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A reprodução em carrapatos e a avaliação de uma enzima de destaque neste processo como antígeno vacinal contra Rhipicephalus (Boophilus) microplus

Seixas, Adriana January 2008 (has links)
Os carrapatos estão distribuídos por todo mundo e impactam tanto a saúde animal quanto humana. A espécie Rhipicephalus (Boophilus) microplus é o principal parasita que afeta a bovinocultura nas regiões tropicais e subtropicais do globo, causando grandes prejuísos econômicos. Os métodos de controle estão baseados no uso de acaricidas químicos, o que resulta na seleção de populações resistentes e no risco de poluição do meio ambiente e dos alimentos. As vacinas têm-se mostrado um método de controle factível, e representam uma alternativa ao uso de acaricidas químicos. No entanto, dez anos após a disponibilização da primeira vacina comercial contra carrapatos, ainda não foi encontrada uma formulação capaz de alcançar a proteção necessária para dispensar o uso de agentes químicos. Sendo assim, estudar a biologia do parasita e conhecer mecanismos de importância fisiológica pode ser uma boa estratégia para encontrar moléculas alvo que possam ser usadas como antígenos no desenvovimento de uma vacina eficaz. Com este objetivo, nesta tese foi estudada a reprodução em carrapatos e avaliada a eficácia de uma enzima evolvida neste processo como antígeno vacinal. Foram abordados os processos de vitelogênese e de embriogênese. Em uma primeira etapa, usando carrapatos da espécie Amblyomma hebraeum como modelo, foi investigada a atuação do hormônio 20- hidroxiecdisona (20E) e de fatores adicionais, presentes na hemolinfa, na captação de vitelogenina (Vg) pelos oócitos. Neste trabalho, verificamos que existem diferentes estratégias de controle da captação de Vg pelo ovário nos carrapatos Ixodide, e que para que ocorra capatação de Vg pelos oócitos de A. hebraeum é necessaário um fator adicional presente na hemolinfa das fêmeas. Uma vez que o desenvolvimento do embrião depende da disponibilidade do material do vitelo estocado nos oócitos, a segunda parte da tese explorou uma cisteíno endopeptidase envolvida na degradação de vitelina (Vt) em ovos do carrapato R. microplus denominada Vitellin Degrading Cysteine endopeptidase (VTDCE). As enzimas da classe das cisteíno endopeptidases estão amplamente distribuidas nas fêmeas deste carrapato. Os estudos com VTDCE mostraram que esta é uma enzima de origem materna, com provável síntese extraovariana e transporte pela hemolinfa, até ser internalizada pelos oócitos. A VTDCE está presente durante todo o desenvolvimento embrionário, assim como em larvas. Interessantemente, esta cisteíno endopeptidase apresenta a propriedade de se associar a Vt por um outro sítio, além do sítio ativo. A VTDCE é a enzima mais eficiente na degradação de vitelina (Vt) em ovos de R. microplus, e devido a sua importância fisiológica, a VTDCE foi testada como antígeno em experimento de vacinação de bovinos e desafio com larvas de R. microplus. Os parâmetros mais afetados nos carrapatos alimentados em bovinos vacinados, com relação aos controles, foram o peso das fêmeas ingurgitadas (19,3 %) e a fertilidade dos ovos (17,6 %). Relacionado os parâmetros análisados, vimos que este antígeno confere uma proteção de 21% aos animais imunizados quando infestados por R. microplus. A proteção parcial alcançada pela VTDCE pode ser complementar a de outros antígenos no desenvolvimento de um coquetel antigênico contra carrapatos, uma vez que nenhum antígeno encontrado até o momento foi capaz de oferecer a proteção necessária para ser empregado individualmente na composição de uma vacina. Estudos como os realizados nesta tese contribuem para o melhor entendimento da biologia dos carrapatos, assim como para o desenvolvimento de novos e melhores métodos de controle desses parasitas. / Ticks are distributed worldwide impacting human and animal health. The cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus is the main parasite that affects livestock in tropical and subtropical regions of world, causing large economical losses. Tick control methods are based on the application of chemical acaricides, which has resulted in selection of resistant ticks and a potential risk of environmental pollution and food contamination. Vaccines have been shown to be a feasible tick control method that offers a cost-effective, environmentally friendly alternative to chemical control. However, ten years after the commercialization of the first vaccine against ticks, to identify tickprotective antigens remains a limiting step in the development of an efficient formulation that would avoid the use of chemical acaricides. In face of this situation, to study the parasite biology and understanding physiological important mechanisms could be a good strategy to find new targets to be used in an efficient vaccine. In order that, this thesis subject was to investigate the reproduction process in ticks and to evaluate the efficiency of an enzyme involved in this process as vaccinal antigen. The process of vitellogenesis and embryogenesis were studied. In the first part, using Amblyomma hebraeum ticks as model, the role of 20- hydroxiecdisone and additional hemolymph borne factors in vitellogenin (Vg) uptake by oocytes were investigated. Our findings showed that there are different strategies to control Vg uptake by ovary in Ixodide ticks. Additionally, for Vg uptake in A. hebraeum ovaries, a vitellogenin uptake factor (VUF) present in female hemolymph is required. As embryo development depends on the availability of yolk material stored into the oocytes, in the second part we studied a cysteine endopeptidase involved in Vt digestion in R. microplus eggs, named vitellin-degrading cysteine endopeptidase (VTDCE). Cysteine endopeptidase enzymes are widely distributed in these tick females. Studies with VTDCE demonstrate that it is a maternal derived endopeptidase involved in a route including extraovarian synthesis, transport, and ovary uptake, before internalization by oocytes. VTDCE is present during all tick development, as well as in larva. Interestingly, this cysteine endopeptidase is able to associate with Vt in another site than the active site. VTDCE showed to be the most efficient Vt hydrolytic enzyme in R. microplus eggs. So, supported by its physiological role, VTDCE was used as antigen in bovine vaccination and R. microplus challenge experiment. The most affected biological parameters in ticks fed on vaccinated animals were weight of engorged ticks (19.3 %), and egg fertility (17.6 %). Relating the biological parameters analyzed, bovine vaccination with VTDCE as antigen resulted in an overall protection of 21%. Therefore, this partial protection could be complementary in the formulation of an antigenic cocktail against tick, once there is not one single protein that achieves the protection level necessary for an efficient and practical vaccine development. Studies like that contribute to the better understanding of tick biology, as well as to the development of new and more efficient methods of control.
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Metaloproteases de carrapato : perspectiva de antígeno para vacina

Ali, Abid January 2014 (has links)
As metaloproteases (MPs) são proteínas que participam em diversos processos fisiológicos e patológicos. Neste trabalho, relatamos a identificação de MPs em três carrapatos de importância econômica: Ixodes persulcatus (Ip-MPs), Rhipicephalus sanguineus (Rs-MPs) e Rhipicephalus microplus (BrRm-MPs). O perfil transcricional em vários tecidos e fases de vida mostra que MPs são transcritas em glândula salivar durante a alimentação de fêmeas e não são transcritos no macho (com exceção de uma MP, BrRm-MP4) e ovos, o que sugere que esta família da proteínas são componentes funcionais necessários para interferir nas defesas do hospedeiro, apoiando o processo de hematofagia. A presença de um sítio de ligação de zinco, uma dobra“Met-turn” e um domínio rico em cisteína na região C-terminal indica que todas os transcritos obtidos codificam para a família de MPs reproplisina (metzincina). Uma das MPs de R. microplus (BrRm-MP4) foi selecionada para uma investigação mais aprofundada quanto ao potencial como um antígeno vacinal, devido ao seu padrão de transcrição ubíquos e devido àprevisão in silico de epítopos imunogênicos, em comparação com as demais MPs identificadas. BrRm-MP4 recombinante (rBrRm-MP4) foi expressa em Escherichia coli e testadas como um antígeno contra infestação de R. microplus. Imunoblot mostrou que o soro de bovinos imunizados com rBrRm-MP4 reconhece BrRm-MP4 da glândula salivar, ovário e larvas de R. microplus. Comparando com o controle, a vacinação com rBrRm-MP4 proporcionou uma redução de 43% no número de fêmeas adultas, redução de 14,80% na postura de ovos e redução de 17,53 % na capacidade de eclosão da larva, realizando um proteção total de 60% estatisticamente significativa. Os resultados indicam que rBrRm-MP4 é um potencial candidato a ser incluído como imunógeno em uma vacina anti-carrapato. / Metalloproteases (MPs) are proteins participating in several physiological and pathological processes. Here, we report the identification of MPs in three economically important ticks: Ixodes persulcatus (Ip-MPs), Rhipicephalus sanguineus (Rs-MPs) and Rhipicephalus microplus (BrRm-MPs). Transcriptional profile in various tissues and life stages revealed the presence of all MPs transcripts in salivary glands during feeding stages and absence in males (except one MP, BrRm-MP4) and eggs, suggesting this family proteins are functional components required to interfere with host defenses, supporting tick hematophagy. The presence of a zinc binding site, a “Met-turn” and C-terminal cysteine rich domain indicates all obtained transcripts encode for proteins belonging to the reproplysin (metzincin) family of MPs. A R. microplus MP (BrRm-MP4) was selected for further investigation concerning its potential as a vaccinal antigen due to its ubiquitous transcription pattern and in silico prediction of immunogenic epitopes, comparing to other obtained MPs. Recombinant BrRm-MP4 (rBrRm-MP4) was expressed in Escherichia coli and tested as an immune-protective antigen against R. microplus infestation. Immunoblot showed specific antibodies against rBrRm-MP4 in immunized calves sera. Sera from immunized calves recognized BrRm-MP4 in R. microplus salivary gland, ovary and larvae. Comparing to ticks reared non-vaccinated calves, rBrRm-MP4 provided 43% reduction in adult female number, 14.80% reduction in egg laying and 17.53% reduction in larva hatching capacity, performing an overall 60% statistically significant protection. We assume rBrRm-MP4 is a potential candidate to be included as immmunogen for further development in an anti-tick vaccine.
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Estudo do mecanismo de ação da atividade acaricida de Calea serrata (Asteraceae) em Rhipicephalus (Boophilus) microplus e da sua toxicidade em roedores

Ribeiro, Vera Lucia Sardá January 2012 (has links)
O extrato n-hexano de Calea serrata demonstrou atividade acaricida contra larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus e R. sanguineus. A enzima acetilcolinesterase (AChE), responsável por hidrolisar a acetilcolina nas sinapses colinérgicas, tem sido alvo de pesticidas e sua inibição pelos organofosforados levam à paralisia e morte de artrópodes. O uso intensivo de acaricidas / inseticidas tem provocado resistência em artrópodes, a qual pode estar relacionada com maior atividade de enzimas de detoxicação, como a glutationa-S-transferase (GST). O objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade acaricida do componente isolado do extrato n-hexano, o precoceno II, e do óleo essencial de C. serrata, assim como, determinar a composição química do referido óleo. Com intuito de compreender o mecanismo de ação acaricida do extrato n-hexano de C. serrata, foi investigado o efeito deste extrato sobre a atividade in vitro da AChE em larvas de R. microplus e em estruturas cerebrais de ratos Wistar machos, bem como sobre a modulação da atividade da GST em larvas de R. microplus. O óleo essencial e o precoceno II, o composto isolado, mostraram atividade larvicida. O óleo essencial apresentou diferentes sesquiterpenos em sua constituição química, além de precoceno II. O extrato nhexano de C. serrata inibiu significativamente a atividade in vitro da AChE em larvas de R. microplus e em estruturas cerebrais de ratos. O extrato n-hexano de C. serrata inibiu significativamente a atividade in vitro da GST. Compostos do extrato n-hexano de C. serrata podem ser potenciais inibidores de AChE e de GST, os quais podem contribuir para a sua toxicidade para os carrapatos. Considerando que o aumento da atividade da GST poderia reduzir a eficiência de carrapaticidas, é possível supor que C. serrata possa ser usada como um adjuvante no controle de R. microplus. Os resultados obtidos também suportam a possibilidade de que a inibição da acetilcolinesterase seja um possível mecanismo de ação do extrato n-hexano de C. serrata. / It has been demonstrated that the n-hexane extract of Calea serrata had acaricidal activity against larvae of R. microplus and R. sanguineus. Acetylcholinesterase (AChE), an enzyme that hydrolyses acetylcholine at cholinergic synapses, is a target for pesticides and its inhibition by organophosphates leads to paralysis and death of arthropods. Extensive uses of acaricides/inseticides have induced resistance in arthropods, which can be related to higher activity of detoxification enzymes, such as glutathione-S-transferase (GST).The aims of the present study were to evaluate the acaricide activity of isolated constituent of n-hexane extract, the precocene II, and the essential oil of C.serrata, in addition to determine the chemical composition of essential oil. In order to understand the mechanism of the acaricidal action of C. serrata n-hexane extract, we investigated the effect of this extract on in vitro anticholinesterase activity of larvae from R. microplus and in brain structures of male Wistar rats, as well as, we investigated the effect of C. serrata on GST activity of larvae from R. microplus.The essential oil and the isolated compound, precocene II, showed larvicidal action. Several sesquiterpenes were detected in the essential oil of C. serrata. The n-hexane extract significantly inhibited in vitro acetylcholinesterase activity in R. microplus larvae and rat brain structures. The n-hexane extract of C. serrata inhibited significantly GST activity. Compounds of n-hexane extract from C. serrata may be potential inhibitors of AChE and GST, which may contribute to its tick toxicity. Considering that higher GST activities would reduce the efficiency of the pesticides, we can also suppose that C. serrata may be at least used as an adjuvant in tick control. The results support that inhibition of acetylcholinesterase is a possible mechanism of action of hexane extract at C. serrata.
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Atividade anticoagulante da catepsina L-like protease BmCL1 do carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus

Xavier, Marina Amaral January 2016 (has links)
Introdução: Rhipicephalus microplus é um parasito importante na bovinocultura. Novas estratégias de controle dependem de um maior entendimento da sua fisiologia e da relação parasito-hospedeiro, e moléculas envolvidas na aquisição e digestão de sangue são alvos interessantes. Objetivo: determinar o mecanismo de ação do inibidor de coagulação BmGTI (Boophilus microplus Midgut Thrombin Inhibitor). Metodologia: BmGTI foi obtido a partir do homogenato de intestino de fêmeas de R. microplus parcialmente ingurgitadas utilizando técnicas de cromatografia de troca iônica, gel filtração e afinidade por trombina. A atividade inibitória foi monitorada pelo ensaio de coagulação do fibrinogênio induzida por trombina. A preparação de BmGTI foi avaliada por SDS-PAGE e analisada por LC-MS/MS. A provável ORF de BmGTI foi clonada no plasmídeo pPIC9, expressa em Pichia pastoris e purificada. Diferentes razões molares de trombina:rBmGTI foram examinadas para atividade inibitória de trombina sobre a clivagem do fibrinogênio em pH 7,5. E64 foi usado para bloquear o sítio ativo de rBmGTI e o ensaio de inibição foi realizado. Diferentes razões molares de trombina:rBmGTI foram incubadas e analisadas por SDS-PAGE para verificar interações entre as proteases. A atividade de rBmGTI sobre o fibrinogênio foi analisada pela incubação de ambos. Resultados e Discussão: Baseado na m/z dos fragmentos trípticos de BmGTI sua sequência foi identificada como BmCL1, uma catepsina Llike protease ativa em pH ácido, mas sem capacidade de hidrolisar substrato sintético em pH ≥7,0. rBmCL1/BmGTI foi expressa em P. pastoris como próenzima e após ativação, a enzima foi purificada. Diferentes razões molares de trombina:rBmCL1/BmGTI foram ensaiadas; quando a concentração de rBmCL1/BmGTI estava 64 vezes maior do que a de trombina, esta apresentou atividade residual de 37%. Quando rBmCL1/BmGTI teve seu sítio ativo bloqueado por E64, não houve inibição da atividade de trombina sobre fibrinogênio. A análise do fibrinogênio por SDS-PAGE, após incubação com rBmCL1/BmGTI, mostrou que as cadeias α e β do fibrinogênio são hidrolisadas. Conclusão: A partir destes resultados, concluímos que BmGTI inibe a coagulação sanguínea pela hidrólise das cadeias α e β do fibrinogênio. / Introduction: Rhipicephalus microplus is an important parasite of cattle. New strategies for control depend on a better knowledge of its physiology and hostparasite relationship, and molecules involved in acquisition and digestion of blood meal are interesting targets. Objectives: to determine how BmGTI (Boophilus microplus Midgut Thrombin Inhibitor) inhibits coagulation. Materials and Methods: BmGTI was obtained from partially engorged females midguts homogenate through ion exchange, size exclusion and thrombin-affinity chromatographies. Thrombin inhibition activity was measured by thrombin-induced fibrinogen clotting assay. BmGTI preparation was checked by SDS-PAGE and analyzed by LCMS/ MS. BmGTI putative ORF was cloned in pPIC9 plasmid, expressed in Pichia pastoris and purified. Different molar ratios of thrombin:BmGTI were examined for inhibitory activity of thrombin upon fibrinogen cleavage at pH 7.5. E64 was used to block BmGTI active site and inhibitory activity was assayed. Different molar ratio of thrombin:BmGTI were incubated and analyzed by SDS-PAGE to verify proteaseinhibitor interactions. BmGTI direct activity upon fibrinogen was analyzed after incubation by SDS-PAGE. Results and Discussion: Based on m/z of the BmGTI tryptic fragments it was identified as BmCL1, a cathepsin L-like proteinase active at acidic pH, but unable to hydrolyze synthetic substrate at pH ≥7.0. BmCL1/BmGTI was expressed in P. pastoris as pro-enzyme and after activation the enzyme was purified. Different molar ratios of thrombin:rBmCL1/BmGTI were assayed, and when rBmCL1/BmGTI concentration was 64-fold higher than thrombin concentration, this enzyme residual activity was 37%. When rBmCL1/BmGTI has its active site blocked with E-64, it was unable to inhibit thrombin activity upon fibrinogen. Analysis by SDS-PAGE of fibrinogen after incubation with rBmCL1/BmGTI showed that fibrinogen chains α and β were hydrolyzed. Conclusion: Based on these results, we concluded that rBmGTI/BmCL1 inhibits blood coagulation through hydrolyzes of fibrinogen chain- α and β.
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Metaloproteases de carrapato : perspectiva de antígeno para vacina

Ali, Abid January 2014 (has links)
As metaloproteases (MPs) são proteínas que participam em diversos processos fisiológicos e patológicos. Neste trabalho, relatamos a identificação de MPs em três carrapatos de importância econômica: Ixodes persulcatus (Ip-MPs), Rhipicephalus sanguineus (Rs-MPs) e Rhipicephalus microplus (BrRm-MPs). O perfil transcricional em vários tecidos e fases de vida mostra que MPs são transcritas em glândula salivar durante a alimentação de fêmeas e não são transcritos no macho (com exceção de uma MP, BrRm-MP4) e ovos, o que sugere que esta família da proteínas são componentes funcionais necessários para interferir nas defesas do hospedeiro, apoiando o processo de hematofagia. A presença de um sítio de ligação de zinco, uma dobra“Met-turn” e um domínio rico em cisteína na região C-terminal indica que todas os transcritos obtidos codificam para a família de MPs reproplisina (metzincina). Uma das MPs de R. microplus (BrRm-MP4) foi selecionada para uma investigação mais aprofundada quanto ao potencial como um antígeno vacinal, devido ao seu padrão de transcrição ubíquos e devido àprevisão in silico de epítopos imunogênicos, em comparação com as demais MPs identificadas. BrRm-MP4 recombinante (rBrRm-MP4) foi expressa em Escherichia coli e testadas como um antígeno contra infestação de R. microplus. Imunoblot mostrou que o soro de bovinos imunizados com rBrRm-MP4 reconhece BrRm-MP4 da glândula salivar, ovário e larvas de R. microplus. Comparando com o controle, a vacinação com rBrRm-MP4 proporcionou uma redução de 43% no número de fêmeas adultas, redução de 14,80% na postura de ovos e redução de 17,53 % na capacidade de eclosão da larva, realizando um proteção total de 60% estatisticamente significativa. Os resultados indicam que rBrRm-MP4 é um potencial candidato a ser incluído como imunógeno em uma vacina anti-carrapato. / Metalloproteases (MPs) are proteins participating in several physiological and pathological processes. Here, we report the identification of MPs in three economically important ticks: Ixodes persulcatus (Ip-MPs), Rhipicephalus sanguineus (Rs-MPs) and Rhipicephalus microplus (BrRm-MPs). Transcriptional profile in various tissues and life stages revealed the presence of all MPs transcripts in salivary glands during feeding stages and absence in males (except one MP, BrRm-MP4) and eggs, suggesting this family proteins are functional components required to interfere with host defenses, supporting tick hematophagy. The presence of a zinc binding site, a “Met-turn” and C-terminal cysteine rich domain indicates all obtained transcripts encode for proteins belonging to the reproplysin (metzincin) family of MPs. A R. microplus MP (BrRm-MP4) was selected for further investigation concerning its potential as a vaccinal antigen due to its ubiquitous transcription pattern and in silico prediction of immunogenic epitopes, comparing to other obtained MPs. Recombinant BrRm-MP4 (rBrRm-MP4) was expressed in Escherichia coli and tested as an immune-protective antigen against R. microplus infestation. Immunoblot showed specific antibodies against rBrRm-MP4 in immunized calves sera. Sera from immunized calves recognized BrRm-MP4 in R. microplus salivary gland, ovary and larvae. Comparing to ticks reared non-vaccinated calves, rBrRm-MP4 provided 43% reduction in adult female number, 14.80% reduction in egg laying and 17.53% reduction in larva hatching capacity, performing an overall 60% statistically significant protection. We assume rBrRm-MP4 is a potential candidate to be included as immmunogen for further development in an anti-tick vaccine.
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Estudo do mecanismo de ação da atividade acaricida de Calea serrata (Asteraceae) em Rhipicephalus (Boophilus) microplus e da sua toxicidade em roedores

Ribeiro, Vera Lucia Sardá January 2012 (has links)
O extrato n-hexano de Calea serrata demonstrou atividade acaricida contra larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus e R. sanguineus. A enzima acetilcolinesterase (AChE), responsável por hidrolisar a acetilcolina nas sinapses colinérgicas, tem sido alvo de pesticidas e sua inibição pelos organofosforados levam à paralisia e morte de artrópodes. O uso intensivo de acaricidas / inseticidas tem provocado resistência em artrópodes, a qual pode estar relacionada com maior atividade de enzimas de detoxicação, como a glutationa-S-transferase (GST). O objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade acaricida do componente isolado do extrato n-hexano, o precoceno II, e do óleo essencial de C. serrata, assim como, determinar a composição química do referido óleo. Com intuito de compreender o mecanismo de ação acaricida do extrato n-hexano de C. serrata, foi investigado o efeito deste extrato sobre a atividade in vitro da AChE em larvas de R. microplus e em estruturas cerebrais de ratos Wistar machos, bem como sobre a modulação da atividade da GST em larvas de R. microplus. O óleo essencial e o precoceno II, o composto isolado, mostraram atividade larvicida. O óleo essencial apresentou diferentes sesquiterpenos em sua constituição química, além de precoceno II. O extrato nhexano de C. serrata inibiu significativamente a atividade in vitro da AChE em larvas de R. microplus e em estruturas cerebrais de ratos. O extrato n-hexano de C. serrata inibiu significativamente a atividade in vitro da GST. Compostos do extrato n-hexano de C. serrata podem ser potenciais inibidores de AChE e de GST, os quais podem contribuir para a sua toxicidade para os carrapatos. Considerando que o aumento da atividade da GST poderia reduzir a eficiência de carrapaticidas, é possível supor que C. serrata possa ser usada como um adjuvante no controle de R. microplus. Os resultados obtidos também suportam a possibilidade de que a inibição da acetilcolinesterase seja um possível mecanismo de ação do extrato n-hexano de C. serrata. / It has been demonstrated that the n-hexane extract of Calea serrata had acaricidal activity against larvae of R. microplus and R. sanguineus. Acetylcholinesterase (AChE), an enzyme that hydrolyses acetylcholine at cholinergic synapses, is a target for pesticides and its inhibition by organophosphates leads to paralysis and death of arthropods. Extensive uses of acaricides/inseticides have induced resistance in arthropods, which can be related to higher activity of detoxification enzymes, such as glutathione-S-transferase (GST).The aims of the present study were to evaluate the acaricide activity of isolated constituent of n-hexane extract, the precocene II, and the essential oil of C.serrata, in addition to determine the chemical composition of essential oil. In order to understand the mechanism of the acaricidal action of C. serrata n-hexane extract, we investigated the effect of this extract on in vitro anticholinesterase activity of larvae from R. microplus and in brain structures of male Wistar rats, as well as, we investigated the effect of C. serrata on GST activity of larvae from R. microplus.The essential oil and the isolated compound, precocene II, showed larvicidal action. Several sesquiterpenes were detected in the essential oil of C. serrata. The n-hexane extract significantly inhibited in vitro acetylcholinesterase activity in R. microplus larvae and rat brain structures. The n-hexane extract of C. serrata inhibited significantly GST activity. Compounds of n-hexane extract from C. serrata may be potential inhibitors of AChE and GST, which may contribute to its tick toxicity. Considering that higher GST activities would reduce the efficiency of the pesticides, we can also suppose that C. serrata may be at least used as an adjuvant in tick control. The results support that inhibition of acetylcholinesterase is a possible mechanism of action of hexane extract at C. serrata.
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A reprodução em carrapatos e a avaliação de uma enzima de destaque neste processo como antígeno vacinal contra Rhipicephalus (Boophilus) microplus

Seixas, Adriana January 2008 (has links)
Os carrapatos estão distribuídos por todo mundo e impactam tanto a saúde animal quanto humana. A espécie Rhipicephalus (Boophilus) microplus é o principal parasita que afeta a bovinocultura nas regiões tropicais e subtropicais do globo, causando grandes prejuísos econômicos. Os métodos de controle estão baseados no uso de acaricidas químicos, o que resulta na seleção de populações resistentes e no risco de poluição do meio ambiente e dos alimentos. As vacinas têm-se mostrado um método de controle factível, e representam uma alternativa ao uso de acaricidas químicos. No entanto, dez anos após a disponibilização da primeira vacina comercial contra carrapatos, ainda não foi encontrada uma formulação capaz de alcançar a proteção necessária para dispensar o uso de agentes químicos. Sendo assim, estudar a biologia do parasita e conhecer mecanismos de importância fisiológica pode ser uma boa estratégia para encontrar moléculas alvo que possam ser usadas como antígenos no desenvovimento de uma vacina eficaz. Com este objetivo, nesta tese foi estudada a reprodução em carrapatos e avaliada a eficácia de uma enzima evolvida neste processo como antígeno vacinal. Foram abordados os processos de vitelogênese e de embriogênese. Em uma primeira etapa, usando carrapatos da espécie Amblyomma hebraeum como modelo, foi investigada a atuação do hormônio 20- hidroxiecdisona (20E) e de fatores adicionais, presentes na hemolinfa, na captação de vitelogenina (Vg) pelos oócitos. Neste trabalho, verificamos que existem diferentes estratégias de controle da captação de Vg pelo ovário nos carrapatos Ixodide, e que para que ocorra capatação de Vg pelos oócitos de A. hebraeum é necessaário um fator adicional presente na hemolinfa das fêmeas. Uma vez que o desenvolvimento do embrião depende da disponibilidade do material do vitelo estocado nos oócitos, a segunda parte da tese explorou uma cisteíno endopeptidase envolvida na degradação de vitelina (Vt) em ovos do carrapato R. microplus denominada Vitellin Degrading Cysteine endopeptidase (VTDCE). As enzimas da classe das cisteíno endopeptidases estão amplamente distribuidas nas fêmeas deste carrapato. Os estudos com VTDCE mostraram que esta é uma enzima de origem materna, com provável síntese extraovariana e transporte pela hemolinfa, até ser internalizada pelos oócitos. A VTDCE está presente durante todo o desenvolvimento embrionário, assim como em larvas. Interessantemente, esta cisteíno endopeptidase apresenta a propriedade de se associar a Vt por um outro sítio, além do sítio ativo. A VTDCE é a enzima mais eficiente na degradação de vitelina (Vt) em ovos de R. microplus, e devido a sua importância fisiológica, a VTDCE foi testada como antígeno em experimento de vacinação de bovinos e desafio com larvas de R. microplus. Os parâmetros mais afetados nos carrapatos alimentados em bovinos vacinados, com relação aos controles, foram o peso das fêmeas ingurgitadas (19,3 %) e a fertilidade dos ovos (17,6 %). Relacionado os parâmetros análisados, vimos que este antígeno confere uma proteção de 21% aos animais imunizados quando infestados por R. microplus. A proteção parcial alcançada pela VTDCE pode ser complementar a de outros antígenos no desenvolvimento de um coquetel antigênico contra carrapatos, uma vez que nenhum antígeno encontrado até o momento foi capaz de oferecer a proteção necessária para ser empregado individualmente na composição de uma vacina. Estudos como os realizados nesta tese contribuem para o melhor entendimento da biologia dos carrapatos, assim como para o desenvolvimento de novos e melhores métodos de controle desses parasitas. / Ticks are distributed worldwide impacting human and animal health. The cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus is the main parasite that affects livestock in tropical and subtropical regions of world, causing large economical losses. Tick control methods are based on the application of chemical acaricides, which has resulted in selection of resistant ticks and a potential risk of environmental pollution and food contamination. Vaccines have been shown to be a feasible tick control method that offers a cost-effective, environmentally friendly alternative to chemical control. However, ten years after the commercialization of the first vaccine against ticks, to identify tickprotective antigens remains a limiting step in the development of an efficient formulation that would avoid the use of chemical acaricides. In face of this situation, to study the parasite biology and understanding physiological important mechanisms could be a good strategy to find new targets to be used in an efficient vaccine. In order that, this thesis subject was to investigate the reproduction process in ticks and to evaluate the efficiency of an enzyme involved in this process as vaccinal antigen. The process of vitellogenesis and embryogenesis were studied. In the first part, using Amblyomma hebraeum ticks as model, the role of 20- hydroxiecdisone and additional hemolymph borne factors in vitellogenin (Vg) uptake by oocytes were investigated. Our findings showed that there are different strategies to control Vg uptake by ovary in Ixodide ticks. Additionally, for Vg uptake in A. hebraeum ovaries, a vitellogenin uptake factor (VUF) present in female hemolymph is required. As embryo development depends on the availability of yolk material stored into the oocytes, in the second part we studied a cysteine endopeptidase involved in Vt digestion in R. microplus eggs, named vitellin-degrading cysteine endopeptidase (VTDCE). Cysteine endopeptidase enzymes are widely distributed in these tick females. Studies with VTDCE demonstrate that it is a maternal derived endopeptidase involved in a route including extraovarian synthesis, transport, and ovary uptake, before internalization by oocytes. VTDCE is present during all tick development, as well as in larva. Interestingly, this cysteine endopeptidase is able to associate with Vt in another site than the active site. VTDCE showed to be the most efficient Vt hydrolytic enzyme in R. microplus eggs. So, supported by its physiological role, VTDCE was used as antigen in bovine vaccination and R. microplus challenge experiment. The most affected biological parameters in ticks fed on vaccinated animals were weight of engorged ticks (19.3 %), and egg fertility (17.6 %). Relating the biological parameters analyzed, bovine vaccination with VTDCE as antigen resulted in an overall protection of 21%. Therefore, this partial protection could be complementary in the formulation of an antigenic cocktail against tick, once there is not one single protein that achieves the protection level necessary for an efficient and practical vaccine development. Studies like that contribute to the better understanding of tick biology, as well as to the development of new and more efficient methods of control.
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Atividade anticoagulante da catepsina L-like protease BmCL1 do carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus

Xavier, Marina Amaral January 2016 (has links)
Introdução: Rhipicephalus microplus é um parasito importante na bovinocultura. Novas estratégias de controle dependem de um maior entendimento da sua fisiologia e da relação parasito-hospedeiro, e moléculas envolvidas na aquisição e digestão de sangue são alvos interessantes. Objetivo: determinar o mecanismo de ação do inibidor de coagulação BmGTI (Boophilus microplus Midgut Thrombin Inhibitor). Metodologia: BmGTI foi obtido a partir do homogenato de intestino de fêmeas de R. microplus parcialmente ingurgitadas utilizando técnicas de cromatografia de troca iônica, gel filtração e afinidade por trombina. A atividade inibitória foi monitorada pelo ensaio de coagulação do fibrinogênio induzida por trombina. A preparação de BmGTI foi avaliada por SDS-PAGE e analisada por LC-MS/MS. A provável ORF de BmGTI foi clonada no plasmídeo pPIC9, expressa em Pichia pastoris e purificada. Diferentes razões molares de trombina:rBmGTI foram examinadas para atividade inibitória de trombina sobre a clivagem do fibrinogênio em pH 7,5. E64 foi usado para bloquear o sítio ativo de rBmGTI e o ensaio de inibição foi realizado. Diferentes razões molares de trombina:rBmGTI foram incubadas e analisadas por SDS-PAGE para verificar interações entre as proteases. A atividade de rBmGTI sobre o fibrinogênio foi analisada pela incubação de ambos. Resultados e Discussão: Baseado na m/z dos fragmentos trípticos de BmGTI sua sequência foi identificada como BmCL1, uma catepsina Llike protease ativa em pH ácido, mas sem capacidade de hidrolisar substrato sintético em pH ≥7,0. rBmCL1/BmGTI foi expressa em P. pastoris como próenzima e após ativação, a enzima foi purificada. Diferentes razões molares de trombina:rBmCL1/BmGTI foram ensaiadas; quando a concentração de rBmCL1/BmGTI estava 64 vezes maior do que a de trombina, esta apresentou atividade residual de 37%. Quando rBmCL1/BmGTI teve seu sítio ativo bloqueado por E64, não houve inibição da atividade de trombina sobre fibrinogênio. A análise do fibrinogênio por SDS-PAGE, após incubação com rBmCL1/BmGTI, mostrou que as cadeias α e β do fibrinogênio são hidrolisadas. Conclusão: A partir destes resultados, concluímos que BmGTI inibe a coagulação sanguínea pela hidrólise das cadeias α e β do fibrinogênio. / Introduction: Rhipicephalus microplus is an important parasite of cattle. New strategies for control depend on a better knowledge of its physiology and hostparasite relationship, and molecules involved in acquisition and digestion of blood meal are interesting targets. Objectives: to determine how BmGTI (Boophilus microplus Midgut Thrombin Inhibitor) inhibits coagulation. Materials and Methods: BmGTI was obtained from partially engorged females midguts homogenate through ion exchange, size exclusion and thrombin-affinity chromatographies. Thrombin inhibition activity was measured by thrombin-induced fibrinogen clotting assay. BmGTI preparation was checked by SDS-PAGE and analyzed by LCMS/ MS. BmGTI putative ORF was cloned in pPIC9 plasmid, expressed in Pichia pastoris and purified. Different molar ratios of thrombin:BmGTI were examined for inhibitory activity of thrombin upon fibrinogen cleavage at pH 7.5. E64 was used to block BmGTI active site and inhibitory activity was assayed. Different molar ratio of thrombin:BmGTI were incubated and analyzed by SDS-PAGE to verify proteaseinhibitor interactions. BmGTI direct activity upon fibrinogen was analyzed after incubation by SDS-PAGE. Results and Discussion: Based on m/z of the BmGTI tryptic fragments it was identified as BmCL1, a cathepsin L-like proteinase active at acidic pH, but unable to hydrolyze synthetic substrate at pH ≥7.0. BmCL1/BmGTI was expressed in P. pastoris as pro-enzyme and after activation the enzyme was purified. Different molar ratios of thrombin:rBmCL1/BmGTI were assayed, and when rBmCL1/BmGTI concentration was 64-fold higher than thrombin concentration, this enzyme residual activity was 37%. When rBmCL1/BmGTI has its active site blocked with E-64, it was unable to inhibit thrombin activity upon fibrinogen. Analysis by SDS-PAGE of fibrinogen after incubation with rBmCL1/BmGTI showed that fibrinogen chains α and β were hydrolyzed. Conclusion: Based on these results, we concluded that rBmGTI/BmCL1 inhibits blood coagulation through hydrolyzes of fibrinogen chain- α and β.
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Atividade anticoagulante da catepsina L-like protease BmCL1 do carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus

Xavier, Marina Amaral January 2016 (has links)
Introdução: Rhipicephalus microplus é um parasito importante na bovinocultura. Novas estratégias de controle dependem de um maior entendimento da sua fisiologia e da relação parasito-hospedeiro, e moléculas envolvidas na aquisição e digestão de sangue são alvos interessantes. Objetivo: determinar o mecanismo de ação do inibidor de coagulação BmGTI (Boophilus microplus Midgut Thrombin Inhibitor). Metodologia: BmGTI foi obtido a partir do homogenato de intestino de fêmeas de R. microplus parcialmente ingurgitadas utilizando técnicas de cromatografia de troca iônica, gel filtração e afinidade por trombina. A atividade inibitória foi monitorada pelo ensaio de coagulação do fibrinogênio induzida por trombina. A preparação de BmGTI foi avaliada por SDS-PAGE e analisada por LC-MS/MS. A provável ORF de BmGTI foi clonada no plasmídeo pPIC9, expressa em Pichia pastoris e purificada. Diferentes razões molares de trombina:rBmGTI foram examinadas para atividade inibitória de trombina sobre a clivagem do fibrinogênio em pH 7,5. E64 foi usado para bloquear o sítio ativo de rBmGTI e o ensaio de inibição foi realizado. Diferentes razões molares de trombina:rBmGTI foram incubadas e analisadas por SDS-PAGE para verificar interações entre as proteases. A atividade de rBmGTI sobre o fibrinogênio foi analisada pela incubação de ambos. Resultados e Discussão: Baseado na m/z dos fragmentos trípticos de BmGTI sua sequência foi identificada como BmCL1, uma catepsina Llike protease ativa em pH ácido, mas sem capacidade de hidrolisar substrato sintético em pH ≥7,0. rBmCL1/BmGTI foi expressa em P. pastoris como próenzima e após ativação, a enzima foi purificada. Diferentes razões molares de trombina:rBmCL1/BmGTI foram ensaiadas; quando a concentração de rBmCL1/BmGTI estava 64 vezes maior do que a de trombina, esta apresentou atividade residual de 37%. Quando rBmCL1/BmGTI teve seu sítio ativo bloqueado por E64, não houve inibição da atividade de trombina sobre fibrinogênio. A análise do fibrinogênio por SDS-PAGE, após incubação com rBmCL1/BmGTI, mostrou que as cadeias α e β do fibrinogênio são hidrolisadas. Conclusão: A partir destes resultados, concluímos que BmGTI inibe a coagulação sanguínea pela hidrólise das cadeias α e β do fibrinogênio. / Introduction: Rhipicephalus microplus is an important parasite of cattle. New strategies for control depend on a better knowledge of its physiology and hostparasite relationship, and molecules involved in acquisition and digestion of blood meal are interesting targets. Objectives: to determine how BmGTI (Boophilus microplus Midgut Thrombin Inhibitor) inhibits coagulation. Materials and Methods: BmGTI was obtained from partially engorged females midguts homogenate through ion exchange, size exclusion and thrombin-affinity chromatographies. Thrombin inhibition activity was measured by thrombin-induced fibrinogen clotting assay. BmGTI preparation was checked by SDS-PAGE and analyzed by LCMS/ MS. BmGTI putative ORF was cloned in pPIC9 plasmid, expressed in Pichia pastoris and purified. Different molar ratios of thrombin:BmGTI were examined for inhibitory activity of thrombin upon fibrinogen cleavage at pH 7.5. E64 was used to block BmGTI active site and inhibitory activity was assayed. Different molar ratio of thrombin:BmGTI were incubated and analyzed by SDS-PAGE to verify proteaseinhibitor interactions. BmGTI direct activity upon fibrinogen was analyzed after incubation by SDS-PAGE. Results and Discussion: Based on m/z of the BmGTI tryptic fragments it was identified as BmCL1, a cathepsin L-like proteinase active at acidic pH, but unable to hydrolyze synthetic substrate at pH ≥7.0. BmCL1/BmGTI was expressed in P. pastoris as pro-enzyme and after activation the enzyme was purified. Different molar ratios of thrombin:rBmCL1/BmGTI were assayed, and when rBmCL1/BmGTI concentration was 64-fold higher than thrombin concentration, this enzyme residual activity was 37%. When rBmCL1/BmGTI has its active site blocked with E-64, it was unable to inhibit thrombin activity upon fibrinogen. Analysis by SDS-PAGE of fibrinogen after incubation with rBmCL1/BmGTI showed that fibrinogen chains α and β were hydrolyzed. Conclusion: Based on these results, we concluded that rBmGTI/BmCL1 inhibits blood coagulation through hydrolyzes of fibrinogen chain- α and β.
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Metaloproteases de carrapato : perspectiva de antígeno para vacina

Ali, Abid January 2014 (has links)
As metaloproteases (MPs) são proteínas que participam em diversos processos fisiológicos e patológicos. Neste trabalho, relatamos a identificação de MPs em três carrapatos de importância econômica: Ixodes persulcatus (Ip-MPs), Rhipicephalus sanguineus (Rs-MPs) e Rhipicephalus microplus (BrRm-MPs). O perfil transcricional em vários tecidos e fases de vida mostra que MPs são transcritas em glândula salivar durante a alimentação de fêmeas e não são transcritos no macho (com exceção de uma MP, BrRm-MP4) e ovos, o que sugere que esta família da proteínas são componentes funcionais necessários para interferir nas defesas do hospedeiro, apoiando o processo de hematofagia. A presença de um sítio de ligação de zinco, uma dobra“Met-turn” e um domínio rico em cisteína na região C-terminal indica que todas os transcritos obtidos codificam para a família de MPs reproplisina (metzincina). Uma das MPs de R. microplus (BrRm-MP4) foi selecionada para uma investigação mais aprofundada quanto ao potencial como um antígeno vacinal, devido ao seu padrão de transcrição ubíquos e devido àprevisão in silico de epítopos imunogênicos, em comparação com as demais MPs identificadas. BrRm-MP4 recombinante (rBrRm-MP4) foi expressa em Escherichia coli e testadas como um antígeno contra infestação de R. microplus. Imunoblot mostrou que o soro de bovinos imunizados com rBrRm-MP4 reconhece BrRm-MP4 da glândula salivar, ovário e larvas de R. microplus. Comparando com o controle, a vacinação com rBrRm-MP4 proporcionou uma redução de 43% no número de fêmeas adultas, redução de 14,80% na postura de ovos e redução de 17,53 % na capacidade de eclosão da larva, realizando um proteção total de 60% estatisticamente significativa. Os resultados indicam que rBrRm-MP4 é um potencial candidato a ser incluído como imunógeno em uma vacina anti-carrapato. / Metalloproteases (MPs) are proteins participating in several physiological and pathological processes. Here, we report the identification of MPs in three economically important ticks: Ixodes persulcatus (Ip-MPs), Rhipicephalus sanguineus (Rs-MPs) and Rhipicephalus microplus (BrRm-MPs). Transcriptional profile in various tissues and life stages revealed the presence of all MPs transcripts in salivary glands during feeding stages and absence in males (except one MP, BrRm-MP4) and eggs, suggesting this family proteins are functional components required to interfere with host defenses, supporting tick hematophagy. The presence of a zinc binding site, a “Met-turn” and C-terminal cysteine rich domain indicates all obtained transcripts encode for proteins belonging to the reproplysin (metzincin) family of MPs. A R. microplus MP (BrRm-MP4) was selected for further investigation concerning its potential as a vaccinal antigen due to its ubiquitous transcription pattern and in silico prediction of immunogenic epitopes, comparing to other obtained MPs. Recombinant BrRm-MP4 (rBrRm-MP4) was expressed in Escherichia coli and tested as an immune-protective antigen against R. microplus infestation. Immunoblot showed specific antibodies against rBrRm-MP4 in immunized calves sera. Sera from immunized calves recognized BrRm-MP4 in R. microplus salivary gland, ovary and larvae. Comparing to ticks reared non-vaccinated calves, rBrRm-MP4 provided 43% reduction in adult female number, 14.80% reduction in egg laying and 17.53% reduction in larva hatching capacity, performing an overall 60% statistically significant protection. We assume rBrRm-MP4 is a potential candidate to be included as immmunogen for further development in an anti-tick vaccine.

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