Submitted by Elís Domingos Ferrari null (elisd.ferrari@yahoo.com.br) on 2017-10-31T11:41:02Z No. of bitstreams: 1 FINAL-Defesa Mestrado CORRIGIDO.pdf: 1177720 bytes, checksum: 7a08f0cef1e5a124653c8190f8178822 (MD5) / Approved for entry into archive by LUIZA DE MENEZES ROMANETTO (luizamenezes@reitoria.unesp.br) on 2017-11-10T18:35:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 ferrari_ed_me_araca_par.pdf: 606404 bytes, checksum: 87114f79e3b3cffb7d3ab08cd9009eb6 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-10T18:35:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ferrari_ed_me_araca_par.pdf: 606404 bytes, checksum: 87114f79e3b3cffb7d3ab08cd9009eb6 (MD5) Previous issue date: 2017-10-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrência e os métodos de diagnóstico para Cryptosporidium spp. em psitacídeos exóticos de cativeiro provenientes das regiões sul e sudeste do Brasil. A purificação dos oocistos nas amostras fecais de 463 psitacídeos foi realizada por meio de centrifugo-flutuação em solução de Sheather. Para análise microscópica, nós utilizamos a coloração negativa de verde malaquita. A amplificação de um fragmento parcial do gene 18S rRNA de Cryptosporidium spp. foi feita usando-se nested PCR seguida de sequenciamento dos fragmentos amplificados (nPCR/S). As amostras também foram testadas por meio de PCR duplex em tempo real, visando-se amplificar um fragmento do gene 18S rRNA de Cryptosporidium galli e Cryptosporidium genótipo III de aves. A ocorrência de Cryptosporidium spp. pela microscopia e nested PCR (nPCR) foi de 3, 02% (14/463) e 4, 97% (23/463), respectivamente. A nPCR/S demonstrou positividade de 1, 73% (8/463) para Cryptosporidium genótipo III de aves, 0, 86% (4/463) para Cryptosporidium parvum e 0, 22% (1/463) para Cryptosporidium canis. A PCR duplex em tempo real demonstrou positividade de 9, 50% (44/463) para as criptosporidiose gástrica, sendo 1, 94% (9/463) para C. galli, 5, 83% (27/463) para Cryptosporidium genótipo III de aves e 1, 73% (8/463) para infecções mistas. Não houve diferença estatística significante entre a positividade pela nPCR e microscopia (p = 0. 1237) e houve concordância justa entre elas (Kappa = 0. 242). Diferença estatística significante (p <0. 0001) e concordância justa (Kappa = 0. 317) foram obtidas nas comparações entre nPCR e PCR duplex em tempo real. Nós concluímos que a PCR duplex em tempo real é a melhor opção para o diagnóstico de criptosporidiose gástrica e que Cryptosporidium genótipo III de aves é o mais comum dentre as espécies/ genótipos de Cryptosporidium que acometem psitacídeos. / The aim of this study was to evaluate the prevalence and diagnostic methods for Cryptosporidium spp. in caged adult exotic parrots from Southern and Southeastern Brazil. The oocyst purification in fecal samples from 463 psittacines was performed by centrifugal-flotation in Sheather's sugar solution. For microscopic analysis, we used malachite green negative staining. Amplification of a partial fragment of the 18S rRNA gene of Cryptosporidium spp. was accomplished using nested PCR (nPCR) followed by sequencing of the amplified fragments (nPCR/S). Samples were also tested by duplex real-time PCR targeting the 18S rRNA gene of Cryptosporidium galli and Cryptosporidium avian genotype III. The prevalence rates of Cryptosporidium spp. by microscopy and nPCR was 3. 02% (14/463) and 4. 97% (23/463), respectively. The nPCR/S showed positivity of 1. 73% (8/463) for Cryptosporidium avian genotype III, 0. 86% (4/463) for Cryptosporidium parvum and 0. 22% (1/463) for Cryptosporidium canis. Duplex real-time PCR showed a positivity of 9. 50% (44/463) for gastric cryptosporidiosis, 1. 94% (9/463) for C. galli, 5. 83% (27/463) for Cryptosporidium avian genotype III and 1. 73% (8/463) for mixed infections. There was no statistically significant difference between positivity for nPCR and microscopy (p = 0. 1237) and fair agreement between them (Kappa = 0. 242). A significant statistical difference (p <0. 0001) and fair agreement (Kappa = 0. 317) were obtained between nPCR and duplex real-time PCR. We found out that duplex real-time PCR is the best option for the diagnosis of gastric cryptosporidiosis and that Cryptosporidium avian genotype III is the most common Cryptosporidium species /genotype in psittacines. / FAPESP: 2015/26334-8

Orientador: Regina Maria Barretto Cicarelli / Banca: Leonor Gusmão / Banca: Joyce Aparecida Martins Lopes Ferraz / Banca: Raquel Mantuaneli Scarel Caminaga / Banca: Celso Teixeira Mendes Júnior / Resumo: Na rotina da genética forense, o uso exclusivo dos marcadores STRs (Short Tandem Repeats) em situações que a amostra biológica apresenta-se degradada pode gerar um resultado final estatístico inconclusivo, tornando fundamental a análise de marcadores adicionais para a resolução do caso. Utilizado como método complementar, os polimorfismos InDels (inserção/deleção) têm mostrado grande potencial para superar as limitações dos marcadores tradicionais. A análise de regiões do cromossomo X também vem ganhando significativa importância nesses estudos, especialmente nos casos em que a análise dos autossômicos não é suficiente. Nessa perspectiva, este trabalho teve por objetivo geral caracterizar a população do estado de São Paulo para 32 polimorfismos de inserção/deleção no cromossomo X (32 X-InDels) e avaliar a utilidade desse multiplex na resolução de casos forenses. Para tanto, buscou-se identificar a diversidade genética desses polimorfismos nessa população, a segregação dos alelos entre os genitores (pai e mãe) para as suas respectivas filhas e a eficiência desse painel na amplificação de DNA extraído de amostras ósseas. Para identificar a diversidade genética, foram analisados os perfis genotípicos de 500 indivíduos não aparentados nascidos no estado de São Paulo. Todos os marcadores mostraram-se polimórficos para a população, sendo MID3701 o que apresentou maior diversidade e somente MID2637 se mostrou pouco informativo. O marcador MID1361 apresentou-se em desequilíbrio de Ha... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In forensic genetics routine, the exclusive use of STRs (Short Tandem Repeats) markers when the biological sample is degraded can generate an inconclusive final statistical result, making essential the analysis of additional markers for case resolution. Used as a complementary method, InDels (insertion/deletion) polymorphisms have shown great potential to overcome the limitations of traditional markers. Polymorphisms in the X chromosome is also gaining significant importance in these studies, especially in those cases in which the analysis of the autosomal markers is not enough. In this perspective, this study aimed to characterize the São Paulo state population for 32 X chromosome insertion/deletion polymorphisms (32 X-InDels) and to evaluate the utility of this multiplex in the resolution of forensic cases. Therefore, it was analyzed the genetic diversity of this population, the alleles segregation between the parents and their respective daughters, and the amplification efficiency of this panel in DNA extracted from human bones. To identify genetic diversity, the genotypic profiles of 500 unrelated individuals born in São Paulo state was analysed. All markers were polymorphic for the population, with MID3701 being the most diverse, and MID2637 the less informative. The MID1361 marker was in Hardy-Weinberg disequilibrium and an allelic variant was identified in its short allele. The panel showed high forensic efficiency, confirmed by the accumulated power of discrimination (0.9999999999993 in females and 0.99999993 in males) and by the accumulated mean exclusion chance (0.999996 in trios and 0.99995 in duos). Comparing with other populations, significant values of genetic distance were obtained and São Paulo is closer to three... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. / Made available in DSpace on 2012-10-24T19:16:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 262881.pdf: 2759896 bytes, checksum: 6c601255ca8f91139751586839b36641 (MD5) / Neste estudo foi padronizada a reação de RT-PCR para detectar a expressão de mRNA de IL-2, para seleção in vitro de substâncias naturais ou sintéticas com potencial atividade imunomodulatória sobre linfócitos T, visto que estes constituem uma das maiores classes de linfócitos e são importantes na regulação da resposta imune inata e adaptativa. Para isso foi utilizada a linhagem de células Jurkat, que são derivadas do tecido hematopoiético humano e produzem IL-2 após estimulação celular com lectinas. Para a realização da reação de RT-PCR, o RNA foi extraído das células Jurkat utilizando-se o reagente Trizol e posteriormente tratado com DNase para obter maior pureza do RNA . Para a padronização da reação de amplificação, foram testados diferentes tampões de reação e temperatura de ligação do iniciador. Os produtos de IL-2 foram confirmados por sequenciamento. Também foi padronizado o tempo e a concentração de Fitohemaglutinina (PHA) utilizada para estimular as células, que foi de 24 horas e 1 µg/ml, respectivamente. Além disso, a Ciclosporina A (CsA) foi selecionada como controle de inibição celular. Após padronização da RT-PCR, foram testados os galatos e os polissacarídeos de Agaricus blazei. Muitos estudos demonstraram que estes compostos possuem atividades farmacológicas, incluindo ações anticancerígenas, antibacteriana, antivirais, entre outras. A citotoxicidade (CC50) dos compostos utilizados foi determinada pelos ensaios colorimétricos MTT e/ou Vermelho Neutro. Dos 15 galatos testados, somente os galatos de propila, butila, octila, nonila, decila, undecila, dodecila e tetradecila, apresentaram atividade de estimulação celular e dos 15 polissacarídeos de Agaricus blazei, somente 3 mostraram-se positivos: polissacarídeo 3, extraído da frutificação e separado por membrana de ultrafiltração 1, polissacarídeo 4, extraído da frutificação e separado por membrana de ultrafiltração 2 e o polissacarídeo 7, extraído do micélio em grãos de trigo e separado por membrana de microfiltração. Paralelamente, foi realizada a imunofenotipagem das células Jurkat e feita à avaliação da estimulação celular por citometria de fluxo. Dentre os marcadores celulares testados (CD25/CD3) a frequência de células positivas para CD25 foi a que melhor refletia a ativação das células Jurkat, porém com menor sensibilidade do que a RT-PCR. Neste estudo, portanto, ficou evidenciada a utilidade de uma técnica in vitro para triagem de substâncias com potencial atividade imunomodulatória sobre linfócitos T, o que permite vislumbrar a análise de grande número destas substâncias, sem utilização de animais de laboratório.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-25T03:26:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 279884.pdf: 7471394 bytes, checksum: 49ecffa5cacc5208c3b1840fdef5866c (MD5) / A resistência a múltiplas drogas é uma das maiores causas para a falha do tratamento das leucemias agudas (LA). A resistência adquirida ou intrínseca a múltiplas drogas (MDR) depende de muitas variáveis biológicas e é principalmente caracterizada pela resistência cruzada a uma ampla variedade de fármacos não relacionados estrutural e funcionalmente. Vários mecanismos podem estar envolvidos no fenômeno MDR, como o mecanismo de efluxo de drogas através da membrana plasmática e as alterações nos mecanismos que regulam a morte celular por apoptose. Assim, o objetivo desse trabalho foi analisar o perfil de expressão das proteínas relacionadas à resistência a múltiplas drogas (ABCB1, ABCC1 e LRP) e à apoptose (Bcl-2) em células blásticas de pacientes com leucemia aguda (LA), ao diagnóstico, atendidos pelo Serviço de Hematologia do Hospital Universitário da Universidade Federal de Santa Catarina (HU-UFSC) e pelo Serviço de Oncologia do Hospital Infantil Joana de Gusmão (HI-Florianópolis) no período de Janeiro de 2008 a Dezembro de 2009. Para tanto, as células blásticas dos adultos e crianças com LA foram separadas por gradiente de densidade com Ficoll-Hypaque e a expressão dos genes e das proteínas de resistência foram avaliadas por RT-PCR semiquantitativo e citometria de fluxo, respectivamente. A média da expressão relativa de todas as amostras foi utilizada como ponto de corte para superexpressão. Tanto os pacientes adultos quanto as crianças apresentam uma ampla variedade de expressão para as proteínas estudadas. Os pacientes adultos com LA apresentaram correlação significativa entre a expressão dos genes abcb1 e lrp e a expressão das proteínas ABCB1 e ABCC1, ABCB1 e Bcl-2, e ABCC1 e Bcl-2 e nos pacientes pediátricos com LA não houve correlação significativa entre os níveis de expressão de dos genes e proteínas estudados. Nos pacientes adultos com LA, houve correlação positiva entre a expressão do gene abcb1 e a idade dos pacientes, e a concentração de LDH, enquanto nos pacientes pediátricos com LA, houve correlação positiva entre a expressão do gene abcc1 e a expressão de CD34, entre a expressão da proteína LRP e a idade, e entre a expressão da proteína ABCB1 e a leucometria ao diagnóstico. Esses resultados sugerem que a análise da expressão gênica de abcb1 está mais relacionada com um pior prognóstico nos pacientes adultos com LA, enquanto que nos pacientes com LA infantil, é a expressão conjunta das proteínas ABCB1, ABCC1 e LRP que parece estar relacionada com um pior prognóstico. Além disso, os resultados também indicam que a determinação do perfil de expressão da ABCB1, ABCC1 e LRP pelo método do RT-PCR semiquantitativo é mais significativa nos casos de LA em adultos e a determinação do perfil de expressão dessas proteínas por citometria de fluxo é mais significativa nas LAs em crianças

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-25T09:16:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 286647.pdf: 2822556 bytes, checksum: efcdfec4981831ef957fb764c96e7d5d (MD5) / Neste estudo foi padronizada a reação de RT-PCR para a detecção da expressão do mRNA dos marcadores TNF-?, IL-10 e iNOS, importantes no contexto de ativação de macrófagos, para seleção in vitro de substâncias naturais ou sintéticas com potencial atividade imunomodulatória sobre macrófagos, visto que estes constituem uma das principais populações de células do sistema imune. Para isso foi selecionada a linhagem murina RAW 264.7, cultivada in vitro e que responde a estímulos como o LPS. Para a realização da RT-PCR, o RNA foi extraído das células utilizando o reagente Trizol e posteriormente feito reação de transcrição reversa com 1 µg de RNA total, em condições padronizadas. Na etapa de amplificação do cDNA, foram testadas a melhor temperatura de anelamento para cada marcador, concentração dos iniciadores específicos e diluição do cDNA. Determinou-se que o melhor tempo necessário para visualizar os produtos de amplificação era de 6 horas para os ensaios de ativação e foram estabelecidas as concentrações de LPS capazes de estimular as células em cultura, quando avaliadas pela RT-PCR e dosagem de óxido nítrico. Verificou-se que a adição prévia de polimixina B (50 µg/ml) nas amostras é eficiente na inativação de endotoxinas contaminantes. Estabeleceu-se um protocolo para testar a potencial atividade antiinflamatória de compostos químicos, pela adição da substância a ser testada 6 horas após a ativação prévia com LPS, incubação por 18 horas e observação da inibição da expressão dos marcadores. Determinou-se em seguida, a atividade de 15 formulações de polissacarídeos de Agaricus blazei, sendo que todos os extratos mostraram atividade, pela RT-PCR, para a concentração de 10 µg/ml para a citocina TNF-? e nas frações 2, 3, 11 e 12 para a enzima iNOS; enquanto que a dosagem de óxido nítrico realizada em paralelo mostrou-se menos sensível. Também avaliou-se a atividade de 9 galatos sintéticos, e concluiu-se que nenhuma das amostras testadas demonstrava atividade ativadora de macrófagos. Ficou evidenciado neste estudo, portanto, a utilidade de uma técnica in vitro para a triagem de substâncias com potencial atividade imunomodulatória sobre macrófagos, que permite vislumbrar a análise de grande número destas substâncias, sem a utilização de animais de laboratório. / In this study an RT-PCR to detect mRNA expression of the markers TNF-?, IL-10 and iNOS, relevant in the macrophage activation context, was standardized in order to in vitro screening of natural or synthetic compounds with potential immunomodulatory activity in macrophages, whereas they constitute a major population of immune systems cells. For this, was selected the murine strain RAW 264.7 cultured in vitro, and that responds to stimuli such as LPS. To perform RT-PCR, RNA was extracted from cells using Trizol reagent and subsequently made a reverse transcription reaction with 1 µg of total RNA under standard conditions. In amplification of cDNA step, were tested the best annealing temperature for each marker, the concentration of specific primers and dilution of cDNA. It was determined that the best time to view the amplification products was 6 hours for the testing of activation, and states the concentrations of LPS the cells were responsive to our model of RT-PCR and measurement of nitric oxide. It was found that the previous addition of polymyxin B (50 µg / ml) in samples is efficient in the inactivation of endotoxin contaminants. Was established a protocol to test the potential anti-inflammatory activity of chemical compounds, by adding the substance to be tested after 6 hours prior to activation with LPS, incubated for 18 hours and observing the inhibition of expression of markers. Was determined activity of 15 polysaccharides of Agaricus blazei where all the extracts showed activity in the RT-PCR for the concentration of 10 µg / ml for TNF-? cytokine and for the fractions 2, 3, 11 and 12 for the iNOS enzyme; but not in the dosage of nitric oxide. We also determined the activity of 9 gallates synthetic, and concluded that none of gallates tested showed activity in activating macrophages. Was evidenced in this study, therefore, the usefulness of an in vitro technique for screening of substances with potential immunomodulatory activity on macrophages, which paves the analysis of many of these substances without the use of laboratory animals.

Orientador: Marcelo Vasconcelos Meireles / Banca: Luzia Helena Queiroz / Banca: Valéria de Sá Jayme / Resumo: A infecção por algumas espécies ou genótipos de Cryptosporidium representa um risco em potencial para a saúde pública, principalmente por causa de morbidade e mortalidade em crianças de zero a cinco anos de idade e em pacientes imunodeprimidos. Embora existam alguns relatos de infecção por Cryptosporidium em animais exóticos, sua participação na epidemiologia da criptosporidiose humana é incerta, e a literatura sobre esse tema ainda é bastante escassa. O objetivo deste estudo foi determinar a ocorrência e realizar a classificação molecular de Cryptosporidium spp. em amostras fecais de animais exóticos criados como animais de estimação no Brasil. Um total de 386 amostras de seis espécies de animais exóticos foi colhido e armazenado em solução de dicromato de potássio 5% a 4°C. Os oocistos foram purificados por centrífugo-sedimentação em água-éter, seguindo-se a extração de DNA genômico e a realização da nested-PCR para amplificação de fragmento parcial do gene da subunidade 18S do rRNA. Positividade para Cryptosporidium spp. foi observada em 11,40% (44/386) das amostras. O sequenciamento de fragmentos amplificados permitiu a identificação de Cryptosporidium tyzzeri (Cryptosporidum genótipo I de camundongos) em camundongos (Mus musculus), Cryptosporidium muris em camundongos, hamster (Mesocricetus auratus e Cricetulus griseus) e chinchila (Chinchilla lanigera), Cryptosporidium parvum em chinchila e Cryptosporidium sp. em porquinho-da-índia (Cavia porcellus). Os resultados deste estudo mostram que há uma variedade de espécies de Cryptosporidium spp. presentes em animais exóticos de companhia no Brasil. Os dados sugerem que esses animais podem participar da epidemiologia da criptosporidiose humana, particularmente por seu estreito convívio / Abstract: Infection by some species or genotypes of Cryptosporidium represents a potential risk to public health, mainly because of the morbidity and mortality in children from zero to five years of age and in immunocompromised patients. Although there are some reports of Cryptosporidium infection in exotic animals, the participation of these animals in the epidemiology of human cryptosporidiosis is uncertain and studies on this topic is still rather scarce. The aim of this study was to determine the occurrence as well as to perform the molecular classification of Cryptosporidium spp. in faecal samples of exotic animals raised as pets in Brazil. A total of 386 faecal samples from six species of exotic animals was collected and stored in a solution 5% potassium dichromate at 4°C. The oocysts were purified by centrifugal sedimentation water-ether, followed by genomic DNA extraction and the performance of the nested-PCR to amplify partial gene fragment of 18S rRNA. Positivity for Cryptosporidium spp. was obtained in 11.40% (44/386) of samples. The sequencing of the amplified fragments allowed the identification of Cryptosporidium tyzzeri (Cryptosporidium mouse genotype I) on mice (Mus musculus), Cryptosporidium muris in mice, hamster (Mesocricetus auratus and Cricetulus griseus) and chinchilla (Chinchilla lanigera), Cryptosporidium parvum in chinchila and Cryptosporidium sp. in guinea pig (Cavia porcellus). The results of this study show that there are a variety of species of Cryptosporidium spp. present in exotic animals company in Brazil. The data suggest that these animals may have zoonotic potential and participate in the epidemiology of human cryptosporidiosis / Mestre

Orientador: Marcos Rogério André / Banca: Rosangela Zacarias Machado / Banca: Darci Moraes Barros Battesti / Resumo: Embora novos genótipos de agentes Anaplasmataceae vêm sendo detectados em carnívoros selvagens, aves selvagens e cervídeos no Brasil, poucos são os estudos acerca da circulação destes patógenos em pequenos mamíferos em nosso território. O presente trabalho teve como objetivo investigar a presença de DNA de Ehrlichia e Anaplasma em roedores amostrados no Brasil. Entre 2000 e 2011, diferentes espécies de roedores [n = 60] foram capturadas em cinco biomas brasileiros. As amostras de baço de roedores foram submetidas a extração de DNA utilizando um kit comercial. A presença de DNA de Ehrlichia e Anaplasma foi investigada utilizando ensaios de PCR em tempo real e convencionais dirigidos a vários genes. Dentre as 458 amostras de baço de roedores testadas, 0,44% (2/458) mostraram-se positivas para Ehrlichia spp. e 2,40% (11/458) para Anaplasma spp., pelos ensaios de PCR em Tempo Real multiplex baseados no gene groESL. A quantificação média do número de cópias de um fragmento do gene groESL por microlitro variou de 1,071 x 102 a 2,808 x 102 cópias para Ehrlichia spp. e 1,123 x 100 a 1,310 x 102 para Anaplasma spp. Pelos ensaios de PCR convencional baseados no gene 16S rRNA, 1,09% (5/458) das amostras mostraram-se positivas para Ehrlichia sp. e 1,97% (9/458) para Anaplasma sp. Análises filogenéticas de máxima verossimilhança baseada em um fragmento de 546 pb do gene 16S rRNA posicionaram os genótipos de Anaplasma detectados em roedores próximos a A. phagocytophilum ou isolados de A. ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Although new genotypes of Anaplasmataceae agents have been detected in wild carnivores, wild birds and deer in Brazil, few reports have been done in order to assess the circulation of these pathogens in small mammals in our territory. The present work aimed to investigate the presence of Ehrlichia and Anaplasma in rodents sampled in Brazil. Between 2000 and 2011, different rodent species [n=60] were trapped in five Brazilian biomes. Rodents' spleen samples were submitted to DNA extraction using a commercial kit. The presence of Ehrlichia and Anaplasma DNA was investigated using real time and conventional PCR assays targeting several genes. Among 458 rodent tested spleen samples, 0.44% (2/458) were positive for Ehrlichia spp. and 2.40% (11/458) for Anaplasma spp., by a multiplex qPCR assay based on groESL gene. The mean quantification of the number of copies of 83pb groESL gene fragment per microliter ranged from 1,071 x 102 to 2,808 x 102 copies for Ehrlichia spp., and 1,123 x 100 to 1,310 x 102 for Anaplasma spp. Out of 458 samples tested, 1.09% (5/458) were positive for Ehrlichia sp. and 1.97% (9/458) for Anaplasma sp. by cPCR assays based on 16S rRNA gene. Maximum Likelihood phylogenetic analyse based on 546pb fragment of 16S rRNA gene positioned the Anaplasma genotypes detected in rodents near to A. phagocytophilum or A. marginale and A. odocoilei isolates. On the other hand, the Ehrlichia genotypes detected in sampled rodents were closely related to E. canis, according to the phylogenetic analyses based on 358pb 16S rRNA gene fragment. The present study showed a low occurrence of Anaplasma and Ehrlichia in rodents in Brazil. / Mestre

Orientador: Karina Paes Bürger / Coorientador: Lara Borges Keid / Banca: Samir Issa Samara / Banca: Raphaella Barbosa Meirelles Bartoli / Resumo: A tuberculose é uma doença infectocontagiosa de caráter zoonótico de grande importância em saúde pública, sendo seu diagnóstico e o conhecimento de sua epidemiologia, peças fundamentais na sua prevenção e controle. Este trabalho objetivou a comparação entre métodos diagnósticos para tuberculose bovina. Foram realizados diagnósticos pelo cultivo microbiológico, caracterização histopatológica e identificação de bacilos álcool-ácido resistentes (BAAR) e identificação molecular da infecção por Mycobacterium bovis em bovinos adultos abatidos em matadourosfrigoríficos sob Serviço de Inspeção Federal (SIF) no Estado de São Paulo e posteriormente, os municípios de origem destes animais foram geoprocessados. Durante o abate, foram identificadas e coletadas amostras de linfonodos com lesões macroscópicas sugestivas de tuberculose. O diagnóstico pelo cultivo microbiológico foi realizado em meio de cultura sólido, a caracterização histopatológica pela coloração com hematoxilina eosina (HE), a identificação de BAAR pela coloração de Ziehl-Neelsen (ZN) e o diagnóstico pela identificação molecular foi realizado a partir de DNA extraído das lesões sugestivas de tuberculose pela reação em cadeia pela polimerase (PCR, nested PCR e multiplex PCR) e a partir de DNA extraído das colônias isoladas para identificação do M. bovis utilizando-se a PCR e a multiplex PCR. Dentre as lesões sugestivas de tuberculose observadas, 50% (25/50) foram identificadas em linfonodos retrofaríngeos e todas foram caracterizadas como caseosas. Houve crescimento de colônias características de M. bovis em 56% (28/50) das amostras, 64% (32/50) das amostras foram consideradas positivas pela coloração com HE e 52% (26/50) pela coloração confirmatória de ZN (identificação de BAAR). A PCR a partir de DNA extraído das lesões teciduais apresentou 38% (19/50) das amostras positivas e a PCR a partir de DNA extraído das... / Abstract: Tuberculosis is a contagious infectious zoonotic disease of high importance in public health, which diagnosis and the epidemiology knowledge are essentials in this disease prevention and control. This study aimed to compare the different diagnostic tests for bovine tuberculosis. Microbiological culture, histopathological and molecular M. bovis diagnosis were made in adults bovines slaughtered in slaughterhouses under Inspection Federal Service - SIF in São Paulo State and after, the animals origin municipalities were geoprocessing. Samples of lymph nodes with macroscopic lesions suggestive of tuberculosis were identified and collected during the animals' slaughter. The microbiological diagnosis was made by culture in solid medium, histopathological characterization by staining with hematoxylin eosin (HE), identification of AFB by Ziehl-Neelsen (ZN) and the diagnosis by molecular identification was carried out from DNA extracted from the lesions suggestive of tuberculosis by polymerase chain reaction (PCR, nested PCR and multiplex PCR) and the DNA extracted from the colonies was isolated for M. bovis identification using PCR and multiplex PCR. Most injuries (50% - 25/50) was identified in retropharingeal and all of them were characterized as caseous. M. bovis colonies growth was characteristics in 56% (28/50) of the samples and64% (32/50) of the samples were positive by HE staining and 52% (26/50) for confirmatory ZN staining. The PCR directly from tissue showed 38% (19/50) of positive samples and the PCR from the colonies showed 56% (28/50) of positive samples. The kappa test (95%) between the diagnoses showed higher agreement between the molecular diagnostics of the colonies, followed by histopathological and molecular analysis of tuberculosis suggestive lesions toward the microbiological diagnosis. The highest sensitivity and specificity values were observed in the colonies molecular testing, followed by histopathological and ... / Mestre

Resumo:A infecção por Cryptosporidium serpentis é comum em répteis, em particular em serpentes, e é caracterizada por infecção crônica com presença de gastrite hipertrófica grave, que pode ser letal. Esta pesquisa teve como objetivo utilizar a reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real, tendo como alvo o gene da proteína do choque térmico (Hsp70), para detecção de C. serpentis em amostras fecais de serpentes, e determinar a sua especificidade e sensibilidade analíticas e epidemiológicas utilizando, como padrão ouro, a nested PCR para amplificação de fragmento parcial do gene da subunidade 18S do rRNA (18S rRNA) seguida de sequenciamento dos fragmentos amplificados (nPCR/S). A PCR em tempo real foi positiva para C. serpentis em 17 amostras (3,37%), enquanto a nPCR/S resultou em positividade para C. serpentis em 15 amostras (2,98%). A nPCR/S resultou em positividade para Cryptosporidium spp. em 60 amostras (11,98%). O seqüenciamento dos fragmentos amplificados pela nPCR foi possível em 38 amostras e resultou na identificação de Cryptosporidium tyzzeri, Cryptosporidium muris, Cryptosporidium varanii e C. serpentis, em diversas espécies de serpentes. Os valores de sensibilidade e especificidade epidemiológicas da PCR em tempo real foram, respectivamente, 93,8% e 99,5%. Embora três amostras tenham apresentado positividade para C. serpentis apenas pela PCR em tempo real, e foram consideradas como resultado falso positivo na estimativa da especificidade e sensibilidade epidemiológicas, a análise da curva de dissociação indicou que essas amostras apresentaram a mesma temperatura de dissociação que as amostras de C. serpentis. Assim, concluiu-se que a PCR em tempo real, visando ao gene Hsp70 é um método sensível e específico para detecção de C. serpentis em amostras fecais de serpentes / Abstract:Cryptosporidium serpentis infection is common in reptiles, especially snakes, and is characterized by chronic infection with severe hypertrophic gastritis, which can be lethal. This research aimed to use the real- time polymerase chain reaction (PCR) targeting the heat shock protein gene (Hsp70) for detection of C. serpentis in fecal samples of 503 snakes, and to determine its analytical and epidemiological specificity and sensitivity using, as a gold standard, the nested PCR targeting the 18S rRNA (18S rRNA) gene followed by sequencing of the amplified fragments (nPCR/S). The real-time PCR was positive for C. serpentis in 17 samples (3.37%), and nPCR/S resulted in positive results for C. serpentis in 15 samples (2.98%). It was also observed that the nPCR/S was positive for Cryptosporidium spp. in 60 samples (11.98%). Sequencing of the fragments amplified by nPCR was possible in 38 samples, and resulted in the identification of Cryptosporidium tyzzeri, Cryptosporidium muris, Cryptosporidium varanii and C. serpentis in several species of snakes. The sensitivity and specificity of real-time PCR were, respectively, 93.8% and 99.5%. Although three samples were positive for C. serpentis only by real-time PCR, and were considered as false positive results in the estimation of the epidemiological specificity and sensitivity, the melting curve analysis indicated that these samples had the same melting temperature of the C. serpentis samples. Thus, we conclude that real-time PCR targeting the gene Hsp70 is a sensitive and specific method for the detection of C. serpentis in fecal samples from snakes / Orientador:Marcelo Vanconcelos Meireles / Banca:Alex Akira Nakamura / Banca:Valéria de Sá Jayme / Banca: Carlos Noriyuki Kaneto / Banca:Roberta Lemos Freire / Doutor

Resumo: A hortênsia é um arbusto semilenhoso muito apreciado como ornamental no Brasil. No Brasil podemos ressaltar a "Região das Hortênsias" no Sul do país, onde esta ornamental é utilizada em projetos de jardinagem em casas e rodovias. A cidade de Gramado têm a hortênsia como sua flor símbolo. No Estado de São Paulo, ela é comumente encontrada na Região de Campos do Jordão. Plantas de hortênsia apresentando anéis cloróticos e necróticos foram observadas por Yuki et al. (2005) em material proveniente de Arujá, estado de São Paulo. Transmissões por extrato vegetal permitiram a observação de lesões locais cloróticas em Chenopodium quinoa e Gomphrena globosa, indicando infecção causada por vírus. Desta forma, o presente trabalho teve como objetivo a identificação e caracterização da espécie viral presente nestas amostras. Inicialmente as amostras foram analisadas por microscopia eletrônica, onde puderam ser observadas partículas alongadas filamentosas, medindo cerca de 490 nm, indicando a provável presença de um potexvirus. Oligonucleotídeos específicos Hyd_senso e Hyd_anti_senso foram desenhados para o Hydrangea ringspot virus (HdRSV), um potexvirus encontrado comumente em países Europeus e nos Estados Unidos. O RNA total foi extraído pelo método de Bertheau et al. (1998), para posterior análise por RT-PCR utilizando-se estes oligonucleotídeos. Dois fragmentos, um em torno de 550 e outro de 250 nucleotídeos foram amplificados e purificados para realização do sequenciamento genético. Uma identidade de nucleotídeos de 96% e 88% para o fragmento maior e menor respectivamente foi observada para HdRSV (número de acesso AJ 707100.1), indicando tratar-se desta espécie viral. O HdRSV até então era uma praga exótica no Brasil, de forma que foi realizada comunicação ao Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, que emitiu parecer... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The hydrangea is an ornamental plant very appreciated in Brazil. In South of Brazil, this plant is used in projects for gardening in houses and highways. Hydrangea is the symbol of Gramado's city. In State of São Paulo this ornamental plant is commonly found in Campos do Jordão. Hydrangea plants showing leaves with chlorotic and necrotic rings were observed by Yuki (2005) in material proceeding from Arujá, State of São Paulo. Chlorotic local lesions were observed on Chenopodium quinoa and Gomphrena globosa, after sap transmission, indicating infection caused by virus. On electron microscope analysis, virus particles with 490 nm could be 4 visualized indicating infectin by a potexvirus. In order to identify the species of virus infecting these plants, specifics primers (Hyd_senso and Hyd_anti_senso) were design for Hydrangea ringspot virus (HdRSV), a potexvirus commonly found infecting hydrangea in Europe and United States. Total RNA was extracted following Bertheau et al., 1998 protocol's and the primers were used in RT-PCR. Two fragments, one around 550bp and another one of 250 nucleotides were amplified and sequenced. An identity of nucleotide of 96% and 88%, respectively, was observed for HdRSV (number of access AJ 707100.1), indicating that both fragments amplified were from the virus. As the HdRSV is an exotic pest in Brazil, the occurrence was notified to the Ministry of Agriculture (MAPA) that gave us the permission for publication this data (process 21052.015361/2007-08). To evaluate the dissemination of this virus in the matrices of hydrangea used in the commercial production in Brazil, 17 samples of the region of Arujá - SP were analysed for the presence of the virus. Eight of them were infected by virus, and the RT-PCR fragment from the varieties Azul Rendado, Azul LZR, Renat Blue, Rosa Japonesa, Rosita and Vermelho Comum were sequenced for analysis... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Renate Krause Sakate / Coorientador: Marcelo Agenor Pavan / Banca: Jorge Alberto Marques Rezende / Banca: Valdir Atsushi Yuki / Mestre