zu verbessern. In einer großen prospektiven Studie von 4 Jahren Dauer konnte der Ultraschall von Lymphknoten, Weichteilgewebe und in transit Strecken eher als die rein klinische Untersuchung Metastasen entdecken und führte auf diese Weise zu einer Verbesserung des rezidivfreien- und des Gesamtüberlebens. Die Feinnadelaspirationszytologie (FNAC) wurde in einer weltweit, zahlenmäßig führenden Studie durchgeführt um die verdächtigten Läsionen tatsächlich zu diagnostizieren. Dies geschah hierbei nahezu nicht-invasiv. Hohe Zahlen an Sensitivität und Spezifität dieser Methode konnten erreicht werden und eine Diagnose konnte auch in sehr kleinen Läsionen oder solchen in einer schwierigen Position etabliert werden. Bei letzteren Läsionen erwies sich auch die Hinzunahme einer ultraschallgesteuerten Drahtmarkierung als nützliches Procedere. Auf diese Weise konnte die Exzision dieser Läsionen in komplizierter Lage vereinfacht werden. Eine weitere Studie untersuchte die begleitende Anwendung der Untersuchung einer seriellen reverse Transskriptase Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) zum Nachweis von Tyrosinase aus peripherem Blut von Hochrisikomelanompatienten. Patienten, die im Blut mindestens einmal positiv getestet wurden, zeigten ein signifikant höheres Risiko, krankheitsspezifisch am Melanom zu versterben, als Patienten, die stets ein negatives Resultat aufwiesen. Die Tyrosinase RT-PCR Untersuchungen konnten auch an geringen Mengen Material wie Feinnadelaspiraten oder dem Feinnadelpunktaten des Sentinel Node erfolgreich durchgeführt werden. Alle aufgezeigten Methoden erwiesen sich als effektiv und wurden deswegen in das bestehende Nachsorgeprogramm der Melanompatienten an der Charité, Berlin aufgenommen. / There exist recommendations but also controversies about the necessity and effectiveness of a distinctive melanoma follow-up programme. Melanoma is one of the fastest increasing malignant tumours with increasing rates of incidence and mortality. In this work new strategies are implemented in a pre-existing melanoma follow-up schedule in order to ameliorate the care for patients, the detection of metastases and the relapse-free and overall survival rates. In a large prospective study taking four years the ultrasound of lymph nodes, soft tissues and in transit distances was shown to earlier detect recurrences than the clinical examination thus significantly enhancing recurrence-free and overall survival. Fine needle aspiration cytology (FNAC) has been performed in a large, worldwide leading study to verify the suspected lesions in a nearly non-invasive way. High percentages in sensitivity and specificity could be achieved also in small lesions or lesions in an unfavourable localization. The latter lesions have been shown to be better detectable by a marking procedure. An anchor wire has been sonographically placed within such a lesion to improve the successful excision. A further study examined the value of serial RT-PCR testing from peripheral blood in melanoma patients. Patients, who have been tested at least once positive, had a higher risk ratio to die disease-specifically from melanoma. This result has been highly significant. RT-PCR examinations could also be applied in small amounts of material such as fine needle aspirations or material of FNA C of the sentinel node. All modalities could be proven to be effective and therefore are included in the melanoma follow-up programme of the Charité, Humboldt University of Berlin.

O objetivo deste estudo foi avaliar a taxa de detecção, quantidade e atividade metabólica de Propionibacterium acnes, antes e após os procedimentos endodônticos de desinfecção, utilizando métodos moleculares baseados em rRNA e rDNA. Foram selecionados 22 pacientes com necrose pulpar e periodontite apical assintomática. Amostras microbiológicas foram coletadas dos canais radiculares após a cirurgia de acesso (S1), após o preparo químico-cirúrgico realizado com Sistema Reciproc e NaClO- 2,5% (S2) e após medicação intracanal com Ca(OH)2 por 14 dias (S3). As amostras dos canais radiculares foram submetidas à extração de DNA e RNA. O RNA foi submetido à reação de transcrição reversa (RT) para confecção de DNA complementar (cDNA). DNA e cDNA foram submetidos a reações de qPCR utilizando iniciadores complementares à sequência de 16S rRNA de P. acnes. O efeito dos procedimentos endodônticos na redução bacteriana foi determinado por qPCR baseada em rDNA. A atividade metabólica bacteriana foi calculada pela razão rRNA/rDNA baseados nos dados dos ensaios de qPCR. Os dados foram analisados pelo teste de Wilcoxon para análise entre as amostras e teste de McNemar para comparação da taxa de detecção dos métodos baseados em rDNA e rRNA, com nível de significância de 5%. A taxa de detecção de P. acnes nas amostras endodônticas foi maior pelo método baseado em rRNA do que pelo método baseado em rDNA (P < 0,0001). P. acnes foi detectado em 36,4% (8/22) e 90,9% (20/22) das amostras S1 utilizando qPCR baseado em rDNA e rRNA, respectivamente. Nas amostras S2, P. acnes foi detectado em 36,4% (8/22) das amostras utilizando o método baseado em rDNA e em 86,4% (19/22) pelo método baseado em rRNA. Nas amostras S3, P. acnes persistiu em níveis detectáveis em todas as amostras positivas em S2. Na análise quantitativa, o nível médio de P. acnes foi 1,28 x 103 cópias de rDNA nas amostras S1. Não houve uma alteração significante dos níveis bacterianos nas amostras S2 e S3 quando comparadas às amostras S1 (P > 0,05). O número de cópias de rRNA foi maior do que o de rDNA em todas as amostras (P < 0,0001). Em S1, o valor mediano da razão rRNA/rDNA foi 7,93 (intervalo de 2,03 a 2,04 x 102). Essa razão permaneceu positiva em S2 (mediana 16,40, intervalo de 2,21 a 4,87 x 102) e S3 (mediana 25,34, intervalo de 0,58 a 1,05 x 103), sem diferença estatística na comparação entre as amostras S1-S2 e S2-S3 (ambos P > 0,05). Baseados nesses achados, concluiu-se que o ensaio de qPCR baseado em rRNA revelou uma alta prevalência de P. acnes nas infecções endodônticas primárias e que este permaneceu metabolicamente ativo nos canais radiculares após o preparo químico-cirúrgico e medicação intracanal. / This study aimed to evaluate the detection rate, quantity and metabolic activity of Propionibacterium acnes before and after endodontic disinfection procedures using RNA- and DNA-based molecular methods. Twenty-two patients with pulp necrosis and asymptomatic apical periodontitis were selected. The microbiological samples were collected from the root canals after access cavity (S1), after the chemo-mechanical preparation performed with the Reciproc System and NaClO- 2.5% (S2) and after intracanal medication with Ca(OH)2 for 14 days (S3). The root canal samples were submitted to DNA and RNA extraction. Complementary DNA (cDNA) was synthetized using the reverse transcription reaction. cDNA and genomic DNA were subjected to qPCR with primers complementary for P. acnes 16S rRNA sequence. The effect of endodontic procedures on bacterial reduction was determined by rDNA-based qPCR. The bacterial metabolic activity was calculate by the rRNA / rDNA ratio based on qPCR assays. Data were analysed by the Wilcoxon test for analysis between samples and McNemar test for detection rate of RNA- and DNA-based molecular methods, with a significance level of 5%. The detection rate of P. acnes in endodontic samples was higher by the rRNA-based method than by the rDNA-based method (P < 0.0001). P. acnes was detected in 36.4% (8/22) e 90.9% (20/22) of the S1 samples using on rDNA- and rRNA- based qPCR, respectively. In S2 samples, P. acnes was detected in 36.4% (8/22) of the samples using the rDNA based method and 86.4% (19/22) by the rRNA based method. In S3 samples, detectable levels of P. acnes persisted in all S2-positive samples. Quantitative analysis of S1 samples revealed that the mean level of P. acnes was 1.28 x 103 rDNA copies per sample. There was no significant change in bacterial levels in S2 and S3 samples when compared to S1 samples (P> 0.05). The number of rRNA copies was greater than the rDNA ones in all samples (P < 0.0001). In S1, the median value of the rRNA / rDNA ratio was 7.93 (range: 2.03 - 2,04 x 102). This ratio remained positive in S2 samples (median 16.40, range: 2.21 - 4.87 x 102) and in S3 (median 25.34, range: 0.58 - 1.05 x 103), with no statistical difference in the comparisons between S1-S2 and S2-S3 samples (both P> 0.05). Based on these findings, it was concluded that the rRNA-based qPCR assay revealed a high prevalence of P. acnes in primary endodontic infections and that it remained metabolically active in the root canals after chemical-surgical preparation and intracanal medication.

Micro-organismos persistentes que permanecem viáveis e em níveis elevados nos canais radiculares após os procedimentos endodônticos podem influenciar no sucesso do tratamento endodôntico. O objetivo deste estudo foi avaliar a quantidade e a atividade metabólica de bactérias persistentes utilizando métodos moleculares baseados em rDNA e rRNA. Foram selecionados 15 pacientes com infecções endodônticas primárias assintomáticas. Amostras microbiológicas foram coletadas dos canais radiculares após a cirurgia de acesso (S1), após o preparo químico-cirúrgico realizado com Sistema Reciproc e NaOCl 2.5% (S2) e após medicação intracanal com Ca(OH)2 por 14 dias (S3). As amostras dos canais radiculares foram submetidas à extração de DNA e RNA. O RNA foi submetido à reação de transcrição reversa para confecção de DNA complementar (cDNA). O efeito dos procedimentos endodônticos na redução bacteriana foi determinado por qPCR baseada em rDNA, utilizando iniciadores universais para a região 16S rRNA do domínio Bacteria e iniciadores espécie-específicos para Bacteroidaceae [G-1] sp oral taxon 272. A atividade metabólica de bactérias totais e Bacteroidaceae [G-1] sp oral taxon 272 foi calculada pela razão rRNA/rDNA baseados nos dados dos ensaios de qPCR. Os dados foram analisados pelo teste de Wilcoxon para análise quantitativa e teste de McNemar para comparação da taxa de detecção dos métodos, com nível de significância de 5%. Todas as amostras S1 foram positivas para bactérias totais, com uma mediana de 1,87 x 105 cópias de rDNA por amostra. Após o preparo químico-cirúrgico houve uma redução significativa de rDNA de bactérias totais (mediana 7,86 x 104, P = 0,01). Entretanto, não houve redução de rDNA bacteriano após a medicação intracanal quando comparada à etapa anterior (mediana 7,97 x 104, P > 0,05). Os resultados da razão rRNA/rDNA revelaram que houve uma redução do metabolismo de bactérias totais em S2 (mediana 1, P = 0,04) e um aumento do metabolismo bacteriano em S3 (mediana 2, P = 0,04). Na análise de Bacteroidaceae [G-1] sp oral taxon 272, o tratamento endodôntico não influenciou na redução nem no metabolismo bacteriano. Concluiu-se que o número total de bactérias foi drasticamente reduzido após o preparo químico-cirúrgico, assim como seu metabolismo. Entretanto, o metabolismo bacteriano aumentou após o uso da medicação intracanal com Ca(OH)2. Bacteroidaceae [G-1] sp. oral taxon 272 permaneceu metabolicamente ativo após o preparo químico-cirúrgico e medicação intracanal, participando, assim, da composição da microbiota persistente. / High levels of microorganisms that persist viable in root canals after endodontic procedures may influence endodontic treatment outcome. This study aimed to evaluate the amount and the metabolic activity of persistent bacteria using rRNA- and rDNA-based molecular methods. Fifteen patients with primary endodontic infections were selected. Microbiological samples were taken from root canals after access cavity (S1), after chemomechanical preparation with Reciproc System and 2.5% NaOCl (S2) and after intracanal medication with calcium hydroxide for 14 days (S3). DNA and RNA were extracted from root canal samples, and cDNA was synthetized using reverse transcription reaction. The effect of endodontic procedures on bacterial reduction was determined by rDNA-based qPCR using universal primers for 16S rRNA Bacteria domain and species-specific primers to Bacteroidaceae [G-1] sp oral taxon 272. The metabolic activity of total bacteria and Bacteroidaceae [G-1] sp oral taxon 272 was calculated by rRNA/ rDNA ratio estimated by qPCR. The data was analyzed by the Wilcoxon test for quantitative analysis and McNemar test for comparison of the detection rate of the methods, with 5% significance level. All S1 samples were positive for total bacteria, with a median value of 1.87 x 105 bacterial cells. After chemomechanical preparation a significant reduction of bacterial rDNA was observed (median 7.86 x 104, P = 0.01). Nevertheless, there was no bacterial rDNA reduction after intracanal medication when compared to S2 samples (median 7.97 x 104, P > 0.05). The rRNA/ rDNA ratio showed a reduction of total bacteria metabolism in S2 (median 1, P = 0,04), and an increase of bacterial metabolism in S3 (median 2, P = 0,04). Bacteroidaceae [G-1] sp oral taxon 272 analysis showed that endodontic treatment did not impact the amount and the metabolic activity of this taxon. In conclusion, the number and metabolism of total bacteria were severely reduced after chemomechanical preparation. On the other hand, the bacterial metabolism increased after intracanal dressing with Ca(OH)2. Bacteroidaceae [G-1] sp. oral taxon 272 remained metabolically active after chemomechanical preparation and intracanal dressing thus participating in the composition of the persistent microbiota.

Por representar a mais importante arbovirose em nível mundial, as infecções causadas pelos vírus da dengue são de grande importância em nosso país, apresentando uma ampla variedade de sintomas clínicos que vão desde infecção assintomática até formas mais graves da doença. O título de anticorpos neutralizantes produzidos frente à infecção por dengue parece ser determinante na forma de apresentação da doença no paciente. Atualmente, a forma com que o teste de neutralização é realizado demanda tempo para sua realização. O objetivo deste trabalho foi padronizar um ensaio de neutralização viral por RT-PCR em tempo real em cepas virais dos quatro sorotipos dengue para, posteriormente, ser empregada na detecção rápida e em grande escala de anticorpos em soro de pacientes e de candidatos vacinais. Para isso, foram construídas curvas padrão, para cada sorotipo viral, por meio da transcrição in vitro do RNA viral. O ensaio de neutralização padronizado nesse estudo reduziu o número de dias de detecção da neutralização em 48 horas quando comparada com a técnica de neutralização tradicional (PRNT), além de utilizar técnicas moleculares sensíveis e específicas para detecção como a RT-PCR em tempo real que garantem maior aplicabilidade do teste. / Because Dengue virus is the most important arboviral disease worldwide, infections caused by this pathogen are of great importance in Brazil, producing a wide variety of clinical symptoms ranging from asymptomatic infection to more serious forms of the disease. The title of neutralizing antibodies produced against the dengue infection appears to be determinant in the outcome of the disease. Currently, neutralization tests that have been performed take time for its execution. The aim of this study was to standardize a viral neutralization assay by real-time RT-PCR of viral strains of the four Dengue serotypes to subsequently be used for rapid detection and large-scale using antibodies of patients and for vaccine candidates. For this matter, standard curves were constructed for each Dengue serotype, by in vitro transcription of viral RNA. The neutralization assay in this study reduced the period of neutralization to 48 hours, compared to traditional neutralization test (PRNT), and it uses a more sensitive and specific molecular technique for detection of neutralizing antibodies, such as real time RT-PCR, to ensure greater applicability of the test

Este estudo buscou estabelecer um sistema de produção de pps, contendo a proteína Gag do MLV para formação da cápside, as glicoproteínas de membrana E1 e E2 do HCV carregando o RNA da glicoproteína do vírus da raiva - RVGP (ppHCV-RVGP). Para gerar ppHCV-RVGP, células HEK293-T foram co-transfectadas com 3 vetores, utilizando lipofectamina e eletroporação. As ppHCV-RVGP foram coletadas do sobrenadante 48 h p.t e quantificadas por qRT-PCR foram obtidas 300 cópias de RNA/&mu;L, para ambos os métodos de co-transfecção. Células Huh 7 foram infectadas e a expressão da RVGP foi analisada 48 h p.i. por ELISA e imunofluorescência indireta (IFI). Estes imunoensaios mostraram a baixa expressão da proteína RVGP. Realizamos ensaios de qRT-PCR para detectar a adesão e entrada da ppHCV-RVGP e verificou-se que a estas foram ineficientes. Realizamos western blotting para analisar a expressão das proteínas necessárias para a formação das ppHCV, este mostrou a produção da proteína Gag e a incorporação das proteínas de membrana, porém a glicoproteína E2 não foi incorporada eficientemente na membrana da ppHCV. Concluímos que o sistema de pseudopartículas virais foi eficiente para transportar o RNA-RVGP, porém não foi capaz de infectar eficientemente células Huh 7. / The aim of this study was to establish a system for the production of pps, containing the protein Gag of MLV to form the capsid, the glycoproteins membrane E1 and E2 of HCV and carrying the RNA of glycoprotein of rabies virus - RVGP (ppHCV-RVGP). To produce ppHCV-RVGP, HEK293-T cells were co-transfected with 3 vectors using lipofectamine and electroporation. The pps were harvested from the supernatant 48 h p.t. and quantificated by qRT-PCR and resulted in 300 copies of RNA/&mu;L, to both methods of co-transfection. Huh 7 cells were infected and RVGP expression was analyzed 48 hours after by ELISA and indirect immunofluorescence (IFI) assays. These immunoassays showed a low expression of RVGP. Others assays of qRT-PCR conducted to detect the adhesion and entry of ppHCV-RVGP showed that this process was inefficient. We performed western blotting assays to analyze the proteins required to form the ppHCV. Western blotting assays that the production of Gag protein and incorporation of glycoproteins were successful, however E2 glycoprotein has not been incorporated efficiently on ppHCV membrane. In conclusion, the system of virus pseudoparticles was efficient in carrying the RNA-RGVP, although was not able to efficiently infect Huh 7 cells.

Vários estudos utilizando modelos animais têm demonstrado que estruturas límbicas como amídala (AMD), hipocampo dorsal (HD) e córtex pré-frontal medial (CPFm) participam na consolidação da memória associada às emoções. Considerando que a síntese de novas proteínas é necessária para o processo de consolidação de memórias, e que a combinação entre o uso de inibidores de síntese proteica e diferentes intensidades de estímulo incondicionado têm gerado respostas comportamentais distintas com relação à consolidação da memória emocional, o presente trabalho se propôs a investigar a hipótese de a consolidação da memória aversiva na AMD, no HD e no CPFm, associada a síntese proteica, ocorre de maneira diferenciada nessas três estruturas, de acordo com a intensidade do estímulo aversivo, bem como se a expressão de genes envolvidos na transmissão histaminérgica seria modificada ao longo das fases da memória emocional aversiva. O objetivo do presente estudo foi avaliar o papel da síntese proteica na AMD, HD e CPFm no processo de consolidação de uma memória aversiva baseada em condicionamento aversivo moderado ou intenso; investigar a expressão de genes ligados a transmissão histaminérgica na AMD, HD e CPFm após o condicionamento aversivo intenso. Para este fim dois experimentos foram realizados: No experimento 1 a anisomicina (ANI) foi microinjetada bilateralmente na AMD ou HD ou CPFm de camundongos antes de serem submetidos a tarefa de esquiva inibitória do tipo step-down utilizando duas intensidades de estímulo incondicionado: moderada ou intensa. No experimento 2, as variações da expressão dos genes da enzima HDC (histidina descarboxilase responsável pela síntese de histamina) e dos receptores H1, H2 e H3 foram analisadas em diferentes espaços temporais através da reação de polimerase em cadeia em tempo real. Os resultados do experimento 1 demonstram que microinjeção de ANI no CPFm prejudica a consolidação da memória de esquiva inibitória com estímulo incondicionado moderado ou intenso, porém quando administrada intra-AMD e intra-HD, a ANI só prejudica a consolidação da memória de esquiva inibitória com estímulo incondicionado intenso. No experimento 2 demonstra que durante a consolidação da memória aversiva intensa há diminuição nos níveis de expressão dos genes: HDC no HD, Hrh3 na AMD, Hrh1 e Hrh3 no CPFm. Já na fase de evocação, na AMD há aumento e diminuição na expressão dos genes HDC e Hrh3, respectivamente; no HD há aumento na expressão dos genes Hrh2 e Hrh3 e no CPFm há aumento na expressão do gene HDC e diminuição nos genes Hrh1 e Hrh3. Durante a reconsolidação há diminuição na expressão dos genes HDC e Hrh3 e aumento do gene Hrh1 na AMD. No DH há aumento com relação ao gene Hrh1, e no CPFm há aumento do gene HDC e diminuição na expressão dos genes Hrh1 e Hrh3. No presente estudo conclui-se que em situações com moderado grau de aversividade, a consolidação dessa experiência não dependerá de síntese proteica na AMD e no HD, mas sim no CPFml. No entanto, em situações com elevado grau de aversividade, a síntese proteica na AMD, HD e CPFm é essencial para a consolidação de tal experiência. Além disso, os genes HDC, Hrh1, Hrh2 e Hrh3 se expressam distintamente na AMD, HD e CPFm ao longo da escala temporal da consolidação, evocação e reconsolidação da formação de memórias de medo. / Several studies using animal models have shown that limbic structures like the amygdala (AMG), dorsal hippocampus (DH) and medial prefrontal cortex (mPFC) are involved in emotional memory consolidation. Whereas the synthesis of new proteins is necessary for memory consolidation process, and that opposite results related to the interaction of protein synthesis inhibitors and foot-shock intensity on memory consolidation have been reported, the present study aims to investigate the hypothesis of protein synthesis in AMG, the DH and mPFC associated with the consolidation of aversive memory occurs differently in these three structures, according to the intensity of the aversive stimulus and the expression of proteins involved in histaminergic transmission would be modified during the process of consolidation and emotional expression of aversive memory. The aim of this study was to evaluate the role of protein synthesis in AMG, DH and mPFC in consolidation of aversive memory based on moderate and intense conditioning; to investigate the expression of proteins related to histaminergic transmission in AMG, DH and mPFC after intense aversive conditioning. For this purpose two experiments were performed: in experiment 1 the anisomycin (ANI) was bilaterally microinjected into AMG or DH or mPFC of mice before being submitted the step-down inhibitory avoidance task using two unconditioned stimulus intensities: moderate or intense. In experiment 2, the variations in the gene expression of HDC enzyme (histidine decarboxylase - responsible for histamine synthesis) and the H1, H2 and H3 receptors were analyzed at different temporal spaces by real-time polymerase chain reaction (RT-PCR). The results of the first experiment demonstrate that microinjection of ANI in mPFC impairs the consolidation of inhibitory avoidance memory with moderate or intense unconditioned stimulus, however when administered intra-AMG and intra DH, ANI only impairs the consolidation of inhibitory avoidance memory under an intensive unconditioned stimulus. The experiment 2 demonstrates that during the consolidation of intense aversive memory there is a decrease of the genes expression levels: HDC in the dorsal hippocampus, Hrh3, Hrh1 in the amygdala, and Hrh3 in the medial prefrontal cortex. During retrieval the HDC and Hrh3 genes expression levels are increased and decreased, respectively in the AMG; the Hhr2 and Hrh3 genes expression levels are increased in the DH, and in the mPFC the HDC gene expression level is increased, and the Hrh1 and Hrh3 are decreased. During reconsolidation the amygdalas HDC and Hrh3 genes expression levels are decreased and the Hrh1 gene is increased. In the DH the Hrh1 gene levels are elevated and in the mPFC the HDC gene expression level is increased and the Hrh1 and Hrh3 are decreased. In the current study we conclude that under moderate aversiveness situations, the consolidation of this experience does not depend on protein synthesis in the AMG and in the DH, but in the mPFC. However, in situations with a high level of adversity, protein synthesis in this three structures are essential for the consolidation of such experience. In addition, the histaminergic genes are distinctly expressed in the AMG, DH and mPFC along the time scale of consolidation, retrieval and reconsolidation of the formation of fear memories.

A ulceração aftosa recorrente (UAR) é uma das lesões mais freqüentes da cavidade bucal, comprometendo a qualidade de vida de seus portadores muitas vezes de maneira importante. Embora sua etiopatogenia ainda não esteja esclarecida, vários fatores têm sido consistentemente relacionados ao surgimento da UAR, especialmente alterações imunológicas e genéticas, conduzindo grande parte da investigação científica para esses campos do conhecimento. Os receptores Toll-Like (TLR) reconhecem produtos moleculares derivados, principalmente, de microrganismos, desencadeando a resposta inflamatória protetora. Entretanto, anormalidades em sua função podem estar relacionadas ao desenvolvimento de doenças, pela ativação aberrante do sistema imunológico. A proposta desta investigação foi a de se avaliar a expressão dos receptores TLR-2, TLR-4 e TLR-7 através do RT-PCR em tempo real, a partir de amostras de sangue periférico e da mucosa bucal de população portadora de UAR e indivíduos controles sadios. Cinco pacientes UAR e quatro controles voluntários compuseram a casuística estudada, sendo submetidos à biópsia de lesões de UAR ou de mucosa de revestimento sadia. Na mesma sessão os pacientes tiveram sangue coletado por venopunção. Posteriormente, ambos os materiais foram submetidos aos procedimentos laboratoriais de extração do RNA e análise de expressão dos receptores TLR por meio da técnica de RT-PCR real time. Não houve diferença significativa na expressão destes receptores entre portadores de UAR e controles sadios, nos dois tipos de amostra. Estudos mais aprofundados são necessários a fim de se verificar a real participação destes receptores na UAR, visto que não há outros estudos nesta área e a amostra analisada foi pequena. / Recurrent aphthous stomatitis (RAS) is one of the most common oral mucosal diseases which may cause serious impairment on patients quality of life. Despite its still unknown pathogenesis, several factors have been consistently associated with RAS, especially genetic and immunological changes, which has driven a lot of research effort towards these issues. Toll-Like receptors (TLR) recognize molecular products, mainly derived from microorganisms, triggering the inflammatory response. However, abnormalities in their function may give rise to the development of diseases, through abnormal activation of the immune system. The purpose of this investigation was to evaluate the expression of receptors TLR-2, TLR-4 and TLR-7 in peripheral blood and tissue samples of RAS and healthy controls, through real time RT-PCR technique. Five UAR patients and four healthy volunteers with no RAS history composed the casuistic and were submitted to biopsy of their UAR lesions or normal oral mucosa. On that same session patients had a blood sample taken through venopuncture. Both samples (tissue and blood) were, afterwards, submitted to lab procedures of RNA extraction and toll-like receptors expression through real time RT-PCR. There were no significant differences in the expression of these receptors between RAS and healthy controls in the two sample types. Further studies are necessary to allow sound conclusions on the actual participation of these receptors in RAS, since the sample followed were small and there are no similar studies published.

O presente estudo teve o objetivo de verificar o padrão de expressão dos genes HOXB13 e HHEX em carcinomas epidermóides de boca (CEB) através das técnicas de Transcriptase Reversa em Reação de Cadeia Polimerase (RT- PCR) e Hibridização In situ (ISH). Fragmentos de tecido tumoral e de tecido não tumoral adjacente à lesão foram obtidos de 30 pacientes portadores de CEB no Serviço de Cirurgia de Cabeça e Pescoço do HC - FMUSP. As amostras tiveram seus cDNAs extraí dos e submetidos à amplificação por PCR. Os “ amplicons” foram visualizados sob luz UV por eletroforese em gel de agarose a 1% contendo brometo de etí dio. A amplificação dos genes foram correlacionadas com a classificação UICC, TNM, graduação histológica, localização e espessura tumoral, invasão de tecidos adjacentes, perineural e vascular. Após seqüenciamento dos “ amplicons” e confirmação dos genes foram confecionadas as sondas de mRNA para realização da técnica de hibridização in situ. Os resultados obtidos através da técnica de RT-PCR mostraram que: a amplificação dos transcritos dos genes HOXB13 e HHEX podem ser detectados tanto no carcinoma epidermóide quanto no tecido não tumoral adjacente à lesão; não existindo diferença na amplificação dos transcritos de ambos genes para os dois grupos de tecido estudados; a amplificação do transcrito do gene HOXB13 mostrou relação estatí stica com os fatores prognósticos: espessura tumoral, invasão perineural e invasão vascular; a amplificação do transcrito do gene HHEX mostrou relação estatí stica com os fatores prognósticos: invasão vascular,envolvimento com os tecidos adjacentes e uma relação inversa com a idade do paciente. A expressão dos transcritos dos genes HOXB13 e HHEX, detectados pela técnica de ISH, mostrou um padrão de marcação consistente e invariável para os tecidos analisados, estando expressos tanto em carcinoma epidermóide quanto no tecido não tumoral adjacentes à lesão. Os resultados apontam para uma correlação entre a expressão do HHEX e do HOXB13 e alguns fatores prognósticos importantes podendo representar um indicador prognóstico valoroso para o entendimento do comportamento biológico do CEB. / The aim of this study was to verify the HOXB13 and HHEX genes expression in oral squamous cell carcinoma (OSCC) using Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) and in situ Hybridization techniques. Tumoral tissues and adjacent non-tumoral oral mucosa specimens were obtained from 30 patients with OSCC at the Head and Neck Surgery Service HC (FMUSP). The samples were cDNA extracted and submitted to the RT-PCR technique. The amplicons were visualized in electrophoresis on a 1% agarose gel with ethidium bromide. Genes expressions were correlated with UICC staging, TNM stage, tumor location, tumor thickness, adjacent tissues involvement, vascular and perineural invasion, and cellular differentiation. Finally, direct sequence analysis was performed on PCR products to confirm cDNA sequence. Riboprobes were confectioned for in situ hybridization analysis. RT-PCR results showed HOXB13 and HHEX transcripts in both tumoral and non-tumoral tissue samples; no statistical correlation was verified between HOXB13/HHEX expressions and tumoral or non-tumoral tissues; there was a positive correlation between HOXB13 tumoral expression and tumor thickness, neural invasion, and vascular invasion; there was a positive correlation between HHEX tumoral expression and adjacent tissue involvement, vascular invasion, and a inverse relationship with patients age; ISH technique exhibited a consistent and invariable pattern of expression for both genes on both tumoral and non-tumoral tissue samples. Present results points out to a correlation between HOXB13 and HHEX expressions, and some important prognostic indicators, and this may represent a valuable tool to understand the biological behavior of OSCC.

As doenças respiratórias agudas (DRAs) são as causas mais comuns de morbidez e mortalidade infantil mundial, podendo ser causadas por uma grande variedade de microorganismos. A fim de se detectar os vírus respiratórios mais comumente associados às infecções agudas do trato respiratório e traçar seu perfil epidemiológico, utilizamos um protocolo de GS RT-PCR (GeneScan Transcrição Reversa-Reação em Cadeia da Polimerase) para a rápida detecção simultânea do, vírus influenza A e B, parainfluenzavirus tipo 1, 2 e 3, picornavirus, metapneumovirus e o adenovírus. As amostras clínicas foram colhidas de crianças menores de cinco anos de idade, apresentando sintomas respiratórios, no Hospital Universitário (HU) da Universidade de São Paulo (USP), durante o ano de 2003. O GS RT-PCR se mostrou uma metodologia sensível e específica, capaz de detectar uma diversidade maior de agentes infecciosos do trato respiratório em relação à Imunofluorescência Indireta (IFI), reduzindo neste estudo a porcentagem de amostras negativas de 69,9% (235 amostras) para 22% (74 amostras). / A reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) assay based on automated fluorescent capillary electrophoresis and GeneScan software analysis was used to detect nine common respiratory viruses in clinical specimens from young children. Assays for human respiratory syncytial virus (HRSV), human parainfluenza viruses 1, 2, and 3, influenza A and B viruses, human metapneumovirus, adenovirus and picornavirus were incorporated into a screening PCR standard assay format. The optimized assay panel was used to test 336 respiratory specimens obtained from children hospitalized with acute respiratory illness (ARI) that had been previously tested by viral culture and indirect immunofluorescence staining (IIF). GS RT-PCR showed be a sensitive and specific methodology, able to detect a larger diversity of respiratory viruses regarding IFI, reducing in this study the percentage of negative samples of 69,9% (235 samples) to 22% (74 samples).

A otimização e padronização de métodos moleculares são fundamentais para evitar distorções nos resultados causadas por processamento de ácidos nucleicos da abundância relativa de micro-organismos de uma amostra. Nos estudos sobre identificação microbiana, a etapa de validação é, na maioria dos casos, negligenciada. As principais etapas em que podem ocorrer vieses capazes de alterar a informação sobre a composição da comunidade microbiana são a extração e a RT-PCR. O rRNA é a molécula ideal para identificar os micro-organismos metabolicamente ativos por estar em maior quantidade dentro da célula. A inexistência de um protocolo de extração de RNA gold standard e de kits comerciais específicos para cada tipo de amostra ambiental pode comprometer as etapas posteriores à extração. O protocolo de extração de RNA adaptado neste trabalho mostrou alta eficácia na lise celular e na remoção de contaminantes co-extraidos, garantindo a integridade e a qualidade do rRNA extraído de amostras contendo altas concentrações de contaminantes. Devido as diferentes características químicas das amostras ambientais, o uso deste protocolo adaptado pode preservar a informação sobre os indivíduos metabolicamente ativos de uma comunidade microbiana. Foram utilizados consórcios artificiais na validação da etapa de PCR. O efeito sinérgico do uso de aditivos, da Taq polimerase de alto rendimento, do programa de sub-ciclagem e da limitação do programa de amplificação em 10 ciclos, mantiveram a proporção dos moldes dos consórcios analisados próximo ao esperado. Após a padronização da técnica de ARDRA, foi definido que há necessidade de entre 500 e 550 UFC para uma cobertura completa da diversidade de lodo ativado. O uso de enzimas combinadas MspI/HaeIII e HhaI/RsaI em uma mesma reação double digest proporcionou a separação dos clones de lodo ativado utilizando menos etapas de ARDRA. E o critério de corte em 3% do total agrupamentos, possibilitou selecionar os perfis mais representativos sem a perda de grupos importantes para a análise das bibliotecas. Foi concluído que, o uso de um protocolo inadequado de extração de RNA de amostras complexas pode gerar extratos contendo contaminantes co-extraidos que interferem na atividade da Taq polimerase e nas enzimas de restrição. Após o sequenciamento de nova geração, foi observado que o uso de diferentes iniciadores de PCR e do pré-processamento manual para os dados obtidos, foram essenciais para ampliar a cobertura observada para a amostra de lodo e melhorar a resolução dos resultados e a profundidade de identificação taxonômica, respectivamente. / The optimization and standardization of molecular methods are fundamental to avoid distortions in the results caused by nucleic acid processing of the relative abundance of microorganisms in a sample. In the studies on microbial identification, the validation step is, in most cases, neglected. The main steps in which biases capable of altering the composition of the microbial community can occur are extraction and RT-PCR. The rRNA is the ideal molecule to identify metabolically active microorganisms because they are in the greatest amount within the cell. The lack of a gold standard RNA extraction protocol and specific commercial kits for each type of environmental sample may compromise the post-extraction steps. The RNA extraction protocol adapted in this work showed high efficacy in cell lysis and in the removal of co-extracted contaminants, guaranteeing the integrity and quality of the rRNA extracted from samples containing high concentrations of contaminants. Due to the different chemical characteristics of the environmental samples, the use of this adapted protocol can preserve the information about the metabolically active individuals of a microbial community. Artificial consortia were used to validate the PCR step. The synergistic effect of the use of additives, the high yield Taq polymerase, the sub-cycling program and the limitation of the amplification program in 10 cycles, kept the proportion of the molds of the consortia analyzed close to the expected. After standardization of the ARDRA technique, it was defined that there is a need for between 500 and 550 CFU for a complete coverage of the diversity of activated sludge. The use of MspI / HaeIII and HhaI / RsaI combined enzymes in the same double digest reaction provided the separation of activated sludge clones using fewer ARDRA steps. And the criterion of cut in 3% of the total groupings, allowed to select the most representative profiles without the loss of important groups for the analysis of the libraries. It was concluded that the use of an inadequate RNA extraction protocol from complex samples can generate extracts containing co-extracted contaminants that interfere with Taq polymerase activity and restriction enzymes. After the sequencing of the new generation, it was observed that the use of different PCR primers and manual preprocessing for the obtained data were essential to increase the coverage observed for the sludge sample and to improve the resolution of the results and the depth of taxonomic identification, respectively.