L’importance respective des lymphocytes T régulateurs naturels générés dans le thymus ou induits en périphérie dans la régulation immunitaire et la résolution de l’inflammation est désormais bien établie. Nous avons contribué à mettre en évidence une nouvelle voie d’induction de lymphocytes T régulateurs périphériques à partir de cellules T humaines CD4+CD25- naïves et mémoires. Nous avons montré que l’engagement de la molécule ubiquitaire transmembranaire CD47 sur la cellule T par un anticorps monoclonal ou par le peptide 4N1K (peptide dérivé du domaine carboxy-terminal de la thrombospondine-1 et spécifique du site de liaison à CD47) induisait des lymphocytes T CD4+ régulateurs exerçant une fonction suppressive sur les lymphocytes T effecteurs. Les propriétés suppressives induites par la thrombospondine-1 confortent les fonctions anti-inflammatoires de cette protéine de la matrice extracellulaire. L’inhibition exercée par les lymphocytes T régulateurs induits dépend du contact intercellulaire entre les cellules T régulatrices et leurs cibles, et est indépendante du TGF-. Nos résultats démontrent également le rôle de CD47 sur le lymphocyte T CD4+ dans la réponse immunitaire spécifique de l’antigène in vivo. En effet, les souris BALB/c déficientes pour CD47 présentent un biais de la sécrétion d’anticorps et de cytokines de type Th1, alors que les souris BALB/c sont décrites comme exprimant un profil de production de cytokines de type Th2. Nos travaux mettent en évidence le rôle de CD47 dans l’inhibition du développement d’une réponse cellulaire et humorale de type Th1 in vivo, confirmant de précédentes études in vitro réalisées avec des cellules T CD4+ humaines. Nous présentons également le rôle inhibiteur de l’engagement de CD28 in vitro sur la différenciation en cellules Th17 des lymphocytes T CD4+ naïfs isolés de souris BALB/c. Le mécanisme proposé est dépendant de la production de l’IL-2 et de l’IFN- et indépendant de la présence de lymphocytes T régulateurs. Notre étude du rôle de deux molécules transmembranaires CD47 et CD28 exprimées sur la cellule T CD4+, contribue à une meilleure connaissance des mécanismes impliqués dans la tolérance immunologique, la résolution de l’inflammation et la différenciation des cellules T "helper" CD4+. / Nowadays, the importance of natural regulatory T cells and adaptive regulatory T lymphocytes in immune regulation and resolution of inflammation are well established. We report a previously unknown pathway to generate adaptive regulatory T cells in the periphery from naive and memory human CD4+CD25- T cells. We show that the stimulation of the broadly expressed transmembrane proteins CD47 on T cells by a monoclonal antibody or by the 4NK1 peptide (carboxy-terminal peptide of thrombospondin-1 (TSP) specific of the binding site of CD47) induced regulatory T cells that exerted an inhibitory function on effector T cells. Our study on the suppressive proprieties of the TSP corroborates with reported anti-inflammatory activities of this extracellular matrix protein. The suppressive function of TSP induced regulatory T cells was contact-dependent and TGF--independent. Our data further demonstrate the role of CD47 expression on T cells in the antigenic-specific immune response in vivo. We report that the CD47-deficient BALB/c mice displayed a Th1-biased antibody and cytokine responses, instead of the Th2 cytokine profile observed in unmanipulated BALB/c mice. Our study outlines the role of CD47 as a self-control mechanism to negatively regulate type 1 cellular and humoral immune responses and most importantly confirm in vivo previous in vitro studies with human CD4+ T cells. We also report that soluble anti-CD28 monoclonal antibody suppressed in vitro differentiation of naïve CD4+ T cells isolated from BALB/c mice into IL-17-producing cells by mechanism that are IL-2 and IFN-γ-dependent but independent of the presence of regulatory T cells. Our studies highlight the suppressive function of two transmembrane molecules CD47 and CD28 expressed by CD4+ T cells in vitro and in vivo in human and mice. They thus may contribute to a better understanding of the mechanisms involved in the induction of immune tolerance, the resolution of inflammation and the differentiation of the T helper cells.

In einem komplexen tierexperimentellen Ansatz wurde das Potenzial der anti huCD4-Antikörper MAX16H5 und MAX12F6 zur Modulierung zellvermittelter Immun-reaktionen in vivo untersucht. Dafür kam ein mehrfach transgenes Mausmodell zur Anwendung, in dem das humane Zielmolekül und dessen physiologischer Ligand als Transgene exprimiert waren. Als T-Zell vermittelte Immunreaktion wurde eine Kon-taktreaktion (delayed type hypersensitivity, DTH) gegen DNFB etabliert und validiert. An der DTH wurde untersucht, ob und wie die verschiedenen Antikörper die Sen-sibilisierungs- und die Auslösungsphase beeinflussen. Die experimentellen Ergeb-nisse zeigen, dass die Antikörper epitop- und isotypabhängig die beiden Phasen der DTH unterschiedlich beeinflussen. Die Applikation der Antikörper während der Sensi-bilisierung führte zu einer unterschiedlich ausgeprägten Suppression der DTH. Dage-gen hatten sie gegensätzliche Effekte auf die Auslösung. Während nach MAX12F6-Behandlung eine stärkere und prolongierte DTH gemessen wurde, verlief die DTH-Reaktion nach MAX16H5-Applikation deutlich abgeschwächt. Mittels flowzytometri-scher Analysen konnte gezeigt werden, dass die Antikörper unterschiedliche Subpo-pulationen der T-Helferzellen depletieren. Darüber hinaus führte MAX16H5 offen-sichtlich zur Induktion regulatorischer T-Zellen. Die Daten erklären unterschiedliche Erfolge aus ersten klinischen Studien mit verschiedenen anti huCD4 Antikörpern. Auch eignet sich CD4 auch als diagnostisches Target zur in vivo Diagnostik T-Zell vermittelter Entzündungsreaktionen. Mit Antikörperfragmenten von MAX16H5 wurde ein immunszintigraphisches Verfahren entwickelt, das die spezifische Darstellung der mit der DTH einhergehenden Entzündungsreaktion ermöglicht.

Background Regulatory T cells (Treg) are a subpopulation of CD4+ T cells that play an important role in the peripheral tolerance mechanisms of the immune system. Their suppressive function on autoreactive T cells can prevent autoimmunity. In type 1 diabetes (T1D), Treg have been inconsistently reported to be impaired in their capability to suppress autoreactive T cells (Tan, et al., 2014; Zhang, et al., 2012). Treg can be thymus derived (tTreg) or generated from naïve CD4+ CD25- T cells in the periphery (pTreg), which exhibit similar suppressive qualities as tTreg. They have also been reported to be actively induced (iTreg) under tolerogenic conditions (Kleijwegt, et al., 2010; Yuan and Malek, 2012). Although several Treg subpopulations have been described, the archetypical Treg express the major markers CD4, CD25 and FOXP3, while CD127 is heavily downregulated. However, activated conventional T cells (Tconv) show a similar phenotype, at least transiently (Miyara, et al., 2009). Since Treg and Tconv have opposing functions and therapeutic indications, it is important to obtain markers that confidently identify bona fide Treg. Scientific aim The aim of my thesis is to define the heterogeneity of human T cells with a specific emphasis to identify bona fide Treg. I examined heterogeneity of this population in healthy controls and T1D patients, as my model disease, and examined how T cells that are exposed to antigen can be defined as Treg or Tconv. Material and Methods For marker phenotyping I used samples from new onset T1D patients (age 7-11 years), autoantibody positive (Aab+) patients and age-matched healthy controls, which were tested by flow cytometry with an array of Treg-associated markers. Separately, freshly isolated CD4+CD25+CD127lo Treg and CD+CD25- Tconv were used for transcriptomic analysis, which was done by RNAseq on isolated whole RNA. For functional analysis of antigen specific gene expression patterns I developed a multi-dye proliferation assay. Treg (CD4+CD25+CD127lo) and Tconv (CD4+CD25-CD127+/lo) were sorted from isolated peripheral blood mononuclear cells (PBMC). I recombined the sorted and proliferation dye stained subsets with CD4- cells to simulate whole PBMC assays and stimulated them with tetanus-, influenza- or auto-antigens (GAD65, proinsulin). Cells were incubated for 5 days and responding proliferating cells as well as non-responding cells were single cell sorted and analyzed by multiplex qPCR. In investigating therapeutic approaches to expand or generate Treg, I examined in vitro approaches for de novo induction of Tregs with tolerogenic dendritic cells (tDCs). The tDCs were differentiated from monocytes either in the presence of 1α,25-OH(2)Vitamin D3 and/or Dexamethasone and matured with lipopolysaccharide. In a multistep assay, naïve T cells were incubated with DCs for two rounds and functional suppression assays were performed. The resultant T cells were analyzed at the DNA, protein, and functional level. Results Substantial phenotypic heterogeneity of peripheral blood CD4+ T cells was observed and documented for three major populations: resting Tconv (CD25-CD127+/lo), activated Tconv (CD25+CD127+) and Treg (CD25+CD127lo) in healthy controls. Despite this, I observed no differences between the Treg subpopulations from new onset T1D patients, Aab+ patients and healthy controls. In addition, there were no differences in the Treg transcriptome of T1D patients and healthy controls by RNAseq. I was, however, able to identify a small set of differentially expressed genes was discovered in Tconv suggesting a role of neutrophils in the onset of T1D. Heterogeneity of antigen-responsive Tconv and Treg was identified by gene expression profiling. I was able to define Treg specific as well as activation specific profiles, and found different expression profiles if T cells are foreign antigen or autoantigen activated and if the responding cells are Treg or Tconv. Genes that define the specific profiles include FOXP3, CD127, several cytokines, transcription factors and activation markers. The manipulation of naïve CD4+CD25- T cells by tDCs led to an unstable CD25+CD127loFOXP3+ phenotype of the generated cells. However, none of the subsequently performed functional assays could confirm that the resultant cells were iTreg or exhausted activated Tconv. In particular, methylation status of the Treg-specific demethylated region (TSDR) was inconsistent with stable Treg, suggesting that so-called tolerogenic protocols may not lead to a long-lived Treg phenotype. Conclusion CD4+CD25+ T cells are heterogeneous. I defined marker combinations that will help distinguish Treg from ex vivo and in vitro activated Tconv cells. With these tools, I was able to show that healthy controls and patients with type 1 diabetes cannot be distinguished by Treg phenotype. Comprehensive single cell analysis of antigen activated T cells provided the most promising avenue for identifying antigen-specific Treg and opens new possibilities to analyze immune therapeutic approaches, particularly when Treg expansion is the therapeutic objective. The findings will be used for monitoring children participating in antigen-based prevention studies in children at risk for T1D. / Hintergrund Regulatorische T Zellen (Treg) sind eine Subpopulation der CD4+ T Zellen, welche eine wichtige Rolle in den peripheren Toleranzmechanismen des Immunsystems spielen. Ihre suppressive Funktion auf autoreaktive T Zellen kann Autoimmunität verhindern. Verschiedene Studien berichteten widersprüchlich, dass Treg in Typ 1 Diabetes (T1D) in ihrer Fähigkeit beeinträchtigt sind autoreaktive T Zellen zu supprimieren (Tan et al., 2014; Zhang et al., 2012). Treg können im Thymus differenzieren (tTreg) oder aus peripheren naïven CD4+CD25- T Zellen generiert werden (pTreg), welche ähnliche suppressive Eigenschaften wie tTreg besitzen. Es wurde außerdem berichtet, dass Treg aktiv unter tolerisierenden Konditionen induziert werden können (iTreg) (Kleijwegt et al., 2010; Yuan and Malek, 2012). Obwohl verschiedene Treg Subpopulationen beschrieben wurden, exprimieren die archetypischen humanen Treg die Hauptmarker CD4, CD25 und FOXP3 exprimieren, während CD127 herunterreguliert ist. Jedoch zeigen auch aktivierte konventionelle T Zellen (Tconv) diesen Phänotyp (Miyara et al., 2009). Da Treg und Tconv gegensätzliche Funktionen und therapeutische Indikationen aufweisen, ist es wichtig Marker zu erhalten, die sicher bona fide Treg identifizieren. Fragestellung Das Ziel meiner Arbeit ist es, die Heterogenität von humanen T Zellen zu definieren mit einen spezifischen Fokus bona fide Treg zu identifizieren. Dafür untersuchte ich die Heterogenität dieser Zellpopulation in gesunden Individuen und T1D Patienten, als Krankheitsmodell, und wie T Zellen als Treg oder Tconv definiert werden können wenn sie einem Antigen ausgesetzt sind. Material und Methoden Für das Phänotypisieren habe ich Proben von Patienten mit beginnendem T1D (Alter 7-11 Jahre), Autoantikörper positiven Patienten (Aab+) und gesunden Individuen mittels Durchflusszytometrie auf eine Reihe von Treg-assoziierten Markern getestet. Des Weiteren wurden frisch isolierte CD4+CD25+CD127lo Treg und CD+CD25- Tconv für die Transkriptomanalyse (RNAseq) genutzt, welche mit der Gesamt-RNA durchgeführt wurden. Für die funktionelle Analyse von Antigen-spezifischen Genexpressionsmustern habe ich ein Multifarbenproliferationstest entwickelt. Treg (CD4+CD25+CD127lo) und Tconv (CD4+CD25-CD127+/lo) wurden aus isolierten mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC) sortiert. Ich habe die sortierten und gefärbten Zellen mit CD4- Zellen zusammengefügt, um einen Gesamt-PBMC-Test zu simulieren und habe die Zellen mit Tetanus-, Influenza- oder Auto-antigen (GAD65, Proinsulin) stimuliert. Die Zellen wurden für 5 Tage inkubiert und die Antigen-reagierenden und -proliferierenden Zellen sowie die nicht-reagierenden Zellen Einzelzell sortiert und mittels Multiplex qPCR analysiert. Um therapeutische Ansätze zum Expandieren oder Generieren von Treg zu untersuchen, habe ich in vitro Ansätze für die de novo Induktion von Treg durch die Nutzung von tolerisierenden dendritischen Zellen (tDCs) untersucht. Die tDCs wurden von Monozyten in Anwesenheit von 1α,25-OH(2)Vitamin D3 und/oder Dexamethason differenziert und mit Lipoploysaccharid maturiert. Naïve T Zellen wurden in einem Mehrschrittverfahren mit DCs inkubiert. Die resultierenden T Zellen wurden auf DNA, Protein und funktioneller Ebene analysiert. Ergebnisse Substantielle phänotypische Heterogenität von peripheren Blut CD4+ T Zellen wurde in drei Hauptpopulationen in gesunden Individuen beobachtet und dokumentiert: ruhende Tconv (CD25-CD127+/lo), aktivierte Tconv (CD25+CD127+) und Treg (CD25+CD127lo). Weiterführend ergab der phänotypische Vergleich von Patienten mit beginnender T1D, Aab+ Patienten und gesunden Individuen keine Unterschiede in den Treg Subpopulationen. Außerdem zeigten sich keine Unterschiede in den durch RNAseq gemessenen Treg Transkriptomen von T1D Patienten und gesunden Individuen. Jedoch wurde ein kleine Gruppe von differentiell exprimierten Genen in Tconv entdeckt, welche eine mögliche Rolle von Neutrophilen in T1D andeuten. Heterogenität von Antigen-spezifischen Tconv und Treg Antworten wurde durch Genexpressionsanalysen identifiziert. Ich konnte Treg- sowie Aktivierungs-spezifische Muster definieren und verschiedene Expressionsprofile finden, wenn T Zellen durch Fremd- oder Autoantigen aktiviert wurden und ob sie die reagierenden Zellen Treg oder Tconv sind. Folgende Gene waren hauptsächlich in die Profilbildung involviert: FOXP3, CD127, mehrere Zytokine, Transkriptionsfaktoren und Aktivierungsmarker. Die Manipulation von naïven CD4+CD25- T Zellen durch tDCs führte zu einem instabilen CD25+CD127loFOXP3+ Phänotyp der generierten Zellen. Jedoch konnte keiner der weiterführenden funktionellen Analysen unterscheiden, ob die resultierenden Zellen iTreg oder aktivierte erschöpfte T Zellen waren. Insbesondere war der Methylierungsstatus der Treg-spezifisch demethylierten Region (TSDR) nicht konsistent mit einen stabilen Treg Phänotyp, was darauf hinweist, dass sogenannte tolerisiernde Protokolle nicht zu einem langlebigen Treg Phänotyp führen. Schlussfolgerungen CD4+CD25+ T Zellen sind heterogen. Ich habe Markerkombinationen definiert die helfen werden Treg von ex vivo und in vitro aktivierten Tconv Zellen zu unterscheiden. Mit diesen Mitteln war ich in der Lage zu zeigen, dass gesunde Individuen und Patienten mit Typ 1 Diabetes nicht anhand ihres Treg Phänotyps unterschieden werden können. Umfassende Einzelzell-Analysen von Antigen aktivierten T Zellen lieferten den vielversprechendsten Ansatz für die Identifizierung von Antigen-spezifischen Treg und eröffnen neue Möglichkeiten um immuntherapeutische Ansätze zu analysieren, insbesondere wenn Treg Expansion das therapeutische Ziel ist. Diese Erkenntnisse werden zukünftig für das Monitoring von Kindern, mit einem hohen T1D Risiko, genutzt die an Antigen-basierten Präventionsstudien teilnehmen.

<p>NB: I had another committee member, Dr. Mark Larché; and would like to have his name included in the document.</p> <p>Thank you.</p> / <p><strong>Introduction: </strong>Increasing incidence of chronic immune diseases are mirrored by changing disease risk factors, which include maternal stress during pregnancy. To date, no studies have investigated the impact of prenatal stress challenge (PNS) on the fetal immune system. Fetal liver and bone marrow represent major sources of hematopoietic stem cells (HSC) at mid gestation, which differentiate and mature in the thymus. Disturbance of immune development may cause immune impairment in later life. Further, progesterone is recognized as a critical part of feto-maternal interaction. This study aimed to determine if PNS interferes with normal fetal immune development in mice and the impact of progesterone supplementation on stress effects. <strong>Methods: </strong>DBA/2J-mated BALB/c dams were sorted into three groups: control, PNS (gestation days (GDs) 12.5 and 14.5) and PNS plus progesterone supplementation (DHD). Fetal tissue was collected on GDs 16.5 and 18.5. Flow cytometric analysis examined frequency and phenotype of fetal immune cell populations: HSC in fetal liver and bone marrow, and different stages of T cell maturation and regulatory T (Treg) cells in the thymus. Fetal tails were collected to determine fetal sex by PCR analysis. <strong>Results: </strong>PNS induced a decrease in organ size on GD16.5, which was not seen on GD18.5 and was reversed by DHD treatment. PNS altered the percentage and absolute number of HSC within the liver and bone marrow populations, on GD16.5 and 18.5. There was a significant lag in T cell maturation as demonstrated by the altered expression of CD3 and skewed CD3-:CD3+ ratio. There was a significant decrease in Treg cells within CD3+ thymic cells in response to PNS. PNS effects in the thymus were ameliorated by DHD treatment. There was no PNS-induced sex bias. <strong>Conclusions: </strong>These results indicate that PNS compromises the developing fetal immune system, which could account for impaired immune responses in adults with chronic immune disease, and provide evidence for a therapeutic role of progesterone supplementation.</p> / Master of Science (MSc)

An equilibrium between proinflammatory and anti-inflammatory immune responses is essential for maternal tolerance of the fetus throughout gestation. To study the participation of fetal tissue-derived factors in this delicate immune balance, we analyzed the effects of human chorionic gonadotropin (hCG) on murine Treg cells and Th17 cells in vitro, and on pregnancy outcomes, fetal and placental growth, blood flow velocities and remodeling of the uterine vascular bed in vivo. Compared with untreated CD4+CD25+ T cells, hCG increased the frequency of Treg cells upon activation of the LH/CG receptor. hCG, with the involvement of IL-2, also interfered with induced differentiation of CD4+ T cells into proinflammatory Th17 cells. In already differentiated Th17 cells, hCG induced an anti-inflammatory profile. Transfer of proinflammatory Th17 cells into healthy pregnant mice promoted fetal rejection, impaired fetal growth and resulted in insufficient remodeling of uterine spiral arteries, and abnormal flow velocities. Our works show that proinflammatory Th17 cells have a negative influence on pregnancy that can be partly avoided by in vitro re-programming of proinflammatory Th17 cells with hCG.

Regulatorische T-Zellen (Treg) eröffnen neue immuntherapeutische Wege zur Kontrolle unerwünschter Immunreaktionen, jedoch wirft die Heterogenität dieser Zellen die Frage auf, welche Treg-Population für die klinische Anwendung. Darauf basierend werden in dieser Arbeit drei Fragestellungen bearbeitet: i) Bestimmung der Häufigkeit von Tregs und deren Subpopulationen in verschiedenen Altersgruppen bei Empfängern einer Organtransplantation (Tx) und einer gesunden Kontrollgruppe; ii) Vergleich der Suppressorkapazität verschiedener Treg-Populationen und in vitro-Expansion der Zellen unter Erhaltung ihrer Funktionalität; iii) Klärung der Differenzierungsmerkmale von Tregs und deren Verknüpfung mit konventionellen T-Zellen (Tconv) mittels Analyse des T-Zell-Rezeptor- (TCR) Repertoires. Sowohl bei gesunden Probanden als auch bei Tx-Empfänger konnte eine altersabhängige Verschiebung von naiven (TregN) hin zu dominant zentralen Gedächtnis-Zellen (TregCM) beobachtet werden, Treg von Tx-Empfängern hatten mehr Effektor-Memory-Zellen (EM) und sie waren mehr aktiviert. In Bezug auf die Kontrolle der frühen Tconv zeigen TregCM eine erhöhte Suppressorkapazität im Vergleich zu TregN. Außerdem sind im Gegensatz zu TregN nur TregCM dazu in der Lage, Apoptose bei Responderzellen zu induzieren. Der Grund hierfür könnte in der stärkeren Expression von CTLA-4 auf TregM liegen. Die Expansionskultur führte zur phänotypischen Veränderung der TregN, deren Umwandlung in TregCM mit einer verbesserten Suppressoraktivität verbunden ist. Die Daten legen nahe, dass das Expandieren mit gesamt Treg für die Adoptive-Treg-Therapie optimal sind, da sie der größte Anteil von ihnen die hochpotenten TregCM sind. TCR-Studien mittels Next Generation Sequencing zeigen weiter, dass TregM aus TregN entstehen, anstatt aus Tconv, in einem Antigen-gesteuerten Prozess. Diese Daten belegen erstmalig neue Erkenntnisse hinsichtlich der Unterschiede der TCR-Repertoires von TregM und Tconv beim Menschen. / Regulatory T cells (Treg) offer new immunotherapeutic options to control undesired immune reactions, but the heterogeinetiy of Treg raises the question which Treg population should be used for clinical translation Thus, this project involves three main parts: i) investigating Treg frequency and subsets distribution with age in healthy donors and transplant (Tx) patients; ii) comparing the suppressive capacity of Treg subsets and expanding them in vitro without losing functionality; iii) clarifyjing the differiation relationship of Treg subsets and their relation to conventional T cells (Tconv) by T cell receptor (TCR) repertoire analysis. From both healthy donors and Tx patients, an age-dependent shift from naïve Treg (TregN) to the dominant central-memory Treg (TregCM) was observed,; However,Treg in Tx patients contained more effector-memory EM cells, , and they were pre-activated due to the exposure to allo antigens,. Regarding control of early Tconv activation, TregCM showed enhanced suppressive capacity compared to TregN; furthermore, only TregCM could induce apoptosis of responder cells while TregN could not, which may result from thehigherexpression of cytotoxic T-lymphocyte antigen 4 (CTLA-4) on TregM. Following in vitro expansion of the Treg subsets, however, TregN converted mainly into TregCM phenotype with enhanced suppression activity. The poor proliferation capacity of TregEM might indicate EM as the terminal differential stage. These data suggest that expansion with total Treg is optimal for adoptive Treg therapy as the majority of them are the highly potent TregCM. Lastly, TCR repertoire study by next generation sequencing (NGS) indicate that TregM derived from TregN rather than Tconv in an antigen-driven process. The highest similarity of the TCR repertoires was observed between TregCM and TregEM. These data reveal new insights for the first time into the distinct TCR repertoires of Treg subsets and Tconv in human by NGS technology.

Nach einer Läsion im Gehirn kommt es trotz der Bildung autoreaktiver T-Zellen zu keiner autoimmunen Neuropathologie. Foxp3+ regulatorische T-Zellen (Tregs) vermitteln möglicherweise Immuntoleranz nach zerebraler Läsion. Deswegen wurde in dieser Studie die Rolle der Tregs 7, 14 und 30 Tage nach einem transienten Verschluss der mittleren Hirnarterie (MCAO), einem Modell für ischämischen Schlaganfall, und nach entorhinaler Kortexläsion (ECL) in der Maus untersucht. Durchflusszytometrisch wurde in beiden Modellen 14 und 30 Tage nach Läsion eine Akkumulation der Tregs in der ipsilateralen Hemisphäre beobachtet. Mikroskopisch wurden an der Läsion Zellkontakte der Tregs mit antigenpräsentierenden Zellen beobachtet. Weitere Experimente wurden ausschließlich nach MCAO durchgeführt. Am Tag 14 und 30 war in der ipsilateralen Hemisphäre eine Akkumulation der Mikroglia zu beobachten. Makrophagen und dendritische Zellen wurden an den Tagen 7, 14 und 30 detektiert. Am Tag 7 und 14 waren ipsilateral im Gehirn ca. 60 % der Tregs positiv für den Proliferationsmarker Ki-67. In zwei Versuchsansätzen wurden naive CD45RBhigh/CD4+ Zellen aus lymphatischen Organen von Foxp3EGFP Mäusen, mit Wildtyp T-Zellrezeptor (TCR), oder 2D2.Foxp3EGFP Mäusen, mit TCR spezifisch gegen Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein, isoliert. Die Zellen wurden einen Tag vor MCAO in RAG1-/- Mäuse, welche keine adulten T- und B-Zellen besitzen, transferiert. Am Tag 14 nach MCAO war in den RAG1-/- Mäusen keine de novo Induktion Foxp3EGFP+ Tregs zu beobachten. CD25+ Tregs wurden durch die Injektion eines Antikörpers gegen CD25 depletiert, um deren Wirkung nach MCAO zu untersuchen. Nach Depletion konnte bis zu 27 Tage nach MCAO keine Veränderung des Läsionsvolumen und des Gangverhaltens beobachtet werden. In dieser Studie wurde im Gehirn eine späte Präsenz und Proliferation Foxp3+ Tregs nach Läsion nachgewiesen. Mikroglia und periphere Immunzellen sind langfristig an Immunvorgängen im lädierten Gehirn beteiligt. / After brain lesion autoreactive T cells specific against brain antigens are expanded, but no delayed autoimmune neuropathology evolves. Immune suppressive CD4+/Foxp3+ regulatory T cells (Tregs) could have an important role in maintaining immune tolerance in the lesioned brain. Therefore, this study sought to analyse the role of Tregs in mice 7, 14 and 30 days after transient middle cerebral artery occlusion (MCAO), a model for ischemic stroke, and entorhinal cortex lesion (ECL). An accumulation of Tregs was detected in the brain by flow cytometry in both models at days 14 and 30 after lesion. Using immunohistochemistry Tregs were found in close cell-cell contact with antigen presenting cells at the lesion site. Further experiments were performed solely with MCAO. On days 14 and 30 after MCAO a strong accumulation of microglia occurred in the ipsilesional hemisphere. Macrophages and dendritic cells were found ipsilesionally on days 7, 14 and 30. On days 7 and 14 about 60% of Tregs were positive for the proliferation marker Ki-67 in the lesioned hemisphere. In two different setups naïve CD45RBhigh/CD4+ cells were isolated from lymphatic organs of Foxp3EGFP mice, carrying a wild type T cell receptor (TCR), or 2D2.Foxp3EGFP mice, carrying a TCR specific for myelin oligodendrocyte glycoprotein. One day before MCAO naïve CD45RBhigh/CD4+ cells depleted of Foxp3EGFP+ Tregs were transferred into RAG1-/- mice, which lack adult B and T cells. At day 14 after MCAO no de novo generation of Foxp3EGFP+ Tregs was observed. The effects of Tregs on stroke outcome were tested by depleting CD25+/Foxp3EGFP+ Tregs with an antibody against CD25. After depletion no effects on lesion volumes and gait parameters were detected up to 27 days following MCAO. The present study demonstrates for the first time a sustained presence and proliferation of Tregs in the lesioned brain. Local microglia and peripheral immune cells are involved in long-lasting immune processes following brain lesion.

In dieser Arbeit wurde die funktionelle Rolle und Regulation des murinen Transkriptionsfaktor Foxp3 untersucht. Der erste wesentliche Teil zur Analyse der funktionellen Rolle war dabei die Erzeugung einer BAC- transgenen Maus. Hierfür wurde ein Zielgenvektor mit der kodierenden Region des eYFPs und einer dualen Selektionskassette sowie die Methode des ET- Klonierens verwendet. Leider war die homologe Rekombination des Zielgenvektors in den BAC nicht erfolgreich. Es kam zu einer ungeklärten Rekombination mit Fremd- DNS. Die Erzeugung der transgenen Maus wurde nach diesem Ergebnis eingestellt, und es wurde mit einer von unserem Kooperationspartner zur Verfügung gestellten BAC- transgenen Maus weitergearbeitet. Diese Maus, die DEREG- Maus, wurde nach dem gleichen Prinzip erstellt, wie die in dieser Arbeit gestartete transgene Maus, an Stelle des eYFPs trägt die DEREG- Maus die kodierenden Region des GFPs und des Diphtheria- Toxin- Rezeptors. Mit dieser Maus wurden erste Analysen zur Überprüfung der transgenen Maus unternommen. Es wurde die Koexpression von GFP und Foxp3, sowie die Depletion der Foxp3+ T- Zellen mittels Diphtheria- Toxin analysiert. Als nächstes wurde die funktionelle Rolle des Transkriptionsfaktors Foxp3 analysiert. Als einer der ersten Schritte wurde die Stabilität von Foxp3 in vivo überprüft und gezeigt, dass T- Zellen, die das Foxp3- Protein exprimieren, bis zu 14 Tage in vivo stabil sind. Weiterhin wurde die Stabilität der Foxp3- Expression in in vitro Kulturen nach Induktion durch TGF-beta untersucht. Die induzierten Tregs zeigten keine stabile Foxp3- Expression und auch bei der Methylierungsanalyse der TSDR zeigten diese T- Zellen nicht das für ex vivo isolierte Foxp3+ T- Zellen beschriebene Methylierungsmuster. Die Stabilität scheint mit der Demethylierung der TSDR zu korrelieren. Die induzierten Tregs zeigten neben dem nicht stabilen Foxp3- Phänotyp auch eine von der Foxp3- Expression abhängige Suppression von naiven Zellen im in vitro Proliferations- Test. Im dritten Teil der Arbeit wurde die Struktur und Regulation des Transkriptionsfaktors Foxp3 untersucht. Der Lokus wurde auf konservierte Regionen im Vergleich zu den Spezies Maus, Mensch, Ratte, Huhn, Schimpanse, Hund und Frosch untersucht. Die in Floess*, Freyer* et al. (63) gefundenen Region TSDR enthält einen hochkonservierten Bereich. Die Region wurde auf mögliche Transkriptionsfaktor- Bindungsstellen hin analysiert, und ebenfalls wurden in diesem Bereich Histon- Modifikationen für die Acetylierung der Histone H3 und H4, sowie Tri- Methylierung des Lysin4 des Histons H3 gefunden. Die TSDR wurde in Luciferase- Tests auf ihre transkriptionelle Aktivität hin getestet und zeigte einem Enhancer ähnliche unterstützende Aktivität. Die Methylierung der TSDR in den Luciferase- Tests führte zu einer Reduktion der transkriptionellen Aktivität. Deletionsmutanten der TSDR konnten den Bereich für die transkriptionelle Aktivität weiter einschränken und zeigten ein 275pb großes Fragment auf, in welchem viele interessante, mögliche Transkriptionsfaktor- Bindungsstellen und auch die größte Anzahl der differentiell methylierten CpG- Motive liegen. / The aim of the study was to analyze the function and regulation of the transcription factor Foxp3. In a first step we designed a BAC-transgenic mouse with eYFP under the control of the Foxp3 promoter. For creating these mice we use the ET- cloning method. The step of homologous recombination of the target vector into the BAC failed. Because of that, we decided to work in cooperation with the group of Tim Sparwasser from Munich and their BAC- transgenic mouse called DEREG- mouse. This mouse expresses the coding region of eGFP fused to the diphtheria- toxin- receptor under the control of the Foxp3 promoter. Therefore Foxp3+ T cells can be easily detected by eGFP expression and can even be depleted by diphtheria- toxin- application. We confirmed the co- expression of Foxp3 and eGFP and furthermore tested the functionality of the depletion- process of Foxp3+ T cells by treatment with diphtheria- toxin. In a second study, we analyzed the stability of Foxp3 expressing cells in vivo. Therefore we transferred Foxp3+ T cells in syngenic mice and analyzed these cells after 14 days for their Foxp3- expression. Furthermore, we tested the induction of Foxp3 expression through TGF-beta and the suppressive activity of these cells. We also analyzed those cells for their methylation pattern, comparing cells, which showed an induction of Foxp3- expression after one week of culture with TGF-beta to cells, which received TGF-beta for one week and were then restimulated in the absence of TGF-beta. The stability of Foxp3 expression seems to correlate with the demethylated state of the TSDR (Treg Specific Demethylated Region). To get a closer look on the region called TSDR in the murine foxp3 locus, we decided to analyze this region under different aspects. First, we checked for putative binding sites of transcription factors by database analysis of the TSDR. We also analysed histon modifications, such as acetylation of histon H3 and H4 and tri- methylation of lysine 4 at histon3, in this region. Presence of these modifications hinted an epigenetic regulation of Foxp3 involving the TSDR. In a last step, the transcriptional activity of TSDR was tested to delineate whether the TSDR serves as an alternative promoter or acts as a regulative element like an enhancer. Luciferase assays showed that TSDR is a regulative enhancer element, which loses transcriptional activity when methylated. Deletion mutants determined the most important fragment of the TSDR.

Ziel der Arbeit war, zu untersuchen, ob der gezielte Einsatz gentherapeutischer Methoden zu einer Verhinderung der Abstoßung allogener Transplantate bzw. zu einer Verhinderung der Induktion des Ischämie-/Reperfusionsschadens in verschiedenen Transplantationsmodellen der Ratte beitragen kann. Dabei wurden zwei Schwerpunkte gesetzt: Zum einen wurde auf den ex-vivo Gentransfer von therapeutischen Molekülen direkt in das Transplantat mit Hilfe von rekombinanten Adenoviren fokussiert. Zum anderen wurde das Potenzial von retroviral modifizierten, allospezifischen T-Zellen als Träger therapeutischer Gene zur Verhinderung der Transplantatrejektion untersucht. Diese Habilitationsschrift umfasst dreizehn Originalartikel in internationalen Zeitschriften, sechs Übersichtsartikel (Reviews) und vier Manuskripte, die bereits zur Veröffentlichung eingereicht sind. / The aim of the research was to investigate, whether the specific use of gene therapeutic methods can play a role in the prevention of allogeneic graft rejection or in the prevention of the induction of ischemia/reperfusion damage in various rat transplantation models. Doing this there were to main focusses: First we concentrated on the ex-vivo gene transfer of therapeutic molecules directly into the graft, which was done using recombinant adenoviruses. Then we investigated the potential of retrovirally modified, allospecific T-cells as carriers for therapeutic genes for the prevention of graft rejection. This publication consists of thirteen original papers in international journals, six reviews and four manuscripts that have been submitted for publication.

A Imunodeficiência Comum Variável (ICV) e a Deficiência Seletiva de Imunoglobulina A (DIgA) são as imunodeficiências primárias humorais de maior freqüência na população mundial. Ambas as doenças são caracterizadas pela ausência ou redução significativa de imunoglobulinas no soro. Embora diversas anormalidades imunológicas tenham sido associadas a estas doenças, nenhuma hipótese unificadora a respeito das bases moleculares das mesmas foi proposta até o presente momento, sendo que o único defeito comum a todos os pacientes é a falha na diferenciação de células B em plasmócitos e conseqüente secreção de anticorpos. Devido à alta incidência de auto-imunidade e alergia em pacientes com ICV e DIgA, no presente trabalho, visamos analisar por citometria de fluxo a população de linfócitos CD4+ com potencial regulador nesses pacientes, para avaliar se possíveis defeitos quantitativos ou funcionais nesta população reguladora poderiam explicar a alta incidência de doenças auto-imunes ou alérgicas associadas a estas imunodeficiências. / Common Variable Immunodeficiency (CVID) and Selective Immunoglobulin A deficiency (IgAD) are the humoral primary immunodeficiencies with the highest incidence in the population. Both diseases are characterized by the absence or significant reduction of serum immunoglobulins. Although several immunological abnormalities have been associated with these diseases, no unifying hypothesis regarding the molecular basis of CVID and IgAD have been proposed to date, and the only defect common to all patients is the failure in differentiation of B cells into plasma cells and consequent secretion of antibodies. Due to the high incidence of autoimmunity and allergy in patients with CVID and IgAD, in the present work we analyzed by flow cytometry the population of CD4+ lymphocytes with regulatory potential in these patients to assess whether possible quantitative or functional defects in this regulatory population could explain the high incidence of autoimmune diseases or allergic reactions associated with these immunodeficiencies.