Submitted by Neusa Fagundes (neusa.fagundes@unioeste.br) on 2018-07-12T17:47:16Z No. of bitstreams: 2 Carla_Fernandez2014.pdf: 1291543 bytes, checksum: 6cd6209240711c8d9c664256a72280c8 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-12T17:47:16Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Carla_Fernandez2014.pdf: 1291543 bytes, checksum: 6cd6209240711c8d9c664256a72280c8 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2014-12-05 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The Laurus nobilis L. is a tree belonging to the family Lauraceae, native to Asia and cultivated in the South and Southeast of Brazil as an ornamental plant, popularly known as laurel. The essential oil was extracted by hydrodistillation in a Clevenger apparatus for 2 hours. The essential oil was fractionated in a chromatographic column to obtain the fractions. The essential oil and fractions were identified by GC/MS. Was mensured the content of phenolic compounds of essential oil and fractions, and antioxidant activity by the DPPH sequestration method, antimicrobial activity against the strains: Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 and ATCC 70603, Proteus mirabilis ATCC 7002, Pseudomonas aeruginosa 27853 and Staphylococcus aureus ATCC 25923, yeasts Candida albicans ATCC 18804, Candida krusei ATCC 20298, Candida parapsilosis ATCC 20019, Candida tropicalis ATCC 750, Cryptococcus gattii L21 / 01 and Cryptococcus neoformans H99, and the filamentous fungi Aspergillus niger IC (clinical isolate), Aspergillus flavus IMI 190443, Aspergillus fumigatus ATCC 16913 by the diffusion test on agar. The minimal inhibitory concentration (MIC) of the sensitive strains was determined by the broth dilution method. And the acaricidal activity against Rhipicephalus microplus by the test of immersion of females and larval, the larvicidal activity against Aedes aegypti by the test of larval immersion. Twenty compounds were identified in the essential oil with 99.01% of the identified peak areas. The major component of the essential oil was the 1.8-cineole with 34.01%. The essential oil of laurel presented 17.57 μg of gallic acid / mg of essential oil of phenolic compounds and showed antioxidant activity by the DPPH method with IC50 of 15.52 mg/mL and the fractions CH2Cl2:C6H14 (8: 2) 9, 96 mg/mL and CH2Cl2: C6H14 (7: 3) 3.65 mg/mL. The essential oil and the CH2Cl2: AcOEt (9:1) fraction showed antibacterial activity against the bacteria Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae and Proteus mirabilis and antifungal activity against strains of Candida albicans, C. krusei, C. parapsilosis, C. tropicalis and Cryptococcus gattii and C. neoformans with minimum inhibitory concentration (MIC) values between 10.00 and 0.31 mg/mL. In relation to the acaricide activity, the immersion test of engorged females of R. microplus had a decrease in egg mass, egg production index and egg viability were affected in the different concentrations of essential oil in relation to the control group. On the larvae of the tick, the essential oil presented LC50 of 3.52 μL/mL and LC99 of 5.94 μL/mL, among the fractions to CH2Cl2: AcOEt (8:2) was the most active with LC50 of 0.13 μL/mL and LC99 of 0.51 μL/mL and the essential oil presented on larvae of A. aegypti LC50 of 0.38 μL/mL and LC99 of 0.48 μL/mL. Therefore, it can be concluded that the essential oil has antioxidant, antimicrobial, acaricidal and larvicidal action on R. microplus and A. aegypti, and that the fractionation was of great importance for the identification of compounds with biological activity. / O Laurus nobilis L. é uma árvore pertencente à família Lauraceae, nativa da Ásia e cultivado no Sul e Sudeste do Brasil como uma planta ornamental, conhecido popularmente como louro. O óleo essencial foi extraído por hidrodestilação em aparelho de Clevenger por 2 horas. O óleo essencial foi fracionado em coluna cromatográfica para a obtenção das frações. O óleo essencial e as frações foram identificados por CG/EM. Foi mensurado o teor de compostos fenólicos do óleo essencial e das frações, e atividade antioxidante pelo método de sequestro do DPPH, atividade antimicrobiana frente as cepas: Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 e ATCC 70603, Proteus mirabilis ATCC 7002, Pseudomonas aeruginosa 27853 e Staphylococcus aureus ATCC 25923, as leveduras Candida albicans ATCC 18804, Candida krusei ATCC 20298, Candida parapsilosis ATCC 20019, Candida tropicalis ATCC 750, Cryptococcus gattii L21/01 e Cryptococcus neoformans H99, e os fungos filamentosos Aspergillus niger IC (isolado clínico), Aspergillus flavus IMI 190443, Aspergillus fumigatus ATCC 16913 de pelo teste de difusão em ágar. Foi determinada da concentração mínima inibitória (CIM) das cepas sensíveis pelo método de diluição em caldo. E a atividade acaricida frente ao Rhipicephalus microplus pelo teste de imersão de fêmeas e larval, a atividade larvicida frente ao Aedes aegypti pelo teste de imersão larval. Foram identificados 20 compostos do óleo essencial com 99,01% das áreas dos picos identificados. O composto majoritário do óleo essencial foi o 1.8-cineol com 34,01%. O óleo essencial de louro apresentou 17,57μg equivalentes de ácido gálico/mg de óleo essencial de compostos fenólicos e mostrou atividade antioxidante pelo método DPPH com IC50 de 15,52 mg/mL e as frações CH2Cl2:C6H14(8:2) 9,96 mg/ mL e CH2Cl2:C6H14(7:3) 3,65 mg/mL. O óleo essencial e a fração CH2Cl2:AcOEt (9:1) mostraram atividade antibacteriana contra as bactérias Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae e Proteus mirabilis e atividade antifúngica contras cepas de Candida albicans, C. krusei, C. parapsilosis, C. tropicalis e Cryptococcus gattii e C. neoformans com valores de concentração mínima inibitória (CIM) entre 10,00 e 0,31mg/mL. Em relação a atividade acaricida, o teste de imersão das fêmeas ingurgitadas de R. microplus houve redução da massa dos ovos, índice de produção de ovos e a viabilidade dos ovos foram afetados nas diferentes concentrações do óleo essencial em relação ao grupo controle. Sobre as larvas do carrapato o óleo essencial apresentou LC50 de 3,52 μL/mL e LC99 de 5,94 μL/mL, dentre as frações a CH2Cl2:AcOEt (8:2) foi a mais ativa com LC50 de 0,13 μL/mL e LC99 de 0,51 μL/mL E o óleo essencial apresentou sobre as larvas de A. aegypti LC50 de 0,38 μL/mL e LC99 de 0,48 μL/mL. Portanto, pode concluir que o óleo essencial possui ação antioxidante, antimicrobiana, acaricida e larvicida sobre o R. microplus e A. aegypti, e que o fracionamento foi de grande importância para a identificação de compostos com atividade biológica.

Própolis é uma substância resinosa produzida por Apis mellifera, contendo principalmente resinas vegetais e cera das próprias abelhas. É usada na colmeia para diversas finalidades, como vedar aberturas, reparar as células e envolver invasores que foram mortos na colméia, além de contribuir para a quase constância da temperatura dentro da colmeia (28 - 30oC). A própolis é importante para as abelhas, pois é responsável pela manutenção de um ambiente quase estéril, agindo contra bactérias, fungos e até larvas invasoras. Em virtude do amplo espectro de atividades biológicas e farmacológicas associadas a esse produto, a própolis vem sendo extensivamente utilizada em medicina alternativa, bem como na indústria cosmética e alimentícia. Apesar dos numerosos estudos já realizados com própolis, os poucos que foram feitos visando ao uso em veterinária relacionavam-se a combate de endoparasitas. Muitas doenças de animais vêm acometendo o homem atualmente, tais como as transmitidas pelos carrapato vermelho do cão (Rhipicephalus sanguineus) e carrapato-estrela (Amblyomma cajennense). Problemas de saúde para o gado e queda da produtividade pecuária é causada pelo carrapato do boi (Rhipicephalus microplus). Além disso, é crescente o interesse de profissionais veterinários pelo uso de produtos naturais, sobretudo em relação aos animais domésticos. Vale lembrar que o uso indiscriminado de acaricidas levou à seleção de carrapatos resistentes, de modo que outras estratégias para o controle dessas pragas são de grande importância. Com isso, o intuito do presente projeto foi a determinação da atividade de extratos brutos de própolis brasileira e seus constituintes no controle de carrapatos específicos e generalistas. Foram preparados extratos clorofórmicos de amostras de própolis verde de Lavras (MG) e própolis preta de Picos (PI), anteriormente analisadas quimicamente. Os extratos foram concentrados à secura e redissolvidos para administração a carrapatos mantidos em laboratório. Os ensaios com extratos brutos foram realizados in vitro para avaliar seu efeito nos artrópodos, empregando-se o teste de pacote de larvas. Foram realizados isolamentos biomonitorados, na tentativa de obtenção de substâncias ativas presentes nas própolis analisadas. O extrato bruto de Picos não revelou atividade acaricida. Por outro lado, o extrato bruto de Lavras mostrou-se bastante ativo e, então, foi fracionado por cromatografia em coluna de gel de sílica. As frações resultantes foram novamente avaliadas em ensaios in vitro em carrapatos. Novo fracionamento e novos bioensaios foram realizados, e foi identificada uma subfração com atividade acaricida. Análises por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) foram desenvolvidas e quatro substâncias majoritárias (ácido 2,2-dimetil-cromeno-6-propenoico-dicafeoil glucosídeo, artepilina-C, bacarina e ácido 2,2-dimetil-cromeno-8-prenil-6-propenoico) dessa subfração ativa foram isoladas em CLAE-preparativo. As substâncias obtidas foram identificadas por meio de análises espectroscópicas correntes em química de produtos naturais (IV, UV, massas e RMN). Por fim, novos bioensaios foram realizados com a espécie de carrapato mais suscetível, Rhipicephalus microplus, porém não se observou atividade acaricida significativa para as substâncias isoladas. Assim sendo, talvez a alta atividade acaricida constatada na subfração ativa seja decorrente do sinergismo entre substâncias. / Propolis is a resinous substance produced by bees Apis mellifera, containing mainly plant exudates and bee waxes. It is used in the hive to close holes, repair cells and involve intruders that are killed inside the hive. Propolis is important to the bees, as it is responsible for the maintenance of the hive as a sterile environment, acting against bacteria, fungus and even invading larvae. Because of the wide range of biological and pharmacological activities of propolis, it has been extensivelly used in alternative medicine, as well as in cosmetic and food industries. However, few studies have been developed concerning the use of propolis to animal health. Nowadays, many animal diseases have affected humans, such as those transmited by ticks, the brown dog tick (Rhipicephalus sanguineus) and the star tick (Amblyomma cajennense). Cattle health problems and decrease of livestock productivity is caused by the cattle tick (Rhipicephalus microplus). In addition, the interest of veterinary professionals toward the use of natural products to animal health is increasing, mainly for the treatment of domestic animals. It is worth remembering that the indiscriminate use of acaricides leads to resistence selection. Thus, new strategies are of great importance for tick control. Hence, the aim of this project was to determine the activity of crude extracts of Brazilian propolis and their constituents for the control of specific and generalist ticks. Chloroform extracts were prepared from samples of green propolis from Lavras (state of Minas Gerais) and black propolis from Picos (state of Piauí), previously analyzed chemically. The extracts were concentrated to dryness and redissolved for ticks administration in laboratory. The bioassays were carried out in vitro to verify the effectivness of the extracts using the larval package test. Bioassays-guided isolations were carried out to obtain active constituents presented in the studied samples. The crude extract of propolis sample from Picos did not show any acaricide activity. On the other hand, the sample propolis from Lavras showed high activity, and then was fractionated by colunm chromatography in silica gel. The fractions obtained were tested, and a subfraction with acaricide activity was obtained. Analyses by high performance liquid chromatography (HPLC) were developed and four compounds (2,2-dimethyl-cromene-6-propenoic-dicafeoyl glucoside acid, artepillin-C, baccarin and 2,2-dimethyl-cromene-8-prenyl-6-propenoic acid) of the active subfraction were isolated using preparative HPLC. These compounds were identified by means of current spectroscopic analysis in chemistry of natural products (IR, UV, mass and NMR). Finally, new bioassays were carried out with the most susceptible tick specie, Rhipicephalus microplus, but no effect was observed testing the isolated compounds. Thus, probably the high acaricidal activity observed in the active subfraction was due to a synergism among the subfraction constituents.

Infestações com Rhipicephalus microplus, o carrapato dos bovinos, causam enormes prejuízos econômicos para a pecuária. Os carrapatos estão desenvolvendo resistência aos carrapaticidas que, além dessa desvantagem, deixam resíduos em carne e leite. Vacinas anticarrapato representam uma alternativa sustentável de controle de infestações, mas as atualmente disponíveis têm efeitos parciais e transitórios. Surge, assim, a necessidade de identificar novos antígenos vacinais. Para alcançar esse objetivo este trabalho explora o fato de que bovinos apresentam fenótipos contrastantes e herdáveis de infestações que são específicos de certas raças. Além disso, o nível de imunidade do hospedeiro afeta a transcrição de genes de glândulas salivares do carrapato, órgão que produz proteínas que medeiam o parasitismo. A hipótese de trabalho é a que os diferentes níveis da imunidade anticarrapato do hospedeiro afetam, também, a composição salivar do parasita. Assim, em carrapatos alimentando-se em hospedeiros resistentes as proteínas que são cruciais ao parasitismo poderão estar ausentes ou deficientes na sua saliva e por isso os carrapatos não terminam sua refeição de sangue. A neutralização dessas mesmas proteínas pela imunidade humoral pode ter o mesmo efeito e por isso, essas proteínas constituem bons antígenos vacinais. Assim, o objetivo do trabalho foi identificar novos antígenos vacinais em saliva de fêmeas e glândulas salivares de ninfas, machos e fêmeas de carrapatos alimentados em hospedeiros resistentes e suscetíveis, bem como em larvas não alimentadas oriundas de ovos de fêmeas alimentadas nestes mesmos hospedeiros. Para isso, foram empregadas abordagens de sequenciamento de nova geração \"RNA-Seq\" (454) e abordagens proteômicas, como análise diferencial em gel (DIGE) e Western Blots (imunoproteoma) seguido de sequenciamento de massa, além da tecnologia de identificação de proteínas multidimensionais (ou Multidimensional Protein Identification Technology, MudPIT) para descrever o proteoma das glândulas salivares e da saliva de fêmeas. A análise transcriptômica resultou no sequencimanto de 1.999.086 reads que permitiu identificar e classificar 11.676 sequências codificadoras (CDS), muitas das quais (3.600 CDS) contêm peptídeo sinal que é indicativo de secreção, portanto podendo estar presente na saliva e Resumo Gustavo Rocha Garcia apresentar função importante na hematofagia. Por meio de MudPIT, identificamos 321 proteínas salivares diferentes, além de 126 proteínas no DIGE e 266 proteínas nos imunoproteomas. Muitas dessas proteínas podem ser consideradas antígenos potenciais por estarem associadas com a hematofagia/parasitismo, tais como proteases, nucleases, inibidores de proteases, peptídeos antimicrobianos, proteínas de fixação, entre outros, inclusive proteínas ainda não caracterizadas. A maioria dos genes codificantes dessas proteínas está mais expressa em carrapatos alimentados em hospedeiros suscetíveis, principalmente em carrapatos machos. Além disso, muitas dessas proteínas não são reconhecidas por soros bovinos, inclusive soros de bovinos infestados, embora soros de bovinos infestados e resistentes ao carrapato apresente a maioria das reatividades. O conjunto dos resultados sugere que em nível de proteína a composição da saliva também é afetada pelos diferentes níveis de imunidade dos hospedeiros, além de variar com o ciclo de vida do carrapato. Desse modo, concluímos que as estratégias de investigação empregadas foram satisfatórias para identificar um conjunto de antígenos salivares do carrapato R. microplus que representam proteínas alvos para compor vacinas multicomponentes anticarrapato. / Infestation with Rhipicephalus microplus, the cattle tick, causes huge economic losses to livestock. Ticks are developing resistance to acaricides that, besides this disadvantage, leave residues in meat and milk. The anti tick vaccines represent a sustainable alternative of the infestations control, but the currently available has partial and transient effects. Thus arises the need to identify new vaccine antigens. To achieve this goal, this work explores the fact that cattle exhibit contrasting phenotypes and inheritable of infestations that are specific to certain breeds. Furthermore, the level of immunity of the host affects gene transcription tick salivary gland, organ that produces proteins that mediate the parasitism. The working hypothesis is that different levels of anti tick immunity of host affect also the salivary composition of the parasite. So in ticks feeding on resistant hosts the proteins that are crucial to parasitism may be absent or deficient in their saliva, and by this the ticks do not finish your meal blood. The neutralization of these same proteins by humoral immunity can have the same effect and by this, these proteins are good vaccine antigens. So, the aim of the study was to identify new vaccine antigens in saliva from females and salivary glands of nymphs, males and females of ticks fed on resistant and susceptible hosts as well as in unfed larvae originating from eggs of females fed on these same hosts. To this, were employed sequencing approaches of new generation \"RNA-Seq\" (454) and proteomic approaches, such as differential analysis in gel (DIGE) and Western Blots (immunoproteomics) followed by sequencing mass, besides the Multidimensional Protein Identification Technology (MudPIT) to describe the proteome of the salivary glands and saliva of females. The transcriptomics analysis identified 11,676 coding sequences (CDS), many of which (3,600 CDS) contain predicted signal peptide indicative of secretion, therefore may be present in saliva and provide an important function in blood feeding. Through MudPIT, we identify 321 different salivary proteins, besides 126 proteins in DIGE and 266 proteins in immunoproteomics. Many of these proteins may be considered as potential antigens to be associated with the blood meal/ parasitism, such as proteases, nucleases, protease inhibitors, antimicrobial peptides, proteins of attachment, among Abstract Gustavo Rocha Garcia others, including proteins not yet characterized. Most of the genes encoding of these proteins are more expressed in ticks fed on susceptible hosts, especially in male ticks. Moreover, many of these proteins are not recognized by bovine sera, including sera from infested hosts, although sera from infested and resistant host to tick present the most reactivities. The overall results suggest that in protein level, the composition of saliva is also affected by the different levels of immunity of the host, besides vary with the tick life cycle. Thus, we conclude that the research strategies employed were satisfactory to identify a set of tick salivary antigens from R. microplus that represent target proteins for composing anti tick multicomponent vaccines.

O carrapato Rhipicephalus microplus é o vetor da bactéria Anaplasma marginale, agente etiológico da anaplasmose bovina. Este trabalho teve como objetivo a caracterização molecular e funcional das vias de sinalização Toll, Imd, Jnk e Jak/Stat do R. microplus. Através de análises in silico, a maioria dos genes que compõe as vias de sinalização de R. microplus foi identificada. Além disso, verificou-se uma modulação negativa da expressão dos genes dessas vias, nas células BME26, pela infecção por A. marginale. Após o silenciamento dos genes codificadores dos fatores de transcrição das vias de sinalização, através da técnica de RNAi, em carrapatos R. microplus, observou-se que o fator de transcrição Relish (Imd) está envolvido no controle da A. marginale, possivelmente através do peptídeo antimicrobiano microplusina. Com este trabalho, ampliamos o conhecimento sobre o sistema imune de carrapatos para compreender melhor a interface vetor-patógeno. / The cattle tick Rhipicephalus microplus is the vector of the bacteria Anaplasma marginale, the etiological agent of bovine anaplasmosis. This study aimed to evaluate the molecular and functional role of the signaling pathways Toll, Imd, Jnk, and Jak/Stat in R. microplus. An in silico analysis allowed the identification of several genes of these signaling pathways. In addition, there was a negative modulation of expression of genes of these pathways in the tick cell line BME26 upon infection with A. marginale. The silencing of some transcription factor genes via RNA interference in ticks indicated that the transcription factor Relish (from the Imd pathway) was involved in the control of bacterial infection, possibly via regulation of the expression of the antimicrobial peptide microplusin. This study helped elucidate the role of the immune system of ticks in the vector-pathogen interface.

Carrapatos são parasitas hematófagos transmissores de doenças para humanos e animais, e responsáveis por prejuízos econômicos de bilhões de dólares para os sistemas pecuários mundiais. A emergência de carrapatos multirresistentes a acaricidas torna urgente o desenvolvimento de vacinas efetivas contra este parasita. Neste trabalho, nós utilizamos dados de sialotranscriptomas de carrapatos R. microplus para selecionar antígenos secretados pelo parasita para serem testados como uma vacina multicomponente. Os antígenos produzidos de forma recombinante em E. coli foram utilizados como imunógenos em animais suscetíveis à carrapatos para testes de proteção vacinal contra infestações por R. microplus em bovinos e por R. sanguineus em cães. No primeiro ensaio, bovinos imunizados com oito antígenos recombinantes adjuvantados com um polímero sintético apresentaram indução de IgG sérica específica para cinco antígenos, e redução de 22% na infestação por carrapatos R. microplus. No segundo ensaio, a imunização de bovinos com nove antígenos adjuvantados com sais de alumínio gerou IgG específica para todos os antígenos inoculados, e proteção vacinal crescente de 70% e 75% em duas infestações sucessivas com carrapatos R. microplus, sem revacinação, indicando boost natural pela infestação. No terceiro ensaio, a imunização de cães com nove antígenos recombinantes associados à hidróxido de alumínio induziu a soroconversão de IgG dos animais para todos os antígenos, e proteção vacinal de 36% contra a infestação por carrapatos R. sanguineus. Todas as formulações afetaram principalmente o número de fêmeas ingurgitadas após a infestação. O efeito protetor de antígenos derivados de carrapatos R. microplus sobre carrapatos R. sanguineus (proteção cruzada) indica ser possível o desenvolvimento de uma vacina multicomponente efetiva contra os dois parasitas. / Ticks are hematophagous parasites which transmit diseases to humans and animals, and are responsible for billions of dollars of damage to the world\'s livestock systems. The emergence of ticks resistant to multiple acaricides makes urgent the development of effective vaccines against this parasite. In this work, we used data from the R. microplus tick sialotranscriptome to select antigens secreted by the parasite to be tested as a multicomponent vaccine. Recombinant antigens expressed in E. coli were used as antigens in tick\'s susceptible hosts to evaluate it efficacy in protect animals against R. microplus and R. sanguineus infestations. In the first assay, bovines immunized with eight recombinant antigens adjuvanted with a synthetic polymer presented the induction of serum IgG reactive for five antigens, and reduction of R. microplus infestation in 22%. In the second trial, immunization of cattle with nine antigens adjuvanted with aluminum salts generated serum IgG against all antigens, and vaccine protection against R. microplus parasitism was calculated in 70% and 75% for each infestation. In the third trial, the immunization of dogs with recombinant antigens adjuvanted with aluminum hydroxide induced IgG seroconversion against all antigens, and a 36% of protection against infestation by R. sanguineus ticks in immunized animals. All formulations reduced mainly the number of engorged females recovered from infestation. The cross reactive protection induced by R. microplus derived antigens R. sanguineus tick infestation indicate that it is possible to develop a unique multicomponent vaccine against the two parasites.

Carrapatos são parasitas hematófagos transmissores de doenças para humanos e animais, e responsáveis por prejuízos econômicos de bilhões de dólares para os sistemas pecuários mundiais. A emergência de carrapatos multirresistentes a acaricidas torna urgente o desenvolvimento de vacinas efetivas contra este parasita. Neste trabalho, nós utilizamos dados de sialotranscriptomas de carrapatos R. microplus para selecionar antígenos secretados pelo parasita para serem testados como uma vacina multicomponente. Os antígenos produzidos de forma recombinante em E. coli foram utilizados como imunógenos em animais suscetíveis à carrapatos para testes de proteção vacinal contra infestações por R. microplus em bovinos e por R. sanguineus em cães. No primeiro ensaio, bovinos imunizados com oito antígenos recombinantes adjuvantados com um polímero sintético apresentaram indução de IgG sérica específica para cinco antígenos, e redução de 22% na infestação por carrapatos R. microplus. No segundo ensaio, a imunização de bovinos com nove antígenos adjuvantados com sais de alumínio gerou IgG específica para todos os antígenos inoculados, e proteção vacinal crescente de 70% e 75% em duas infestações sucessivas com carrapatos R. microplus, sem revacinação, indicando boost natural pela infestação. No terceiro ensaio, a imunização de cães com nove antígenos recombinantes associados à hidróxido de alumínio induziu a soroconversão de IgG dos animais para todos os antígenos, e proteção vacinal de 36% contra a infestação por carrapatos R. sanguineus. Todas as formulações afetaram principalmente o número de fêmeas ingurgitadas após a infestação. O efeito protetor de antígenos derivados de carrapatos R. microplus sobre carrapatos R. sanguineus (proteção cruzada) indica ser possível o desenvolvimento de uma vacina multicomponente efetiva contra os dois parasitas. / Ticks are hematophagous parasites which transmit diseases to humans and animals, and are responsible for billions of dollars of damage to the world\'s livestock systems. The emergence of ticks resistant to multiple acaricides makes urgent the development of effective vaccines against this parasite. In this work, we used data from the R. microplus tick sialotranscriptome to select antigens secreted by the parasite to be tested as a multicomponent vaccine. Recombinant antigens expressed in E. coli were used as antigens in tick\'s susceptible hosts to evaluate it efficacy in protect animals against R. microplus and R. sanguineus infestations. In the first assay, bovines immunized with eight recombinant antigens adjuvanted with a synthetic polymer presented the induction of serum IgG reactive for five antigens, and reduction of R. microplus infestation in 22%. In the second trial, immunization of cattle with nine antigens adjuvanted with aluminum salts generated serum IgG against all antigens, and vaccine protection against R. microplus parasitism was calculated in 70% and 75% for each infestation. In the third trial, the immunization of dogs with recombinant antigens adjuvanted with aluminum hydroxide induced IgG seroconversion against all antigens, and a 36% of protection against infestation by R. sanguineus ticks in immunized animals. All formulations reduced mainly the number of engorged females recovered from infestation. The cross reactive protection induced by R. microplus derived antigens R. sanguineus tick infestation indicate that it is possible to develop a unique multicomponent vaccine against the two parasites.

Submitted by Rosivalda Pereira (mrs.pereira@ufma.br) on 2017-06-14T16:54:49Z No. of bitstreams: 1 AlbertoLopes.pdf: 7651509 bytes, checksum: 542872f26d9cc8bf6b0b65d8a7151d16 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-14T16:54:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AlbertoLopes.pdf: 7651509 bytes, checksum: 542872f26d9cc8bf6b0b65d8a7151d16 (MD5) Previous issue date: 2015-07-07 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPQ) / Fundação de Amparo à Pesquisa e ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico do Maranhão (FAPEMA) / The tick Rhipicephalus microplus is the major cattle ectoparasite of the world accounting for losses of billions of dollars that directly affect the return of such livestock. Its control is difficult due to the resistance of ticks to all chemical bases commercially available miticides. Acaricidal activity of terpenes has been evaluated in several studies that show satisfactory results, indicating these compounds are potential sources of new acaricidal products. The aim of this work was to select terpenes with potential activity against enzyme acetylcholinesterase (AChE) from R. microplus. Properties of the molecular volume, geometric parameters and vibrational terpenes were obtained from quantum chemical calculations the density functional theory level. Bioinformatic methodologies were applied to study the interaction of terpenes identified in essential oils of Citrus spp. and Lippia spp. with three AChE R. microplus. Since there are no available experimental structures, models of the three AChE were generated by homology modeling and then refined by molecular dynamics simulations. Soon after, were studies of molecular docking to detect best energy conformation of interaction and molecular dynamics simulations of this complex were carried out to study the behavior of this interaction. Our results suggest that the known acaricide activity of carvacrol is associated with its interaction with AChEs, while the acaricide activity of thymol is not associated with inhibition of that enzyme. Also, as expected, showed an excellent interaction coumafos acaricide and reports the first record of interaction of AChE from R. microplus with gammamuuruleno and elemol terpenes, molecules with few studies and that now configure themselves as candidates potential new acaricidal products. / O carrapato Rhipicephalus microplus é o principal ectoparasita da bovinocultura mundial sendo responsável por perdas de bilhões de dólares que afetam diretamente o retorno de tal produção animal. Seu controle é difícil devido à resistência dos carrapatos a todas as bases químicas de acaricidas comercialmente disponíveis. A atividade acaricida de terpenos tem sido avaliada em vários estudos que mostram resultados satisfatórios, indicando que estes compostos são fontes potenciais de novos produtos acaricidas. O objetivo desse trabalho foi selecionar terpenos com potencial atividade sobre a enzima acetilcolinesterase (AChE) de R. microplus. As propriedades do volume molecular, os parâmetros geométricos e vibracionais de terpenos foram obtidos a partir de cálculos de química quântica no nível da teoria do funcional de densidade. Metodologias de bioinformática foram aplicadas para estudar a interação de terpenos identificados em óleos essenciais de Citrus spp. e Lippia spp. com as três AChE de R. microplus. Como não existem estruturas experimentais disponíveis, modelos das três AChE foram gerados por modelagem por homologia e em seguida refinadas por simulações de dinâmica molecular. Logo após, foram realizados estudos de docagem molecular para detectar a melhor conformação energética de interação e simulações de dinâmica molecular desse complexo foram realizadas para estudarmos o comportamento dessa interação. Os resultados sugerem que a conhecida atividade carrapaticida do carvacrol está associada com a sua interação com a AChE, enquanto que a atividade carrapaticida do timol não está associado com a inibição dessa mesma enzima. Além disso, como esperado, mostrou uma excelente interação do carrapaticida cumafós e relata o primeiro registro da interação da AChE de R. microplus com os terpenos gama-muuruleno e elemol, moléculas com poucos estudos e que a partir de agora configuram-se como candidatos potenciais para novos produtos acaricidas.

Os ecossistemas naturais encontram-se sob forte pressão humana o que promove fragmentação e destruição de grandes áreas nativas. Estas mudanças favorecem situações impróprias para o parasita levando ao surgimento ou ressurgimento de doenças infecciosas/parasitárias. Consequentemente, tem se tornado importante pesquisas de fluxo epidemiológico de carrapatos entre animais e ambiente auxiliando a identificação do papel desses vetores na dispersão de patógenos. As coletas ocorreram na Fazenda Experimental Capim Branco – Uberlândia, MG, entre 2015 e 2017. Para a coleta de carrapatos em vida livre foi utilizado o arraste de flanela e a armadilhas de CO2 e nos animais a inspeção visual. Em áreas campestres a maior prevalência foi de Amblyomma sculptum, seguida por Rhipicephalus microplus e Amblyomma dubitatum. Nos piquetes de ovinos coletou R. microplus e Amblyomma spp., com predominância de ninfas de A. sculptum no inverno. Em áreas florestais A. sculptum e A. dubitatum foram os mais frequentes embora a quantidade de A. sculptum tenha sido maior tanto na mata ribeirinha quanto na mata semidecídua. Ainda em área florestal encontrou em menor quantidade R. microplus, Ixodes loricatus e Amblyomma longirostre. Observou uma maior eficiência de coleta de agregados de larvas por arraste enquanto a armadilha de gelo foi mais adequada para ninfas e adultos do gênero Amblyomma. Foi visto também que áreas florestais são constantemente mais infestadas do que áreas campestres. O gado em sua maioria apresentava R. microplus, mas a presença de A. sculptum foi observada com frequência em menor quantidade. Constatando que o parasitismo por este carrapato não é acidental. Dermacentor nitens, A. sculptum e R. microplus foram encontrados em cavalos, respectivamente seguindo a prevalência. Os cães apresentavam Rhipicephalus sanguineus além de A. sculptum e por fim, em pequenos mamíferos não voadores a presença de A. sculptum e I. loricatus, espécie predominante. Nenhum carrapato foi encontrado em ovinos. Consequentemente nota-se que a espécie A. sculptum está presente em diferentes ambientes e também em bovinos, equinos, cães e pequenos mamíferos. Sugerindo ser um carrapato importante no Cerrado pelo fato de ser o vetor mais comum associado à febre manchada no Brasil. / Natural ecosystems are under severe human pressure which promotes fragmentation and destruction of large native areas. These changes favor situations unfit for the parasite leading to the emergence or reemergence of infectious/parasitic diseases. Consequently, epidemiological studies of ticks between animals and environment have become important, helping to identify the role of these vectors in the dispersion of pathogens. The samples were collected in the Experimental Farm Capim Branco - Uberlândia, MG, in 2015 to 2017. For the collection free living ticks use a dragging flag and CO2 traps and for the animals used visual inspection. In rural areas the highest prevalence was of Amblyomma sculptum, followed by Rhipicephalus microplus and Amblyomma dubitatum. In the sheep area collected R. microplus and Amblyomma spp., with predominance of A. sculptum nymphs in winter. In forest areas A. sculptum and A. dubitatum were the most frequent although the A. sculptum was higher in the “ribeirinha” area the semideciduous area. Still in the forest it found in smaller quantity R. microplus, Ixodes loricatus and Amblyomma longirostre. Observed a greater efficiency for the drag in the aggregate of larvae while the ice trap was more suitable for nymphs and adults of the Amblyomma spp. It has also been seen that forest areas are constantly more infested than rural areas. The majority ticks of the cattle were R. microplus, but the presence of A. sculptum was frequently observed in less quantity. The parasitism on cattle by tick is not accidental. Dermacentor nitens, A. sculptum and R. microplus were found in horses, respectively, following the prevalence. The dogs presented Rhipicephalus sanguineus and A. sculptum and finally, in non volant small mammals the presence of I. loricatus was dominant, but A. sculptum was not discarded. No ticks were found in sheep. Consequently it is noted that the A. sculptum is present in different environments as in cattle, horses, dogs and small mammals. It suggests to be an important tick in the Cerrado and the most common vector associated with spotted fever in Brazil. / Tese (Doutorado)

Infestações com Rhipicephalus microplus, o carrapato dos bovinos, causam enormes prejuízos econômicos para a pecuária. Os carrapatos estão desenvolvendo resistência aos carrapaticidas que, além dessa desvantagem, deixam resíduos em carne e leite. Vacinas anticarrapato representam uma alternativa sustentável de controle de infestações, mas as atualmente disponíveis têm efeitos parciais e transitórios. Surge, assim, a necessidade de identificar novos antígenos vacinais. Para alcançar esse objetivo este trabalho explora o fato de que bovinos apresentam fenótipos contrastantes e herdáveis de infestações que são específicos de certas raças. Além disso, o nível de imunidade do hospedeiro afeta a transcrição de genes de glândulas salivares do carrapato, órgão que produz proteínas que medeiam o parasitismo. A hipótese de trabalho é a que os diferentes níveis da imunidade anticarrapato do hospedeiro afetam, também, a composição salivar do parasita. Assim, em carrapatos alimentando-se em hospedeiros resistentes as proteínas que são cruciais ao parasitismo poderão estar ausentes ou deficientes na sua saliva e por isso os carrapatos não terminam sua refeição de sangue. A neutralização dessas mesmas proteínas pela imunidade humoral pode ter o mesmo efeito e por isso, essas proteínas constituem bons antígenos vacinais. Assim, o objetivo do trabalho foi identificar novos antígenos vacinais em saliva de fêmeas e glândulas salivares de ninfas, machos e fêmeas de carrapatos alimentados em hospedeiros resistentes e suscetíveis, bem como em larvas não alimentadas oriundas de ovos de fêmeas alimentadas nestes mesmos hospedeiros. Para isso, foram empregadas abordagens de sequenciamento de nova geração \"RNA-Seq\" (454) e abordagens proteômicas, como análise diferencial em gel (DIGE) e Western Blots (imunoproteoma) seguido de sequenciamento de massa, além da tecnologia de identificação de proteínas multidimensionais (ou Multidimensional Protein Identification Technology, MudPIT) para descrever o proteoma das glândulas salivares e da saliva de fêmeas. A análise transcriptômica resultou no sequencimanto de 1.999.086 reads que permitiu identificar e classificar 11.676 sequências codificadoras (CDS), muitas das quais (3.600 CDS) contêm peptídeo sinal que é indicativo de secreção, portanto podendo estar presente na saliva e Resumo Gustavo Rocha Garcia apresentar função importante na hematofagia. Por meio de MudPIT, identificamos 321 proteínas salivares diferentes, além de 126 proteínas no DIGE e 266 proteínas nos imunoproteomas. Muitas dessas proteínas podem ser consideradas antígenos potenciais por estarem associadas com a hematofagia/parasitismo, tais como proteases, nucleases, inibidores de proteases, peptídeos antimicrobianos, proteínas de fixação, entre outros, inclusive proteínas ainda não caracterizadas. A maioria dos genes codificantes dessas proteínas está mais expressa em carrapatos alimentados em hospedeiros suscetíveis, principalmente em carrapatos machos. Além disso, muitas dessas proteínas não são reconhecidas por soros bovinos, inclusive soros de bovinos infestados, embora soros de bovinos infestados e resistentes ao carrapato apresente a maioria das reatividades. O conjunto dos resultados sugere que em nível de proteína a composição da saliva também é afetada pelos diferentes níveis de imunidade dos hospedeiros, além de variar com o ciclo de vida do carrapato. Desse modo, concluímos que as estratégias de investigação empregadas foram satisfatórias para identificar um conjunto de antígenos salivares do carrapato R. microplus que representam proteínas alvos para compor vacinas multicomponentes anticarrapato. / Infestation with Rhipicephalus microplus, the cattle tick, causes huge economic losses to livestock. Ticks are developing resistance to acaricides that, besides this disadvantage, leave residues in meat and milk. The anti tick vaccines represent a sustainable alternative of the infestations control, but the currently available has partial and transient effects. Thus arises the need to identify new vaccine antigens. To achieve this goal, this work explores the fact that cattle exhibit contrasting phenotypes and inheritable of infestations that are specific to certain breeds. Furthermore, the level of immunity of the host affects gene transcription tick salivary gland, organ that produces proteins that mediate the parasitism. The working hypothesis is that different levels of anti tick immunity of host affect also the salivary composition of the parasite. So in ticks feeding on resistant hosts the proteins that are crucial to parasitism may be absent or deficient in their saliva, and by this the ticks do not finish your meal blood. The neutralization of these same proteins by humoral immunity can have the same effect and by this, these proteins are good vaccine antigens. So, the aim of the study was to identify new vaccine antigens in saliva from females and salivary glands of nymphs, males and females of ticks fed on resistant and susceptible hosts as well as in unfed larvae originating from eggs of females fed on these same hosts. To this, were employed sequencing approaches of new generation \"RNA-Seq\" (454) and proteomic approaches, such as differential analysis in gel (DIGE) and Western Blots (immunoproteomics) followed by sequencing mass, besides the Multidimensional Protein Identification Technology (MudPIT) to describe the proteome of the salivary glands and saliva of females. The transcriptomics analysis identified 11,676 coding sequences (CDS), many of which (3,600 CDS) contain predicted signal peptide indicative of secretion, therefore may be present in saliva and provide an important function in blood feeding. Through MudPIT, we identify 321 different salivary proteins, besides 126 proteins in DIGE and 266 proteins in immunoproteomics. Many of these proteins may be considered as potential antigens to be associated with the blood meal/ parasitism, such as proteases, nucleases, protease inhibitors, antimicrobial peptides, proteins of attachment, among Abstract Gustavo Rocha Garcia others, including proteins not yet characterized. Most of the genes encoding of these proteins are more expressed in ticks fed on susceptible hosts, especially in male ticks. Moreover, many of these proteins are not recognized by bovine sera, including sera from infested hosts, although sera from infested and resistant host to tick present the most reactivities. The overall results suggest that in protein level, the composition of saliva is also affected by the different levels of immunity of the host, besides vary with the tick life cycle. Thus, we conclude that the research strategies employed were satisfactory to identify a set of tick salivary antigens from R. microplus that represent target proteins for composing anti tick multicomponent vaccines.

O carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus é responsável por perdas econômicas substanciais na bovinocultura, acarretando o uso intensivo de acaricidas. Problemas com os resíduos químicos presentes na carne e no leite, o custo dos acaricidas e a seleção de populações de carrapato resistentes, têm estimulado o desenvolvimento de métodos de controle alternativos não-químicos. Muito esforço tem sido despendido para o desenvolvimento de uma vacina contra o carrapato, no entanto, seu desenvolvimento depende da identificação de moléculas e caracterização de seus papéis na fisiologia do carrapato. Nesse sentido, entender melhor os processos envolvidos no desenvolvimento embrionário pode ajudar na identificação de alvos para o controle desse ectoparasita. Foi sugerida previamente a participação da Tick Heme-binding Aspartic Proteinase (THAP), uma aspártico-endopeptidase dos ovos do carrapato, na degradação da vitelina. Neste trabalho, nós avaliamos a função fisiológica e as características bioquímicas adicionais dessa proteína. Para identificar os sítios e o perfil de transcrição do gene da THAP, o RNA total foi extraído de intestino, ovário e corpo gorduroso de fêmeas parcialmente e completamente ingurgitadas e de ovos, e analisado por PCR quantitativo. Esta análise revelou que o gene da THAP é transcrito nos três tecidos, porém maior quantidade de mRNA foi detectada no corpo gorduroso e intestino de fêmeas completamente ingurgitadas, onde o processo de vitelogênese já foi iniciado. Nos ovos, a transcrição do gene da THAP não foi detectada. Para investigar a presença da proteína nos tecidos e ovos foi realizado um westen-blot com soro anti-THAP, que revelou a presença, em pequena quantidade, da proteína na hemolinfa, no intestino e no corpo gorduroso. Maior concentração de proteína foi detectada no ovário de fêmeas completamente ingurgitadas e nos ovos durante todo o desenvolvimento embrionário. Também foi observado que a THAP é sintetizada na forma de pró-endopeptidase e depois do início da embriogênese é convertida à forma ativa por autoproteólise. Uma proteína recombinante (rTHAP) foi produzida pela clonagem da região codificadora no vetor de expressão pET43a e expressão em Escherichia coli. Depois da purificação, a rTHAP apresentou atividade enzimática sobre substrato sintético fluorogênico, sendo especificamente inibida por pepstatina A. Para investigar sua participação na degradação de vitelina (VT), VT purificadas de ovos coletados 1, 7 e 12 dias após a postura foram incubadas com a rTHAP em diferentes pH (3,5; 4,0; 4,5; e 5,0). A análise por SDS-PAGE mostrou que a rTHAP é capaz de hidrolisar VT purificada de ovos coletados 7 dias após a postura em pH 3,5 a 37 ºC. Esta atividade é sensível a heme e inibida por pepstatina A. VT purificadas de ovos coletados 1 e 12 dias após a postura não foram hidrolisadas e em outros pH a atividade da rTHAP não foi eficiente. Nossos resultados sugerem que a THAP é sintetizada principalmente em tecidos extra-ovarianos, estocada nos ovários e incorporada nos oócitos como pró-endopeptidase. Durante a embriogênese, a THAP é ativada a enzima na forma madura desenvolvendo papel no processamento da vitelina do carrapato. / Rhipicephalus (Boophilus) microplus is a one-host tick that causes losses to bovine herds, leading intensive use of chemical acaricides. Problems of chemical residues in meat and milk, costs of acaricides, and development of resistance by ticks, have long been recognized and have helped to stimulate interest in tick control by immunological methods. Major efforts have been made to develop vaccines against tick; however, its development still depends on the identification of tick molecules and characterization of their roles in arthropod physiology. In this sense, to understand the processes involved in embryonic development can help in the identification of additional targets to control this ectoparasite. Previously, an aspartic endopeptidase from tick eggs, named THAP (Tick Heme-binding Aspartic Proteinase), was suggested to be involved in vitellin degradation. In this work, we have investigated the physiological role and additional chemical features of this protein. To identify the site and profiles of the THAP transcription, total RNA extracted from midgut, ovary and fat body from partially and fully engorged females and from eggs was analyzed by qRT-PCR. This analysis showed that THAP mRNA was transcripted in these three tissues. However, highest levels of transcriptions were found in fat body and midgut of fully engorged vitellogenic females. In eggs, THAP mRNA transcription was not detected. In order to investigate the presence of THAP protein in the tissues and eggs, an immunoblot analysis was conducted with an anti-nTHAP serum. The THAP protein was detected in the haemolymph, midgut and fat body and, in higher quantity, in the ovary of fully engorged females, and it was present throughout embryo development. The protein is synthesized as a higher molecular mass form (pro-endopeptidase) and after the onset of embryogenesis THAP is converted into an active form by autocatalysis. A recombinant THAP (rTHAP) was produced through cloning in pET43a vector and expression in Escherichia coli. After the purification the rTHAP was active upon fluorogenic substrate in a reaction specifically inhibit by pepstatin A. To investigate rTHAP vitellin-degradation activity, vitellin (VT) purified from 1-, 7- and 12-day-old eggs were incubated with rTHAP in a range of pHs (3.5, 4.0, 4.5 and 5.0). SDS-PAGE analysis showed that rTHAP is able to hydrolyze VT from 7-day-old eggs in pH 3.5 at 37ºC in a reaction that is heme-sensitive and inhibited by pepstatin A. Vitellins from eggs collected on the 1st and 12th days after oviposition were not hydrolyzed and in other pHs rTHAP activity was not efficient. These results suggest that THAP is synthesized in ovary and extra-ovarian site, stocked in ovary and incorporated by vitellogenic oocytes with a pro-endopeptidase. During embryogenesis, THAP was actived to the mature enzyme and play a role in tick vitellin processing.