abstract: The discovery and development of novel antibacterial agents is essential to address the rising health concern over antibiotic resistant bacteria. This research investigated the antibacterial activity of a natural clay deposit near Crater Lake, Oregon, that is effective at killing antibiotic resistant human pathogens. The primary rock types in the deposit are andesitic pyroclastic materials, which have been hydrothermally altered into argillic clay zones. High-sulfidation (acidic) alteration produced clay zones with elevated pyrite (18%), illite-smectite (I-S) (70% illite), elemental sulfur, kaolinite and carbonates. Low-sulfidation alteration at neutral pH generated clay zones with lower pyrite concentrations pyrite (4-6%), the mixed-layered I-S clay rectorite (R1, I-S) and quartz. Antibacterial susceptibility testing reveals that hydrated clays containing pyrite and I-S are effective at killing (100%) of the model pathogens tested (E. coli and S. epidermidis) when pH (< 4.2) and Eh (> 450 mV) promote pyrite oxidation and mineral dissolution, releasing > 1 mM concentrations of Fe2+, Fe3+ and Al3+. However, certain oxidized clay zones containing no pyrite still inhibited bacterial growth. These clays buffered solutions to low pH (< 4.7) and oxidizing Eh (> 400 mV) conditions, releasing lower amounts (< 1 mM) of Fe and Al. The presence of carbonate in the clays eliminated antibacterial activity due to increases in pH, which lower pyrite oxidation and mineral dissolution rates. The antibacterial mechanism of these natural clays was explored using metal toxicity and genetic assays, along with advanced bioimaging techniques. Antibacterial clays provide a continuous reservoir of Fe2+, Fe3+ and Al3+ that synergistically attack pathogens while generating hydrogen peroxide (H2O¬2). Results show that dissolved Fe2+ and Al3+ are adsorbed to bacterial envelopes, causing protein misfolding and oxidation in the outer membrane. Only Fe2+ is taken up by the cells, generating oxidative stress that damages DNA and proteins. Excess Fe2+ oxidizes inside the cell and precipitates Fe3+-oxides, marking the sites of hydroxyl radical (•OH) generation. Recognition of this novel geochemical antibacterial process should inform designs of new mineral based antibacterial agents and could provide a new economic industry for such clays. / Dissertation/Thesis / Doctoral Dissertation Geological Sciences 2015

This study investigated the neuroprotective effects of novel small molecule NOX inhibitors after induction of an ischemic stroke model on Neuroblastoma cells (NB69). Previous findings show that high levels of reactive oxygen species (ROS) have been identified for playing a role in causing inflammation, cellular damage and apoptosis in many cardiovascular diseases. It is believed that by inhibiting the Nox enzymes that generate ROS, the damage caused to the brain (measured as % cell viability) would be decreased.  NOX2 and NOX4 gene expression what validated in NB69 cells using PCR, gel electrophoresis and GAPDH as a reference gene. Stroke was modelled by using the oxygen-glucose depletion model and reperfusion injury was modelling by replenishing glucose and oxygen supplies to the cell and incubator for 24-72hrs. Gene expression of NOX4 expression after 1hr ischemia and 24-48hrs reperfusion showed there was an increase in relative expression after 24hrs and a decrease in expression after 48hrs. No gene expression analysis could be shown for NOX2. Cell viability was measured amongst treatment groups using the MTS assay. Statistical analysis consisted of Shapiro Wilk tests, One-way ANOVAs, Tukey tests and ROUT Outlier analysis. Only M114 was seen to have a statistically significant neuroprotective effect on the cells ( after 1hr ischemia, 24+48hrs reperfusion and 2hr ischemia + 48hr reperfusion). After 72hrs reperfusion all three treatments reduced cell viability significantly from the negative control group (p&lt;0.0001) highlighting the importance of ROS signalling in neural cells and the consequences of eradicating it. Media was changed on plates after 48hrs reperfusion. These findings show that all three substances have some effect on the cells and can target their NOX enzymes and identifies M114 as a potential new treatment for stroke patients.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / In this study, the effects of mercury (HgCl2) in cucumber seedlings (Cucumis sativus L.) were investigated through the analysis of the physiological and biochemical parameters. The biochemical parameters analyzed were: the antioxidant enzyme activities (catalase (CAT), ascorbate peroxidase (APX) and superoxide dismutase (SOD)), and the non-enzymatic antioxidant levels (ascorbic acid (ASA), carotenoids, and non-protein thiol content (SH)). The damage at the membrane lipids (lipid peroxidation, electrolytic leakage percentage (ELP)), the chlorophyll content, and protein oxidation were determined. The hydrogen peroxide levels (H2O2) and the δ-aminolevulinic acid dehydratase (δ-ALAD) activity were also determined. The growth of cucumber seedlings was evaluated based on the dry and fresh matter, and on the root and shoot length. Cucumber seedlings were exposed to 0 to 500 μM of HgCl2 during 10 and 15 days. The results showed that Hg was absorbed by the growing seedlings, and its content was greater in the roots than in the shoot. Moreover, a reduction in the root and shoot length, at both 10 and 15 days, which was dependent on time and concentration, was observed at all concentrations tested. At the concentration of 50 μM HgCl2 the root fresh weight of 15-day-old seedlings increased, however, it reduced at the other concentrations. For 10-day-old seedlings, a reduction in root and shoot fresh biomass was observed. No reduction in shoot fresh biomass was observed at the concentration of 50 μM HgCl2, at 15 days. Regarding dry weight, there was an increase at 500 μM, both at 10 and 15 days, however, at the concentration of 250 μM HgCl2, there was an increase at 15 days. Moreover, a significant reduction in the dry weight of shoot in all tested concentrations was observed. The results showed higher levels of lipid peroxides, as well as a protein oxidation increase, and chlorophyll content reduction when seedlings were exposed to 250 and 500 μM HgCl2. In relation to the antioxidant enzymes, there was an increase in the CAT activity at 10 days of exposure to HgCl2, at 50 μM. However, in the higher concentration (500 μM) of mercury, there was a marked inhibition. Besides, at both 10 and 15 days, an inhibition of APX enzyme in the mercury higher concentrations (250 and 500 μM) was observed. The SOD, another enzyme of the antioxidant system, showed an increased activity in the concentration below 50 μM HgCl2, and a reduced activity in the higher concentrations. Regarding ELP, alterations only in the higher concentrations (500 μM HgCl2) and at 15 days of exposure to metal were observed. Furthermore, seedlings with 10 days of exposure to HgCl2 had their reduced H2O2 levels at 50 μM HgCl2, but the H2O2 increased at the higher concentration. In relation to non-enzymatic antioxidants, increasing SH levels at all the concentrations at 10-days of exposure were observed. ASA levels also increased at all tested concentrations at 10 and 15 days of exposure at metal. Yet, the carotenoids levels increased at low concentrations and decreased at high concentrations, both at 10 and 15 days of exposure to Hg. δ-ALA-D activity increased at 50 μM HgCl2 at 15 days, and was inhibited at higher concentrations. Therefore, the results obtained from the biochemical and physiological analyses suggest that mercury induces oxidative stress in cucumber seedlings, resulting in injuries in the tissues, which leads to a reduction in the growth, and loss of dry matter of the seedlings. / Neste estudo, foram investigados os efeitos do mercúrio (HgCl2) em plântulas de pepino (Cucumis sativus L.) através da análise de parâmetros bioquímicos e fisiológicos. Os parâmetros bioquímicos analisados foram: as atividades de enzimas antioxidantes [catalase (CAT), ascorbato peroxidase (APX) e superóxido dismutase (SOD)] e os níveis de antioxidantes não-enzimáticos (ácido ascórbico (ASA), carotenóides e tióis não-protéicos (-SH)). O dano aos lipídios de membrana [a peroxidação lipídica e a porcentagem de vazamento de eletrólitos (ELP)], o conteúdo de clorofila e a oxidação de proteínas foram determinadas. Foram também determinados os níveis de peróxido de hidrogênio (H2O2) e a atividade da delta-aminolevulinato desidratase (δ-ALAD). O crescimento das plântulas de pepino foi avaliado baseado na matéria seca e fresca e no comprimento de raízes e parte aérea. As plântulas de pepino foram expostas a 0; 0,5; 50; 250 e 500 μM de HgCl2 durante 10 e 15 dias. Os resultados demonstraram que o mercúrio foi absorvido pelas plântulas, e seu conteúdo foi maior nas raízes que na parte aérea. Além disso, uma redução no comprimento das raízes e da parte aérea, ambos aos 10 e 15 dias, que foi dependente do tempo e da concentração, foi observada em todas as concentrações testadas. Na concentração de 50 μM de HgCl2 o peso fresco das raízes das plântulas aos 15 dias aumentou, no entanto, ele reduziu nas outras concentrações. Para as plântulas com 10 dias, foi observada uma redução na massa fresca de raízes e parte aérea. Nenhuma redução na massa fresca da parte aérea foi observada na concentração de 50 μM de HgCl2, aos 15 dias. Em relação ao peso seco, houve um aumento a 500 μM, ambos a 10 e 15 dias, entretanto, na concentração de 250 μM de HgCl2 houve um aumento aos 15 dias. Além disso, foi observada uma redução significativa no peso seco da parte aérea em todas as concentrações testadas. Os resultados mostraram níveis elevados de peróxidos lipídicos, assim como aumento na oxidação de proteínas, e redução no conteúdo de clorofila quando as plântulas foram expostas a 250 e 500 μM de HgCl2. Em relação às enzimas antioxidantes, houve um aumento na atividade da CAT aos 10 dias de exposição ao HgCl2, a 50 μM. No entanto, na concentração mais alta (500 μM) de HgCl2, houve uma marcada inibição. Também, tanto aos 10 quanto aos 15 dias, foi observada uma inibição na atividade da enzima APX nas concentrações de HgCl2 mais elevadas (250 e 500 μM). A SOD, outra enzima do sistema de defesa antioxidante, mostrou atividade aumentada na concentração abaixo de 50 μM HgCl2, e atividade reduzida nas concentrações mais altas. Em relação à ELP, foram observadas alterações somente na concentração mais elevada (500 μM de HgCl2) aos 15 dias de exposição ao metal. Além disso, as plântulas com 10 dias de exposição ao metal, tiveram seus níveis de H2O2 reduzidos na concentração de 50 μM de HgCl2, mas o H2O2 aumentou na concentração mais alta. Em relação aos antioxidantes não-enzimáticos, foram observados níveis de SH aumentados em todas as concentrações aos 10 dias de exposição. Os níveis de ASA também aumentaram em todas as concentrações testadas aos 10 e 15 dias de exposição ao metal. Ainda, os níveis dos carotenóides aumentaram em baixas concentrações e foram reduzidos em altas concentrações, ambos aos 10 e 15 dias de exposição ao mercúrio. A atividade da ALA-D aumentou a 50 μM de HgCl2 aos 15 dias, e diminuiu em concentrações mais altas. Portanto, os resultados obtidos das análises bioquímicas e fisiológicas sugerem que a exposição ao mercúrio induz estresse oxidativo em plântulas de pepino, resultando em injúria nos tecidos o que leva a redução no crescimento e perda de matéria seca das plântulas.Neste estudo, foram investigados os efeitos do mercúrio (HgCl2) em plântulas de pepino (Cucumis sativus L.) através da análise de parâmetros bioquímicos e fisiológicos. Os parâmetros bioquímicos analisados foram: as atividades de enzimas antioxidantes [catalase (CAT), ascorbato peroxidase (APX) e superóxido dismutase (SOD)] e os níveis de antioxidantes não-enzimáticos (ácido ascórbico (ASA), carotenóides e tióis não-protéicos (-SH)). O dano aos lipídios de membrana [a peroxidação lipídica e a porcentagem de vazamento de eletrólitos (ELP)], o conteúdo de clorofila e a oxidação de proteínas foram determinadas. Foram também determinados os níveis de peróxido de hidrogênio (H2O2) e a atividade da delta-aminolevulinato desidratase (δ-ALAD). O crescimento das plântulas de pepino foi avaliado baseado na matéria seca e fresca e no comprimento de raízes e parte aérea. As plântulas de pepino foram expostas a 0; 0,5; 50; 250 e 500 μM de HgCl2 durante 10 e 15 dias. Os resultados demonstraram que o mercúrio foi absorvido pelas plântulas, e seu conteúdo foi maior nas raízes que na parte aérea. Além disso, uma redução no comprimento das raízes e da parte aérea, ambos aos 10 e 15 dias, que foi dependente do tempo e da concentração, foi observada em todas as concentrações testadas. Na concentração de 50 μM de HgCl2 o peso fresco das raízes das plântulas aos 15 dias aumentou, no entanto, ele reduziu nas outras concentrações. Para as plântulas com 10 dias, foi observada uma redução na massa fresca de raízes e parte aérea. Nenhuma redução na massa fresca da parte aérea foi observada na concentração de 50 μM de HgCl2, aos 15 dias. Em relação ao peso seco, houve um aumento a 500 μM, ambos a 10 e 15 dias, entretanto, na concentração de 250 μM de HgCl2 houve um aumento aos 15 dias. Além disso, foi observada uma redução significativa no peso seco da parte aérea em todas as concentrações testadas. Os resultados mostraram níveis elevados de peróxidos lipídicos, assim como aumento na oxidação de proteínas, e redução no conteúdo de clorofila quando as plântulas foram expostas a 250 e 500 μM de HgCl2. Em relação às enzimas antioxidantes, houve um aumento na atividade da CAT aos 10 dias de exposição ao HgCl2, a 50 μM. No entanto, na concentração mais alta (500 μM) de HgCl2, houve uma marcada inibição. Também, tanto aos 10 quanto aos 15 dias, foi observada uma inibição na atividade da enzima APX nas concentrações de HgCl2 mais elevadas (250 e 500 μM). A SOD, outra enzima do sistema de defesa antioxidante, mostrou atividade aumentada na concentração abaixo de 50 μM HgCl2, e atividade reduzida nas concentrações mais altas. Em relação à ELP, foram observadas alterações somente na concentração mais elevada (500 μM de HgCl2) aos 15 dias de exposição ao metal. Além disso, as plântulas com 10 dias de exposição ao metal, tiveram seus níveis de H2O2 reduzidos na concentração de 50 μM de HgCl2, mas o H2O2 aumentou na concentração mais alta. Em relação aos antioxidantes não-enzimáticos, foram observados níveis de SH aumentados em todas as concentrações aos 10 dias de exposição. Os níveis de ASA também aumentaram em todas as concentrações testadas aos 10 e 15 dias de exposição ao metal. Ainda, os níveis dos carotenóides aumentaram em baixas concentrações e foram reduzidos em altas concentrações, ambos aos 10 e 15 dias de exposição ao mercúrio. A atividade da ALA-D aumentou a 50 μM de HgCl2 aos 15 dias, e diminuiu em concentrações mais altas. Portanto, os resultados obtidos das análises bioquímicas e fisiológicas sugerem que a exposição ao mercúrio induz estresse oxidativo em plântulas de pepino, resultando em injúria nos tecidos o que leva a redução no crescimento e perda de matéria seca das plântulas.

Submitted by GABRIELA BRASIL ROMÃO null (gabibromao@yahoo.com.br) on 2016-08-02T16:22:32Z No. of bitstreams: 1 Dissertação - Versão Final (GABRIELA BRASIL ROMAO).pdf: 4722088 bytes, checksum: 45c94484a90edf6dfe782f335f396a2e (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-08-02T17:18:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 romao_gb_me_arafcf.pdf: 4722088 bytes, checksum: 45c94484a90edf6dfe782f335f396a2e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T17:18:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 romao_gb_me_arafcf.pdf: 4722088 bytes, checksum: 45c94484a90edf6dfe782f335f396a2e (MD5) Previous issue date: 2016-07-04 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A erva-baleeira, Cordia verbenacea DC., é uma espécie de planta originária do Brasil, encontrada principalmente na Floresta Tropical Atlântica. É largamente utilizada na medicina tradicional por apresentar, principalmente, ação anti-inflamatória. Dados recentes da literatura mostraram que esta ação está relacionada à presença de compostos fenólicos, flavonoides e sesquiterpenos, além de ser constatada a atividade antioxidante em diferentes extratos de C. verbenacea. Epécies reativas de oxigênio e nitrogênio são produzidas constantemente no organismo, podendo causar danos ou benefícios aos sistemas biológicos. Estão altamente relacionadas com o processo de envelhecimento do organismo, e, consequentemente, do envelhecimento cutâneo. A busca e pesquisa de cosméticos com ativos naturais com propriedades antioxidantes tem aumentado significativamente. Este estudo teve como objetivo avaliar a ação do extrato hidroetanólico 70 % de folhas de C. verbenacea (EtOH 70 %) em diferentes espécies reativas de oxigênio de importância biológica, para uma possível aplicação na prevenção do envelhecimento cutâneo. Inicialmente, foram comparados os extratos etanólico, hidroetanólico 70 % e aquoso de folhas de C. verbenacea a fim de selecionar o extrato com maior teor de compostos fenólicos totais e flavonoides totais, além de maior atividade antioxidante. O extrato EtOH 70 % foi selecionado para avaliação da atividade antioxidante in vitro frente a diferentes espécies reativas (radicais modelo ou sistemas biológicos modelo envolvendo estas espécies) como também avaliar a citotoxicidade, os perfis cromatográficos em CCD e CLAE-DAD e desenvolver uma formulação fitocosmética contendo o extrato para avaliar o fator de proteção solar (FPS). O extrato EtOH 70 % apresentou resultados promissores em relação à atividade antioxidante comparado aos resultados dos padrões utilizados e aos dados da literatura disponíveis para extratos vegetais similares. Com relação ao FPS, este não apresentou valor considerável. Na linhagem celular HepG2 o extrato EtOH 70 % não apresentou citotoxicidade nas concentrações testadas, porém, na linhagem HaCat, apresentou baixa citotoxicidade. O extrato EtOH 70 % apresentou teor de compostos fenólicos totais e flavonoides totais de 14,0 e 4,0 % (m/m), respectivamente; os valores de CE50 obtidos para os ensaios de análise antioxidante pelo DPPH•, ABTS+•, O2―•, descoramento da crocina (ROO•), HOCl e H2O2 foram de 13,44, 7,02, 196,61, 10,93, 3,49 e 302,17 μg/mL, respectivamente; os perfis cromatográficos mostraram-se complexos contendo substâncias de média e alta polaridade, sugerindo a presença de flavonoides e triterpenos pelos espectros no UV e sendo confirmada pela quantificação das substâncias 4',5-diidroxi-2',3,5',6,7-pentametoxiflavona, cordialina A e outro triterpeno análogo à cordialina A com teores de 0,66, 0,67 e 0,12 % (m/m), respectivamente. Com os resultados obtidos foi possível comprovar a eficácia do extrato EtOH 70 % quanto à sua pronunciada atividade antioxidante frente a diferentes espécies reativas, possivelmente, devido às substâncias fenólicas e flavonoides, o que pode ter também relação com a sua atividade anti-inflamatória. / Erva-baleeira, Cordia verbenacea DC., is a native Brazilian plant species, mainly found at the Atlantic Forest. It is widely used in traditional medicine mostly for its anti-inflammatory properties. Literature data shows that this activity is related to the presence of phenolic compounds, flavonoids and sesquiterpenes, it was also verified the antioxidant activity for different extracts of C. verbenacea. Reactive oxygen and nitrogen species are constantly produced in the organism and might cause damage or benefits on biological systems. They are highly related to the ageing process of the body and, consequently, to skin ageing. The research for natural cosmetics drugs with antioxidant properties has had a significant increase and, therefore, the aim of this study was to evaluate the antioxidant activity of an hydroethanolic extract of C. verbenacea leaves (EtOH 70 %) on different reactive oxygen species of biological importance. Initially, the ethanolic, hydroethanolic (70 %) and aqueous extracts of C. verbenacea leaves were compared to select the extract with a higher total phenolic content and total flavonoid content, as well as higher antioxidant activity. The EtOH 70 % extract was selected for in vitro evaluation of its antioxidant activity against different reactive species (radicals model or bioprocess model involving these species), but also to evaluate its cytotoxicity, the chromatographic profiles in TLC and HPLC and to develop a phytocosmetic contaning the extract, to evaluate its sun protection factor (SPF). The EtOH 70 % extract showed promising results concerning the antioxidant activity compared to the standard substances used and to the available literature data for similar plant extracts. Regarding to the SPF, the extract did not present a considerable value. In HepG2 cell line, the extract did not show cytotoxicity on the tested concentrations, but, in HaCat cell line, it showed low cytotoxicity. The EtOH 70 % extract exhibited total phenolic content and total flavonoid content of 14.0 and 4.0 % (w/w), respectively; the EC50 values obtained from the antioxidant activity tests by DPPH• , ABTS+• , O2 ―• , crocin bleaching (ROO• ), HOCl and H2O2 assays were 13.44, 7.02, 196.61, 10.93, 3.49 and 302.17 μg/mL, respectively; the chromatographic profiles demonstrated to be complex containg substances of medium and high polarity, suggesting the presence of flavonoids and triterpenes by UV spectra, which were confirmed by the quantification of 4',5-dihydroxy-2',3,5',6,7-pentamethoxiflavone, cordialin A and another triterpene similar to cordialin A with the content of 0,66, 0,67 e 0,12 % (w/w), respectively. From the obtained results, it was possible to prove the effectiveness of EtOH 70 % extract regarding its pronounced antioxidant activity against different reactive species, possibly, due to the phenolics and flavonoids and, also, the relation with its anti-inflammatory activity.

Orientador: Olga Maria Mascarenhas de Faria Oliveira / Banca: Antonio Baldo Geraldo Martins / Banca: Katia Maria da Silva Cerqueira Leite / Resumo: pesquisa de produtos naturais é uma fonte importante de informações para o desenvolvimento de novos fármacos que tenham ação em diferentes processos oxidativos teciduais. Estudou-se o potencial antioxidante das frutas exóticas e tropicais araçá, atemóia, bunchósia, cajá-manga, canistel, carissa, falsomangostão, jambo-vermelho, jatobá, jenipapo, jujuba, mangostão, massala, pitaya. Buscou-se a interação das amostras com as espécies reativas de oxigênio sob ensaios modelos. Todas as amostras foram eficientes com as espécies estudadas como ABTS, DPPH, HOCl, H2O2, O2 • - , determinação de fenóis, flavonóides; mostrou-se ainda que as amostras tiveram um potencial favorável com relação a células, no caso, eritrócitos quando em presença de radicais livres e outras espécies reativas. Na pesquisa da ação de frutas e outros produtos naturais em processos oxidativos modelo deve-se buscar possíveis efeitos protetores e agressores aos sistemas biológicos / Abstract: The search for natural products is an important source of information for the development of new drugs that have action in different tissue oxidative processes. Studied the antioxidant potential of fruit and exotic tropical guava, atemoya Bunchosia, caja-manga, Pouteria campechiana, Carissa, false mangosteen, wax jambu, jatoba, jenipapo, jujube, mangosteen, masala, pitaya. We attempted to sample the interaction with the reactive oxygen species under test models. All samples were efficient in the studied species such as ABTS, DPPH, HOCl, H2O2, O2 • -, determination of phenols, flavonoids, showed also that the samples had a positive potential with respect to cells, in this case, when in erythrocytes presence of free radicals and other reactive species. In search of action of fruits and other natural products in oxidation processes model should seek protective effects and possible attackers to biological systems / Mestre

Antecedentes & Objetivos: A produção de oxidação ocorre naturalmente no organismo via processos fisiológicos, entretanto, frente a situações patológicas verifica-se um desequilíbrio entre a oxidação e a antioxidação, ocasionando estresse oxidativo (EO). Estudos demonstram maiores níveis de EO associados a diversas doenças, incluindo a doença periodontal (DP) e a doença renal crônica (DRC). O objetivo do presente estudo foi avaliar o impacto da DP sobre os níveis de EO em doentes renais crônicos pré-dialíticos. Materiais e Métodos: Dados demográficos, socioeconômicos e de histórico médico de 139 pacientes do Serviço Nefrologia do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA) foram obtidos por meio de entrevista e análise de prontuário. Foram realizados exames clínicos periodontais e coleta sanguínea e salivar. Associações entre a condição periodontal e níveis séricos e salivares de marcadores de estresse oxidativo foram avaliadas, através de antioxidação total (FRAP) e sulfidrilas. Também foi avaliada correlação entre os níveis séricos e salivares de antioxidação total. Resultados: Médias de profundidade de sondagem estiveram significativamente associadas a maiores níveis séricos de sulfidrilas (p=0,04), quando ajustados para sexo e atividade física. Não foi observada associação significativa com os outros parâmetros séricos ou salivares de EO. Os níveis salivares de FRAP estiveram significativamente associados aos seus níveis séricos (R²= 0,23, p<0,001). Conclusões: A concentração salivar de FRAP explica aproximadamente 23% dos seus níveis séricos, utilizando modelos ajustados. Pacientes com maiores médias de profundidade de sondagem apresentaram maiores níveis séricos de sulfidrilas. Análises adicionais, avaliando também oxidação e dano proteico, proporcionarão dados para uma melhor compreensão do processo oxidativo nessa mesma amostra. / Background & Aims: The oxidation occurs naturally through physiological activities, but in pathological states an imbalance between oxidation and antioxidation is observed, resulting in oxidative stress (OS). Studies have shown higher levels of OS associated with several diseases, including periodontal disease (PD) and chronic kidney disease (CKD). The aim of the present study was to evaluate the impact of PD on OS levels in chronic pre-dialytic renal patients. Materials & Methods: Demographic, socioeconomic and medical history data of 139 patients from the Department of Nephrology of the Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA) were obtained through interview and medical records. Periodontal clinical examinations and salivary and blood collection were performed. Associations between periodontal status and serum and salivary levels of total antioxidation (FRAP) and sulfhydryl were evaluated, as well as a correlation between serum and salivary levels of total antioxidation. Results: Higher probing depth means were significantly associated with serum sulfhydryl levels (p = 0.04) when adjusted for sex and physical activity. No significant association was observed with other serum or salivary OE markers. The salivary levels of FRAP were significantly associated with serum FRAP levels (R² = 0.23, p <0.001). Conclusion: FRAP salivary levels accounts for approximately 23% of FRAP serum levels using multivariate models. Higher probing depth means were associated with higher serum levels of sulfhydryl. Further analysis evaluating oxidation and protein damage will provide data for a better understanding of the oxidative process in this sample.

Este estudo tem como objetivo principal avaliar os efeitos da suplementação crônica com extrato de chá verde sobre os indicadores inflamatórios e da função de neutrófilos de ratos obesos. Ratos machos Wistar (Rattus norvegicus) foram tratados com extrato de chá verde via intragástrica, durante 12 semanas (5 dias/semana; 500mg/kg) e a obesidade foi induzida por dieta de cafeteria (8 semanas). Os neutrófilos foram obtidos da cavidade peritonial pela injeção de glicogênio de ostra (1% em PBS) 4h antes do procedimento de eutanásia por decapitação. Os resultados obtidos demonstram que a obesidade causa uma redução nas funções efetoras de neutrófilos o que pode pode aumentar a suceptibilidade à infecções, e o tratamento com extrato de chá verde melhora as funções dessas células. Dessa forma, este trabalho contribui para a elucidação das alterações decorrentes da obesidade no sistema imune e as ações benéficas do extrato de chá verde nesta condição. / This study aims to evaluate the effects of chronic supplementation with green tea extract on inflammatory markers and neutrophil function of rats with obesity induced by cafeteria diet intake. For this study, male Wistar rats (Rattus norvegicus) were treated with green tea extract intragastric for 12 weeks (5 days/week; 500mg/kg) and obesity induced by cafeteria diet (8 weeks). Neutrophils were obtained from peritoneal cavity by injection of oyster glycogen (1% in PBS) 4 h before euthanasia by decapitation procedure. The results obtained demonstrate that the obesity causes a reduction in neutrophil effector functions which may increase susceptibility to infections, and the treatment with green tea extract seems to improve the functions of these cells in obese mice. This work contributes for the elucidation of the changes arising from obesity in the immune system and the beneficial actions of the green tea extract in this condition.

A enzima mieloperoxidase (MPO), presente em leucócitos da linhagem granulocítica e monocítica, tem papel fundamental na produção de espécies reativas de oxigênio (ERO). Existem fortes evidências que alguns produtos gerados a partir de reações catalisadas por mieloperoxidase (MPO) tenham papel na sinalização celular. Dentre estes produtos, chama atenção o oxigênio singlete (1O2). Em fagócitos, esta ERO poderia participar tanto do processo de morte de patógenos, quanto da sinalização de eventos da inflamação. O nosso grupo de pesquisa trabalha com a hipótese de que a localização da MPO, e consequentemente, os sítios de produção de 1O2 definem a função da enzima e do 1O2. O interesse particular no 1O2 deve-se também ao fato de que sua detecção não é trivial e relativamente pouco é conhecido sobre sua produção por sistemas biológicos se comparado a outras EROs. Neste estudo trabalhamos com a questão da localização de MPO em neutrófilos e monócitos humanos e com a detecção de 1O2 através da utilização de sondas específicas. Nos experimentos realizados avaliamos a produção de 1O2 pela utilização da sonda 9,10 difenilantraceno (DPA) e também empregando o éster 9,10-antracenil-3-bispropionato de etila (ABPE) como captador de 1O2. Apesar da proposta de uso do DPA revestindo partículas a serem fagocitadas ter sido feita anteriormente (Garcia F., mestrado concluído em 2006) houve dificuldades na utilização desta técnica que foram reconsideradas neste trabalho. Com esta sonda também obtivemos imagens em microscopia confocal, através da fluorescência do DPA e perda desta fluorescência após reação com 1O2. As análises dos resultados com a microscopia confocal em neutrófilos confirmam que 1O2 está sendo realmente formado no fagolissosomo, quando as células são ativadas por partículas opsonizadas. Em monócitos também houve a possibilidade de utilizar DPA como sonda para 1O2. Neste caso observamos um decréscimo mais lento da fluorescência quando comparado com neutrófilos e também um apagamento mais difuso da sonda. Acreditamos que as diferenças observadas, na formação de 1O2, para neutrófilos e mononucleares em microscopia confocal podem ser devido a diferentes formas de compartimentalização da enzima nestes dois tipos celulares. É possível que isto tenha uma função biológica específica, uma vez que, 1O2 parece ser um importante sinalizador no processo inflamatório. Dado o interesse na detecção de 1O2 em células do sistema imune, também utilizamos uma nova sonda, o éster 9,10-antracenil-3-bispropionato de etila (ABPE). A detecção neste caso é feita pelo monitoramento de um endoperóxido por HPLC. Os resultados obtidos com essa nova sonda demonstram-se mais satisfatórios quando comparados ao DPA, permitindo uma melhor detecção da produção de 1O2 por fagócitos. / The enzyme myeloperoxidase (MPO), present in leukocytes of granulocytic and monocytic lineage, plays a fundamental role in the production of reactive oxygen species (ROS). There is strong evidence that some products generated from reactions catalyzed by myeloperoxidase (MPO) have a role in cell signaling. Among these products, calls attention singlet oxygen (1O2). In phagocytes, ROS could participate in this process both the death of pathogens, the signaling events of inflammation. Our research group works on the assumption that the location of the MPO, and consequently, the production sites to define the role of 1O2 and 1O2 enzyme. The particular interest in the 1O2 is also due to the fact that its detection is not trivial and relatively little is known about its production by biological systems compared to other ROS. In this study we worked with the question of localization of MPO in human neutrophils and monocytes and the detection of 1O2 by using specific probes. In the experiments we evaluated the production of 1O2 by use of a probe 9.10 difenilantraceno (DPA) and also using the 9.10-ester antracenil bispropionato-3-acid ethyl esters (ABPE) 1O2 as a pickup. Although the proposed use of the DPA coating particles to be phagocytized have been made previously (F. Garcia, MA completed in 2006) hove difficulties in using this technique have been reconsidered in this work. With this probe also obtained images in confocal microscopy, by fluorescence of DPA and loss of fluorescence after reaction with 1O2. The analysis of results with confocal microscopy confirmed that in neutrophils 1O2 is actually being formed in fagolissosomo, when cells are activated by opsonized particles. Monocytes were also able to use DPA as a probe to 1O2. In this case we observe a slower decrease in fluorescence when compared with neutrophils and also a more diffuse effacement of the probe. We believe that the observed differences in the formation of 1O2 for neutrophils and mononuclear cells in confocal microscopy may be due to different forms of compartmentalization of the enzyme in these two cell types. It is possible that this has a specific biological function, since, 1O2 seems to be an important sign in the inflammatory process. Given the interest in the detection of 1O2 cells of the immune system, also used a new probe, the 9.10-ester antracenil bispropionato-3-acid ethyl esters (ABPE). The detection in this case is made by an endoperoxide monitoring by HPLC. The results obtained with this new probe show is more satisfactory when compared to the DPA, allowing better detection of 1O2 production by phagocytes.

Espécies de Candida com relevância clínica diferem entre si com relação a aspectos como prevalência clínica, virulência e perfil de resistência a antifúngicos. Formulamos a hipótese de que estas diferenças podem ocorrer devidas em parte à capacidade relativa distinta destas espécies de resistirem ao estresse oxidativo que é imposto por fagócitos durante a patogênese da candidíase. Nesse contexto, poucos são os estudos de resposta ao estresse oxidativo (REO) em espécies que não Candida albicans. Assim, esse trabalho teve por objetivo investigar a REO in vitro em isolados de referência e clínicos de 8 espécies de Candida – C. albicans, C. dubliniensis, C. famata, C. glabrata, C. guilliermondii, C. krusei, C. parapsilosis e C. tropicalis. Para tal, foi avaliado o grau de resistência a oxidantes, a capacidade de adaptação, a indução de enzimas antioxidantes, os níveis de glutationa total, a capacidade antioxidante total e a indução de dano oxidativo a proteínas e lipídios através de metodologias atuais. C. albicans, C. glabrata e C. krusei apresentaram maior resistência ao estresse oxidativo nas condições testadas, C. parapsilosis e C. tropicalis resistência média e C. dubliniensis, C. famata e C. guilliermondii foram mais sensíveis. Todas as espécies demonstraram capacidade adaptativa e indução de enzimas antioxidantes. Os níveis de glutationa total mostraram redução intracelular frente ao estresse oxidativo. A capacidade antioxidante total foi variável entre espécies. Outros testes (efeito de meio condicionado e de moléculas quorum-sensing – tirosol e farnesol - no crescimento, capacidade de proteção cruzada e oxidante total) foram empregados sem sucesso. Ainda, verificamos em isolados de C. albicans a relação entre capacidade de resistirem a oxidantes e produção de fosfolipase e protease. Os resultados indicaram ausência de correlação entre estes fatores. Espécies com sistema antioxidante mais frágil são também as que ocorrem com menor frequência em infecções sistêmicas ou resistem menos ao efeito dos antifúngicos. É interessante investigar se C. albicans, C. glabrata e C. krusei tiram vantagem efetiva de um sistema antioxidante mais potente para causarem candidíase disseminada ou resistirem a drogas. A caracterização detalhada da REO pode proporcionar a descoberta de novos alvos para a ação de antifúngicos no futuro. / Candida species with clinical relevance differ in therms of clinical prevalence, virulence and profile of resistance to antifungal agents. We hypothesized that these differences may be due in part to the relative ability of these species to resist oxidative stress that is imposed by phagocytes in the pathogenesis of candidiasis. In this context, there are few studies of the oxidative stress response (OSR) in different species than C. albicans. Thus, this study aimed to investigate the in vitro OSR considering isolates of eight Candida species – C. albicans, C. dubliniensis, C. famata, C. glabrata, C. guilliermondii, C. krusei, C. parapsilosis and C. tropicalis. To this purpose, we evaluated the resistance degree to oxidants, the adaptability, the induction of antioxidant enzymes, levels of total glutathione, total antioxidant status and induction of oxidative damage to proteins and lipids by current methodologies. C. albicans, C. glabrata and C. krusei showed greater resistance to oxidative stress in the conditions tested; C. parapsilosis and C. tropicalis showed an intermediate resistance and C. dubliniensis, C. famata and C. guilliermondii were more sensitive to oxidative stress. All species showed adaptive capacity and induction of antioxidant enzymes. The levels of total glutathione showed intracellular reduction against oxidative stress. The total antioxidant capacity was variable between species. Other tests (effect of conditioned medium and quorum-sensing molecules - farnesol and tirosol – on growth, ability of cross-protection and total oxidant status) were tested without success. Still, we found in isolates of C. albicans the relationship between ability to resist oxidation and production of phospholipase and protease. The results indicated no correlation between these factors. Species with weaker antioxidant system are also those that occur less frequently in systemic infections or are less resistant to the effect of antifungal agents. It is interesting to investigate if C. albicans, C. glabrata and C. krusei take effective advantage of a more powerful antioxidant system to cause disseminated candidiasis or resist drugs. The detailed characterization of the OSR can provide the discovery of new targets for the action of antifungals in the future.

A produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) pelos neutrófilos, que representa um mecanismo essencial da imunidade inata contra agentes infecciosos, pode ser desencadeada por imunocomplexos (IC) associados ou não com componentes do sistema complemento. Os IC são normalmente eliminados da circulação pela ligação aos receptores de complemento do tipo 1 em eritrócitos, que os transportam até o baço e o fígado, onde são fagocitados por macrófagos residentes. Porém, defeitos neste mecanismo de eliminação podem levar à deposição de IC nos vasos e tecidos. Em algumas doenças inflamatórias, onde ocorre uma intensa deposição de IC, pode acontecer o recrutamento e a ativação maciça de neutrófilos pelos IC. Nessa situação, os mecanismos endógenos de defesa tecidual não conseguem controlar as alterações desencadeadas pelos fatores oxidantes e líticos liberados pelos neutrófilos, levando à possível lesão tecidual e consequências funcionais e estruturais para o organismo. Nessa perspectiva, tem-se intensificado, nos últimos anos, a procura por novos compostos terapêuticos com capacidade de reduzir os danos aos tecidos adjacentes ao acúmulo de IC, neutrófilos, ERO e enzimas líticas, expostos a níveis deletérios desses componentes. Assim, neste trabalho foi avaliado o potencial antioxidante de um conjunto de dez derivados 3-fenilcumarínicos no metabolismo oxidativo de neutrófilos humanos estimulados por ICs, empregando-se o ensaio de quimioluminescência dependente de luminol e de lucigenina (QLlum e QLluc, respectivamente). Posteriormente, foi avaliada a citoxicidade das amostras, através do ensaio de exclusão do azul de tripan e medida da atividade da lactato desidrogenase liberada, bem como sua capacidade de sequestrar HOCl e inibir a atividade das enzimas NADPH oxidase e mieloperoxidase (MPO). Observou-se que todas as amostras avaliadas inibiram a QLlum e a QLluc, sendo que cinco delas tiveram efeito inibitório maior que ou igual a 50% (C6, C13, C13a, C24 e C24a)*. Este efeito biológico não foi mediado pela citotoxicidade das 3-fenilcumarinas, nas condições avaliadas. Dentre essas amostras, o derivado 3-fenilcumarínico C13, que foi o mais efetivo em inibir a QLluc, possui duas características que parecem estar relacionadas com tal efeito: um grupo substituinte orto-diidroxi no esqueleto cumarínico e um grupo metilenodioxila no anel fenílico. Além do mais, todas as substâncias que possuem o grupo metilenodioxila no anel fenílico (C1, C6, C6a, C13, C13a) apresentaram efeito inibitório da QLluc maior que as respectivas análogas sem este substituinte (C15, C18, C18a, C24, C24a). A inibição da QLluc parece ser independente da inibição da atividade da NADPH oxidase, visto que as substâncias apresentaram efeito inibitório discreto no consumo de O2 pelos neutrófilos estimulados por IC. Por outro lado, as amostras C13 e C24, que têm em comum a presença do grupo substituinte 6,7-diidroxi, apresentaram os maiores efeitos inibitórios sobre a QLlum, apresentando IC50 semelhante. Essas duas substâncias também foram as mais ativas em inibir a atividade da enzima MPO e em sequestrar o HOCl. Para esses dois ensaios, a atividade biológica observada foi dependente do número de hidroxilas na estrutura do derivado 3-fenilcumarínico. Os resultados deste trabalho mostram que a atividade antioxidante dos derivados 3-fenilcumarínicos sobre o metabolismo oxidativo de neutrófilos humanos está relacionada às características estruturais dessas moléculas. Dentre a série de substâncias avaliadas, C13 e C24 são as amostras mais promissoras para uso como protótipos de moléculas com aplicação terapêutica na modulação desta função neutrofílica. / Production of reactive oxygen species (ROS) by neutrophils, which is an essential mechanism of innate immunity against infectious agents, can be triggered by immune complexes (IC) associated or not with components of the complement system. IC are normally cleared from the circulation by binding to complement receptor type 1 on erythrocytes and transport to spleen and liver, where they are phagocytized by resident macrophages. However, defects in this clearance mechanism can lead to deposition of IC in vessels and tissues, favoring neutrophil chemotaxis. In some inflammatory diseases there is intense deposition of IC, which triggers massive recruitment and activation of neutrophils. In these situations, the endogenous tissue defense mechanisms are not able to regulate the local disorders provoked by the oxidant and lytic compounds released by neutrophils, and tissue damage as well as structural and functional consequences to the organism might occur. In this perspective, the last years have been marked by an intense search for new therapeutic compounds able to reduce the damage to tissues surrounding the site of accumulation of IC, neutrophils, ROS and lytic enzymes, exposed to deleterious levels of these components. So, the present work reports the evaluation of the antioxidant potential of ten 3-phenylcoumarin derivatives in the neutrophil oxidative metabolism stimulated with IC, through the luminol- and lucigenin-dependent chemiluminescence assay (QLlum and QLluc, respectively). Further, cytotoxicity of the samples was evaluated by the trypan blue exclusion assay and measurement of lactate dehydrogenase activity, as well as their ability to scavenge HOCl and inhibit NADPH-oxidase and myeloperoxidase (MPO) activity. We found that all the samples inhibited QL-lum and QLluc, being the inhibitory effect of five of them higher than or equal to 50% (C6, C13, C13a, C24 e C24a)*. This biological effect was not mediated by cytotoxicity of the 3-phenylcoumarins, under the conditions assessed. Compound C13, which was the most effective inhibitor of QLluc among the set of phenylcoumarins tested, has two structural features that seem to be related to this effect: an orto-dihydroxyl group in the coumarin moiety and a methylenedioxyl group attached to the phenyl ring. Moreover, the inhibitory effect of all 3-phenylcoumarins bearing the methylenedioxyl group (C1, C6, C6a, C13, C13a) was higher than that found to their analogues without this group (C15, C18, C18a, C24, C24a). The CLluc inhibition by phenylcoumarins seems to be independent of inhibition of NADPH-oxidase activity, since these compounds had a slight inhibitory effect in the O2 consumption by IC-stimulated neutrophils. On the other hand, compounds C13 and C24, which shares the 6,7-dihydroxyl group, had the highest inhibitory effects on CLlum with similar IC50 values among the samples tested. These compounds were also the most active ones to inhibit MPO activity and scavenge HOCl. Such biological effects were dependent on the number of hydroxyl groups in the 3-phenylcoumarin moiety. The results of this work show that the antioxidant activity of 3-phenylcoumarin derivatives in the oxidative metabolism of human neutrophils is related to the structural characteristics of these molecules. Among the set of compounds evaluated, C13 and C24 are the most promising samples to be used as prototypes of moleculse with therapeutic application in the modulation of neutrophil function.