Made available in DSpace on 2015-03-26T13:47:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1900042 bytes, checksum: b7b1b3c446b79d6611fd389a12e3ffb6 (MD5) Previous issue date: 2013-11-13 / The cattle tick, Rhipicephalus (Boophilus) microplus is responsible for significant economic losses in tropical and subtropical countries around the world. Nowadays, the chemical control for this parasite is affected by the resistance development to several commercial acaricides, which has been reported in many countries. Furthermore, the concerns generated by chemical remains in animal products and the environment makes from this control a problem of high level importance for the public health. Thus, the immunological control becomes a promising alternative because the easy administration, low costs and its contributions to the food security. The objective of this study was to evaluate the lymph nodes response of cattle immunized at field with the peptide rSBm7462 anti Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Fourteen crossbred cattle (Bos taurus x Bos indicus) with degree of blood holstein-zebu and aged 4-10 months were used. The animals were maintained on two farms in the north of Minas Gerais and received three immunizations with the peptide rSBm7462 applied subcutaneously at 30-day intervals. Pre-scapular lymph nodes were collected surgically 15 days after each immunization and fixed in formalin for 18 hours, then they were embedded in paraffin subsequently. Lymph node samples were stained with Hematoxylin-Eosin (HE) for cellular events observation. On the other hand, in order to antigens identifying in immunized animals lymph nodes, the immunohistochemistry (IHC) with peroxidase-anti peroxidase (PAP) method was performed. Lymph node response of cattle inoculated was evaluated by analysis of germinal centers (GC) formation, medullary cords hyperplasia (MC) and antigen rSBm7462 presence in PAP+ cells. This study shows that the recombinant peptide rSBm7462 induces a T-dependent adaptive immune response on lymphoid tissues characterized by the affinity and immunological memory in the secondary lymphoid tissues structure formation. / O carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus é responsável por perdas econômicas significativas nos países das regiões tropicais e subtropicais. Atualmente, o controle químico para este parasito é afetado pela geração de resistência aos diversos acaricidas comerciais, ato que tem sido reportado em vários países do mundo. Além disso, a preocupação com os resíduos químicos nos produtos de origem animal e no ambiente é um problema de saúde pública. Portanto, o controle imunológico torna-se uma alternativa promissora devido à sua fácil administração, ser economicamente viável e contribuir na segurança alimentar. O objetivo deste trabalho foi avaliar a resposta de linfonodos de bovinos imunizados a campo com o peptídeo rSBm7462 anti Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Foram utilizados 14 bovinos mestiços (Bos taurus x Bos indicus), com grau de sangue variado holandês-zebu, com idades entre 4-10 meses, mantidos em duas propriedades rurais do norte de Minas Gerais. Os animais receberam três imunizações do peptídeo rSBm7462, aplicados por via subcutânea, com intervalo de 30 dias. Após 15 dias de cada imunização, os linfonodos pré-escapulares foram coletados cirurgicamente e fixados por 18 horas em formol. Posteriormente foram incluídos em parafina. As amostras dos linfonodos foram coradas pela técnica hematoxilina-eosina (HE) para a observação de eventos celulares. Para a identificação do antígeno nos linfonodos dos animais imunizados, foi realizada a técnica de imunoistoquimica (IHQ) com o método peroxidase-anti-peroxidase (PAP). A resposta de linfonodos dos bovinos inoculados foi avaliada pelas análises de formação de centros germinais (CG), hiperplasia de cordões medulares (CM) e a presença do antígeno rSBm7462 em células PAP+, demostrando que o peptídeo recombinante rSBm7462 induz uma resposta imune adaptativa T-dependente, caracterizada nos tecidos linfóides secundários pela formação de estruturas que conferem afinidade e memória imunológica.

Submitted by PPG Biologia Celular e Molecular (bcm@pucrs.br) on 2017-10-24T11:23:13Z No. of bitstreams: 1 BRUNA_FERREIRA_LEAL_TES.pdf: 9428836 bytes, checksum: 9ef80f04ac10ad1e26b54ce86ddd80ce (MD5) / Approved for entry into archive by Caroline Xavier (caroline.xavier@pucrs.br) on 2017-10-26T15:45:53Z (GMT) No. of bitstreams: 1 BRUNA_FERREIRA_LEAL_TES.pdf: 9428836 bytes, checksum: 9ef80f04ac10ad1e26b54ce86ddd80ce (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-26T15:54:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 BRUNA_FERREIRA_LEAL_TES.pdf: 9428836 bytes, checksum: 9ef80f04ac10ad1e26b54ce86ddd80ce (MD5) Previous issue date: 2017-03-28 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / Rhipicephalus microplus is a tick that infests preferably bovines and cause a great damage in the livestock. The main control method against ticks is the use of acaricides, which lead to the emergence of resistant populations, in addition to increasing costs and risk of contamination of meat, milk and environment. Thus, vaccine antigens have been identified and characterized as an alternative to acaricides. Salivary molecules of hematophagous parasites can inhibit responses associated to homeostasis and modulate the host immune system and, therefore, are options in the search for anti-tick vaccines. This work characterized a glycine rich-protein and the paramyosin of R. microplus. Glycine rich-proteins are secreted in tick saliva and are essential in the attachment and blood feeding. Paramyosin is able to evade the host immune system and proved to be an important allergen of mites and vaccine antigen against helminths. The cDNA and amino acid sequences of the R. microplus glycine rich-protein (RmGRP) were identified and analyzed, revealing two distinct portions of the protein (glycine residues presented dispersed in the N-terminal region and in repeated patterns along the C-terminal region). Cloning, expression and purification of RmGRP were performed and the recombinant protein was tested for recognition by sera from naturally and experimentally infested bovines, indicating their antigenicity, but also displaying a high heterogeneity in protein recognition between individuals and among infestations in the same individual. In addition, recombinant RmGRP was recognized by sera from rabbits immunized with saliva and salivary gland from partially and fully engorged females and eggs, but not from sera from rabbits immunized with gut. Expression of the gene encoding RmGRP (rmgrp) in different female tissues and tick development stages was evaluated by qRT-PCR. Gene transcription was found in eggs, larvae, adult males, salivary glands, fat bodies and ovaries of partially and fully engorged females, with the highest expression levels in 1-day-old larvae and salivary glands of fully engorged females. rmgrp was not expressed in 3- and 6-day-old eggs and in guts of partially and fully engorged females, corroborating to the aforementioned result. Effects of RNAm silencing corresponding to RmGRP and RmPRM were evaluated, which resulted in egg laying reduction in the group in which the RmPRM gene was silenced and in the reduction of larval hatching rate in the two groups. Therefore, it is suggested that both proteins are important during larval development, but only RmPRM is required in egg formation and/or laying. Cloning of the coding DNA regions and expression of N-terminal, internal and Cterminal fragments of R. microplus paramyosin (RmPRM) in Escherichia coli and of the complete RmPRM in Pichia pastoris were confirmed by SDS-PAGE and western-blot. From the data obtained, both RmGRP and RmPRM have characteristics that make them possible candidates to compose a cocktail vaccine against R. microplus. / O Rhipicephalus microplus ? um carrapato que infesta preferencialmente bovinos, causando um grande preju?zo ? pecu?ria. O principal m?todo de controle ? o uso de acaricidas, os quais selecionam popula??es resistentes, al?m de aumentar o custo e o risco de contamina??o da carne, do leite e do ambiente. Desta forma, ant?genos vacinais t?m sido identificados e caracterizados como alternativa aos acaricidas. Mol?culas salivares de parasitos hemat?fagos podem inibir respostas associadas ? homeostase e modular o sistema imune do hospedeiro e, portanto, s?o op??es na busca por vacinas anti-carrapato. Neste contexto, este trabalho caracterizou uma prote?na rica em glicinas e a paramiosina do R. microplus. Prote?nas ricas em glicinas s?o secretadas na saliva e s?o essenciais na fixa??o e na alimenta??o do parasito. J? a paramiosina ? capaz de evadir o sistema imune do hospedeiro e mostrou-se um importante alergeno em ?caros e ant?geno vacinal contra helmintos. As sequ?ncias de cDNA e amino?cidos da prote?na rica em glicinas de R. microplus (RmPRG) foram identificadas e analisadas, revelando duas por??es distintas da prote?na (com glicinas isoladas ao longo da regi?o N-terminal e padr?es repetidos contendo glicinas ao longo da regi?o C-terminal). A clonagem, express?o e purifica??o da RmGRP foram realizadas e a prote?na recombinante foi testada quanto ao reconhecimento por soros de bovinos naturalmente e experimentalmente infestados, indicando a sua antigenicidade, mas tamb?m uma alta heterogeneidade no reconhecimento da prote?na entre indiv?duos e entre infesta??es no mesmo indiv?duo. Al?m disso, a RmGRP recombinante foi reconhecida pelos soros de coelhos imunizados com saliva e gl?ndula salivar de f?meas parcialmente e totalmente ingurgitadas e ovos, mas n?o por soros de coelhos imunizados com intestino. A express?o do gene codificante para a RmGRP (rmgrp) em diferentes tecidos de f?meas e fases do desenvolvimento do carrapato foi avaliada por qRT-PCR. A transcri??o do gene foi encontrada em ovos, larvas, machos adultos, al?m de gl?ndulas salivares, corpos gordurosos e ov?rios de f?meas parcialmente e totalmente ingurgitadas, apresentando os maiores n?veis de express?o nas larvas de 1 dia e nas gl?ndulas salivares de f?meas totalmente ingurgitadas. rmgrp n?o foi expresso nos ovos de 3 e 6 dias e no intestino de f?meas parcialmente e totalmente ingurgitadas, corroborando o resultado anterior. Ainda foram avaliados os efeitos do silenciamento do RNAm correspondente ? RmGRP e ? RmPRM, o que resultou na redu??o da taxa de postura de ovos no grupo em que o gene da RmPRM foi silenciado e da eclos?o de larvas em f?meas tratadas nos dois grupos. Portanto, sugere-se que as duas prote?nas s?o importantes durante o desenvolvimento larval, mas s? a RmPRM seja necess?ria na forma??o e/ou postura dos ovos. Tamb?m foi realizada a 8 clonagem da regi?o codificante e express?o dos fragmentos N-terminal, interno e C-terminal da paramiosina de R. microplus (RmPRM) em E. coli e da RmPRM completa em P. pastoris, sendo confirmadas por SDS-PAGE e western-blot. A partir dos dados obtidos, ambas RmGRP e RmPRM apresentam caracter?sticas que fazem delas poss?veis candidatas a comporem uma vacina coquetel contra o R. microplus.

Submitted by Jorge Silva (jorgelmsilva@ufrrj.br) on 2017-04-26T19:53:52Z No. of bitstreams: 1 2012 - Simone Quinelato Bezerra.pdf: 1703088 bytes, checksum: c39ad4f0bc5fb8b05085a7e4684060b9 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-26T19:53:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012 - Simone Quinelato Bezerra.pdf: 1703088 bytes, checksum: c39ad4f0bc5fb8b05085a7e4684060b9 (MD5) Previous issue date: 2012-03-30 / FAPERJ / Aiming to decrease the chemicals acaricide use and their damages, new alternatives for ticks control has been studied. Metarhizium anisopliae s.l. is one of the most studied fungi in agricultural pest management programs, since it has great acaricide potential. Therefore, this study aimed to characterize molecular and morphologically, as well as evaluate the virulent potential of 30 M. anisopliae s.l. isolates from different geographical regions, hosts or substrates allowing the selection of virulent isolates in order to be further investigated for field programs of microbial control of pests. Initially, the analyses of morphological characterizations of the isolates were made to confirm their identification. Each isolate had its conidial potential production evaluated. The colonies studied showed morphological characteristics consistent with those described in the literature. The colonies diameter varied between 29.66 mm and 51.33 mm among isolates. There was both length and width variation in the conidia and phialides in the same isolate, as well as the presence of grouped and solitary phialides. The conidial production potential was variable among isolates, but both conidial size and colonies diameter did not influence the conidial production; isolates with low conidial production showed similar colony size in comparison to isolates with high potential. In a second stage of the study, the virulence of these isolates was evaluated to Rhipicephalus microplus larvae treated with one of the four different conidial concentrations (105, 106, 107 or 108 conidia.mL-1). The lethal action of Brazilian M. anisopliae s.l isolates to R. microplus larvae were confirmaded with high mortality among the isolates, which in general was proportional to the conidia concentration of the treatments. Most isolates killed larvae population with 107 conidia.mL-1 concentration, however the most virulent isolates presented lethal concentration of 106 conidia.mL-1 with main percentages of mortality nearly 100% at day 20 after treatment. In addition, the genetic variability of these isolates was performed to evaluate their relationship with other species of Metarhizium sp. through RFLP-PCR analysis and ITS1-5.8S-ITS2 rDNA sequencing. No specificity pattern was observed when isolates from the same region, host or substrate were grouped. Low genetic variability was observed among isolates, which were basically grouped into two groups. The CG 344 isolate was shown to be genetically distant from the remaining Brazilian isolates studied, but according to the ?GenBank? sequences comparison, it was related to the Metarhizium genus. It is suggested that this variation occured owing the lack of procedures that could generated morphological and molecular changes, which probably contribute to this low genetic variability. The present study allowed the detection of M. anisopliae s.l. isolates with highly virulence to R. microplus larvae, that may be considered potential biocontrol agents for this tick species, emphasizing the importance of molecular tools for identification and characterization of fungal isolates, ensuring the product quality, their success implement and the environmental track of the fungi at field biological control programs. / Na tentativa de diminuir a utiliza??o de produtos qu?micos e os danos por eles causados, novas alternativas para o controle de carrapatos vem sendo estudadas. O fungo Metarhizium anisopliae ? um dos mais estudados em programas agropecu?rios de manejo de pragas, pois apresenta grande potencial acaricida. Baseado nisso, o presente estudo objetivou a caracteriza??o morfol?gica, molecular e a avalia??o da virul?ncia de 30 isolados brasileiros de M. anisopliae s.l. provenientes de diferentes regi?es geogr?ficas, hospedeiros ou substratos, com a finalidade de selecionar isolados mais virulentos para utiliza??o em futuros programas de biocontrole de carrapatos. Inicialmente os isolados foram caracterizados morfologicamente para confirma??o de sua identifica??o, tamb?m sendo avaliado o potencial de produ??o de con?dios de cada isolado. As col?nias estudadas apresentaram caracter?sticas morfol?gicas compat?veis com as descritas na literatura. O tamanho das col?nias variou entre 29,66 mm e 51,33 mm de di?metro. Houve varia??o no comprimento e na largura de con?dios e fi?lides num mesmo isolado, assim como a presen?a de fi?lides agrupadas e solit?rias. O potencial de produ??o de con?dios foi vari?vel entre os isolados, por?m tanto o tamanho dos con?dios quanto o di?metro das col?nias n?o influenciaram a produ??o de con?dios. Numa segunda etapa do estudo, foi avaliada a virul?ncia destes isolados sobre larvas de Rhipicephalus microplus tratadas com uma das quatro diferentes concentra??es de con?dios (105, 106, 107 ou 108 con?dios/mL). Foi confirmada a a??o letal dos isolados brasileiros de M. anisopliae s.l. sobre larvas de R. microplus, geralmente ocorrendo de forma diretamente proporcional a concentra??o conidial dos tratamentos. A maioria dos isolados ocasionou a morte de metade da popula??o de larvas com a concentra??o de 107 con?dios/mL; os isolados mais virulentos apresentaram esta concentra??o letal com 106 con?dios/mL, com percentuais m?dios de mortalidade de larvas pr?ximos de 100% ao 20? dia ap?s tratamento. Al?m disso, buscou-se avaliar a variabilidade gen?tica destes isolados e sua rela??o com outras esp?cies do g?nero Metarhizium atrav?s da an?lise de RFLP-PCR e do sequenciamento da regi?o ITS1-5.8S-ITS2 do rDNA. N?o foi observado um padr?o de especificidade para o agrupamento entre isolados oriundos de mesma regi?o, hospedeiro ou substrato. Foi observada variabilidade gen?tica entre os isolados que basicamente se agruparam em dois grupos. O isolado CG 344 mostrou-se geneticamente distante de todos os outros, mas de acordo com a compara??o com sequ?ncias obtidas do ?GenBank? mostrou-se relacionado ao g?nero Metarhizium. Esta varia??o pode ser devido ao fato deste isolado ter sido poupado de processos que gerassem altera??es morfol?gicas e moleculares, o que possivelmente contribuiu para a pequena variabilidade gen?tica obsevada. O presente estudo possibilitou a detec??o de isolados brasileiros de M. anisopliae s.l. com elevada virul?ncia para larvas de R. microplus, podendo ser considerados potenciais agentes no biocontrole desta esp?cie de carrapato, ressaltando a import?ncia da utiliza??o de ferramentas moleculares para identifica??o e caracteriza??o destes isolados, contribuindo para a qualidade do produto, o sucesso de sua aplica??o e o monitoramento de um isolado introduzido no ambiente com finalidade de controle biol?gico.

Rhiphicephalus microplus is one of the main ectoparasites of cattle in regions of tropical and subtropical climate. The economic losses caused by this parasite are related to treatment costs, decreased productivity and disease transmission. Currently the use of chemical products is still the most common form of control of the cattle tick, however, its use in an inadequate and suppressive way, has been causing the development of resistance to different classes of commercially available acaricides. Thus, the control of this parasite has been characterized by presenting a great challenge for technicians and producers. An alternative to tick control is the association of two different pharmacological bases, and currently this form of presentation is widely found commercially. The objective of this work is to describe the evaluation of the effectiveness of organophosphates and synthetic pyrethroids based on different combinations of R. microplus in the state of Rio Grande do Sul, Brazil. For this, 54 samples of cattle farms were collected, located in different municipalities of the state of Rio Grande do Sul. The evaluation of the in vitro efficacy of the acaricides tested was performed through the adult immersion test (AIT). In order to carry out the tests, four commercially available products were chosen: Ectoparasiticide A - 15% cypermethrin + 25% chlorpyrifos + 1% citronellal - (Colosso®, Ouro Fino Animal Health), Ectoparasiticide B - 15% cypermethrin + 30% chlorpyrifos + 15% fenthion - (Colosso FC30®, Ouro Fino Animal Health), Ectoparasiticide C - 50% chlorpyriphos + 6% cypermethrin high-cis - (Flytion®, Clarion Biosciences Ltda.) and Ectoparasiticide D - 16% ethion + 8.5% chlorpyriphos + 5% alpha-cypermethrin - (Potenty®, MSD Animal Health). The cypermethrin/ chlorpyrifos/ fenthion combination showed the best results, with an average efficiency greater than 95%, being effective in 94.44% (51/54) of the tested farms. The product containing the cypermethrin / chlorpyrifos / citronellal combination had a lower mean efficacy (62.11%), being effective in only 29.62% (16/54) of the properties tested. R. microplus presents different degrees of resistance to the association of organophosphates and synthetic pyrethroids, and multiple resistance was observed in most of the populations studied. Only the cypermethrin/ chlorpyrifos/ fenthion combination showed acceptable mean levels of efficacy in the tick populations studied. In this way, it is essential to establish a frequent monitoring of the effectiveness of the carrapaticides used, in order to prolong their useful life, contributing to their rational use for tick control in cattle. / Rhiphicephalus microplus é um dos principais ectoparasitas de bovinos em regiões de clima tropical e subtropical. As perdas econômicas que este parasita causa, estão relacionadas aos custos com tratamento, diminuição da produtividade e transmissão de doenças. Atualmente o uso de produtos químicos ainda é a forma mais comum de controle do carrapato bovino, no entanto, seu uso de maneira inadequada e supressiva, vem causando o desenvolvimento de resistência às diferentes classes de acaricidas disponíveis comercialmente. Assim, o controle deste parasita tem se caraterizado por apresentar um grande desafio para técnicos e produtores. Uma alternativa ao controle do carrapato é a associação de duas bases farmacológicas diferentes, sendo que atualmente esta forma de apresentação é amplamente encontrada a nível comercial. O objetivo deste trabalho é descrever a avaliação da eficácia de associações carrapaticidas, a base de organofosforados e piretroides sintéticos, em diferentes populações de R. microplus no estado do Rio Grande do Sul, Brasil. Para isto, foram coletadas amostras de carrapatos de 54 propriedades, localizadas em diferentes municípios do estado do Rio Grande do Sul. A avaliação da eficácia in vitro dos acaricidas testados foi realizada através do teste de imersão de teleóginas (bicarrapaticidograma). Para a realização dos testes, foram escolhidos quatro produtos comercialmente disponíveis, sendo eles denominados: Produto A - 15% cipermetrina + 25% cloripirifós + 1% citronelol - (Colosso®, Ouro Fino Saúde Animal), Produto B - 15% cipermetrina + 30% cloripirifós + 15% fenthion - (Colosso FC30®, Ouro Fino Saúde Animal), Produto C - 50% cloripirifós + 6% cipermetrina high-cis - (Flytion®, Clarion Biosciences Ltda.), Produto D - 16% ethion + 8.5% cloripirifós + 5% alfa-cipermetrina - (Potenty®, MSD Saúde Animal). A associação de cipermetrina/clorpirifós/fenthion, apresentou os melhores resultados, com eficácia média superior a 95%, sendo eficaz em 94,44% (51/54) das propriedades testadas. O produto contendo a associação de cipermetrina/clorpirifós/citronelal, apresentou menor eficácia média (62,11%), sendo eficaz em apenas 29,62% (16/54) das propriedades testadas. R. microplus, apresenta diferentes graus de resistência à associação de organofosforados e piretroides sintéticos, sendo observado resistência múltipla em boa parte das populações estudadas. Apenas a combinação de cipermetrina/clorpirifos/fenthion apresentou níveis médios aceitáveis de eficácia nas populações de carrapato estudadas. Desta maneira, é fundamental estabelecer um monitoramento frequente da eficácia dos carrapaticidas utilizados, a fim de prolongar sua vida útil, contribuindo para o seu uso racional para o controle do carrapato em bovinos.

O carrapato Rhipicephalus microplus é o principal ectoparasita de bovinos. O controle de R. microplus baseia-se principalmente no uso de acaricidas químicos, o que contribuiu para o problema emergente da seleção de populações de carrapatos resistentes. Portanto, há a necessidade do desenvolvimento de métodos mais eficientes/sustentáveis de controle, como o controle biológico utilizando fungos acaropatogênicos. A eficácia do fungo Metarhizium anisopliae de forma isolada ou em associação com acaricida químico para controle do carrapato bovino já foi evidenciada em condições de campo utilizando uma cepa de carrapatos resistente à acaricidas. No entanto, pouco se sabe sobre os mecanismos moleculares de R. microplus envolvidos na sua interação com M. anisopliae e com acaricidas. Assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar a resposta de larvas de R. microplus expostas ao fungo, ao acaricida e à associação de ambos. Primeiramente foi realizado um estudo para determinar a metodologia mais indicada para avaliar o efeito in vitro do fungo M. anisopliae sobre larvas de R. microplus. Para isso, comparamos o Teste de Pacote de Larvas modificado (TPL) e o Teste de Imersão de Larvas (TIL). Os valores de tempo letal mediano (TL50) obtido na maior concentração de M. anisopliae (108conídios/mL) foram 24,8 e 9,2 dias para o TPL e TIL, respectivamente. A mortalidade após 21 dias foi de 38% e 98% para o TPL e TIL respectivamente, na mesma concentração. O TIL demonstrou ser o teste mais indicado a ser utilizado, sendo, portanto, escolhido para realização dos experimentos futuros. Em seguida foi realizado um estudo para comparar a suscetibilidade de diferentes isolados de R. microplus ao fungo M. anisopliae. Foram avaliados 67 isolados de campo. Para tanto, as larvas de R. microplus foram imersas em uma suspensão de M. anisopliae (108conídios/mL) durante 5 min. Os tempos letais medianos (TL50) variaram de 2,6 a 24,9 dias A mortalidade observada no 15º dia após o tratamento variou de 26,3 a 100% nas amostras testadas. Esses resultados demonstraram que as populações de campo de R. microplus apresentam uma alta variação em sua suscetibilidade a M. anisopliae. Por fim, foi realizada uma análise transcricional (RNAseq) de larvas de R. microplus expostas a M. anisopliae, cipermetrina, associação de ambos e do controle (não-tratado). A análise dos transcritos dos quatro grupos gerou um total de 507.792 sequências com um tamanho total de 303.160.891 pb. Foram encontrados 31 genes diferencialmente expressos no grupo controle quando comparado com M. anisopliae, 39 com cipermetrina e 73 com M. anisopliae + cipermetrina. M. anisopliae e o grupo da associação apresentaram 81 genes diferencialmente expressos e M. anisopliae e cipermetrina, 46. Houve 177 genes diferencialmente expressos ao comparar M. anisopliae + cipermetrina com larvas expostas à cipermetrina Os resultados deste estudo demonstraram que a associação M. anisopliae + cipermetrina aumentou a expressão de genes relacionados a resposta à agressão, provavelmente pelo fato da associação provocar uma agressão maior ao carrapato e este responder de forma mais rápida, levando à superexpressão de genes de defesa. As descobertas deste estudo fornecem informações sobre as vias e mecanismos moleculares de R. microplus ativados em resposta à interação de M. anisopliae e a acaricida. Além disso, esses estudos estabelecem as bases para pesquisas futuras sobre genes-chave que controlam a suscetibilidade de R. microplus a M. anisopliae. O sinergismo evidenciado em nossos estudos comprova a ideia de que o controle integrado, utilizando o controle biológico com o controle químico é uma opção tanto para o controle de cepas de carrapatos resistentes à acaricidas, quanto para um controle mais rápido de cepas de carrapatos que não apresentam resistência ou que apresentem resistência intermediária. / The tick Rhipicephalus microplus is the major cattle ectoparasite. The control of R. microplus is based mainly on the use of chemical acaricides, which contributed to the emerging problem of the selection of tick populations resistant to acaricides. Therefore, there is a need for the development of more efficient/sustainable methods of control, such as biological control using acari pathogenic fungi. The effectiveness of the fungus Metarhizium anisopliae alone or in association with chemical acaricide to control the bovine tick has already been evidenced under field conditions using an acaricide resistant tick strain. However, to date, little is known about the molecular pathways of R. microplus involved with its interaction with M. anisopliae and with acaricides. Thus, the aim of the present study is to evaluate the response of R. microplus larvae exposed to the fungus, the acaricide and the association of both. Firstly, a study was carried out to determine the most appropriate methodology to evaluate the in vitro effect of the fungus M. anisopliae on larvae of R. microplus tick. For this, we compared the Modified Larval Packet Test (LPT) and the Larval Immersion Test (LIT). The values of lethal time (LT50) obtained in the highest concentration of M. anisopliae (108conidia / mL) were 24.8 and 9.2 days for LPT and LIT, respectively. Mortality after 21 days was 38% and 98% for LPT and LIT, respectively, at the same concentration. The LIT proved to be the most indicated test to be used and was therefore chosen to carry out the following experiments Then, a study was performed to compare the susceptibility of different R. microplus isolates to M. anisopliae fungus. Sixty-seven field isolates were evaluated. For this, R. microplus larvae were immersed in a suspension of M. anisopliae (108conidia/mL) for 5 min. Lethal times (LT50) ranged from 2.6 to 24.9 days. Mortality observed on the 15th day after treatment ranged from 26.3 to 100% in the tested samples. These results demonstrated that R. microplus field populations showed a high variation in their susceptibility to M. anisopliae. Finally, a RNAseq analysis of R. microplus larvae exposed to M. anisopliae, cypermethrin, association of both or untreated (control) was performed. Analysis of the transcripts of the four groups generated a total of 507,792 sequences with a total length of 303,160,891 bp. We found 31 differentially expressed genes in the control group when compared to M. anisopliae, 39 with cypermethrin and 73 with M. anisopliae + cypermethrin. M. anisopliae and the association group had 81 differentially expressed genes and M. anisopliae and cypermethrin, 46 There were 177 differentially expressed genes when comparing M. anisopliae + cypermethrin with cypermethrin exposed larvae. The results of this study demonstrated that the association of M. anisopliae + cypermethrin increased the expression of genes related to response to aggression, possibly because the M. anisopliae + cypermethrin association causes a greater aggression to the tick and, then it could respond quickly, leading to overexpression of defense genes. The findings of this study provide information on the pathways and molecular mechanisms of R. microplus in response to the interaction of M. anisopliae and acaricides. In addition, these studies establish the basis for future research on key genes that control the susceptibility of R. microplus to M. anisopliae. The synergism evidenced in our studies confirms the idea that integrated control using biological control and chemical control is an option both for the control of acaricide resistant tick strains and for a faster control of tick strains that do not show resistance or exhibit intermediate resistance.

O carrapato Rhipicephalus microplus é o principal ectoparasita de bovinos. O controle de R. microplus baseia-se principalmente no uso de acaricidas químicos, o que contribuiu para o problema emergente da seleção de populações de carrapatos resistentes. Portanto, há a necessidade do desenvolvimento de métodos mais eficientes/sustentáveis de controle, como o controle biológico utilizando fungos acaropatogênicos. A eficácia do fungo Metarhizium anisopliae de forma isolada ou em associação com acaricida químico para controle do carrapato bovino já foi evidenciada em condições de campo utilizando uma cepa de carrapatos resistente à acaricidas. No entanto, pouco se sabe sobre os mecanismos moleculares de R. microplus envolvidos na sua interação com M. anisopliae e com acaricidas. Assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar a resposta de larvas de R. microplus expostas ao fungo, ao acaricida e à associação de ambos. Primeiramente foi realizado um estudo para determinar a metodologia mais indicada para avaliar o efeito in vitro do fungo M. anisopliae sobre larvas de R. microplus. Para isso, comparamos o Teste de Pacote de Larvas modificado (TPL) e o Teste de Imersão de Larvas (TIL). Os valores de tempo letal mediano (TL50) obtido na maior concentração de M. anisopliae (108conídios/mL) foram 24,8 e 9,2 dias para o TPL e TIL, respectivamente. A mortalidade após 21 dias foi de 38% e 98% para o TPL e TIL respectivamente, na mesma concentração. O TIL demonstrou ser o teste mais indicado a ser utilizado, sendo, portanto, escolhido para realização dos experimentos futuros. Em seguida foi realizado um estudo para comparar a suscetibilidade de diferentes isolados de R. microplus ao fungo M. anisopliae. Foram avaliados 67 isolados de campo. Para tanto, as larvas de R. microplus foram imersas em uma suspensão de M. anisopliae (108conídios/mL) durante 5 min. Os tempos letais medianos (TL50) variaram de 2,6 a 24,9 dias A mortalidade observada no 15º dia após o tratamento variou de 26,3 a 100% nas amostras testadas. Esses resultados demonstraram que as populações de campo de R. microplus apresentam uma alta variação em sua suscetibilidade a M. anisopliae. Por fim, foi realizada uma análise transcricional (RNAseq) de larvas de R. microplus expostas a M. anisopliae, cipermetrina, associação de ambos e do controle (não-tratado). A análise dos transcritos dos quatro grupos gerou um total de 507.792 sequências com um tamanho total de 303.160.891 pb. Foram encontrados 31 genes diferencialmente expressos no grupo controle quando comparado com M. anisopliae, 39 com cipermetrina e 73 com M. anisopliae + cipermetrina. M. anisopliae e o grupo da associação apresentaram 81 genes diferencialmente expressos e M. anisopliae e cipermetrina, 46. Houve 177 genes diferencialmente expressos ao comparar M. anisopliae + cipermetrina com larvas expostas à cipermetrina Os resultados deste estudo demonstraram que a associação M. anisopliae + cipermetrina aumentou a expressão de genes relacionados a resposta à agressão, provavelmente pelo fato da associação provocar uma agressão maior ao carrapato e este responder de forma mais rápida, levando à superexpressão de genes de defesa. As descobertas deste estudo fornecem informações sobre as vias e mecanismos moleculares de R. microplus ativados em resposta à interação de M. anisopliae e a acaricida. Além disso, esses estudos estabelecem as bases para pesquisas futuras sobre genes-chave que controlam a suscetibilidade de R. microplus a M. anisopliae. O sinergismo evidenciado em nossos estudos comprova a ideia de que o controle integrado, utilizando o controle biológico com o controle químico é uma opção tanto para o controle de cepas de carrapatos resistentes à acaricidas, quanto para um controle mais rápido de cepas de carrapatos que não apresentam resistência ou que apresentem resistência intermediária. / The tick Rhipicephalus microplus is the major cattle ectoparasite. The control of R. microplus is based mainly on the use of chemical acaricides, which contributed to the emerging problem of the selection of tick populations resistant to acaricides. Therefore, there is a need for the development of more efficient/sustainable methods of control, such as biological control using acari pathogenic fungi. The effectiveness of the fungus Metarhizium anisopliae alone or in association with chemical acaricide to control the bovine tick has already been evidenced under field conditions using an acaricide resistant tick strain. However, to date, little is known about the molecular pathways of R. microplus involved with its interaction with M. anisopliae and with acaricides. Thus, the aim of the present study is to evaluate the response of R. microplus larvae exposed to the fungus, the acaricide and the association of both. Firstly, a study was carried out to determine the most appropriate methodology to evaluate the in vitro effect of the fungus M. anisopliae on larvae of R. microplus tick. For this, we compared the Modified Larval Packet Test (LPT) and the Larval Immersion Test (LIT). The values of lethal time (LT50) obtained in the highest concentration of M. anisopliae (108conidia / mL) were 24.8 and 9.2 days for LPT and LIT, respectively. Mortality after 21 days was 38% and 98% for LPT and LIT, respectively, at the same concentration. The LIT proved to be the most indicated test to be used and was therefore chosen to carry out the following experiments Then, a study was performed to compare the susceptibility of different R. microplus isolates to M. anisopliae fungus. Sixty-seven field isolates were evaluated. For this, R. microplus larvae were immersed in a suspension of M. anisopliae (108conidia/mL) for 5 min. Lethal times (LT50) ranged from 2.6 to 24.9 days. Mortality observed on the 15th day after treatment ranged from 26.3 to 100% in the tested samples. These results demonstrated that R. microplus field populations showed a high variation in their susceptibility to M. anisopliae. Finally, a RNAseq analysis of R. microplus larvae exposed to M. anisopliae, cypermethrin, association of both or untreated (control) was performed. Analysis of the transcripts of the four groups generated a total of 507,792 sequences with a total length of 303,160,891 bp. We found 31 differentially expressed genes in the control group when compared to M. anisopliae, 39 with cypermethrin and 73 with M. anisopliae + cypermethrin. M. anisopliae and the association group had 81 differentially expressed genes and M. anisopliae and cypermethrin, 46 There were 177 differentially expressed genes when comparing M. anisopliae + cypermethrin with cypermethrin exposed larvae. The results of this study demonstrated that the association of M. anisopliae + cypermethrin increased the expression of genes related to response to aggression, possibly because the M. anisopliae + cypermethrin association causes a greater aggression to the tick and, then it could respond quickly, leading to overexpression of defense genes. The findings of this study provide information on the pathways and molecular mechanisms of R. microplus in response to the interaction of M. anisopliae and acaricides. In addition, these studies establish the basis for future research on key genes that control the susceptibility of R. microplus to M. anisopliae. The synergism evidenced in our studies confirms the idea that integrated control using biological control and chemical control is an option both for the control of acaricide resistant tick strains and for a faster control of tick strains that do not show resistance or exhibit intermediate resistance.

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-12-26T18:07:39Z No. of bitstreams: 1 Tese_Andrina Braga.pdf: 3419509 bytes, checksum: cf371a1829a1d9fd26aa223dfca9d501 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-12-26T18:07:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_Andrina Braga.pdf: 3419509 bytes, checksum: cf371a1829a1d9fd26aa223dfca9d501 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-12-26T18:07:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_Andrina Braga.pdf: 3419509 bytes, checksum: cf371a1829a1d9fd26aa223dfca9d501 (MD5) Previous issue date: 2017-07-21 / FAPEAM - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / R. microplus and H. irritans are ectoparasites that cause economic losses in Brazilian livestock. Natural products extracted from plants are promising sources for pest control, reducing the negative effects caused by the uncontrolled application of commercially available acaricides. P. tuberculatum stands out in the surveys due to its insecticidal actions. Therefore, the objective of this work is to perform the phytochemical study of P. tuberculatum, as well as its insecticidal potential against H. irritans and R. microplus. In this study the insecticidal potential of extracts and isolated substances of P. tuberculatum was evaluated, extracts were obtained from leaves, fruits and stalks prepared with solvents: hexane, chloroform, ethyl acetate and ethanol in six concentrations, however, for Como Concentrations. The activity of the extracts was evaluated on engorged larvae and females of R. microplus and adults H. irritans. The isolated and identified substances were piplatin, pelitorin and 3,4,5-trimethoxy dihydrocinnamic acid isolated from ethanolic extract of P. tuberculatum fruits. There is no immersion test of adults of R. microplus, it was observed that it offers effective results of fruit extract with 99,7%, and for other extracts or fruit are also shown as promising for adult immersion test. For R. microplus larvae a 24 hour evaluation, observing LC50 of 1,23 mg/mL and 1,29 mg/mL for hexenic leaf and bead extracts, respectively. The LC50 found for H. irritans on impregnated filter paper, the ethanolic extract of stems at LC50 was 6,00 mg/mL, which was the best result for this test. However as isolated substances, the message shown (LC50 of 0,48 mg/mL), this may have been due to a combination of compounds, since in the extracts with a combination of compounds, with the most known results. Thus, the present work demonstrates that the species P. tuberculatum presents an important acaricidal action. / R. microplus e H. irritans são ectoparasitas que causam prejuízos econômicos na pecuária brasileira. Os produtos naturais extraídos de plantas são fontes promissoras para o combate de pragas, reduzindo os efeitos negativos ocasionados pela aplicação descontrolada dos acaricidas disponíveis no mercado. P. tuberculatum destaca-se nas pesquisas devido as suas várias ações inseticidas. Com isso, o objetivo desse trabalho foi realizar estudo fitoquímico de P. tuberculatum, bem como determinar seu potencial inseticida contra H. irritans e R. microplus. Neste estudo, foi avaliado o potencial inseticida de extratos e de substâncias isoladas de P. tuberculatum. Os extratos foram obtidos de folhas, frutos e talos preparados com os solventes: hexâno, clorofómio, acetato de etila e etanol em seis concentrações, no entanto, para as substâncias foram quatro concentrações. A atividade dos extratos foi avaliada sobre larvas e fêmeas ingurgitadas de R. microplus e de adultos H. irritans. As substâncias isoladas e identificadas foram a piplatina, pelitorina e ácido 3,4,5- trimetóxi-dihidrocinâmico, isoladas a partir de extrato etanólico de frutos de P. tuberculatum. No teste de imersão de adultos de R. microplus, observou-se que o extrato que apresentou eficácia foi o extrato de fruto com 99,7%, sendo que para os demais extratos o fruto também mostrou ser promissor para o teste de imersão de adultos. Para as larvas de R. microplus, a avaliação ocorreu em 24 horas, observando CL50 de 1,23 mg/mL e 1,29 mg/mL para os extratos hexânico de folhas e talos, respectivamente. Já a CL50 encontrada para H. irritans em papel filtro impregnado, o extrato etanólico de talos a CL50 foi de 6,00 mg/mL, sendo este o melhor resultado para este teste. No entanto, entre as substâncias isoladas, somente a pelitorina mostrou resultados (CL50 de 0,48 mg/mL). Isso pode ter corrido devido a não combinação de compostos, já que nos extratos, a combinação dos compostos fez com que os resultados fossem mais potencializados. Dessa forma, o presente trabalho demonstrou que a espécie P. tuberculatum apresenta importante ação acaricida.

Submitted by Luanna Matias (lua_matias@yahoo.com.br) on 2015-03-11T18:57:33Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Lorena Lopes Ferreira - 2013.pdf: 653277 bytes, checksum: 4c9aa7d38ca40c4e856a2bcb3c40a6f2 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Matias (lua_matias@yahoo.com.br) on 2015-03-11T20:01:36Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Lorena Lopes Ferreira - 2013.pdf: 653277 bytes, checksum: 4c9aa7d38ca40c4e856a2bcb3c40a6f2 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-11T20:01:36Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Lorena Lopes Ferreira - 2013.pdf: 653277 bytes, checksum: 4c9aa7d38ca40c4e856a2bcb3c40a6f2 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2013-09-20 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Ticks are external parasites distributed in the world. Its parasitism causes direct and indirect damage to their hosts. Rhipicephalus microplus is the principal ectoparasite of the livestock causing economic and sanitary implications in the tropics regions. Control strategies are still a challenge and new alternatives are being sought to avoid the use of chemical methods that are reprehensible in relation to animal and human health, and also the environment. It is known that Bos indicus are more resistant to ticks than Bos taurus, while their crosses have a moderate resistance. The olfactory and gustatory senses allow these parasites to seek hosts, mating partners and distinguish between food and harmful substances. The receptors of these sensory organs are present throughout the body and appendages of arthropods, being pore sensilla in the chelicerae important when it comes to ticks taste receptors. Electrophysiology assists in the discovery of active principles that attract or repel these parasites and this will be proven after a behavioral test. This work was performed in order to characterize R. microplus electrophysiological responses to phagostimulants in different concentrations like salts (NaCl and KCl, 10-3 a 10-1M), glucose (10-4 a 10-1M), adenosine triphosphate (ATP, 10-6 a 10-2M), reduced glutathione (GSH, 10-6 a 10-2M), a mixture of substances (MIX, glucose1M+ATP10- 2M+GSH10-3M) and sera of susceptible and resistant cattle to ticks. A single cell electrophysiology technique was used in the taste sensila of R. microplus. Engorged nymphs of R. microplus were collected from naturally infested bovines. Females ticks were fed on rabbits for a period of three to five days. The females were removed and taken directly to the electrophysiology room in order to be prepared for the test. At least 10 females were tested per substance. The shape, frequency and amplitude of spikes were analyzed with the program Autospike. The statistical analysis was performed with the software R applying ANOVA followed by Tukey HSD post-hoc (5%). In relation to the phagostimulants it was observed that the taste receptors of the chelicerae were responsive for all substances tested, having a more intense responses at higher concentrations. The frequency of responses to salts ranged from 11.09 ± 0.98 to 28.50 ± 3.49 spikes/s; to glucose from 25.40 ± 2.33 to 37.15 ± 4.47 spikes/s, to ATP from 17.91 ± 1.28 to 37.30 ± 4.77 spikes/s; to GSH from 19.10 ± 2.84 to 56.6 ± 5.08 spikes/s and the MIX 50.60 ± 4.42 spikes/s. The responses were uni or multicellular depending on the concentration. Sera from resistant cattle xiii triggered a higher frequency of spikes/s (average of 53.48 ± 1.89 spikes/s, ranging from 48.45 ± 4.28 to 61.05 ± 5.14 spikes/s) when compared with the susceptible cattle (average of 40.33 ± 1.63 spikes/s, ranging from 33.30 ± 3.02 to 49.05 ± 5.20 spikes/s). The records analyzed showed that R. microplus was more stimulated by sera from resistant cattle than those from susceptible animals. It is known that in the serum has phagostimulants which probably triggered spikes in both groups. On the other hand, the greater number of spikes to resistant bovine serum might be due to the presence of deterrents compounds. Both sera showed a multicellular response. It was also observed that there were variations in the spikes frequency between animals of the same group according to the characteristic of spikes recorded. It was concluded that R. microplus respond in a dose dependent pattern to the phagostimulants tested. And also that, this tick was able differentiated the sera of susceptible to sera of resistant bovines. / Carrapatos são ectoparasitas obrigatoriamente hematófagos de diversas espécies e estão distribuídos mundialmente. Seu parasitismo acarreta danos diretos e indiretos a seus hospedeiros. Rhipicephalus microplus é o principal ectoparasita da pecuária causando problemas econômicos e sanitários nas regiões tropicais e subtropicais. O seu controle ainda é um desafio e novas alternativas estão sendo buscadas para evitar o uso de métodos químicos que são condenáveis em relação à saúde animal, humana e também ao meio ambiente. Sabe-se que os bovinos Bos indicus são mais resistentes que os Bos taurus, enquanto que seus cruzamentos possuem uma resistência moderada. A olfação e gustação permitem que esses parasitas busquem por hospedeiros, parceiros para cópula e distingam entre alimentos e substâncias nocivas a eles. Há receptores desses sentidos distribuídos por todo o corpo e apêndices dos artrópodes, sendo as porossensilas das quelíceras dos carrapatos importantes quando se refere a receptores gustativos. A eletrofisiologia auxilia na descoberta de compostos químicos que atraem ou repelem esses parasitos. Este trabalho foi feito com intuito de caracterizar as respostas eletrofisiológicas das porossensilas de R. microplus frente a alguns fagoestimulantes em diferentes concentrações como sais (NaCl e KCl, 10-3 a 10-1M), glicose (10-4 a 10-1M), adenosina trifosfato (ATP, 10-6 a 10-2M), glutationa reduzida (GSH, 10-6 a 10-2M) e uma mistura de substâncias (MIX, Glicose1M + ATP10-2M + GSH10-3M). Objetivou ainda avaliar as respostas eletrofisiológicas para soros de bovinos sensíveis (Girolando) e resistentes (Nelore) ao carrapato. Para isso foi utilizada a técnica de registro em sensila única nas porossensilas de fêmeas de R. microplus. Fêmeas alimentadas em coelhos por três a cinco dias foram usadas. Foram testadas no mínimo dez fêmeas por concentração e substância. Após o registro, analisou-se a forma, frequência e amplitude de spikes com o auxílio do programa Autospike. A análise estatística foi feita com o software R aplicando ANOVA seguido de Teste de Tukey com nível mínimo de significância de 5%. As porossensilas foram responsivas a todos os fagoestimulantes testados, mostrando resposta mais intensa nas maiores concentrações. A frequência de spikes/s para os sais variou de 11,09 ± 0,98 a 28,50 ± 3,49; para glicose 25,40 ± 2,33 a 37,15 ± 4,47; para o ATP de 17,91 ± 1,28 a 37,30 ± 4,77; para o GSH de 19,10 ± 2,84 a 56,6 ± 5,08 e o MIX de 50,60 ± 4,42. As respostas foram uni ou multicelulares. Os soros dos bovinos resistentes xi desencadearam uma maior frequência de spikes/s (média de 53,48 ± 1,89 spikes/s, variando 48,45 ± 4,28 a 61,05 ± 5,14 spikes/s) quando comparado com o grupo dos soros dos bovinos sensíveis (média de 40,33 ± 1,63 spikes /s, variando de 33,30 ± 3,02 a 49,05 ± 5,20 spikes/s). Os registros analisados mostraram que as porossensilas de R. microplus foram mais estimuladas pelo soro de animais resistentes do que aqueles de animais sensíveis. A maior frequência de spikes desencadeada pelos soros de bovinos resistentes pode ter ocorrido pela presença de compostos deterrentes além dos fagoestimulantes existentes no soro. Para ambos os soros foi observada uma resposta multicelular. Observou-se também que dentro de um mesmo grupo houve variações em relação à frequência dos spikes, que foi atribuído à resistência dos animais. Concluiu-se que as porossensilas de R. microplus responderam de forma dose dependente aos fagoestimulantes testados e também apresentaram uma maior atividade para soros de bovinos resistentes do que soros de bovinos sensíveis.

O carrapato Rhipicephalus microplus é o principal ectoparasita de bovinos. O controle de R. microplus baseia-se principalmente no uso de acaricidas químicos, o que contribuiu para o problema emergente da seleção de populações de carrapatos resistentes. Portanto, há a necessidade do desenvolvimento de métodos mais eficientes/sustentáveis de controle, como o controle biológico utilizando fungos acaropatogênicos. A eficácia do fungo Metarhizium anisopliae de forma isolada ou em associação com acaricida químico para controle do carrapato bovino já foi evidenciada em condições de campo utilizando uma cepa de carrapatos resistente à acaricidas. No entanto, pouco se sabe sobre os mecanismos moleculares de R. microplus envolvidos na sua interação com M. anisopliae e com acaricidas. Assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar a resposta de larvas de R. microplus expostas ao fungo, ao acaricida e à associação de ambos. Primeiramente foi realizado um estudo para determinar a metodologia mais indicada para avaliar o efeito in vitro do fungo M. anisopliae sobre larvas de R. microplus. Para isso, comparamos o Teste de Pacote de Larvas modificado (TPL) e o Teste de Imersão de Larvas (TIL). Os valores de tempo letal mediano (TL50) obtido na maior concentração de M. anisopliae (108conídios/mL) foram 24,8 e 9,2 dias para o TPL e TIL, respectivamente. A mortalidade após 21 dias foi de 38% e 98% para o TPL e TIL respectivamente, na mesma concentração. O TIL demonstrou ser o teste mais indicado a ser utilizado, sendo, portanto, escolhido para realização dos experimentos futuros. Em seguida foi realizado um estudo para comparar a suscetibilidade de diferentes isolados de R. microplus ao fungo M. anisopliae. Foram avaliados 67 isolados de campo. Para tanto, as larvas de R. microplus foram imersas em uma suspensão de M. anisopliae (108conídios/mL) durante 5 min. Os tempos letais medianos (TL50) variaram de 2,6 a 24,9 dias A mortalidade observada no 15º dia após o tratamento variou de 26,3 a 100% nas amostras testadas. Esses resultados demonstraram que as populações de campo de R. microplus apresentam uma alta variação em sua suscetibilidade a M. anisopliae. Por fim, foi realizada uma análise transcricional (RNAseq) de larvas de R. microplus expostas a M. anisopliae, cipermetrina, associação de ambos e do controle (não-tratado). A análise dos transcritos dos quatro grupos gerou um total de 507.792 sequências com um tamanho total de 303.160.891 pb. Foram encontrados 31 genes diferencialmente expressos no grupo controle quando comparado com M. anisopliae, 39 com cipermetrina e 73 com M. anisopliae + cipermetrina. M. anisopliae e o grupo da associação apresentaram 81 genes diferencialmente expressos e M. anisopliae e cipermetrina, 46. Houve 177 genes diferencialmente expressos ao comparar M. anisopliae + cipermetrina com larvas expostas à cipermetrina Os resultados deste estudo demonstraram que a associação M. anisopliae + cipermetrina aumentou a expressão de genes relacionados a resposta à agressão, provavelmente pelo fato da associação provocar uma agressão maior ao carrapato e este responder de forma mais rápida, levando à superexpressão de genes de defesa. As descobertas deste estudo fornecem informações sobre as vias e mecanismos moleculares de R. microplus ativados em resposta à interação de M. anisopliae e a acaricida. Além disso, esses estudos estabelecem as bases para pesquisas futuras sobre genes-chave que controlam a suscetibilidade de R. microplus a M. anisopliae. O sinergismo evidenciado em nossos estudos comprova a ideia de que o controle integrado, utilizando o controle biológico com o controle químico é uma opção tanto para o controle de cepas de carrapatos resistentes à acaricidas, quanto para um controle mais rápido de cepas de carrapatos que não apresentam resistência ou que apresentem resistência intermediária. / The tick Rhipicephalus microplus is the major cattle ectoparasite. The control of R. microplus is based mainly on the use of chemical acaricides, which contributed to the emerging problem of the selection of tick populations resistant to acaricides. Therefore, there is a need for the development of more efficient/sustainable methods of control, such as biological control using acari pathogenic fungi. The effectiveness of the fungus Metarhizium anisopliae alone or in association with chemical acaricide to control the bovine tick has already been evidenced under field conditions using an acaricide resistant tick strain. However, to date, little is known about the molecular pathways of R. microplus involved with its interaction with M. anisopliae and with acaricides. Thus, the aim of the present study is to evaluate the response of R. microplus larvae exposed to the fungus, the acaricide and the association of both. Firstly, a study was carried out to determine the most appropriate methodology to evaluate the in vitro effect of the fungus M. anisopliae on larvae of R. microplus tick. For this, we compared the Modified Larval Packet Test (LPT) and the Larval Immersion Test (LIT). The values of lethal time (LT50) obtained in the highest concentration of M. anisopliae (108conidia / mL) were 24.8 and 9.2 days for LPT and LIT, respectively. Mortality after 21 days was 38% and 98% for LPT and LIT, respectively, at the same concentration. The LIT proved to be the most indicated test to be used and was therefore chosen to carry out the following experiments Then, a study was performed to compare the susceptibility of different R. microplus isolates to M. anisopliae fungus. Sixty-seven field isolates were evaluated. For this, R. microplus larvae were immersed in a suspension of M. anisopliae (108conidia/mL) for 5 min. Lethal times (LT50) ranged from 2.6 to 24.9 days. Mortality observed on the 15th day after treatment ranged from 26.3 to 100% in the tested samples. These results demonstrated that R. microplus field populations showed a high variation in their susceptibility to M. anisopliae. Finally, a RNAseq analysis of R. microplus larvae exposed to M. anisopliae, cypermethrin, association of both or untreated (control) was performed. Analysis of the transcripts of the four groups generated a total of 507,792 sequences with a total length of 303,160,891 bp. We found 31 differentially expressed genes in the control group when compared to M. anisopliae, 39 with cypermethrin and 73 with M. anisopliae + cypermethrin. M. anisopliae and the association group had 81 differentially expressed genes and M. anisopliae and cypermethrin, 46 There were 177 differentially expressed genes when comparing M. anisopliae + cypermethrin with cypermethrin exposed larvae. The results of this study demonstrated that the association of M. anisopliae + cypermethrin increased the expression of genes related to response to aggression, possibly because the M. anisopliae + cypermethrin association causes a greater aggression to the tick and, then it could respond quickly, leading to overexpression of defense genes. The findings of this study provide information on the pathways and molecular mechanisms of R. microplus in response to the interaction of M. anisopliae and acaricides. In addition, these studies establish the basis for future research on key genes that control the susceptibility of R. microplus to M. anisopliae. The synergism evidenced in our studies confirms the idea that integrated control using biological control and chemical control is an option both for the control of acaricide resistant tick strains and for a faster control of tick strains that do not show resistance or exhibit intermediate resistance.

A oviposição é um estágio vulnerável do ciclo de vida de carrapatos. Rhipicephalus microplus, como todos Ixodidae e Argasidae, possui uma glândula especializada, o órgão de Gené, que produz uma cera que é depositada na superfície do ovo durante a oviposição. Além de restringir a perda excessiva de água, a cera atua como uma barreira contra o ataque de organismos invasores. Em R.microplus, como em outros carrapatos, há poucos estudos demonstrando atividade antimicrobiana em ovos. Ainda mais, não há na literatura relato de atividade antibiofilme em ovos de carrapatos e nem mesmo em qualquer outro artrópode. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a hipótese da existência de mecanismos de defesa em ovos de R. microplus contra biofilmes bacterianos. O extrato água/metanol da cera dos ovos apresentou atividade contra o biofilme de Pseudomonas aeruginosa sem afetar a sua viabilidade. Esse extrato também demonstrou efeito antibiótico contra Staphylococcus epidermidis. Nós identificamos a molécula com ambas atividades (antibiofilme e antibiótica) como N-(3-sulfooxy-25-cholest-5-en-26-oyl)-L-isoleucina (boophiline). Na busca por possíveis mecanismos responsáveis pelo efeito antibiofilme de boophiline contra P. aeruginosa, 14 genes foram analisados por qRT-PCR. Boophiline inibe a expressão de fliC (flagelo) e cdrA (componente estrutural da matriz), cujos produtos são necessários para a formação do biofilme de P. aeruginosa. Monosfosfato de guanosina dimérico cíclico (c-di-GMP) é um importante segundo mensageiro característico de bactérias Gram-negativas. Altos níveis intracelulares de c-di-GMP promovem o estilo de vida séssil enquanto baixos níveis induzem o comportamento móvel. De acordo com essa afirmação, nós encontramos que boophiline aumenta a motilidade swarming de P. aeruginosa. Desta forma, nos questionamos se o mecanismo de ação de boophiline estaria envolvido com c-di-GMP já que o sistema quorum sensing não foi afetado pela molécula. Interessantemente, quando os níveis de c-di-GMP foram aumentados pela superexpressão de uma diguanilato ciclase, boophiline não inibiu efetivamente a formação de biofilme. Uma explicação para esse resultado é que boophiline interfere em uma via específica regulada por c-di-GMP, o que explicaria não termos obtido um decréscimo no nível total deste segundo mensageiro. Contrariamente, boophiline foi bactericida contra S. epidermidis. Mudanças morfológicas significativas foram observadas em células tratadas com a molécula, as quais foram severamente danificadas. Boophiline levou a formação anormal de septo, rompimento da membrana bacteriana e extravasamento do material intracelular. Adicionalmente avaliamos o potencial antibiofilme e anti-protozoário de filtrados de cultura obtidos de bactérias isoladas de tecidos de R. microplus. Quatorze filtrados de cultura bacteriano apresentaram notável atividade contra o biofilme de P. aeruginosa e S. epidermidis e foram citotóxicos contra Tritrichomonas foetus. Nosso trabalho é pioneiro em demonstrar a existência de proteção contra biofilmes em ovos de carrapatos bem como de bactérias associadas a carrapatos como produtoras de moléculas bioativas. Além disso, nós demonstramos que boophiline é uma nova molécula antibiofilme, sendo a primeira vez relatado na literatura que um composto age inibindo cdrA. Os dados obtidos em nosso estudo poderiam estimular novas abordagens em áreas como fisiologia e controle de artrópodes, genética e fisiologia de microrganismos e controle de biofilmes. / The oviposition is a vulnerable stage of the tick life cycle. Rhipicephalus microplus, as all Ixodidae and Argasidae, has a specialized gland, the Gene’s organ, which produce a wax that is smeared on egg surface during oviposition. In addition to restricting excessive water loss, wax acts as a barrier to attack by invading organisms. In R. microplus, as in other ticks, there are few studies showing antimicrobial activity in eggs. Moreover, there is no report of antibiofilm activity in tick eggs nor in any other arthropod. The objective of our study was to evaluate the hypothesis of the existence of defense mechanisms against bacterial biofilms in R. microplus eggs. The eggs wax water/methanol extract showed activity against Pseudomonas aeruginosa biofilm without affecting its viability. This extract also presented an antibiotic effect against Staphylococcus epidermidis. We have identified the molecule anti-biofilm and antibiotic as N-(3-sulfooxy-25-cholest-5-en-26-oyl)-L-isoleucine (boophiline). In the search for possible mechanisms responsible by antibiofilm effect of boophiline against P. aeruginosa, 14 genes were evaluated by qRT-PCR. We showed that boophiline inhibits the expression of fliC (flagellum) and cdrA (matrix structural component), whose products are necessary for biofilm formation in P. aeruginosa. Bis-(3’–5’)-cyclic dimeric guanosine monophosphate (c-di-GMP) is an important second messenger, characteristic of Gram-negative bacteria. High intracellular levels of c-di-GMP promote a sessile mode of growth, while low levels promote motile behavior. In line with this, we found that boophiline increases swarming motility, which raised the question whether it acts by altering c-di-GMP levels. Interestingly, when c-di-GMP levels were increased by overexpression of a diguanilate cyclase, boophiline no longer inhibited biofilm formation. One explanation for these results is that boophiline interferes with a specific c-di-GMP-regulated pathway, which would explain we have not obtained a decrease in the total level of this second messenger. Conversely, boophiline had a bactericidal effect against S. epidermidis. Significant morphological changes were observed in the boophiline-treated cells, which appeared to be severely damaged. Boophiline was found to cause abnormal septum formation, bacterial membrane disruption, and extravasation of intracellular material. Additionally, our work also aimed to evaluate the potential antibiofilm and anti-protozoa of culture filtrates obtained from bacteria isolated of R. microplus tissues. Fourteen bacterial culture filtrates showed remarkable activity against of P. aeruginosa and S. epidermidis biofilms, and were cytotoxic against Tritrichomonas foetus. Our work is pioneer in demonstrating the existence of protection mechanisms in tick eggs against biofilms, and ticks-associated bacteria as producers of bioactive molecules. Furthermore, we demonstrated that boophiline is a new antibiofilm molecule, and is the first reported in the literature that a molecule inhibits cdrA. The data obtained in our study could stimulate new approaches in areas such as the physiology and control of arthropods, the genetics and physiology of microorganisms, and biofilm control.