Submitted by Cleide Dantas (cleidedantas@ufpa.br) on 2014-02-10T11:41:12Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_BasesMolecularesResistencia.pdf: 941177 bytes, checksum: ee3acd908afddff5f4d0f8ea3e686640 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva (arosa@ufpa.br) on 2014-03-31T16:49:02Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertacao_BasesMolecularesResistencia.pdf: 941177 bytes, checksum: ee3acd908afddff5f4d0f8ea3e686640 (MD5) license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-03-31T16:49:02Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertacao_BasesMolecularesResistencia.pdf: 941177 bytes, checksum: ee3acd908afddff5f4d0f8ea3e686640 (MD5) license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Previous issue date: 2004 / Mercúrio é um dos elementos mais tóxicos tanto para seres humanos como os demais animais. Em ambientes naturais seus compostos podem ter origem em fontes naturais ou em decorrência da ação do homem. A atividade microbiana tem papel crítico na biorremediação. A resistência ao mercúrio nas bactérias está associada a um conjunto de genes organizados no operon mer. Considerando este cenário realizamos um estudo com bactérias Gram-negativas isoladas de sedimento de rios de duas áreas com distintos graus de atividade antropogênica, Barreiras e Caxiuanã. A resistência ao mercúrio foi avaliada em ensaios de crescimento in vitro da bactéria em meio contendo Hg. A presença do operon mer foi determinada por PCR para os genes RTPCABD, componentes do operon. O ensaio in vitro, determinou que apenas 2 isolados dos 107 avaliados, Acinetobacter baumannii de Caxiuanã e Pseudomonas stutzeri de Barreiras, apresentavam resistência ao Hg. Um operon mer foi identificado e caracterizado apenas do isolado Acinetobacter baumannii. Este apresenta os genes RTPCAD e sua organização e seqüência nucleotídica possui identidade total com o operon mer de um isolado de Acinetobacter calcoaceticus da Rússia. / Mercury is one of the most toxic elements, for both human and animals. Its compounds in natural environments can arise from natural and anthropogenic sources. Microbial activities play a critical rule in bioremediation. Mercury resistance in bacteria is associated with a gene cluster present on mer operon. Considering that picture we carried on a study with Gram-negative bacteria isolates from freshwater sediment from two areas with distinct anthropogenic impact, Barreiras and Caxiuanã. Resistance to Hg was evaluated by in vitro growing in medium containing Hg. The presence of mer operon was evaluated by PCR targeting RTPCABD mer gene sequences. The in vitro assay revealed that only two strains, from 107 isolates, were resistant to Hg the bacteria Acinetobacter baumannii from Caxiuanã and a Pseudomonas stutzeri from Barreiras. A mer operon was identified in the Acinetobacter baumannii strain and its sequencing revealed a organization as merRTPCAD and a complete nucleotide identity with a mer operon identified in a Acinetobacter calcoaceticus from Russia.

Introdução: Isolados clínicos de Pseudomonas aeruginosa multirresistentes estão associados a elevadas taxas de mortalidade. A resistência ao imipenem é uma urgência global, uma vez que é considerado o tratamento de escolha para infecções associadas a bactérias Gram negativas multirresistentes. Assim, elucidar os mecanismos de resistência é de vital importância para realizar um controle epidemiológico efetivo da disseminação deste tipo de isolado. Objetivos: Caracterizar os principais mecanismos de resistência ao imipenem em 76 isolados clínicos brasileiros de Pseudomonas aeruginosa, recuperados em 2004/2007, de 4 centros hospitalares do Estado de São Paulo. Material e métodos: Foram investigados: i) o perfil de resistência com determinação da CIM do imipenem; ii) a detecção de metalo-betalactamases (MBL) através de métodos fenotípicos e genotípicos; iii) a sensibilidade e especificidade do método de dupla difusão do disco na detecção de MBL; iv) a presença de genes codificadores de metilases 16S RNAr e sua associação com fenótipos aminoglicosídeo resistentes; v) alterações da permeabilidade por perda da porina OprD; vi) a presença ou ausência do gene oprD por PCR; vii) triagem fenotípica para expressão de bombas de efluxo através da determinação da CIM de quinolonas, cefalosporinas e carbapenêmicos na presença/ausência de inibidores específicos, realizando uma análise comparativa com o método de disco combinado; viii) os genes associados às bombas de efluxo mexA e mexE, através de PCR; ix) caracterizar a expressão das bombas de efluxo MexAB-OprM e MexEF-OprN, x) a clonalidade dos isolados por tipagem genotípica, através de ERIC-PCR, avaliando a relação genética (dendrograma) e sua associação com o predomínio de um determinado mecanismo de resistência. Resultados: Dentre os isolados de P. aeruginosa resistentes ao imipenem estudados (n=76, CIM50 e CIM90 = 32 µg/mL e > 512 µg/mL, respectivamente) 82% apresentaram um fenótipo de multirresistência. O principal mecanismo de resistência ao imipenem foi a produção de MBL, detectada em 74% dos isolados, e destes, 62% carregavam o gene blaSPM-1 e 12% carregavam o gene blaVIM-like. O método de dupla difusão do disco identificou a produção de MBL em 61% dos isolados. A combinação CAZ/MAA apresentou maior sensibilidade na detecção de MBL associada à SPM-1 (89%), mostrando uma especificidade de 86%. A presença do gene rmtD foi confirmada em 66% das amostras resistentes aos aminoglicosídeos, sendo que a presença concomitante do gene rmtD e do gene blaSPM-1 foi confirmada em 61% dos isolados. A deleção da porina OprD foi observada em 71% dos isolados. Dentre os isolados MBL positivos, 66% apresentaram ausência desta porina e, dentre as amostras MBL negativas, 85% não apresentaram OprD. Assim, para a resistência ao imipenem foi confirmada a contribuição de dois mecanismos, mediados pela presença de MBL e ausência de porina OprD. Em 13% (10/76) isolados, a deleção da porina OprD esteve associada à presença de seqüências de inserção (SI) em uma região anterior ao gene oprD. Por outro lado, a ausência de amplificação da região 736/1394 do gene oprD, em 11% (9/76) dos isolados, sugeriu a presença de polimorfismos. O gene mexA esteve presente em 92% dos isolados, enquanto que o gene mexE esteve presente em 82% dos isolados. A triagem de bombas de efluxo por disco combinado e análise da CIM na presença de reserpina, CCCP e PAβN, utilizando levofloxacina, meropenem, aztreonam, imipenem ou levofloxacina, não teve correlação com a superexpressão dos sistemas MexAB-OprM e MexEF-OprN. Ambos os métodos careceram de especificidade e sensibilidade quando comparados ao PCR em tempo real. A superexpressão dos sistemas mexA e mexE foi confirmada em 35% (7/20) isolados MBL negativos, enquanto que 11% (6/56) isolados MBL positivos apresentaram superexpressão do gene mexA ou mexE, sendo que 7% (4/56) isolados MBL positivos superexpressaram ambos os genes. A superexpressão dos sistemas MexAB-OprM e MexEFOprN como único mecanismo de resistência ao meropenem e imipenem foi confirmada em 10% (2/20) dos isolados MBL negativos. Nos 76 isolados, a tipagem genotípica por ERIC-PCR, identificou a presença de 24 clusters (considerando 90% de similaridade na análise do dendrograma). Conclusão: A convergência de múltiplos mecanismos de resistência em P. aeruginosa parece ser um evento favorável para a seleção de clones endêmicos multirresistentes disseminados na região Sudeste do Brasil. / Introduction: Clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa are associated with high mortality rates. Resistance to imipenem is a global concern, since it is a drug of choice for the treatment of infections produced by multidrug-resistant Gram-negative bacteria. Thus, research on resistance mechanisms is crucial to carry out an effective program for infection control and epidemiology of imipenem-resistant strains. Objective: to characterize the major mechanisms of imipenem resistance in 76 clinical isolates of P. aeruginosa recovered from clinical samples collected, from 2004 to 2007, in four hospitals in the State of São Paulo, Brazil. Material and methods: Isolates were screened for: i) resistance profile to antibacterial agents, determining the MIC of imipenem; ii) the detection of metallo-beta-lactamase (MBL) by phenotypic and genotypic methods, iii) MBL detection by using a double-disk diffusion test (D-test), determining the sensitivity and specificity of the assay; iv) the presence of genes encoding 16S rRNA methylases and their association with aminoglycoside-resistant phenotypes, v) changes in the bacterial permeability due to porin (OprD) loss; vi) the presence or absence of the oprD gene by using PCR; vii) phenotypic expression of efflux pumps by determining the MIC of quinolones, cephalosporins and carbapenems in the presence/absence of specific inhibitors, performing a comparative analysis with a combined-disk method, viii) genes encoding efflux pumps proteins (mexC and mexX) by PCR; ix) MexAB-OprM and MexEF efflux pumps expression; x) clonal relatedness, by ERIC-PCR genotyping, regarding the predominance of major resistance genotypes. Results: Among imipenem-resistant P. aeruginosa strains (n=76, MIC50 e MIC90 = 32 µg/mL e > 512 µg/mL, respectively) 82% showed a multidrug-resistant phenotype. The main mechanism of imipenem resistance was the MBL production detected in 74% strains, of which 62% harbored the blaSPM-1 gene, and 12% harbored the blaVIM-like gene. The D-test identified MBL production in 61% strains. In this regard, CAZ/MAA was the most sensitive combination for MBL detection associated to SPM-1 enzyme (89%), exhibiting 86% specificity. The presence of the rmtD 16S rRNA methylase gene was confirmed in 66% aminoglycoside-resistant strains. Moreover, presence of both rmtD and blaSPM-1 genes was identified in 61% strains. Loss of OprD porins was observed in 71% strains. In this regard, 66% MBL positive strains and 85% MBL negative strains showed OprD loss. Thus, MBL production and OprD loss contributed to imipenem resistance in P. aeruginosa. Most likely, in 13% (10/76) strains the porin loss was associated to insertion sequences (SI) inserted upstream of the oprD gene. On the other hand, in 11% (9/76) strains the absence of a PCR product targeting the 736/1394 region of the oprD gene, suggested the presence of polymorphisms. The mexA gene was identified in 92% strains, whereas the mexE gene was identified in 82% strains. Results obtained from efflux pump screening by using a combined-disk assay and MIC determination in the presence of reserpine, CCCP e PABN (using levofloxacin, meropenem, aztreonam or imipenem) was not correlated with results obtained from MexAB-OprM and MexEF-OprN overexpression analysis by RT-PCR. In this regard, both combined-disk and MIC assay showed lack of specificity and sensitivity in comparison to RT-PCR. Overexpression of mexA and mexE genes was confirmed in 35% (7/20) MBL-negative and 11% (6/56) MBL-positive strains, respectively, being 7% (4/56) MBL-positive strains overexpressed both genes. The overexpression of MexAB-OprM and MexEF-OprN efflux pumps, as only mechanism of resistance to meropenem and imipenem was observed in 10% (2/20) MBL-negative strains. ERICPCR typing revealed the presence of 24 clusters among 76 imipenem-resistant P. aeruginosa strains (≥ 90% similarity). Conclusion: The convergence of multiple mechanisms of resistance in Pseudomonas aeruginosa seems to be a favorable event for the selection of multiresistant clones endemic in the southeastern region of Brazil.

Introdução. Quinolonas são antimicrobianos sintéticos que inibem as enzimas DNA-girase e topoisomerase IV resultando na morte bacteriana. São altamente eficazes no tratamento de infecções bacterianas, especialmente causadas por bactérias Gram negativas, e portanto amplamente utilizados na medicina humana e veterinária, na qual também são empregados como profiláticos. Porém, o uso indiscriminado e inadequado levou ao aumento de bactérias resistentes a estes compostos. Esta resistência pode ocorrer devido a mutações nas enzimas DNA-girase e topoisomerase IV, e também por genes contidos em plasmídeos. Estes últimos são os principais responsáveis pela disseminação e circulação da resistência entre o meio ambiente e o ambiente hospitalar. Objetivos. Pesquisar genes de resistência a antimicrobianos do grupo das quinolonas em bactérias Gram negativas de origem clínica e ambiental que apresentam resistência fenotípica a este grupo. Material e Métodos. 73 cepas de Enterobacteriaceae e Aeromonas sp. de origem clínica e ambiental foram selecionadas para o estudo, e avaliadas quanto à sensibilidade aos antimicrobianos do grupo das quinolonas e à pesquisa de genes de resistência a este mesmo grupo e mutações no gene que codifica a enzima DNA-girase por meio de PCR e sequenciamento. Resultados. Das 73 cepas previamente selecionadas para compor o estudo, 65 foram utilizadas, devido à exclusão de perfis clonais similares. Nestas, foram observados os genes, qnrS1 (1,5 por cento ), qnrS2 (26,2 por cento ), qnrB1 (3,1 por cento ), qnrB19 (12,3 por cento ), qnrD1 (1,5 por cento ), aac(6)-Ib-cr (10,8 por cento ), oqxA (43,1 por cento ) e oqxB (41,5 por cento ), e duas variantes determinadas qnrB-like (3,1 por cento ) e qnrB69-like (1,5 por cento ). Os genes qnrA, qnrC e qepA não foram identificados. Mutações na enzima DNA-girase foram observadas em 97,9 por cento das cepas positivas para algum dos genes pesquisados. Em 4 cepas foi possível estabelecer a associação do gene aac(6)-Ib-cr com integron de classe 1. Foi realizado sequenciamento e caracterização do plasmídeo completo onde estava inserido o gene qnrD1. Conclusões. Este estudo relata pela primeira vez no Brasil a ocorrência dos genes qnrS2, oqxA e oqxB, a associação entre o elemento genético integron de classe 1 e o gene aac(6)-Ib-cr, e o gene qnrD1 e a caracterização do plasmídeo completo onde este estava inserido. Os genes qnrB1, qnrB19, e aac(6)-Ib-cr, anteriormente apenas relatados em cepas clínicas, foram observados em cepas ambientais. Os resultados deste estudo mostram alta frequência de genes de resistência a quinolonas tanto em isolados clínicos quanto em isolados ambientais, alertando quanto à disseminação da resistência entre fontes diferentes, e possível manutenção destes genes por cepas ambientais. / Introduction. Quinolones are synthetic antimicrobial agents that inhibit DNA gyrase and topoisomerase IV enzymes resulting in bacterial death. They are highly effective in the treatment of bacterial infections, especially the ones caused by Gram negative bacteria, as well as for prophylaxy. Therefore they are widely used in human and veterinary medicine. However, indiscriminate and improper use led to an increase of bacteria resistance to these compounds. This resistance can be due to mutations in DNA gyrase and topoisomerase IV enzymes and also by genes contained in plasmids, which are mainly responsible for the spread and transmission of resistance between the environment and the hospital set. Objectives. To search for genes of resistance to quinolone antimicrobial agents in Gram-negative bacteria from clinical and environmental strains that present phenotypic resistance to this group. Material and Methods. 73 strains of Enterobacteriaceae and Aeromonas spp., from clinical and environmental origin, were selected for this study, and evaluated for antimicrobial susceptibility of quinolone and search of resistance genes in this same group and also for mutations in the gene encoding the enzyme DNA gyrase by PCR and sequencing. Results. Of the 73 strains previously selected to compose this study, 65 were used, due to the exclusion of similar clonal profiles. In these, genes qnrS1 (1.5 per cent ), qnrS2 (26.2 per cent ) qnrB1 (3.1 per cent ), qnrB19 (12.3 per cent ) qnrD1 (1.5 per cent ) aac(6\')-Ib-cr (10.8 per cent ) oqxA (43.1 per cent ) and oqxB (41.5 per cent ) were observed, and two variants were named as qnrB-like (3.1 per cent ) and qnrB69-like (1.5 per cent ). The qnrA, qnrC and qepA genes were not identified. Mutations in DNA gyrase enzyme were observed in 97.9 per cent of the positive strains for at least one of the genes studied. It was possible to establish the association of aac(6\')-Ib-cr with class 1 integron gene in four strains. Complete sequencing and characterization of plasmid qnrD1, where the gene was inserted, was performed. Conclusions. This study reports, for the first time in Brazil, the occurrence of qnrS2, oqxA and oqxB genes, the association between genetic element integron class 1 gene and the aac (6 \')-Ib-cr, and qnrD1 gene and the characterization of the complete plasmid where this was inserted. qnrB1, qnrB19, and aac(6\')-Ib-cr genes, previously only reported in clinical strains, were observed in environmental strains. The results of this study show a high frequency of quinolone-resistance genes for both clinical and environmental isolates, warning about the spread of resistance through different sources, and the possible maintenance of these genes by environmental strains.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:42Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-04-29. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:19Z : No. of bitstreams: 1 Publico-154.pdf: 1362092 bytes, checksum: b56e51cd61b6e0026e1f047e7ce95328 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Staphylococcus coagulase negativo (SCoN) são importantes agentes etiológicos responsáveis por infecções relacionadas à assistência à saúde (IrAS) em infecções da corrente sanguínea. Em estudo retrospectivo foram avaliados SCoN isolados de pacientes com IrAS da corrente sanguínea em dois hospitais gerais da cidade de São Paulo no período de agosto de 2005 à agosto de 2007.Os isolados foram caracterizados a nível de espécies e testes de suscetibilidade aos antimicrobianos pelo Vitek® system e Vitek® 2. A presença do gene mecA e o tipo de SCCmec foram determinados por PCR multiplex. Staphylococcus epidermidis foi a espécie predominante seguido de S. hominis, S. haemolyticus, S. simulans, S. warneri, S. capitis e S. auricularis. Observou-se 88,2% de resistência à oxacilina nos isolados com 100% de concordância entre os discos de oxacilina e cefoxitina confirmados pelo gene mecA. Todos isolados foram suscetíveis à vancomicina e quatro isolados apresentaram resistência intermediária à teicoplanina pelo Etest®. Um S. epidermidis mostrou-se resistente à linezolida. O tipo de SCCmec predominante foi o tipo III seguido pelos tipos IV, I, II e V. Em 26,9% dos isolados mecA positivo não foram caracterizados nenhum tipo de SCCmec pelo protocolo utilizado. / Coagulase negative staphylococci (CoNS) are important etiologic agents responsible for healthcare related infection (HCRI) in bloodstream infections. In a retrospective study we evaluate CoNS isolated from patients with HCRI in bloodstream infections admitted to two general hospitals at São Paulo city, from August 2005 to August 2007. The isolates were characterized at species level and antimicrobial susceptibility tested by the Vitek® system and ViteK® 2. Oxacillin resistance was evaluated by oxacillin and cefoxitin discs. The presence of mecA gene and the SCCmec type were determined by multiplex PCR. Staphylococcus epidermidis was the predominant specie followed by S. hominis, S. haemolyticus, S. simulans, S. warneri, S. capitis and S. auricularis. Oxacillin resistance was observed in 88.2% of the isolates with 100% concordance between oxacilin and cefoxitin discs confirmed by mecA gene. All isolates were susceptible to vancomycin and four isolates revealed intermediate resistance to teicoplanin by Etest®. One S. epidermidis showed resistance to linezolide. The predominant SCC type was the type III followed by the types IV, I, II and V. In 26.9% positive mecA isolates we did not characterize the SCCmec type by the molecular protocol utilized. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Descrever a prevalência das espécies bacterianas isoladas nas infecções urinárias comunitárias. Descrever os perfis de susceptibilidade aos antibióticos de uso oral utilizado frente às bactérias isoladas nas infecções urinárias comunitárias. Avaliar a prevalência de fenótipos de resistência bacterianos através dos resultados dos testes de susceptibilidade e dos rastreamentos específicos utilizados. Amostras colhidas exclusivamente no atendimento ambulatorial com contagens de unidades formadoras de colônias entre 100.000 a ≥1.000.000 por mililitro (UCF/ml) Com ou sem piúria no exame de elementos anormais na urina e sedimentoscopia (EAS). Foram analisados retrospectivamente os resultados de urinoculturas e dos testes de susceptibilidade a antimicrobianos, realizados em um Laboratório da rede privada na cidade do Rio de janeiro, de pacientes atendidos em ambulatórios e com quadros de ITU. As amostras de urina coletadas englobavam basicamente os seguintes bairros: Botafogo, Barra da Tijuca, Ipanema, Copacabana, Tijuca e Centro. Foram analisados um total de 8.475 culturas de urina divididas em 7.286 urinas de pacientes femininos e 1.189 de pacientes masculinos entre Janeiro de 2006 a Dezembro de 2012. As amostras foram todas coletadas na Cidade do Rio de Janeiro e englobavam basicamente os seguintes bairros: Botafogo, Barra da Tijuca, Ipanema, Copacabana, Tijuca e Centro. Encontramos um percentual de resistência de 27% para ciprofloxacina frente à Escherichia coli que com 68.23% é a principal etiologia encontrada na ITU na comunidade os resultados das três fluoroquinolonas avaliadas no estudo, ciprofloxacina (2 geração), levofloxacina (3 geração) e norfloxacina (2 geração), acharemos respectivamente 27%, 25% e 20% de resistência em Escherichia coli. O uso de fluoroquinolonas em infecções urinárias comunitárias e consequentemente os achados de padrões de resistência neste estudo, reforçam o que já foi descrito em outros trabalhos. A cefalosporina de 2 geração (cefuroxima), demonstrou percentuais de resistência bastante satisfatórios frente as principais etiologias. Em Escherichia coli o percentual foi de 2%, em Klebsiella pneumoniae 3% e em Proteus mirabilis não houve nenhum achado de resistência. Uma das vantagens da cefuroxima é ser ativa quanto à produção de beta lactamase, conferindo um espectro maior frente a possíveis produtoras desta enzima. Seu esquema posológico é de 250mg duas vezes ao dia por 7 dias para infecções urinárias não complicadas. O meio mais eficaz de melhorar a administração antimicrobiana provavelmente envolverá um programa abrangente que incorpora múltiplas estratégias e colaboração entre as diversas especialidades dentro de uma determinada instituição de saúde. Neste contexto, a observação periódica da incidência bacteriana com seus respectivos índices de resistência aos antimicrobianos por sitio de infecção e correlação com os antibióticos mais comumente utilizados, é mandatória para o sucesso terapêutico. / Describe the prevalence of bacterial species isolated from community acquired urinary tract infections and to describe the bacterial susceptibility profiles to oral antimicrobials. The prevalence of resistant phenotypes was also evaluated. Samples were taken from outpatients whose urine cultures showed >= 100,000 Colony Forming Units per milliliter (CFU/ml) with or without pyuria on direct examination of urine sediment samples. Urine culture results were retrospectively reviewed and antimicrobial susceptibility testing performed in a private clinical laboratory located in Rio de Janeiro. A total of 8475 urine cultures performed between January 2006 and December 2012 were analyzed. Female urine samples represented 7286 samples while male samples represented 1189 samples. Escherichia coli was found as the main etiology among urinary tract infections, (68,23%) showing 27% of ciprofloxaxin resistance, 25% Levofloxacin resistance and 20% Norfloxacin resistance. The use of fluoroquinolones in community acquired urinary tract infections and the resistance patterns found in this present study reinforces what has been described by other authors. A second generation cephalosporin (cefuroxime) showed resistance in main etiologies - E. coli 2% and K. pneumoniae 3%, while Proteus mirabilis showed no resistance at all. Among the main advantages of cefuroxime is the activity against the production of beta lactamases. The regimen dosage is 250mg twice a day for 7 days to treat uncomplicated urinary tract infections. The most effective way to improve antimicrobials administration is to develop a comprehensive program that incorporates multiple strategies and collaborative work between different medical specialties inside a healthcare institution. In such a context, the bacterial incidence rates and antimicrobial resistance rates should be closely observed and correlated to infection sites for better achievement of success in antimicrobial therapy.

As infecções associadas aos cuidados de saúde constituem um problema grave nas unidades hospitalares bem como nos serviços de atendimento extra-hospitalares. Diferentemente de outros países, no Brasil, existe uma incidência alta dessas infecções causadas por microorganismos Gram-negativos produtores de β-lactamase de espectroestendido (ESBL). Estas enzimas hidrolisam compostos β-lactâmicos e são consideradas mundialmente como de importância clínica, pois a localização de seus genes emelementos móveis facilitam a transmissão cruzada. Este estudo foi realizado com amostras bacterianas isoladas de material clínico e de fezes de pacientes internados em um hospital da rede pública no Rio de Janeiro, Brasil. Estes pacientes estavam internados em duas unidades de terapia intensiva cardiológica, no período de janeiro a dezembro de 2007. O estudo teve por objetivo realizar a caracterização fenotípica e genotípica desses isolados associados à colonização ou infecção dos pacientes. Os testes fenotípicos e genotípicos foram realizados na Universidade do Estado do Rio de Janeiro e incluíram provas bioquímicas, teste de susceptibilidade, teste confirmatório para a expressão da produção da enzima ESBL e Reação de Polimerase em Cadeia (PCR) com iniciadores específicos para cinco genes: blaTEM, blaSHV, CTX-M1, Toho1 e AmpC. As espécies bactérianas mais frequentemente isoladas foram Escherichia coli (25%) e Klebsiella pneumoniae (30,56%), e os genes mais prevalentes foram blaTEM (41,6%), AMPC (41,6%) blaSHV (33,3%), CTX-M1 (25%), e Toho1 (19,44%). Identificamos em 25% das amostras enterobactérias que não eram E. coli, K. pneumoniae ou Proteus sp, com fenótipo para ESBL e a expressão dos mesmos genes, confirmando a necessidade de investigação nestes grupos microbianos. O substrato mais sensível para a expressão da área de sinergismo no Teste de Aproximação foi o ceftriaxone (80%). Identificamos também que 17% das amostras positivas para ESBL apresentaram co-produção para AmpC e 50% apresentaram mais de um gene para os iniciadores testados. A presença da carbapenemase foi avaliada em amostras bacterianas com susceptibilidade intermediária para ertapenem, através do Teste de Hodge modificado. Os achados do presente estudo caracterizaram a co-produção de AmpC e ESBL, bem como sugerem a necessidade da revisão e a ampliação dos métodos para a detecção de outros padrões de resistência na nossa Instituição. / Healthcare-associated infections are a major problem in hospital units as well as in units outside hospital, where procedures are performed. In Brazil, differently from other countries, a large proportion of these infections are caused by extended spectrum beta-lactamase (ESBL) producing Gram-negative microorganisms. These enzymes, which hydrolyse β-lactams, are considered of clinical importance worldwide. Their localization in genes that are located in móbile structures facilitate cross infection. This study was performed with bacterial isolates found in clinical specimens and faeces of patients hospitalized in a public hospital in the city of Rio de Janeiro, Brazil. These patients were in two different cardiological intensive care units from January till December 2007. The goal of the study was the phenotypic and genotypic characterization of the bacterial isolates which were associated with colonization or infection. Phenotypic and genotypic tests were performed in Universidade do Estado do Rio de Janeiro (Rio de Janeiro State University) and included biochemical tests, susceptibility tests, a comfirmatory test for the expression of ESBL, and polymerase chain reaction (PCR) with specific primers for five gentes : blaTEM, blaSHV, CTX-M1, Toho1 and AmpC. The most frequently isolated bactéria were Escherichia coli (25%) and Klebsiella pneumoniae (30,56%), and the most prevalent genes were blaTEM (41,6%), AMPC (41,6%) blaSHV (33,3%), CTX-M1 (25%), and Toho1 (19,44%). In 25% of samples we identified enterobacteria that were not E. coli, K. pneumoniae oor Proteus spp, but with the ESBL phenotype and the expression of the same genes, suggesting these microbes needed investigating. The most sensitive substrate for expressing synergism in the double-disk diffusion test was ceftriaxone (80%). We also identified that 17% of ESBL positive isolates showed co-production of AmpC and 50% showed more than one gene tested by PCR. The presence of carbapenemase was studied in bacterial isolates with intermediate susceptibility to ertapenem, by a modified Hodge test. The findings in the present study characterize the co-production of AmpC and ESBL, and suggest the need for reviewing detection methods used and possibly using other methods for the detection of other resistance patterns in our Institution.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Infectious keratoconjunctivitis (IK), also known as pinkeye , is an ocular disease that affects cattle and sheep. In cattle, the microorganisms involved are Moraxella bovis, Moraxella bovoculi and Moraxella ovis. In sheep, the main microorganisms isolated from lesions are Mycoplasma conjuntivae, Chlamydia psittaci and M. ovis. Antibiotics are widely used in the treatement ofthis disease; therefore, to perform tests of susceptibility is essential in order to use the most effective drugs. However, few studies about the susceptibility of M. bovis, M. bovoculi and M. ovis to antibiotics are available in the literature. In Brazil, there are no studies describing the susceptibility profile of M. bovoculi and M. ovis. Susceptibility tests for M. bovis, M. bovoculi and M. ovis are routinely determined at laboratories by disk diffusion method. On the other hand, the broth microdilution method, which is the reference method, is used for Moraxella spp. with epidemiological purposes, such as, to define the antimicrobial susceptibility profiles of strains from a specific region. This dissertation aimed to determine the antimicrobial susceptibility of Brazilian strains of M. bovis, M. bovoculi and M. ovis by broth microdilution and disk diffusion for the main antimicrobials used to treat IK and, thus, to verify differences in antimicrobial susceptibility profiles of the three species of Moraxella. We also aimed to evaluate the agreement between the disk diffusion and broth microdilution method. In order to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC), obtained by the broth microdilution method, and the diameter of inhibition zone, obtained by disk diffusion method, the following antimicrobials were used: ampicillin, cefoperazone, ceftiofur, cloxacillin, enrofloxacin, florfenicol, gentamicin, neomycin, oxytetracycline and penicillin. The MIC and MBC were higher for M. bovis than for M. bovoculi and M. ovis. The drugs evaluated showed good agreement between disc diffusion and the reference method, except oxytetracycline and penicillin. When analyzed the methods agreement for each Moraxella species we found lower rates of agreement, as well as, more quantities of errors in M. bovis strains. The results of this study emphasize that M. bovis, M. bovoculi and M. ovis have a different antimicrobial susceptibility profile. / A ceratoconjuntivite infecciosa (CI), também conhecida como pinkeye , é uma doença ocular que acomete bovinos e ovinos. Em bovinos os micro-organismos envolvidos na CI são Moraxella bovis, Moraxella ovis e Moraxella bovoculi. Já em ovinos são Mycoplasma conjunctivae, Clamydia psittaci e M. ovis. A terapia antimicrobiana é amplamente utilizada para essa enfermidade, desta forma é imprescindível a realização de testes de suscetibilidade com a finalidade de escolher de forma prudente o fármaco a ser utilizado. Contudo, estudos sobre a suscetibilidade de M. bovis, M. bovoculi e M. ovis são escassos na literatura científica, sendo que no Brasil não existem trabalhos que descrevem o perfil de suscetibilidade de M. bovoculi e M. ovis. Testes de suscetibilidade para Moraxella spp. são determinados na rotina laboratorial pelo método de disco difusão, e, de forma geral, emprega-se o método de microdiluição em caldo com fins epidemiológicos, como caracterizar isolados de um surto ou de uma região específica. Neste contexto, esta dissertação objetivou determinar a suscetibilidade aos antimicrobianos de cepas de M. bovis, M. bovoculi e M. ovis, isoladas no Brasil, por meio dos métodos de microdiluição em caldo e disco difusão em ágar frente aos principais antimicrobianos utilizados no tratamento de CI e desta forma verificar diferenças nos perfis de suscetibilidade aos antimicrobianos das três espécies de Moraxella testadas. Também buscou-se avaliar a concordância entre o método de disco difusão em ágar e microdiluição em caldo. Amostras de M. bovis, M. bovoculi e M. ovis, oriundos de casos clínicos de CI, foram identificados por meio de análise morfo-tintorial e testes bioquímicos e a identificação das espécies foi realizada por análise molecular. Para determinar a concentração inibitória mínima (CIM) e a concentração bactericida mínima (CBM), obtidas no método de microdiluição em caldo e o diâmetro do halo de inibição obtido no método de disco difusão em ágar, foram utilizados os seguintes antimicrobianos: ampicilina, cefoperazona, ceftiofur, cloxacilina, enrofloxacina, florfenicol, gentamicina, neomicina, oxitetraciclina e penicilina. As cepas de Moraxella spp. foram sensíveis a maioria dos antimicrobianos testados. As CIM e CBM foram, de forma geral, superiores para as cepas de M. bovis quando comparadas com M. bovoculi e M. ovis. Para a maioria dos fármacos avaliados observou-se boa concordância entre o método teste e o método de referência, exceto para a oxitetraciclina e a penicilina. Ao analisar a concordância dos métodos em cada espécie de Moraxella verificou-se que as menores porcentagens, assim como as maiores quantidades de erros, foram encontradas para as cepas de M. bovis. Os resultados deste trabalho demonstram que M. bovis, M. bovoculi e M. ovis apresentam diferenças quanto ao perfil de suscetibilidade aos antimicrobianos.

Submitted by Vasti Diniz (vastijpa@hotmail.com) on 2017-09-08T14:21:13Z No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1859059 bytes, checksum: b132aa4cd1f20f233d8bac438414a9bc (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-08T14:21:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1859059 bytes, checksum: b132aa4cd1f20f233d8bac438414a9bc (MD5) Previous issue date: 2015-04-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The mutual ineffective for many antibiotics called multidrug resistance (MDR), has undermined the therapeutic value of existing antibacterial. With the identification and characterization of efflux systems that confer clinical resistance to antimicrobial, has emerged interest in developing a new class of agents enhancers the antibiotic action that act as inhibitors of efflux pumps, this are also called antibiotic activity modifiers or antibiotics adjuvantes. In this study, were evaluated synthetic guanylhydrazones derivatives as antibacterial and agents modulators of drug resistance in strains of Staphylococcus aureus. The bacterial strains used express the genes NorA, MrsA or TetK encoding proteins efflux for norfloxacin and ethidium bromide (NorA), erythromycin (MsrA) and tetracycline(TetK), respectively. The minimum inhibitory concentrations (MIC) values of the antibiotics and synthetic derivatives were determined in nutrient broth by the microdilution assay, and to evaluate the modulator activity, the MIC of antibiotics and ethidium bromide were determined in the absence and presence of subinibitory concentrations of guanylhydrazones. The compounds tested did not display relevant antibacterial activity for majority compounds at the concentrations tested, showing MIC ranging from (16 to > 256 μg/mL). When combined with the antibiotics tetracycline and erythromycin some compounds reduced their MIC 2-fold and 4-fold respectively. However, when combined with norfloxacin, except only one compound, all guanylhydrazones derivatives in different ratios and degrees of sensitivity, were able to potentiate the effect of this antibiotic, with three compounds which reduced its MIC 16-fold to norfloxacin, 32-fold to ethidium bromide and 8-fold for berberine used as positive controls for NorA pump. The molecular docking studies showed that both norfloxacin and compound 13 are recognized by the same binding site on the NorA pump, suggesting a competitive mechanism. The results presented here reported for the first time its great potential of guanylhydrazones derivatives to be putative inhibitors of bacterial efflux systems, especially for strains Staphylococcus aureus. / A ineficácia mútua para diversos antibióticos chamada de resistência múltipla as drogas (MDR), tem minado o valor terapêutico dos antibacterianos existentes. Com a identificação e caracterização de sistemas de efluxo que conferem resistência clínica aos antimicrobianos, tem surgido interesse no desenvolvimento de uma nova classe de agentes potenciadores da ação antibiótica que atuem como inibidores de bombas de efluxo, estes também são chamados de modificadores de atividade antibiótica ou adjuvantes de antibióticos. No presente trabalho, foram avaliados derivados sintéticos guanilhidrazônicos como antibacterianos e agentes moduladores da resistência à drogas em linhagens de Staphylococcus aureus. As linhagens bacterianas utilizadas expressam o gene norA, msrA ou tetK codificadores das proteínas de efluxo para norfloxacina e brometo de etídeo (NorA), eritromicina (MsrA) e tetraciclina (TetK), respectivamente. Foram determinadas por meio da técnica de microdiluição em caldo nutritivo os valores das concentrações inibitória mínima (CIM) dos antibióticos e dos derivados sintéticos, e para avaliar a atividade moduladora, as CIM dos antibióticos e do brometo de etídeo foram determinadas na ausência e na presença de concentrações subinibitórias dos compostos sintéticos. Os compostos ensaiados não mostraram atividade antibacteriana efetiva para a maioria dos compostos nas concentrações testadas, exibindo CIM variando entre (16 à >256 μg/mL). Quando combinados com os antibióticos tetraciclina e eritromicina alguns reduziram suas CIM em 2 e 4 vezes respectivamente. Entretanto quando combinado com norfloxacina, exceto apenas um composto, todos os derivados guanilhidrazônicos em diferentes proporções e graus de sensibilidade, foram capazes de potencializar o efeito deste antibiótico, apresentando três compostos que reduziram sua CIM até 16 vezes, 32 vezes para brometo de etídeo e 8 vezes para berberina usados como controles positivos para bomba NorA. Os estudos de docking molecular mostrou que tanto a norfloxacina quanto o composto 13 reconhecem o mesmo sítio de ligação na bomba NorA, sugerindo um mecanismo competitivo para atividade moduladora a drogas. Estes resultados aqui apresentados relatam pela primeira vez, o potencial de derivados guanilhidrazônicos em ser putativos inibidores dos sistemas de efluxo bacterianos, em especial para estirpes de Staphylococcus aureus.

Ventilator-associated pneumonia (VAP) is the most prevalent nosocomial infection in intensive care unit (ICU), associated with high mortality rate (14-70%). The objective of this study is evaluate the factors that influence the death of patients with VAP, especially bacterial resistance, prescription errors and de-escalation of antibiotics. Was developed a retrospective study in adult ICU of the Federal University of Uberlândia, which included 120 patients with VAP. We used the chi-square test for qualitative variables, the Student t test for quantitative variables and multiple logistic regression to determine the predictors of mortality.Was identified high mortality of VAP (35%), with a high rate of antimicrobial resistance. The de-escalation of antibiotics and the presence of resistant bacteria had no effect on mortality. The more frequent error prescription of antibiotics was the delay in the start of antibiotic (64.4%). Among the antibiotic prescription errors, patients using incorrect attack dose died 4 times more (P = 0.031) and who did not correction by renal function died 3 times more (P = 0.000). The multiple logistic regression analysis found that the incorrect adjustment for renal function was the only factor that interfered in mortality (1,803-42,531, R² de 0,469). In conclusion, antibiotic prescription errors influenced mortality of patients with VAP, stressing that adequate treatment of VAP is still a challenge that deserves to be continually reassessed, so that the expected clínical response to therapy be guaranteed. / A pneumonia associada à ventilação mecânica (PAV), é a infecção nosocomial mais prevalente na Unidade de Terapia Intensiva (UTI), associada a elevada taxa mortalidade (14-70%). O objetivo do estudo foi avaliar os fatores que influenciam o óbito dos pacientes com PAV, com destaque para à resistência bacteriana, descalonamento e erros de prescrição de antibióticos. Foi realizado estudo retrospectivo realizado na UTI de adultos da Universidade Federal de Uberlândia, em que foram incluídos 120 casos de PAV. Utilizou-se o teste do qui-quadrado para análise das variáveis qualitativas, o teste t de Student para variáveis quantitativas e a regressão logística múltipla para determinar os preditores de mortalidade. Foi identificado elevada mortalidade por PAV de 35% com alta taxa de resistência antimicrobiana. O descalonamento de antibióticos e a presença de bactérias resistentes não influenciaram na mortalidade. O principal erro de prescrição de antibióticos foi o atraso no inicio do antibiótico (66,6%). Dentre os erros de prescrição de antibióticos, os pacientes que utilizaram dose de ataque incorreta morreram 4 vezes mais (P=0,031) e os que não ajustaram pela função renal morreram 3 vezes mais (P=0,000). A análise de regressão logística múltipla constatou que o ajuste incorreto pela função renal foi o único fator que interferiu na mortalidade (1,803-42,531, R² de 0,469) . Em conclusão, os erros de prescrição de antibióticos influenciaram na mortalidade de pacientes com PAV, reforçando que tratamento adequado da PAV ainda é um desafio que merece ser continuamente reavaliado, para que a resposta clínica esperada com a terapêutica seja garantida. / Mestre em Ciências da Saúde

As infecções associadas aos cuidados de saúde constituem um problema grave nas unidades hospitalares bem como nos serviços de atendimento extra-hospitalares. Diferentemente de outros países, no Brasil, existe uma incidência alta dessas infecções causadas por microorganismos Gram-negativos produtores de β-lactamase de espectroestendido (ESBL). Estas enzimas hidrolisam compostos β-lactâmicos e são consideradas mundialmente como de importância clínica, pois a localização de seus genes emelementos móveis facilitam a transmissão cruzada. Este estudo foi realizado com amostras bacterianas isoladas de material clínico e de fezes de pacientes internados em um hospital da rede pública no Rio de Janeiro, Brasil. Estes pacientes estavam internados em duas unidades de terapia intensiva cardiológica, no período de janeiro a dezembro de 2007. O estudo teve por objetivo realizar a caracterização fenotípica e genotípica desses isolados associados à colonização ou infecção dos pacientes. Os testes fenotípicos e genotípicos foram realizados na Universidade do Estado do Rio de Janeiro e incluíram provas bioquímicas, teste de susceptibilidade, teste confirmatório para a expressão da produção da enzima ESBL e Reação de Polimerase em Cadeia (PCR) com iniciadores específicos para cinco genes: blaTEM, blaSHV, CTX-M1, Toho1 e AmpC. As espécies bactérianas mais frequentemente isoladas foram Escherichia coli (25%) e Klebsiella pneumoniae (30,56%), e os genes mais prevalentes foram blaTEM (41,6%), AMPC (41,6%) blaSHV (33,3%), CTX-M1 (25%), e Toho1 (19,44%). Identificamos em 25% das amostras enterobactérias que não eram E. coli, K. pneumoniae ou Proteus sp, com fenótipo para ESBL e a expressão dos mesmos genes, confirmando a necessidade de investigação nestes grupos microbianos. O substrato mais sensível para a expressão da área de sinergismo no Teste de Aproximação foi o ceftriaxone (80%). Identificamos também que 17% das amostras positivas para ESBL apresentaram co-produção para AmpC e 50% apresentaram mais de um gene para os iniciadores testados. A presença da carbapenemase foi avaliada em amostras bacterianas com susceptibilidade intermediária para ertapenem, através do Teste de Hodge modificado. Os achados do presente estudo caracterizaram a co-produção de AmpC e ESBL, bem como sugerem a necessidade da revisão e a ampliação dos métodos para a detecção de outros padrões de resistência na nossa Instituição. / Healthcare-associated infections are a major problem in hospital units as well as in units outside hospital, where procedures are performed. In Brazil, differently from other countries, a large proportion of these infections are caused by extended spectrum beta-lactamase (ESBL) producing Gram-negative microorganisms. These enzymes, which hydrolyse β-lactams, are considered of clinical importance worldwide. Their localization in genes that are located in móbile structures facilitate cross infection. This study was performed with bacterial isolates found in clinical specimens and faeces of patients hospitalized in a public hospital in the city of Rio de Janeiro, Brazil. These patients were in two different cardiological intensive care units from January till December 2007. The goal of the study was the phenotypic and genotypic characterization of the bacterial isolates which were associated with colonization or infection. Phenotypic and genotypic tests were performed in Universidade do Estado do Rio de Janeiro (Rio de Janeiro State University) and included biochemical tests, susceptibility tests, a comfirmatory test for the expression of ESBL, and polymerase chain reaction (PCR) with specific primers for five gentes : blaTEM, blaSHV, CTX-M1, Toho1 and AmpC. The most frequently isolated bactéria were Escherichia coli (25%) and Klebsiella pneumoniae (30,56%), and the most prevalent genes were blaTEM (41,6%), AMPC (41,6%) blaSHV (33,3%), CTX-M1 (25%), and Toho1 (19,44%). In 25% of samples we identified enterobacteria that were not E. coli, K. pneumoniae oor Proteus spp, but with the ESBL phenotype and the expression of the same genes, suggesting these microbes needed investigating. The most sensitive substrate for expressing synergism in the double-disk diffusion test was ceftriaxone (80%). We also identified that 17% of ESBL positive isolates showed co-production of AmpC and 50% showed more than one gene tested by PCR. The presence of carbapenemase was studied in bacterial isolates with intermediate susceptibility to ertapenem, by a modified Hodge test. The findings in the present study characterize the co-production of AmpC and ESBL, and suggest the need for reviewing detection methods used and possibly using other methods for the detection of other resistance patterns in our Institution.