by Kar-Keung Ching. / "May 2000." / Thesis (Ph.D.)--Chinese University of Hong Kong, 2000. / Includes bibliographical references (p. 154-173). / Electronic reproduction. Hong Kong : Chinese University of Hong Kong, [2012] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web. / Mode of access: World Wide Web. / Abstracts in English and Chinese.

Em Escherichia coli, a assimilação de sulfato e sua redução a sulfeto é mediada por um transportador do tipo ABC codificado pelos genes sbpcysWUA e várias enzimas codificadas por cysNCDGHIJ. Embora a importância deste sistema tenha sido largamente demonstrada em outros organismos, não existem relatos na literatura sobre a via na bactéria fitopatogênica Xanthomonas axonopodis pv. citri (X. citri). Neste trabalho, utilizando uma abordagem funcional baseada em análises de bioinformática, proteômica e gene repórter, mostramos que a via de sulfato está presente e ativa em X. citri. Ainda, a partir da expressão e produção em larga escala da proteína ligadora de sulfato Sbp, realizamos ensaios de biofísica que evidenciaram a interação da proteína com sulfato e o aumento da estabilidade térmica e estrutural, obtendo-se cristais. O trabalho apresenta as primeiras evidências da funcionalidade desta via em X. citri durante o crescimento in vitro e infecção in vivo e abre pespectivas de estudos para compreensão do papel deste íon na fisiologia do microrganismo. / In Escherichia coli, the capture and reduction of sulfate to sulfide is mediated by an ABC-type transporter encoded by genes sbpcysWUA and several enzymes encoded by cysNCDGHIJ. Although the importance of this system has been widely demonstrated in other organisms, there are no reports in the literature related to the way that sulfate is assimilated and reduced in plant pathogen Xanthomonas axonopodis pv. citri (X. citri). In this work, using a functional approach based on bioinformatics analysis, proteomics and gene reporter, we show that the way is present and active in X. citri. Indeed, the sulfate binding protein was expressed and produced in large scale for biophysical assays demonstrating the interaction of the protein with sulfate and increased thermal stability and crystals was produced. The study presents the first evidence of the functionality of this pathway in X. citri during growth in vitro and in vivo infection and opens perspectives studies to understand the role of this ion in the physiology of the microorganism.

Neste trabalho foi transfectada uma linhagem de células embrionárias de rim humano (HEK293) com os genes das subunidades α e β da tireotrofina humana (hTSH), hormônio glicoproteico secretado pela hipófise. Após 5 dias de cultivo obteve-se uma concentração de hTSH no meio condicionado de 0,95μg/mL. O material foi concentrado e purificado utilizando uma estratégia envolvendo duas etapas, uma cromatografia de troca catiônica e uma cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) de fase reversa, que permitiu uma recuperação de 55% e uma pureza >90%. O produto purificado (hTSH-HEK) foi analisado e comparado a uma preparação comercial obtida em células CHO (hTSH-CHO) e a uma preparação hipofisária (hTSH-Pit). A identidade e a pureza do hTSH-HEK foram avaliadas por métodos físicoquímicos e imunológico (espectrometria de massa MALDI-TOF, HPLC de exclusão molecular e de fase reversa, SDS-PAGE e ensaio imunoradiométrico). A porção glicídica do hTSH-HEK foi avaliada pela análise do perfil dos N-glicanos e o comportamento biológico deste hormônio foi avaliado por bioensaio in vivo e estudo farmacocinético. As 3 preparações apresentaram pureza equivalente (97%) e a massa molecular relativa do hTSH-HEK foi 2,1% menor do que a do hTSH-CHO e 2,7% maior do que a do hTSH-Pit. A maior hidrofobicidade relativa, avaliada por RP-HPLC, foi a do hTSH-HEK. Os N-glicanos identificados no hTSH-HEK foram do tipo complexo, apresentando predominantemente estruturas tri-antenárias, enquanto no hTSH-CHO e no hTSH-Pit as estruturas bi-antenárias foram predominantes. Foram detectadas diferenças significativas relacionadas à composição dos carboidratos para estas preparações, um teor muito menor de ácido siálico e muito maior de fucose foram observados no hTSHHEK. Foi confirmada a atividade biológica das 3 preparações, sendo a bioatividade do hTSHHEK 39% e 16% inferior à do hTSH-CHO e hTSH-Pit, respectivamente. A meia-vida circulatória do hTSH-HEK foi menor (1,5 X) que a do hTSH-CHO e a do hTSH-Pit (1,2 X). De acordo com esses resultados o hTSH-HEK pode ser considerado uma alternativa viável para aplicações clínicas especialmente por sua origem humana e composição de carboidratos. / In this work a strain of embryonic human kidney cells (HEK293) was transfected with the genes of the α and β subunits of human thyrotropin (hTSH), a glycoproteic hormone secreted by the pituitary gland. After 5 days of culture, the concentration of hTSH in conditioned medium was 0.95μg/mL. The material was concentrated and purified utilizing a strategy involving two steps, a cation-exchange chromatography and a reversed phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC), providing an overall yield of 55% and a purity level > 90%. The purified material (hTSH-HEK) was analyzed and compared to a recombinant commercial preparation obtained from CHO cells (hTSH-CHO) and to a human pituitary preparation (hTSH-Pit). Identity and purity of hTSH-HEK were evaluated through physicochemical and immunological methods (MALDI-TOF mass spectrometry, size exclusion HPLC, reversed-phase HPLC, SDS-PAGE, immunoradiometric assay). Glycidic portion of hTSHHEK was evaluated by N-glycoprofiling analysis and the biological behavior of this hormone was evaluated by an in vivo bioassay and via a pharmacokinetic study. The 3 preparations showed equivalent purity (97%) and hTSH-HEK molecular mass was 2.1% lower than hTSHCHO mass and 2.7% higher than hTSH-Pit mass. The highest relative hydrophobicity, evaluated by RP-HPLC, was shown by hTSH-HEK. Remarkable differences related to the carbohydrate moiety were found for these preparations, a much lower sialic acid content and a higher fucose content being observed in hTSH-HEK. Biological activity was confirmed for the three preparations, the hTSH-HEK bioactivity being 39% and 16% lower than hTSH-CHO and hTSH-Pit, respectively. The hTSH-HEK circulatory half-life (t1/2) was lower than that of hTSHCHO (1.5-fold) and hTSH-Pit (1.2-fold). According to these findings, HEK293-derived hTSH can be considered useful for clinical applications, also in view of its human origin and particular N-glycan composition.

Nicotiana benthamiana is now an established platform for molecular farming, the production of biopharmaceuticals in plants. Infiltration with Agrobacterium tumefaciens (agroinfiltration) is commonly used to transiently express one or multiple transgenes in N. benthamiana leaves. Agroinfiltrated N. benthamiana is a flexible and scalable recombinant protein (RP) production platform, but is impeded by low RP yields. Plant proteases can degrade RPs and thus limit RP accumulation. To inform, design and implement strategies for enhancing RP accumulation, I present four papers about proteases and protease inhibitors in agroinfiltrated N. benthamiana. First, I investigated the transcriptome, extracellular proteome and active secretome to understand the plant response to agroinfiltration and investigate the expressed proteases. I show that an extracellular immune response is mounted at the expense of photosynthesis. Comprehensive annotation and monitoring uncover a large, diverse repertoire of proteases in agroinfiltrated leaves, indicating that broad-range depletion of protease activity may be required to enhance RP accumulation. Second, I reviewed the literature on multifunctional plant protease inhibitors (PIs) and grouped them into three types of multifunctional PIs that evolved independently. Third, I screened candidate PIs and discovered that three new, unrelated PIs enhance RP accumulation. I present universal elements of the RP degradation machinery, uncovering new questions on our understanding of the protease network that degrades RPs. Fourth, I identified targets of SlCYS8, a PI that enhances RP accumulation. The target proteases of SlCYS8 are implicated in RP degradation and the high specificity of SlCYS8 can be used to study their role in other processes. By elucidating the immune response to agroinfiltration, by uncovering the N. benthamiana protease repertoire and by providing new tools to deplete the activity of specific proteases, this thesis makes a relevant contribution to both basic plant research and molecular farming.

No presente estudo, avaliamos a resposta imune naturalmente adquirida ao Plasmodium vivax em indivíduos de áreas endêmicas de malária utilizando proteínas recombinantes baseadas em três antígenos de formas assexuadas sanguíneas do parasita: Antígeno 1 de Membrana Apical (AMA-1), região C-terminal da Proteína 1 de Superfície do Merozoíta (MSP1 19) e Antígenos Variantes de P. vivax (VIR). Sete proteínas recombinantes correspondentes a quatro subfamílias VIR (A, B, C e E) foram incluídas neste estudo. Inicialmente, as diferentes proteínas recombinantes foram comparadas, por ELISA, quanto ao reconhecimento por anticorpos IgM, IgG e subclasses de IgG de 200 indivíduos infectados por P. vivax procedentes dos estados do Pará e Rondônia. As freqüências de indivíduos que apresentaram anticorpos IgM ou IgG anti-VIR durante a infecção foram de 29,6% e 26,0%, respectivamente. Não observamos predomínio de determinadas subclasses de IgG na resposta imune anti-VIR, com exceção da subfamília C que foi predominantemente reconhecida por anticorpos da subclasse IgG1. Em contraste, as freqüências de indivíduos que apresentaram anticorpos IgG para as proteínas AMA-1 e MSP119 foram significativamente mais altas (57,0% e 90,5%, respectivamente). A resposta imune celular aos antígenos VIR foi avaliada por ensaios de proliferação in vitro com células mononucleares de indivíduos recentemente expostos ao P. vivax. Não observamos respostas proliferativas significativas a estes antígenos quando comparamos o grupo de indivíduos exposto ao P. vivax com o grupo não exposto. Posteriormente, avaliamos o padrão de reatividade cruzada entre anticorpos e células T contra as quatro subfamílias VIR através da imunização experimental de camundongos BALB/c com cada uma das proteínas na presença de adjuvante de Freund. Os títulos de anticorpos IgG dos animais imunizados contra cada proteína recombinante foram detectados por ELISA de inibição. Altos títulos de anticorpos específicos contra as proteínas VIR foram obtidos após a 2ª dose de imunização. Além disso, observamos que o esquema de imunização utilizado, constituído por duas doses seqüenciais de cada uma das proteínas recombinantes VIR, foi capaz de induzir anticorpos de reatividade contra as diferentes subfamílias VIR. Complementamos estes estudos avaliando a resposta proliferativa de células de nódulos linfáticos de camundongos imunizados e re-estimuladas in vitro com cada uma das proteínas VIR. Os resultados demonstraram que as proteínas VIR contêm epítopos específicos e de reatividade cruzada para células T. Estes dados sugerem fortemente a presença de epítopos comuns entre esses antígenos e mostram que o esquema de imunização utilizado pode servir como base para futuros estudos de indução de imunidade protetora contra malária vivax em primatas não humanos. / In the present study, we evaluated comparatively the acquired immune response to Plasmodium vivax in individuais from endemic areas of malaria using recombinant proteins based on three antigens from asexual blood stages of the parasite: Apical Membrane Antigen 1 (AMA-1), C-terminal region of the Merozoite Surface Protein1 (MSP1 19), and Variant Antigens of P. vivax (VIR). Seven recombinant proteins corresponding to the four VIR subfamilies (A, B, C and E) were included in this study. Initially, the different recombinant proteins were compared by ELISA with regard to the recognition by IgM, IgG, and IgG subclass of antibodies from 200 individuais with patent infection from the States of Pará and Rondônia. The frequencies of individuais that presented IgM ar IgG antibodies anti-VIR during the infection were 29.6% or 26.0%, respectively. We did not observe predominance of any IgG subclass during immune response anti-VIR, except in the case of the C subfamily which was predominantly recognized by IgG1 subclass. In contrast, the frequencies of the individuais that presented IgG antibodies to AMA-1 e MSP119 were significantly higher (57.0% and 90.5%, respectively). The cellular immune response to VIR antigens was evaluated by in vitro proliferative assays in mononuclear cells of the individuais recently exposed to P. vivax. We did not observe significantly proliferative responses to these antigens when we compared malaria exposed and non exposed individuais. Subsequently, we evaluated the pattern of cross recognition between antibodies and T cell against four VIR subfamilies after experimental immunization of BALB/c mice with each one of the proteins emulsified with Complete Freund\'s adjuvant. The IgG antibody titers of the mice immunized against each one of the recombinant proteins were detected by inhibition ELISA. High specific titers against VIR proteins were obtained after the second immunizing dose. Most importantly, we observed that the immunization schedule constituted by two sequential doses of each one of the VIR recombinant proteins were able to induce cross-reactive antibodies against the different VIR subfamilies. These studies were complemented by lymphocyte proliferative response analysis of the immunized mice after an in vitro stimulation with each one of the VIR proteins. Our results demonstrated that the VIR proteins presented specific and cross-reactive epitopes recognized by T cells. These data strongly suggested of the commons epitopes are present and showed that this schedule of immunization may be used as basis for future studies aimed at inducing protective immunity against vivax malaria in non human primates.

Neste trabalho foi transfectada uma linhagem de células embrionárias de rim humano (HEK293) com os genes das subunidades α e β da tireotrofina humana (hTSH), hormônio glicoproteico secretado pela hipófise. Após 5 dias de cultivo obteve-se uma concentração de hTSH no meio condicionado de 0,95μg/mL. O material foi concentrado e purificado utilizando uma estratégia envolvendo duas etapas, uma cromatografia de troca catiônica e uma cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) de fase reversa, que permitiu uma recuperação de 55% e uma pureza >90%. O produto purificado (hTSH-HEK) foi analisado e comparado a uma preparação comercial obtida em células CHO (hTSH-CHO) e a uma preparação hipofisária (hTSH-Pit). A identidade e a pureza do hTSH-HEK foram avaliadas por métodos físicoquímicos e imunológico (espectrometria de massa MALDI-TOF, HPLC de exclusão molecular e de fase reversa, SDS-PAGE e ensaio imunoradiométrico). A porção glicídica do hTSH-HEK foi avaliada pela análise do perfil dos N-glicanos e o comportamento biológico deste hormônio foi avaliado por bioensaio in vivo e estudo farmacocinético. As 3 preparações apresentaram pureza equivalente (97%) e a massa molecular relativa do hTSH-HEK foi 2,1% menor do que a do hTSH-CHO e 2,7% maior do que a do hTSH-Pit. A maior hidrofobicidade relativa, avaliada por RP-HPLC, foi a do hTSH-HEK. Os N-glicanos identificados no hTSH-HEK foram do tipo complexo, apresentando predominantemente estruturas tri-antenárias, enquanto no hTSH-CHO e no hTSH-Pit as estruturas bi-antenárias foram predominantes. Foram detectadas diferenças significativas relacionadas à composição dos carboidratos para estas preparações, um teor muito menor de ácido siálico e muito maior de fucose foram observados no hTSHHEK. Foi confirmada a atividade biológica das 3 preparações, sendo a bioatividade do hTSHHEK 39% e 16% inferior à do hTSH-CHO e hTSH-Pit, respectivamente. A meia-vida circulatória do hTSH-HEK foi menor (1,5 X) que a do hTSH-CHO e a do hTSH-Pit (1,2 X). De acordo com esses resultados o hTSH-HEK pode ser considerado uma alternativa viável para aplicações clínicas especialmente por sua origem humana e composição de carboidratos. / In this work a strain of embryonic human kidney cells (HEK293) was transfected with the genes of the α and β subunits of human thyrotropin (hTSH), a glycoproteic hormone secreted by the pituitary gland. After 5 days of culture, the concentration of hTSH in conditioned medium was 0.95μg/mL. The material was concentrated and purified utilizing a strategy involving two steps, a cation-exchange chromatography and a reversed phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC), providing an overall yield of 55% and a purity level > 90%. The purified material (hTSH-HEK) was analyzed and compared to a recombinant commercial preparation obtained from CHO cells (hTSH-CHO) and to a human pituitary preparation (hTSH-Pit). Identity and purity of hTSH-HEK were evaluated through physicochemical and immunological methods (MALDI-TOF mass spectrometry, size exclusion HPLC, reversed-phase HPLC, SDS-PAGE, immunoradiometric assay). Glycidic portion of hTSHHEK was evaluated by N-glycoprofiling analysis and the biological behavior of this hormone was evaluated by an in vivo bioassay and via a pharmacokinetic study. The 3 preparations showed equivalent purity (97%) and hTSH-HEK molecular mass was 2.1% lower than hTSHCHO mass and 2.7% higher than hTSH-Pit mass. The highest relative hydrophobicity, evaluated by RP-HPLC, was shown by hTSH-HEK. Remarkable differences related to the carbohydrate moiety were found for these preparations, a much lower sialic acid content and a higher fucose content being observed in hTSH-HEK. Biological activity was confirmed for the three preparations, the hTSH-HEK bioactivity being 39% and 16% lower than hTSH-CHO and hTSH-Pit, respectively. The hTSH-HEK circulatory half-life (t1/2) was lower than that of hTSHCHO (1.5-fold) and hTSH-Pit (1.2-fold). According to these findings, HEK293-derived hTSH can be considered useful for clinical applications, also in view of its human origin and particular N-glycan composition.

No Brasil, e em outros paises de clima tropical, os carrapatos se tornaram um enorme problema economico de^$de que a industria do gado se desenvolveu. O carrapato Boophilus microplus, um dos artropodes mais importantes na veterinaria, causa efeitos direto, como suc,cao de sangue, e indireto, como a transmissao de uma grande variedade de patogenos que normalmente resulta em infec,c~es letais. As vacinas genicas contendo o antigeno Bm86, uma proteina ligada a membrana do intestino do carrapato B. microplus, representam uma alternativa atrativa aos acaricidas para controlar as infesta~oes por carrapatos em contrapartida aos inconvenientes produtos quimicos. Devido sua administra,cao ser feita em 4 doses no primeiro ano, seguida de refor,cos a cada seis meses, estas formula,coes vacinais nao s3c adequadas para paises com cria,cao extensiva de gado, como no Brasil. Visando uma libera~ao sustentada do antigeno Bm86, neste trabalho desenvolveuse uma vacina de dose unica baseada em microesferas polimericas. Para obter o padrao de liberac,ao desejavel, diferentes formula,coes e parametros de processo foram variados, como a composi,cao do polimero, a taxa entre os monomeros ^Uacido latico:acido glicolico\" e o tamanho das microparticulas. As formula,coes foram preparadas pelo metodo de emulsao multipla e evapora,cao do solvente. A formula~ao que melhor se enquadrou nos objetivos da vacina de dose unica foi preparada com PLGA 75:25, solu,cao 3% de PVA como estabilizante, agita,cao de 11000 rpm para forma,cao da emulsao primaria e de 800 rpm para forma,cao da emulsao multipla e evapora,cao do solvente. As particulas assim obtidas apresentaram um tamanho medio de 25 ,um, uma taxa de encapsula,cao maior que 90% e aproximadamente 50% da proteina foi liberada in vitro em 60 dias. Analises por SDS-PAGE e Westem Bloning revelaram que a proteina se manteve integra apos encapsula,cao. Os resultados da avalia,cao da imunogenicidade em bovinos mostraram que a formula,cao baseada em microesferas polimericas biodegradaveis e habil a conseguir, com uma unica dose, uma resposta imune similar aquela conseguida com tres doses das formula,coes convencionais da vacina de Bm86. / In Brazil, and in others tropical countries, the ticks have become a huge economic problem since the industry of livestock has developed. Ticks and tick-borne diseases affect animal and human health and are the cause of significant economic losses. The cattle tick Boophilus microplus is one of the most important arthropods in veterinary. This tick species causes both direct effects, such as blood sucking, and indirect effects, such as transmission of a wide variety of pathogens, which usually result in lethal infections. The gene vaccines based on Bm86 antigen, a midgut membrane-bound protein of the cattle tick B. microplus, represent a good alternative to control tick infestations, compared to chemicals. However, due to these vaccine formulations need 4 doses over the first year with booster at each 6 months to be effective, they are not suitable for countries with extensive cattle raising, like Brazil. Aiming a sustained release of Bm86 antigen, in this work we developed a single shot vaccine based on Bm86 loaded polymeric microspheres. In order to obtain desired release patterns, different formulations and processing parameters were varied, for example, the composition of the polymer, the monomer ratio lactic acid:glycolic acid and the size of the microparticles. The formulations were prepared by solvent evaporation method based on double emulsion. The formulation that presented better result as single shot vaccine was prepared with PLGA 75:25, solution 3% of PVA as stabilizer, agitation of 11000 rpm to form the primary emulsion and 800 rpm to obtain the double emulsion and solvent evaporation. The particles thus obtained presented an average size of 25 m, encapsulation ratio greater than 90% and approximately 50% of the protein was released in vitro in 60 days. Analysis by SDSPAGE and Western Blot showed that the integrity of the protein remained after encapsulation. The immunogenic studies showed that the formulation based onbiodegradable polymeric microspheres is able to elicit, with a single dose, an immune response and protection similar to that attained with 3 doses of conventional Bm86 vaccine formulations.

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A leptospirose é a zoonose mais disseminada no mundo e uma das principais causas de perda econômica no agronegócio. O estudo de novos antígenos de superfície de Leptospira interrogans, é intrigante e pode fornecer conhecimento na interação inicial patógeno-hospedeiro. Os genes LIC13059 e LIC10879, escolhidos por bioinformática, com predição de localização na superfície celular, foram clonados e as proteínas recombinantes expressas em E. coli, para avaliar a interação com componentes do hospedeiro. Após purificação, as proteínas encontravam-se estruturadas e foram reconhecidas por soro de indivíduos infectados. As proteínas recombinantes interagem com plasminogênio, fibrinogênio e laminina. rLIC13059, nomeada Lsa25.6, quando ligada ao fibrinogênio é capaz de inibir a formação de coágulo de fibrina e rLIC10879, nomeada Lsa16, interage com e-caderina, sugerido envolvimento na cascata de coagulação e ligação com o hospedeiro, respectivamente. O plasminogênio ligado às proteínas é convertido em plasmina, o que poderia ajudar a penetração bacteriana no hospedeiro. / Leptospirosis is the most widespread zoonosis and also a major cause of economic loss in animal production worldwide. The study of new surface antigens of Leptospira interrogans is intriguing and may shed light into the initial pathogen-host interactions. We set out to study two novel coding sequences LIC13059 and LIC10879 predicted to be located at the cell surface. The genes were cloned and the recombinant proteins were expressed in E. coli. The purified recombinant proteins presented secondary structures, and interacted with plasminogen, fibrinogen and laminin human components. rLIC13059, named Lsa25.6, when bound to fibrinogen was capable of inhibiting the formation of fibrin clot, while rLIC10879, named Lsa16, interacted with e-cadherin, a mammalian cell receptor, suggesting participation in coagulation pathway and host-cell binding, respectively. The plasminogen captured by both recombinant proteins could be converted into plasmin, a mechanism that could help bacterial penetration in the host.

No presente estudo, avaliamos a resposta imune naturalmente adquirida ao Plasmodium vivax em indivíduos de áreas endêmicas de malária utilizando proteínas recombinantes baseadas em três antígenos de formas assexuadas sanguíneas do parasita: Antígeno 1 de Membrana Apical (AMA-1), região C-terminal da Proteína 1 de Superfície do Merozoíta (MSP1 19) e Antígenos Variantes de P. vivax (VIR). Sete proteínas recombinantes correspondentes a quatro subfamílias VIR (A, B, C e E) foram incluídas neste estudo. Inicialmente, as diferentes proteínas recombinantes foram comparadas, por ELISA, quanto ao reconhecimento por anticorpos IgM, IgG e subclasses de IgG de 200 indivíduos infectados por P. vivax procedentes dos estados do Pará e Rondônia. As freqüências de indivíduos que apresentaram anticorpos IgM ou IgG anti-VIR durante a infecção foram de 29,6% e 26,0%, respectivamente. Não observamos predomínio de determinadas subclasses de IgG na resposta imune anti-VIR, com exceção da subfamília C que foi predominantemente reconhecida por anticorpos da subclasse IgG1. Em contraste, as freqüências de indivíduos que apresentaram anticorpos IgG para as proteínas AMA-1 e MSP119 foram significativamente mais altas (57,0% e 90,5%, respectivamente). A resposta imune celular aos antígenos VIR foi avaliada por ensaios de proliferação in vitro com células mononucleares de indivíduos recentemente expostos ao P. vivax. Não observamos respostas proliferativas significativas a estes antígenos quando comparamos o grupo de indivíduos exposto ao P. vivax com o grupo não exposto. Posteriormente, avaliamos o padrão de reatividade cruzada entre anticorpos e células T contra as quatro subfamílias VIR através da imunização experimental de camundongos BALB/c com cada uma das proteínas na presença de adjuvante de Freund. Os títulos de anticorpos IgG dos animais imunizados contra cada proteína recombinante foram detectados por ELISA de inibição. Altos títulos de anticorpos específicos contra as proteínas VIR foram obtidos após a 2ª dose de imunização. Além disso, observamos que o esquema de imunização utilizado, constituído por duas doses seqüenciais de cada uma das proteínas recombinantes VIR, foi capaz de induzir anticorpos de reatividade contra as diferentes subfamílias VIR. Complementamos estes estudos avaliando a resposta proliferativa de células de nódulos linfáticos de camundongos imunizados e re-estimuladas in vitro com cada uma das proteínas VIR. Os resultados demonstraram que as proteínas VIR contêm epítopos específicos e de reatividade cruzada para células T. Estes dados sugerem fortemente a presença de epítopos comuns entre esses antígenos e mostram que o esquema de imunização utilizado pode servir como base para futuros estudos de indução de imunidade protetora contra malária vivax em primatas não humanos. / In the present study, we evaluated comparatively the acquired immune response to Plasmodium vivax in individuais from endemic areas of malaria using recombinant proteins based on three antigens from asexual blood stages of the parasite: Apical Membrane Antigen 1 (AMA-1), C-terminal region of the Merozoite Surface Protein1 (MSP1 19), and Variant Antigens of P. vivax (VIR). Seven recombinant proteins corresponding to the four VIR subfamilies (A, B, C and E) were included in this study. Initially, the different recombinant proteins were compared by ELISA with regard to the recognition by IgM, IgG, and IgG subclass of antibodies from 200 individuais with patent infection from the States of Pará and Rondônia. The frequencies of individuais that presented IgM ar IgG antibodies anti-VIR during the infection were 29.6% or 26.0%, respectively. We did not observe predominance of any IgG subclass during immune response anti-VIR, except in the case of the C subfamily which was predominantly recognized by IgG1 subclass. In contrast, the frequencies of the individuais that presented IgG antibodies to AMA-1 e MSP119 were significantly higher (57.0% and 90.5%, respectively). The cellular immune response to VIR antigens was evaluated by in vitro proliferative assays in mononuclear cells of the individuais recently exposed to P. vivax. We did not observe significantly proliferative responses to these antigens when we compared malaria exposed and non exposed individuais. Subsequently, we evaluated the pattern of cross recognition between antibodies and T cell against four VIR subfamilies after experimental immunization of BALB/c mice with each one of the proteins emulsified with Complete Freund\'s adjuvant. The IgG antibody titers of the mice immunized against each one of the recombinant proteins were detected by inhibition ELISA. High specific titers against VIR proteins were obtained after the second immunizing dose. Most importantly, we observed that the immunization schedule constituted by two sequential doses of each one of the VIR recombinant proteins were able to induce cross-reactive antibodies against the different VIR subfamilies. These studies were complemented by lymphocyte proliferative response analysis of the immunized mice after an in vitro stimulation with each one of the VIR proteins. Our results demonstrated that the VIR proteins presented specific and cross-reactive epitopes recognized by T cells. These data strongly suggested of the commons epitopes are present and showed that this schedule of immunization may be used as basis for future studies aimed at inducing protective immunity against vivax malaria in non human primates.