Orientador: José Luiz Laus / Coorientador: Renato Pariz Maluta / Banca: Paola Castro Moraes / Banca: Cristiane dos Santos Honsho / Resumo: O tratamento cirúrgico para a catarata, pela facoemulsificação, é atualmente o mais aceito e praticado. A utilização de lentes intraoculares (LIO), indicadas para a correção da emetropia e para a profilaxia da opacificação da cápsula posterior, pode, todavia, ensejar contaminação advinda da cavidade nasal e da conjuntiva palpebral, além do ambiente, da equipe cirúrgica, de materiais e de instrumentais. Com o trabalho, objetivou-se a identificação de linhagens de bactérias presentes nas secreções nasal e conjuntival e no humor aquoso de cães submetidos à facoemulsificação com implante de lentes intraoculares, bem como a caracterização da diversidade genética entre as populações encontradas, empregando-se o sequenciamento da região 16S rDNA de microrganismos, após seleção de diferentes grupos pela Rep-PCR, com o primer BoxA1 associado ao BoxC1R. Encontraram-se bactérias dos gêneros Enterobacter, Staphylococcus, Streptococcus e Pantoea e a espécie Staphylococcus aureus. Pela PCR-RFLP, utilizando-se a enzima MboI, identificaram-se espécies de Staphylococcus, como o S. pseudointermedius. Foram encontrados dois exemplares de Staphylococcus aureus coagulase positivo, pela PCR, confirmados pelo teste bioquímico da coagulase. Os isolados foram submetidos à Rep-PCR com marcadores moleculares Rep1R-I associado ao Rep2, Eric2 e BoxC1R. Encontrou-se alta variabilidade genética entre eles, notadamente quanto ao gênero Staphylococcus. O sequenciamento da região 16S rDNA e a Rep-PCR foram factíveis na detecção da diversidade genética. Oito isolados do gênero Enterobacter em secreção conjuntival e, ao mesmo tempo, no humor aquoso, apresentaram distância genética de 0.000. Cinco por cento dos pacientes submetidos à facoemulsificação com implante de LIO apresentaram contaminação do humor aquoso, por Enterobacter spp / Abstract: Phacoemulsification is the surgical treatment most commonly performed and accepted for cataracts. The use of artificial intraocular lens (IOL), indicated to achieve emetropy and as an aid on the prophylaxis of posterior capsule opacification, may, however, give rise to contamination arising from the nasal cavity and palpebral conjunctiva, in addition to the environment, the surgical staff, materials and instrumental. The goal of this research was to identify strains of bacteria present in the nasal and conjunctival secretions and aqueous humor of dogs undergoing phacoemulsification with implantation of intraocular lenses, as well as the characterization of genetic diversity among populations found using it sequencing of 16S rDNA of microorganisms, after selection of different groups by Rep-PCR with the primer BoxA1 associated BoxC1R. This study founded genders of bacteria like Enterobacter, Staphylococcus, Streptococcus and Pantoea and Staphylococcus aureus species. PCR-RFLP, using the enzyme MboI, identified Staphylococcus species such as S. pseudointermedius. Two copies of coagulase positive Staphylococcus aureus, founded by PCR, were confirmed by biochemical coagulase test. All of isolates was submitted by Rep-PCR with molecular markers Rep1R-I associated with Rep2, Eric2 and BoxC1R. It was found high genetic variability among them, especially regarding the gender Staphylococcus. Sequencing of 16S rDNA and Rep-PCR were effective in detecting genetic diversity. Eight isolates of gender Enterobacter in the conjunctival secretion and, at the same time, in aqueous humor, showed genetic distance of 0.000. Five percent of patients submitted to phacoemulsification with IOL implantation showed contamination in aqueous humor, by Enterobacter spp / Mestre

Orientador: Patrícia Pintor dos Reis / Coorientador: Igor Jurisica / Banca: Sandra Drigo Linde / Banca: Jefferson Luiz Gross / Resumo: O câncer de pulmão é a causa mais frequente de óbito por câncer, com 1,6 milhões de óbitos mundialmente, a cada ano. Apesar dos avanços nas estratégias de tratamento, o prognóstico dos pacientes com carcinoma pulmonar ainda é pobre. O desenvolvimento de drogas com alvos moleculares têm levado a um aumento, embora modesto, na sobrevida de pacientes com carcinomas pulmonares de células não pequenas (NSCLC), especialmente do subtipo histológico adenocarcinoma (AD). A identificação de vias moleculares como alvos terapêuticos é uma área promissora de investigação. Considerando que os miRNAs regulam a expressão gênica, os miRNAs têm o potencial de modular vias moleculares associadas à gênese e progressão do câncer. Investigamos alterações na expressão e ou mutações em sequências de miRNAs em AD pulmonar, utilizando plataformas de análise de sequenciamento de alto desempenho (Illumina) (N=17 AD e N=7 tecidos pulmonares histologicamente normais) e ensaios da PCR quantitativa em tempo real (RQ-PCR) (N=22 AD e N=9 N). A análise de miRNA-Seq identificou variações em nucleotídeos únicos (SNVs) bem como alterações na expressão de miRNAs em AD pulmonar. Três miRNAs (miR- 328, miR-574 e miR-99a) foram validados, com expressão aumentada (p<0,05) em AD comparado com N. Adicionalmente, realizamos uma meta-análise de dados da literatura em NSCLC, com o objetivo principal de comparar os dados da literatura com os nossos dados de miRNA-Seq em AD. Os miRNAs identificados na meta-análise foram utilizados em análises de predição de genes-alvo potencialmente regulados por miRNAs. Redes de interação proteica e vias moleculares relevantes em AD pulmonar foram identificadas. mRNAs-alvo identificados nas redes de interação foram validados por RQ-PCR em 57 amostras de 38 pacientes com NSCLC (N=30 NSCLC e N=27 N). Os resultados mostraram que 3 genes-alvo de miRNAs (PIK3R1, NOTCH1, KLF4), estavam frequentemente... / Abstract: Not available / Mestre

Orientador: Eduardo Bagagli / Coorientador: Raquel Cordeiro Theodoro / Banca: Patricia Albuquerque de Andrade Nicola / Banca: Adriana Pardini Vicentini / Banca: Silvio de Alencar Marques / Banca: Renata Castiglioni Pascon / Resumo: O solo é o provável habitat do fungo patogênico Paracoccidioides spp., devido à detecção molecular deste patógeno neste tipo de amostra, associada à frequente infecção de trabalhadores rurais e isolamento em animais silvestres (Dasypus novemcinctus e Cabassous centralis). O presente estudo visou detectar e diferenciar as espécies Paracoccidioides brasiliensis (complexo) e Paracoccidioides lutzii no ambiente, pelas técnicas de Nested PCR, FISH, respectivamente, em amostras ambientais aerossóis e solo de tocas de tatus provenientes de áreas endêmicas para a Paracoccidioidomicose nas regiões Sudeste, Centro-Oeste e Norte brasileiras. Além da detecção ambiental de Paracoccidioides sp. por métodos moleculares, foi estudada a ocorrência de tatus infectados com P. lutzii no centro-oeste brasileiro, região de maior prevalência desta espécie, onde nenhum animal havia sido avaliado até o presente momento. Obtivemos a detecção positiva para ambas as espécies de Paracoccidioides por ambas as técnicas de detecção (Nested PCR e hibridização in situ), além da diferenciação por ITS (Internal Transcribed Spacer) pudemos visualizar os espécimes fúngicos em algumas amostras aerossóis. Acreditamos que os dados refletem a real ocorrência dos fungos em seu nicho, no entanto, o isolamento animal em tatus demonstrou-se negativo para 7 animais avaliados no trabalho, o que pode indicar que a relação da espécie P. lutzii com os tatus pode não ser a mesma com os casos de tatus infectados com P. brasiliensis em outras regiões brasileiras / Abstract: Soil is probably the habitat of pathogenic fungi Paracoccidioides spp., due to the molecular detection of this pathogen in these samples, associated with the frequent of infection in rural workers and the isolation in wild animals (Dasypus novemcinctus and Cabassous centralis). This project aimed to detect and differentiate the species P. brasiliensis (complex) and P. lutzii in the environment, by the techniques of Nested PCR and FISH, respectively, in environmental aerosol samples and soil from armadillo's burrows, from endemic and non-endemic areas to Paracoccidioidomycosis in the Southeast, Midwest and North regions of Brazil. Besides the environmental detection of Paracoccidioides spp. by molecular methods, the occurrence of armadillos infected with P. lutzii the Brazilian center-west region with the highest prevalence of this kind, where no animals were evaluated at the present time will be studied. We achieved positive detection of both species of Paracoccidioides by both detection techniques (PCR and in situ hybridization), and further the differentiation by the ITS (Internal Transcribed Spacer) we could visualize fungal species in some aerosol samples also differentiating the two species. We believe of the data reflect the actual occurrence of fungi in their niche, however the animal isolation in armadillo's showed up negative for 7 animals evaluated at work, which indicated that the ratio of the species P. lutzii with armadillo may not be the same with cases of armadillo's infected with P. brasiliensis in other regions of Brazil / Doutor

Orientador: Manoel Victor Franco Lemos / Banca: Ricardo Antonio Polanczyk / Banca: Sabrina Moutinho Chabregas / Banca: Janete Apparecida Desidério Sena / Banca: Antonio Sérgio Ferraudo / Resumo: A bactéria B. thuringiensis caracteriza-se pela produção de proteínas tóxicas a representantes de diversas ordens de insetos, as quais são codificadas por genes cry. Este trabalho foi realizado com objetivo de selecionar isolados de B. thuringiensis por meio da caracterização morfológica e molecular identificando as diferentes subclasses dos genes cry3, cry7, cry8, cry9 e cry35 e determinar a patogenicidade contra Sphenophorus levis, que é uma das mais importantes pragas da cultura da cana-de-açúcar. Foram utilizados 1128 isolados de B. thuringiensis e com a observação em microscópio com contraste de fases foram confirmadas como pertencentes à espécie de B. thuringiensis e três linhagens padrões. O material genético foi extraído pela matriz de troca iônica "Instagene Matrix" e submetido a PCR com iniciadores gerais cry3, cry7, cry8, cry9 e cry35 identificando-se 45 isolados com produto de amplificação para coleópteros, os quais juntamente com as linhagens padrões de B. thuringiensis var. tenebrionis, var. morrissone e var. tolworthi e testemunhas foram utilizados para a realização do bioensaio. A análise discriminante alocou os isolados em três grupos quanto à toxicidade de B. thuringiensis e os grupos ficaram assim definidos: um grupo de BAIXA efetividade, com 19,60% do total dos isolados, nesse grupo ficaram as testemunhas e uma linhagem padrão B. thuringiensis var. morrissone e isolados do LGBBA; um grupo de MÉDIA efetividade, com 66,67% do total dos isolados, nesse grupo ficaram duas linhagens padrões B. thuringiensis var. tolworthi e var. morrissone e isolados do LGBBA e um grupo com ALTA efetividade com 13,72% do total dos isolados do LGBBA, os quais podem ser considerados promissores no controle biológico de S. levis. / Abstract: Molecular characterization and selection of B. thuringiensis isolates exhibiting potential control on Sphenophorus levis larvae. Bacillus thuringiensis is characterized by the production of toxic proteins to insects from a number of different orders which are coded by the cry genes. This work was developed aiming to select B. thuringiensis isolates using morphological and molecular analysis so as to identify different cry genes subclass for cry3, cry7, cry8, cry9 and cry35 and also to determine the pathogenicity levels against Sphenophorus levis larvae, that is one of the most important sugar-cane pests. As much as 1128 bacterial isolates together with three control strains were used and for the phase contrast microscopy and molecular analysis. The genetic materials were obtained using the Instagene Matrix that is an ionic matrix and the PCR primers used were developed for cry3, cry7, cry8, cry9 and cry35 genes. A total of 45 isolates were selected showing possible amplicons for coleopterans. These isolates together with the standard strains B. thuringiensis var. tenebrionis, var. morrissone a var. tolworthi were used for bioassays. A discriminating analysis has allocated the bacterial isolates within three groups of B. thuringiensis toxicity and these groups were defined as one with LOW effectivity, comprising 19,6% of the isolates and the control strains together with one of the control strains B. thuringiensis var. morrissone. Another group has revealed a MEDIAN effectivity with a total of 66.7% of the isolates including two other control strains B. thuringiensis var. tolworthi e var. morrissone and a third group with HIGH effectivity with 13.7% of the isolates which were considered as promising B. thuringiensis isolates for the control of S. levis larvae. / Doutor

Orientador: Manoel Victor Franco Lemos / Coorientador: Janete Apparecida Desidério / Banca: Ana Maria Guidelli Thuler / Banca: Fernando Hercos Valicente / Banca: Lucia Maria Carareto Alves / Banca: Odair Aparecido Fernandes / Resumo: A caracterização molecular de 46 isolados de Bacillus thuringiensis foi realizada por meio da técnica de PCR com os oligonucleotídeos iniciadores gerais Gral-cry8(d)/Gral-cry8(r), resultando na identificação do isolado BT_I622 como portador do gene cry8 (coleóptero-específico). O fragmento obtido de aproximadamente 376 pares de base (pb), localizado na porção inicial do gene, foi clonado em vetor pGEM®-T Easy, sequenciado e analisado por bioinformática. A determinação da sequência completa do gene cry8 presente no isolado BT_I622, foi realizada pela estratégia de "primer walking" com a utilização de oligonucleotídeos específicos. Os iniciadores foram elaborados através do programa Primer3, com base nas sequências de genes cry8 depositadas no banco de dados público GenBank (NCBI) e, por meio da análise das sequências geradas com o par de oligonucleotídeos gerais utilizados inicialmente na caracterização dos isolados. As amplificações com diferentes combinações de iniciadores resultaram na obtenção de fragmentos em torno de 1420, 3302, 628, 1580, 508 e 510 pb, os quais foram clonados, sequenciados e analisados pelos programas Phred/Phrap/Consed visando a montagem do gene. A sequência contendo 3531 pb foi comparada ao GenBank pela ferramenta BLASTn, apresentando 98% de similaridade com o gene cry8Ka2. Paralelamente, a sequência de aminoácidos deduzida (1176 aa) revelou 75% de identidade com a proteína Cry8Ba1 na análise com o algoritmo BLASTp, demonstrando que o isolado BT_I622 é portador de um novo gene cry8. Os bioensaios indicaram que as larvas de Sphenophorus levis são sensíveis a nova proteína Cry8 de B. thuringiensis / Abstract: The molecular characterization of 46 Bacillus thuringiensis isolates was carried out using the PCR technique with primers designed to detect cry8 genes (Gral-cry8(d)/Gral-cry8(r)), resulting in the identification of the isolate BT_1622 as a cry8 gene carrier (coleopteran specific). The ca. 376 base pairs (bp) fragment obtained was located in the initial part of the gene, which was cloned into the plasmid pGEM®-T Easy, sequenced and analyzed by bioinformatics. The complete sequence determination of this gene found within isolate BT_1622 was done using the "primer walking" strategy. The primers were designed using the software Primer3, comparing to previously sequenced cry8 genes found in the public database GenBank (NCBI) and analyzing the sequences generated with the pair of general primers used initially in the characterization of isolates. The amplifications with different primer combinations resulted other fragments of this gene with 1,420; 3,302; 628; 1,580; 508 and 510 bp, which were cloned, sequenced and analyzed using the software Phred/Phrap/Consed to obtain the full gene. The 3,531 bp sequence was compared to the GenBank using the BLASTn tool, and showed 98% of similarity with the gene cry8Ka2. Also, the deduced amino acid sequence (1,176 amino acids) showed 75% identity to the Cry8Ba1 using the algorithm BLASTp, demonstrating that the isolate BT_1622 carriers a new cry8 gene. The bioassay results indicated that the Sphenophorus levis larvae are sensitive to the new Cry8 protein of B. thuringiensis / Doutor

Resumo: O controle biológico utilizando microrganismos vem sendo estudado como uma alternativa ao uso de agroquímicos. Estes pesticidas poluem o ambiente, além de serem tóxicos a diversas espécies vegetais e animais. Diante disso, a bactéria Bacillus thuringiensis é um importante entomopatógeno que vem sendo utilizado na agricultura pelo fato de secretar proteínas que são tóxicas a insetos pertencentes a diversas ordens. Dentre os diversos genes de B. thuringiensis que codificam proteínas tóxicas, as classes vip1, vip2 e cry3 destacam-se como alternativa para o controle de insetos-praga da ordem Coleoptera. O presente trabalho objetivou a identificação e caracterização molecular, por meio da técnica de PCR-RFLP, dos genes cry3, vip1, vip2 e vip1/vip2 em uma coleção de B. thuringiensis, quanto a possíveis polimorfismos existentes, procurando relacioná-los à toxicidade em larvas de Anthonomus grandis. Da análise de 1078 isolados de B. thuringiensis, foram encontrados 151 isolados positivos para os genes em estudo e 14 perfis polimórficos, indicando a presença de subclasses destes genes. Os resultados obtidos nos ensaios de toxicidade indicam que os polimorfismos gênicos podem apresentar interferência na toxicidade das proteínas, sendo que a toxina Cry3 apresentou uma maior efetividade na mortalidade em larvas de A. grandis. Os resultados também evidenciaram que a PCR-RFLP mostrou-se apropriada para a detecção da variabilidade genética em B. thuringiensis, permitindo a identificação de haplótipos / Abstract: Biological control using microorganisms is being studied as an alternative to the use of agrochemicals. These pesticides pollute the environment, being toxic to many species of plants and animals. For these reasons, the bacterium Bacillus thuringiensis is an important entomopathogen that has been used in agriculture, once it produces proteins that are toxic to many target insect orders. Among several genes from B. thuringiensis that encode toxic proteins there are vip1, vip2 and cry3 classes that stand as an alternative for controlling insect pests belonging the Coleoptera order. The objective of this work was to identify and characterize molecularly, through PCR-RFLP, the genes cry3, vip1, vip2 and vip1/vip2 in a collection of B. thuringiensis, for possible polymorphisms exist, trying to relate them to the toxicity in Anthonomus grandis larvae. Analysis of 1078 isolates of B. thuringiensis, were found 151 positive isolates for the genes under study and 10 polymorphic profiles, which indicate the presence of subclasses of the genes. These results obtained in tests toxicity indicate that polymorphisms gene may have interference with the toxicity of the protein, and the toxin Cry3 showed a greater effectiveness in mortality in A. grandis larvae. These results also showed that the PCR-RFLP proved to be suitable for the detection of genetic variability in B. thuringiensis, allowing the identification of haplotypes / Orientador: Janete Apparecida Desidério / Coorientador: Odair Aparecido Fernandes / Banca: Maria Inês Tiraboschi Ferro / Banca: José Roberto Postali Parra / Mestre

Orientador: Elerson Gaetti Jardim Junior / Banca: Ana Cláudia Okamoto / Banca: Adriana de Sales Cunha Correia / Resumo: Introdução: A relação entre a microbiota bucal e infecções graves em pacientes mantidos internados em unidades de terapia intensiva (UTI) vem sendo estabelecida, principalmente para os portadores de próteses totais ou parciais, visto que o biofilme bucal pode se converter em reservatório de microrganismos que não fazem parte dessa microbiota. Objetivo: Esse estudo objetivou avaliar a presença dos principais patógenos periodontais e oportunistas na boca de pacientes mantidos em unidades de terapia intensiva. Material e Método: Foram obtidos dados referentes às condições de saúde de 156 pacientes mantidos por mais de 72 horas em ambiente de UTI. Realizou-se exames clínicos intrabucais e coleta de amostras de saliva e mucosas bucais, de secreções respiratórias, sangue e urina. A presença dos principais microrganismos bucais e oportunistas associados às infecções hospitalares foi avaliada por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR). A análise estatística foi realizada pelos testes de Mann-Whitney e Test T, enquanto a correlação entre as variáveis foi obtida pelo Teste de Spearman, todos ao nível de significância de 5%. Resultados: Houve correlação negativa entre a presença de leucócitos e alguns patógenos oportunistas bucais e exógenos. Os microrganismos estudados foram mais prevalentes no gênero masculino e os anaeróbios obrigatórios e microrganismos capnofílicos oriundos do ambiente bucal se mostraram mais relevantes nas infecções sistêmicas do que os patógenos oportunistas exógenos, como as enterobactérias e os pseudomonados. Conclusão: Concluiu-se que a fragilidade da saúde bucal de pacientes internados em UTI, por vezes com imunossupressão, associada a colonização e/ou infecção de microrganismos oportunistas, pode ser um fator agravante na deterioração e piora do quadro sistêmico do paciente / Abstract: Introduction: The relationship between the oral microbiota and serious infections in patients kept in intensive care units (ICU) has been established, mainly for patients with dentures or partials, since oral biofilm can become reservoir of micro-organisms that are not part of this microbiota. Objective: This study aimed to evaluate the presence of the main periodontal pathogens and infections in the mouth of patients kept in intensive care units. Material and method: Data were obtained on the health conditions of 156 patients held for more than 72 hours in the ICU environment. Intraoral clinical examination was carried out and collection of samples of saliva and oral mucosa, respiratory secretions, blood and urine. The presence of the main oral and opportunistic micro-organisms associated with hospital-acquired infections were evaluated by means of the polymerase chain reaction (PCR). Statistical analysis was performed by Mann-Whitney tests and Test T, while the correlation between the variables was obtained by Spearman test, all at a significance level of 5%. Results: There was a negative correlation between the presence of leukocytes and some oral opportunistic pathogens and exogenous. The microorganisms studied were more prevalent in male gender and obligate anaerobes and capnofilicos microorganisms from oral cavity were more relevant in systemic infections than the exogenous opportunistic pathogens, such as Enterobacteriaceae and Pseudomonas. Conclusion: It was concluded that the fragility of the oral health of patients admitted to ICU, sometimes with immune suppression associated with the colonization and/or infection from opportunistic micro-organisms can be an aggravating factor in the deterioration and worsening of the patient's systemic framework / Mestre

Orientador: Helio Langoni / Banca: Jane Megid / Banca: Márcia Marinho / Resumo: A leptospirose é uma enfermidade infecto-contagiosa, de caráter zoonótico, que possui grande importância mundial. É causada por diversas espécies de bactérias patogênicas do gênero Leptospira, ocorrendo com maior frequência em regiões tropicais com condições sanitárias precárias. A infecção ocorre pelo contato direto ou indireto com a urina de animais infectados, e pode variar de assintomática até quadros clínicos graves que causam a morte. A leptospirose em ovinos é responsável por queda na produção animal, e por riscos para a saúde pública. O desenvolvimento de técnicas de diagnóstico permite identificar animais doentes, auxiliando no tratamento precoce, controle de reservatórios, e na prevenção da enfermidade. O presente estudo teve como objetivo principal comparar diferentes técnicas de diagnóstico na leptospirose em ovinos. Amostras de rim, fígado e sangue foram coletadas de 465 animais provenientes de um abatedouro. O soro foi submetido à Soroaglutinação Microscópica (SAM), e as amostras de rim e fígado dos animais soropositivos foram individualmente analisadas por quatro técnicas: cultivo bacteriano, técnica de Warthin Starry (WS), PCR convencional (PCR) e PCR quantitativa (qPCR). Amostras teciduais de 15 ovinos soronegativos, escolhidos aleatoriamente, foram utilizadas como controles negativos. No exame sorológico 21 animais foram positivos (4,5%) para os sorovares Hardjo (n=12), Hebdomadis (n=5), Sentot (n=2), Wolfii (n=1) e Shermani (n=1). Os títulos apresentados foram 100 (n=10), 200 (n=2), 400 (n=6) e 1600 (n=3). No cultivo bacteriano nenhum animal apresentou resultado positivo; na técnica de WS quatro animais foram positivos em amostras de rim, e nenhum de fígado; na PCR seis animais foram positivos em amostras de rim, e nenhum de fígado; e na qPCR 11 animais foram positivos, 8 em amostras... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Leptospirosis is an infectious disease, of zoonotic character, which has great importance worldwide. It is caused by several species of pathogenic bacteria of Leptospira genera, occurring more frequently in tropical regions with poor sanitary conditions. The infection occurs by direct or indirect contact with urine of infected animals, and can vary from asymptomatic to severe clinical pictures that lead to death. Leptospirosis in sheep is responsible for decrease in animal production, and for risks in public health. The development of diagnostic techniques allows to identifying sick animals, assisting in early treatment, reservoirs control, and disease prevention. The present study had as main objective to compare different techniques of leptospirosis diagnostic in sheep. Samples of kidney, liver and blood were collected from 465 animals originated from a slaughterhouse. The sera were submitted to Microscopic Agglutination Test (MAT), and kidney and liver samples of seropositive animals were individually analyzed by four techniques: bacteriological culture, Warthin Starry (WS) technique, conventional PCR (PCR), and quantitative PCR (qPCR). Tissue samples from 15 seronegative sheep, chosen randomly, were used as negative controls. In serologic exam 21 animals were positive (4.5%) to serovars Hardjo (n=12), Hebdomadis (n=5), Sentot (n=2), Wolfii (n=1) and Shermani (n=1). The titers presented were 100 (n=10), 200 (n=2), 400 (n=6) and 1600 (n=3). In bacteriologic culture no animal presented positive result; in WS technique four animals were positive in kidney samples, and none in liver; in PCR six animals were positive in kidney samples, and none in liver; and in qPCR 11 animals were positive, 8 in kidney samples and three in liver samples. The bacterial quantification resulting from qPCR revealed median of 4.32 bacteria/μL in liver... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Heloiza Ferreira Alves do Prado / Banca: João Cláudio Thoméo / Banca: Ana Maria Rodrigues Cassiolato / Resumo: Em conjunto com outras enzimas que degradam amido, as α-amilases e CGTases são incluídas na família 13 glicosilhidrolases caracterizada por uma conformação (α/β)8-barril. As amilases são grupo importante de enzimas industriais, representando cerca de 25% do mercado mundial de enzima.. Foram isoladas linhagens bacterianas de áreas do Cerrado que apresentaram alta produção de amilases em estudos anteriores. Devido ao interesse em ampliar os conhecimentos de α-amilases e CGTase com potencial de aplicação industrial, no presente trabalho, propôs-se realizar estudos de análises físico-químicas e do efeito da fonte de carbono, na produção de α-amilase das linhagens microbianas A-1.2 e A-18 e de CGTase produzida por Paenibacillus campinasensis H69-3 utilizando na fermentação submersa os amidos solúvel, trigo, milho, batata e mandioca; farelo de trigo e mandioca; Maizena e Arrozina como diferentes fontes de carbono alternativas Além disso, propôs-se aperfeiçoar os estudos de produção de amilases pela linhagem microbiana A-1.2 por meio da otimização dos constituintes nutricionais do meio de cultivo em que cada um dos ensaios do planejamento fatorial foi executado em triplicata e dessa forma, consideraram-se as médias dos resultados obtidos dessas repetições. Iniciar estudos de biologia molecular com a CGTase produzida por P. campinasensis H69-3 buscando estratégias para a clonagem e expressão da CGTase em hospedeiro heterólogo (Escherichia coli). As linhagens A-1.2 e A-18 tiveram as fontes de carbono amido solúvel, amido de mandioca, amido de milho e farelo de mandioca como os substratos que maximizaram a produção da enzima por ambas as linhagens, e o tempo de fermentação com maiores atividades foi entre 72 e 96 horas. O perfil de produção ao longo do tempo da CGTase de P. campinasensis H69-3 indicou o amido solúvel, amido de mandioca e a Maizena como as fontes de carbono que propiciaram as mais altas... / Abstract: Together with other enzymes that degrade starch, α-amylases and CGTases are included in the family 13 glycosylhydrolases, characterized by a conformation (α/β)8-barrel. Amylases are an important group of industrial enzymes, accounting for approximately 25% of the world enzyme market. Bacterial strains from the Cerrado areas, which have shown a high production of amylase in the previous studies, have been isolated. Due to the interest in expanding the knowledge of α-amylase and CGTase with potential for industrial application, the present work proposes to conduct studies of physical and chemical analysis and the effect of carbon source on the production of α-amylase of A-1.2 and A-18 microbial strains, as well as CGTase produced by Paenibacillus campinasensis H69-3 in submerged fermentation using the soluble starch, wheat, corn, potato and cassava; wheat bran and cassava; Maizena and Arrozina like various alternative sources of carbon. Furthermore, it proposes enhancing the amylase study of the microbial strain A-1.2 by optimizing the nutritional components of the culture medium in which each of the factorial design experiments has been carried out in triplicate, and thus considering the average results of these repetitions. To initiate molecular biology studies with CGTase produced by P. campinasensis H69-3 searching strategies for the cloning and expression of the CGTase in a heterologous harbourer (E. coli). The A-1.2 and A-18 strains were the carbon sources of soluble, cassava and corn starch, and cassava bran as the substrate that maximized the enzyme production by both strains. And the fermentation time with higher levels of activity was between 72 and 96 hours. The production profile over the CGTase P. campinasensis H69-3 time has indicated the soluble and cassava starch and Maizena as carbon source that provided the highest enzymatic activities. The 72 hours period of time has been more appropriate in enzymatic tests, ... / Mestre

Orientador: Angelo Berchieri Junior / Banca: Fabiana Silva Lima / Banca: Ana Maria Iba Kanashiro / Banca: Oswaldo Durval Rossi Junior / Banca: Luiz Augusto do Amaral / Resumo: A Salmonella Pullorum (SP) é muito semelhante à Salmonella Gallinarum (SG), agentes da Pulorose e Tifo aviário, respectivamente, sendo responsáveis por perdas econômicas no setor avícola. São salmonelas de composição antigênica similar e a distinção de ambas tem sido baseada em provas bioquímicas. Entretanto, este procedimento é laborioso e o surgimento de estirpes com comportamento bioquímico atípico tem estimulado a procura por outros métodos de diagnóstico, como os testes moleculares. No presente estudo, analisou-se o método descrito na literatura envolvendo o gene rfbS em conjunto com testes desenvolvidos com base nos genes speC e speF. O gene rfbS codifica a enzima que atua na parede celular de bactérias e tem sido utilizado para diferenciar SP e SG. Com o propósito de padronizar a PCR para ser utilizada na rotina laboratorial, empregou-se dois métodos de extração de DNA e diferentes concentrações de reagentes. Entretanto, tendo em vista a dificuldade de padronização encontrada desde o início, foi concomitantemente desenvolvida a PCR para os genes speC e speF. Estes dois últimos estão relacionados com a produção da enzima ornitina-descarboxilase, a qual é ativa em SP e inativa em SG. Após testes inicias, foi possível padronizar a PCR do gene speC com posterior utilização da técnica de tratamento enzimático com a enzima de restrição Eco RI. Tanto para o gene rfbS quanto para os genes speC e speF, os resultados encontrados permitiram a diferenciação de 13 amostras de SP e 20 de SG isoladas no Brasil e duas cepas ATCC. Sendo assim, as ações sanitárias e a tomada de decisão no campo podem ser conduzidas de maneira rápida e segura. / Abstract: Salmonella Pullorum (SP) is very similar to Salmonella Gallinarum (SG). They are respectively agents of Pulorosis and Avian Typhoid, both diseases responsible for economic losses to poultry production. Due to the fact that both salmonellas have similar antigenic composition, their differentiation has been based in biochemical tests. However, this fact that this kind of procedure is very troublesome and the occurence of strains showing atypical behavior have stimulated the search for others diagnostic methods, such as molecular tests. In the present study, a method described in the literature using gene rfbS was analyzed together with tests developed based on genes speC and speF. Gene rfbS encodes an enzyme that acts on the cell wall of bacteria and has been used in the differentiation between SP and SG. In order to standardize the PCR procedure to be used in laboratory routine, two methods for DNA extraction were used, as well as different concentrations of the reagents. However, due to the difficulty in the standardization observed from the beginning of the study, a PCR procedure was developed for genes speC and speF. These genes are related to the production of the enzyme ornithine-descarboxilase, active in SP and inactive in SG. After the initial tests, PCR of gene speC was standardized, and later on it was coupled with the enzymatic treatment with restriction enzyme Eco RI. Results obtained for gene rfbS as well as for genes speC and speF enabled differentiation of 13 SP and 20 SG strains isolated in Brazil and two strains ATCC. So, the sanitary actions and the decisions in the livestock can to be conduced with safety and rapidity. / Doutor