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Identificação e caracterização de inibidores de serino-endopeptidases (serpinas) em Rhipicephalus (Boophilus) microplus

Tirloni, Lucas January 2012 (has links)
Carrapatos são animais hematófagos transmissores de diversas doenças para animais e seres humanos. O Rhipicephalus (Boophilus) microplus é um ectoparasito específico de bovinos. É responsável por importantes perdas econômicas na pecuária de países produtores de carne e leite. O aumento de populações de carrapatos resistentes aos principais acaricidas usados e a possível contaminação ambiental e dos produtos derivados como carne e leite impõem estudos para desenvolver novos métodos de controle. O controle imunológico é uma estratégia comprovadamente viável, porém ainda falta encontrar antígenos suficientemente eficientes. Uma das estratégias para atingir esse fim é o estudo de proteínas participantes de processos fisiológicos de grande importância para o carrapato, como é a aquisição e digestão de sangue. Proteínas pertencentes à superfamília das serpinas (serine protease inhibitors) participam do controle de diversos processos fisiológicos em mamíferos, inclusive coagulação sanguínea, fibrinólise e ativação do sistema complemento. Uma vez que carrapatos possuem informação para a síntese de serpinas, supõe-se que algumas têm como função perturbar a homeostase de seus hospedeiros. Analisando banco de sequências de cDNA identificamos 16 sequências que codificam serpinas no carrapato bovino, que foram nomeadas RmS (R. microplus serpin). Análises por RT-PCR mostraram que na maioria dos tecidos e estágios de desenvolvimento do parasito há expressão das RmS. Todas as sequências identificadas mostram conservação com serpinas de outras espécies de carrapatos. Aproximadamente 41% das RmS (7 de 16) provavelmente são secretadas, pois possuem predição para peptídeo-sinal. Assim como em outras serpinas, todas RmS possuem entre 1 e 4 sítios para N-glicosilação. Modelos tridimensionais revelam conservação de estrutura terciária das RmS analisadas com outras serpinas de mamíferos. Devido à presença de peptídeo-sinal, conservação com serpinas de outros carrapatos e presença em saliva, que foi revelada pelo estudo proteômico preliminar da saliva do parasito, RmS-3 foi escolhida para estudos mais pormenorizados. Para isso, a sequência codificadora foi clonada e ela foi obtida em forma recombinante. Anticorpos policlonais produzidos contra a proteína recombinante revelaram a presença da proteína em todos os tecidos analisados, e também na saliva, o que sugere participar na modulação das respostas do hospedeiro. / Ticks are hematophagous animals vectors of several human and animal diseases. Rhipicephalus (Boophilus) microplus is a bovine-specific ectoparasite. It is causes significant economic losses in livestock-producing countries. Increasing tick acaricide-resistant populations and, possible contamination on the environmental and on bovine-derived products contamination such as meat and milk impel the study of new control methods. Immunological control is a strategy proved to be feasible, but it requires really efficient antigens. A strategy to achieve this purpose is the study of proteins acting in physiological processes of major importance for the tick, as blood intake and digestion. Proteins belonging to the superfamily of serpins (serine protease inhibitors) have a role in several mammalian physiological processes, including blood coagulation, fibrinolysis and complement activation. As ticks encode information for serpins synthesis it is assumed they disrupt homeostasis their hosts. Through analysis of the cDNA sequences database, we identified 16 sequences coding for serpins in cattle tick, which were named RmS (R. microplus serpin). RT-PCR analyses showed RmSs are expressed in most tick tissues and developmental stages. All identified sequences are conserved concerning other tick species serpins. Around 41% of RmS (7 out 16) are probably secreted, since they have sequences predicting for signal peptide. Similarly as other serpin, all RmSs have 1 to 4 N-glycosylation sites. Protein modeling showed all RmSs have a conserved tertiary structure with other mammal serpins. RmS-3 was chosen for further studies due to presence of signal peptide, conservation with serpin inform other ticks and the presence in saliva revealed by an initial a proteomic study of tick saliva. In these studies, its gene was cloned RmS-3 was obtained as a recombinant protein. Polyclonal antibodies were against the recombinant protein showed RmS-3 presence in all analyzed tissues and also in saliva, suggesting it have a role disturbing host responses.
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As quitinases de Metarhizium anisopliae : caracterização genômica e funcional

Junges, Angela January 2014 (has links)
O metabolismo da quitina em fungos envolve diversos processos, tais como a manutenção da parede celular metabolicamente ativa, a nutrição básica e também diferentes aspectos da virulência. Quitinases são enzimas pertencentes às famílias 18 e 19 das glicosil hidrolases (GH18 e GH19) e são responsáveis pela hidrólise das ligações β-1,4 da quitina. Este homopolímero linear composto de unidades de N-acetil-glicosamina é um componente essencial da parede celular de fungos e do exoesqueleto de artrópodes. Inúmeras quitinases foram atribuídas a atividades estruturais, morfogênicas, autolíticas e nutricionais em células fúngicas. No entomopatógeno Metarhizium anisopliae, as quitinases também estão envolvidas na virulência. Os genomas de fungos filamentosos exibem um número maior de genes que codificam para quitinases do que os genomas de bactérias ou de leveduras. Uma busca realizada no genoma de M. anisopliae identificou 24 genes que pertencem à família 18 das glicosil hidrolases, incluindo os três genes que codificam quitinases previamente determinados e nomeados de chit1, chi2 e chi3. Essas quitinases putativas foram classificadas, com base na organização de seus domínios e em análises filogenéticas, nos subgrupos previamente descritos A, B e C e em um novo subgrupo D. Além disso, três outras proteínas GH18 puderam ser classificadas como endo-N-acetil-glicosaminidases putativas, enzimas que estão associadas com deglicosilação e foram, portanto, classificadas em um novo subgrupo E. O perfil transcricional dos genes GH18 foi avaliado por qPCR utilizando RNA extraído de oito diferentes condições de cultivo, representando diferentes estágios de desenvolvimento ou diferentes estados nutricionais. Esses transcritos dos genes GH18 foram detectados em pelo menos um dos diferentes estágios de desenvolvimento de M. anisopliae validando, portanto, os genes propostos. Nem todos os membros de um mesmo subgrupo apresentaram padrões iguais de expressão sob as diferentes condições. A determinação das quitinases e ENGases de M. anisopliae e um estudo mais detalhado envolvendo o papel dessas enzimas em funções morfológicas ou nutricionais irá permitir um entendimento mais amplo do potencial quitinolítico deste fungo entomopatogênico altamente infectivo. Com o objetivo de avançar no estudo das quitinases de M. anisopliae, vetores para a construção de mutantes nulos para os quatro genes de quitinases do sgC foram gerados e, utilizando a metodologia de agrotransformação para fungos, linhagens transformantes foram obtidas. Análises genéticas e fenotípicas múltiplas serão realizadas para avaliar as alterações induzidas pelos mutantes de quitinases do sgC. / Fungal chitin metabolism involves diverse processes such as metabolically active cell wall maintenance, basic nutrition, and different aspects of virulence. Chitinases are enzymes belonging to the glycoside hydrolase family 18 (GH18) and 19 (GH19) and are responsible for the hydrolysis of β-1,4-linkages in chitin. This linear homopolymer of N-acetyl-β-Dglucosamine is an essential constituent of fungal cell walls and arthropod exoskeletons. Several chitinases have been directly implicated in structural, morphogenetic, autolytic and nutritional activities of fungal cells. In the entomopathogen Metarhizium anisopliae, chitinases are also involved in virulence. Filamentous fungi genomes exhibit a higher number of chitinase-coding genes than bacteria or yeasts. The survey performed in the M. anisopliae genome has successfully identified 24 genes belonging to glycoside hydrolase family 18, including three previously experimentally determined chitinase-coding genes named chit1, chi2 and chi3. These putative chitinases were classified based on domain organization and phylogenetic analysis into the previously described A, B and C chitinase subgroups, and into a new subgroup D. Moreover, three GH18 proteins could be classified as putative endo-N-acetyl-β-D-glucosaminidases, enzymes that are associated with deglycosylation and were therefore assigned to a new subgroup E. The transcriptional profile of the GH18 genes was evaluated by qPCR with RNA extracted from eight culture conditions, representing different stages of development or different nutritional states. The transcripts from the GH18 genes were detected in at least one of the different M. anisopliae developmental stages, thus validating the proposed genes. Moreover, not all members from the same chitinase subgroup presented equal patterns of transcript expression under the eight distinct conditions studied. The determination of M. anisopliae chitinases and ENGases and a more detailed study concerning the enzymes' roles in morphological or nutritional functions will allow comprehensive insights into the chitinolytic potential of this highly infective entomopathogenic fungus. In order to proceed on the study of M. anisopliae chitinases, four vectors to sgC chitinases single gene knockouts were developed by using Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation, and a few mutant strains were recovered. Multiple phenotypic and genetic analyses will be performed to evaluate the modifications induced by sgC chitinase gene mutant strains after their validation.
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Caracterização da rVTDCE de Rhipicephalus (Boophilus) microplus : uma peptidase antimicrobiana

Oldiges, Daiane Patrícia January 2012 (has links)
O carrapato bovino, Rhipicephalus (Boophilus) microplus, é um artrópode hematófago, responsável por importantes perdas na pecuária. Durante o desenvolvimento do embrionário do carrapato a cisteíno endopeptidase degradadora de vitelina (VTDCE) participa do processo de hidrólise de vitelina (Vt), a principal fonte de energia e aminoácidos durante esse período. Devido à sua importância na fisiologia do parasita, a VTDCE é um alvo potencial para o desenvolvimento de vacinas anti-carrapatos. Estudos anteriores demonstraram que a VTDCE nativa, purificada de ovos confere proteção contra R. microplus, desencadeada pela resposta imune dos bovinos após a administração deste antígeno. Entretanto, o extenso e dispendioso processo de purificação desta proteína, acrescido do baixo rendimento e fonte escassa de material (ovos de carrapato) inviabiliza a utilização da proteína nativa para fins comerciais. Tais dificuldades podem ser ultrapassadas por meio do uso de uma proteína recombinante. O presente trabalho tem por objetivo a expressão, purificação e caracterização da VTDCE recombinante (rVTDCE). Parte da sequência de aminoácidos da VTDCE nativa foi obtida por sequenciamento de edman e pela análise por especrometria de massas de petídeos obtidos pelo tratamento da proteína com tripsina e. As sequências obtidas assim obtidas foram utilizadas para buscar a sequência da ORF da VTDCE em um banco de cDNA. Por meio de PCR, a ORF da enzima foi clonada em vetor de clonagem e posteriormente de expressão. A rVTDCE expressa em Escherichia coli foi purificada por cromatografia de afinidade e utilizada para determinar algumas de suas propriedades, como atividade enzimática e antimicrobiana. A atividade enzimática foi avaliada através de ensaios fluorimétricos, onde a rVTDCE mostrou características similares à VTDCE nativa. Ensaios antimicrobianos foram realizados para avaliar a possível atividade sugerida após análise da sequencia da ORF da VTDCE. A análise molecular mostrou que a sequência da VTDCE apresenta semelhança com peptídeos antimicrobianos, fato comprovado através de ensaios antimicrobianos. Efetivamente, a VTDCE apresentou atividade antimicrobiana tanto na sua forma nativa como na forma desnaturada desprovida de atividade peptidásica, demonstrando que ambas as atividades são independentes. Foram feitos também ensaios imunológicos, onde anticorpos policlonais anti-rVTDCE foram produzidos em coelhos e bovinos. Por Western blot foi observado que os anticorpos policlonais produzidos contra VTDCE recombinante reconheceram a VTDCE nativa, e o inverso também, indicando que a forma recombinante pode ser utilizada para experimentos de vacinação. / The cattle tick, Rhipicephalus (Boophilus) microplus is a hematophagous arthropod, responsible for significant losses in livestock. During the tick embryo the vitellin-degrading cysteine endopeptidase (VTDCE) participates in the vitellin (Vt) hydrolysis, the main energy source and amino acids during this period. Due to the importance of this enzyme in parasite physiology the VTDCE is a potential target for development of anti-tick vaccine. In previous studies, the immunization with native VTDCE, purified from tick egg, conferred protection against R. microplus. However, the extensive and expensive purification process, plus the low achievement precludes the use of the native protein for commercial purposes. This difficulty can be overcome by the expression of a recombinant protein in heterologous organism. This work aims the expression, purification and characterization of recombinant VTDCE (rVTDCE). Part of the native VTDCE amino acid sequence was determined by Edman sequencing. Native protein was also trypsinized and peptides sequenced by mass spectrometry. The sequences obtained from mass spectrometry and Edman sequencing were used to search the ORF sequence of VTDCE in a tick cDNA library. Through PCR enzyme ORF was cloned into a cloning vector and further into an expression vector. The rVTDCE expressed in Escherichia coli was purified by affinity chromatography and used to determine some of its properties such as antimicrobial and enzyme activity. The enzymatic activity was measured using fluorimetric assays, where rVTDCE had similar characteristics to VTDCE. Antimicrobial assays were performed to evaluate the possible activity suggested after sequence analysis. Molecular analysis showed that the sequence of VTDCE shows similarity with antimicrobial peptides, which was proven through antimicrobial assays. Effectively, the VTDCE presented antimicrobial activity even when the protein didn’t present enzymatic activity, demonstrating that both activities are independent. Immunological assays were also performed. Polyclonal anti-rVTDCE serum were produced in rabbits and cattle. Western blot showed that the polyclonal antibodies raised against recombinant VTDCE recognized the native form, indicating that the recombinant form may be used for vaccination experiments.
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Uso de Babesia bovis como uma vacina de vetor vivo para o controle do carrapato bovino Rhipicephalus microplus

Oldiges, Daiane Patrícia January 2016 (has links)
O carrapato Rhipicephalus microplus é um ectoparasito hematófago de grande importância para a pecuária por ser responsável por perdas massivas na produção animal, de forma que o seu controle é economicamente relevante. Este carrapato, além dos danos que causa por si só, é também um importante vetor para a transmissão de microorganismos patogênicos, entre eles o hemoprotozoário intraeritrocítico Babesia bovis. O presente trabalho descreve o desenvolvimento de uma linhagem de B. bovis capaz de expressar um antígeno protetor, uma glutationa S-transferase do carrapato Haemaphysalis longicornis (HlGST), e o teste desta linhagem como uma vacina de vetor vivo para o controle do carrapato R. microplus. B. bovis, em cultivo, da linhagem S74-T3B foram eletroporados em presença de plasmídeo contendo o promotor bidirecional de B. bovis Ef-1 aresponsável pela expressão independente de dois genes: o repórter fusionado ao agente para seleção (GFP-BSD) e HlGST fusionada à sequência codificadora do peptídeo sinal de MSA-1 (merozoite surface antigen-1). Após a eletroporação, foi feita a seleção com blasticidina para obtenção da linhagem nomeada HlGST. A linhagem HlGST é composta por parasitos contendo diferentes padrões de inserção dos genes exógenos, tanto dentro quanto fora do locus Ef-1. Uma linhagem clonal denominada HlGST-Cln expressando HlGST e GFP-BSD foi obtida a partir da linhagem HlGST. Dois ensaios, independentes, de imunização de bovinos com os parasitos clonais foram realizados, sendo usado como controle uma linhagem clonal previamente caracterizada denominada GFP-Cln. Todos os animais inoculados desenvolveram uma forma branda de babesiose, indicando que ambas as linhagens clonais são atenuadas, mas apenas os animais imunizados com a linhagem HlGST-Cln foram capazes de produzir anticorpos anti-HlGST. O segundo procedimento de imunização foi seguido por um desafio com larvas de R. microplus. O desenvolvimento dessas larvas no hospedeiro levou a fêmeas adultas de menor peso e fertilidade. Coletivamente, esses dados mostram a possibilidade de uso de linhagens transfectadas de B. bovis como vacinas de vetor vivo. / The tick Rhipicephalus microplus is a notorious blood-feeding ectoparasite of cattle, responsible for massive losses in animal production. It is the main vector of pathogenic microorganisms, including Babesia bovis, an intraerythrocytic apicomplexan protozoan parasite responsible for bovine babesiosis. This study describes the development and testing of a live B. bovis vaccine expressing the protective tick antigen glutathione S-transferase from Haemaphysalis longicornis (HlGST). The B. bovis S74- T3B parasites were electroporated with a plasmid containing the bidirectional Ef-1 promoter of B. bovis controlling expression of two independent genes, the selectable marker GFP-BSD, and HlGST fused to the MSA-1 (merozoite surface antigen-1) signal peptide from B. bovis. Electroporation followed by blasticidin selection resulted in the emergence of a mixed B. bovis transfected line (termed HlGST) in in vitro cultures, containing parasites with distinct patterns of insertion of both exogenous genes, either in or outside the Ef-1 a locus. A B. bovis clonal line termed HlGST-Cln expressing HlGST and GFP-BSD was then derived from the mixed parasite line HlGST. Two independent calf immunization trials were performed via intravenous inoculation of the HlGST-Cln and a control consisting of an irrelevant transfected clonal line of B. bovis designated GFP-Cln. The control GFP-Cln line contains a copy of the GFP-BSD gene inserted into the Ef-1 locus of B. bovis in an identical fashion as the HIGST-Cln parasites. All animals inoculated with the HlGST-Cln and GFP-Cln transfected parasites developed mild babesiosis indicating that both transfected cloned parasite lines are attenuated. All animals immunized with HlGST-Cln produced detectable anti-glutathione-S-transferase antibodies. After immunization with HlGST-Cln, calves were challenged with R. microplus larva. Development of these larva produce fully engorged female tick with reduced weight and fertility. Collectively, these data show that transfected B. bovis parasites can be used as vectors in live vectored vaccines.
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Agrupamentos gênicos envolvidos na biosíntese de metabólitos secundários no fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae : identificação genômica e padrões de expressão em cutículas do carrapato Rhipicephalus microplus

Oliveira, Nicolau Sbaraini January 2016 (has links)
O gênero Metarhizium abriga fungos cosmopolitas que infectam hospedeiros artrópodes. Curiosamente, enquanto algumas espécies do gênero infectam um amplo espectro de hospedeiros (hospedeiro-generalistas), outras espécies infectam apenas alguns artrópodes (hospedeiro-especialistas). Esse traço evolutivo singular permite comparações únicas, a fim de determinar como patógenos e fatores de virulência surgem. Dentre os diversos fatores de virulência descritos, se destacam os metabólitos secundários que hipoteticamente desempenhem papéis essenciais na infecção fúngica. No entanto, a maioria dos genes para a produção de metabólitos secundários em Metarhizium spp. não foram ainda caracterizados, e pouco se sabe sobre a organização gênomica, expressão e regulação destes genes. A fim de melhor compreender estes aspectos, nós realizamos uma análise e descrição detalhada de agrupamentos gênicos (clusters) envolvidos na biossíntese de metabólitos secundários em M. anisopliae, analisamos dados de um estudo transcritômico onde o fungo foi cultivado em cutículas de carrapato avaliando a expressão diferencial destes clusters, bem como avaliamos a conservação destes genes entre espécies do gênero Metarhizium. Ademais, nossa análise se estendeu avaliando aspectos evolutivos e filogenéticos para três clusters: MaPKS1 cujo produto é putativamente assemelhado a tropolonas e citrininas, MaNRPS-PKS2 cujo produto é putativamente assemelhado a pseurotina e MaTERP1 cujo produto putativo é o ácido helvólico. Dentre os 73 clusters identificados no genoma de M. anisopliae, 20 % estavam positivamente regulados na condição experimental de infecção inicial, com presumível papel na virulência do fungo. Dentre os clusters positivamente regulados estão genes já caracterizados envolvidos na biossíntese de destruxinas, NG39x e ferricrocina, em conjunto com genes putativamente envolvidos na biossíntese do ácido helvólico, produtos assemelhados a pseurotina e tropolonas e citrininas, além de genes envolvidos na biossíntese de compostos desconhecidos. Curiosamente, diversos clusters positivamente regulados na condição de infecção inicial não estão presentes em espécies hospedeiro-especialistas do gênero Metarhizium, indicando que existem diferenças nas estratégias metabólicas empregadas por espécies hospedeiro-generalistas e hospedeiro-especialistas no ciclo infeccioso. Estas diferenças no potencial metabólico podem ter sido parcialmente moldadas por eventos de transferência horizontal, conforme sugere nossa análise filogenética sobre a origem do o cluster putativamente envolvido na biossíntese do ácido helvólico em Metarhizium spp. Em conclusão, diversos clusters desconhecidos são descritos e aspectos da sua organização, regulação e origem são discutidos, fornecendo evidências sobre o impacto dos metabólitos secundários no ciclo de vida e infecção de espécies do gênero Metarhizium. / The Metarhizium genus harbors cosmopolitan fungi that infect arthropod hosts. Interestingly, while some species infect a wide range of hosts (host-generalists), other species infect only a few arthropods (host-specialists). This singular evolutionary trait permits unique comparisons to determine how pathogens and virulence determinants emerge. Among the several virulence determinants that have been described, secondary metabolites (SMs) are suggested to play essential roles during fungal infection. However, the majority of genes related to SM production in Metarhizium spp. are uncharacterized, and little is known about their genomic organization, expression and regulation. To better understand these aspects, we have performed a deep survey and description of SM biosynthetic gene clusters (BGCs) in M. anisopliae, analyzed RNA-seq data from fungi grown on cattle-tick cuticles, evaluated the differential expression of BGCs, and assessed conservation within the Metarhizium genus. Furthermore, our analysis extended to the construction of a phylogeny for the following three BGCs: a tropolone/citrinin-related compound (MaPKS1), a pseurotin-related compound (MaNRPS-PKS2), and a putative helvolic acid (MaTERP1). Among 73 BGCs identified in M. anisopliae, 20% were up-regulated during initial tick cuticle infection and presumably possess virulence-related roles. These up-regulated BGCs include known clusters, such as destruxin, NG39x and ferricrocin, together with putative helvolic acid and pseurotin- and tropolone/citrinin-related compound clusters, as well as uncharacterized clusters. Interestingly, several up-regulated BGCs were not conserved in host-specialist species from the Metarhizium genus, indicating differences in the metabolic strategies employed by generalist and specialist species to overcome and kill their host. These differences in metabolic potential may have been partially shaped by horizontal gene transfer (HGT) events, as our phylogenetic analysis provided evidence that the putative helvolic acid cluster in Metarhizium spp. originated from an HGT event. In conclusion several unknown BGCs are described, and aspects of their organization, regulation and origin are discussed, providing evidence for the impact of SMs on the Metarhizium genus lifestyle and infection process.
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Caracterização da rVTDCE de Rhipicephalus (Boophilus) microplus : uma peptidase antimicrobiana

Oldiges, Daiane Patrícia January 2012 (has links)
O carrapato bovino, Rhipicephalus (Boophilus) microplus, é um artrópode hematófago, responsável por importantes perdas na pecuária. Durante o desenvolvimento do embrionário do carrapato a cisteíno endopeptidase degradadora de vitelina (VTDCE) participa do processo de hidrólise de vitelina (Vt), a principal fonte de energia e aminoácidos durante esse período. Devido à sua importância na fisiologia do parasita, a VTDCE é um alvo potencial para o desenvolvimento de vacinas anti-carrapatos. Estudos anteriores demonstraram que a VTDCE nativa, purificada de ovos confere proteção contra R. microplus, desencadeada pela resposta imune dos bovinos após a administração deste antígeno. Entretanto, o extenso e dispendioso processo de purificação desta proteína, acrescido do baixo rendimento e fonte escassa de material (ovos de carrapato) inviabiliza a utilização da proteína nativa para fins comerciais. Tais dificuldades podem ser ultrapassadas por meio do uso de uma proteína recombinante. O presente trabalho tem por objetivo a expressão, purificação e caracterização da VTDCE recombinante (rVTDCE). Parte da sequência de aminoácidos da VTDCE nativa foi obtida por sequenciamento de edman e pela análise por especrometria de massas de petídeos obtidos pelo tratamento da proteína com tripsina e. As sequências obtidas assim obtidas foram utilizadas para buscar a sequência da ORF da VTDCE em um banco de cDNA. Por meio de PCR, a ORF da enzima foi clonada em vetor de clonagem e posteriormente de expressão. A rVTDCE expressa em Escherichia coli foi purificada por cromatografia de afinidade e utilizada para determinar algumas de suas propriedades, como atividade enzimática e antimicrobiana. A atividade enzimática foi avaliada através de ensaios fluorimétricos, onde a rVTDCE mostrou características similares à VTDCE nativa. Ensaios antimicrobianos foram realizados para avaliar a possível atividade sugerida após análise da sequencia da ORF da VTDCE. A análise molecular mostrou que a sequência da VTDCE apresenta semelhança com peptídeos antimicrobianos, fato comprovado através de ensaios antimicrobianos. Efetivamente, a VTDCE apresentou atividade antimicrobiana tanto na sua forma nativa como na forma desnaturada desprovida de atividade peptidásica, demonstrando que ambas as atividades são independentes. Foram feitos também ensaios imunológicos, onde anticorpos policlonais anti-rVTDCE foram produzidos em coelhos e bovinos. Por Western blot foi observado que os anticorpos policlonais produzidos contra VTDCE recombinante reconheceram a VTDCE nativa, e o inverso também, indicando que a forma recombinante pode ser utilizada para experimentos de vacinação. / The cattle tick, Rhipicephalus (Boophilus) microplus is a hematophagous arthropod, responsible for significant losses in livestock. During the tick embryo the vitellin-degrading cysteine endopeptidase (VTDCE) participates in the vitellin (Vt) hydrolysis, the main energy source and amino acids during this period. Due to the importance of this enzyme in parasite physiology the VTDCE is a potential target for development of anti-tick vaccine. In previous studies, the immunization with native VTDCE, purified from tick egg, conferred protection against R. microplus. However, the extensive and expensive purification process, plus the low achievement precludes the use of the native protein for commercial purposes. This difficulty can be overcome by the expression of a recombinant protein in heterologous organism. This work aims the expression, purification and characterization of recombinant VTDCE (rVTDCE). Part of the native VTDCE amino acid sequence was determined by Edman sequencing. Native protein was also trypsinized and peptides sequenced by mass spectrometry. The sequences obtained from mass spectrometry and Edman sequencing were used to search the ORF sequence of VTDCE in a tick cDNA library. Through PCR enzyme ORF was cloned into a cloning vector and further into an expression vector. The rVTDCE expressed in Escherichia coli was purified by affinity chromatography and used to determine some of its properties such as antimicrobial and enzyme activity. The enzymatic activity was measured using fluorimetric assays, where rVTDCE had similar characteristics to VTDCE. Antimicrobial assays were performed to evaluate the possible activity suggested after sequence analysis. Molecular analysis showed that the sequence of VTDCE shows similarity with antimicrobial peptides, which was proven through antimicrobial assays. Effectively, the VTDCE presented antimicrobial activity even when the protein didn’t present enzymatic activity, demonstrating that both activities are independent. Immunological assays were also performed. Polyclonal anti-rVTDCE serum were produced in rabbits and cattle. Western blot showed that the polyclonal antibodies raised against recombinant VTDCE recognized the native form, indicating that the recombinant form may be used for vaccination experiments.
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Perfil inibitório e antigenicidade da cistatina JpIocys2a de Ixodes ovatus

Sabadin, Gabriela Alves January 2015 (has links)
Cistatinas são um grupo de inibidores de cisteíno proteases que atuam na regulação da proteólise e estão presentes em uma ampla variedade de organismos. Estudos sobre essa classe de inibidores em parasitas têm contribuído para elucidar suas funções na regulação de processos fisiológicos como a digestão do sangue e a supressão da resposta imune do hospedeiro durante a alimentação. Por isso, cistatinas são um alvo interessante na pesquisa para o desenvolvimento de novos métodos de controle de parasitas. Além disso, a caracterização de proteínas compartilhadas por diferentes espécies de parasitas representa uma estratégia viável para encontrar potenciais alvos para uma vacina multi-espécie. Entretanto, as funções das cistatinas nos carrapatos permanecem obscuras, especialmente na espécie Ixodes ovatus. Neste trabalho, foi caracterizado o perfil inibitório de rJpIocys2a, uma cistatina de I. ovatus, para as catepsinas B, C e L. O perfil de inibição enzimática de rJpIocys2a se mostrou variável entre catepsinas envolvidas na digestão do sangue pelo carrapato e na evasão da resposta imune do hospedeiro. Além disso, um peptídeo baseado na sequência de aminoácidos do inibidor JpIocsy2a (STQ-pep) foi sintetizado e utilizado para imunização de coelhos. O soro anti-STQ-pep foi usado para analisar a antigenicidade cruzada entre cistatinas dos carrapatos Rhipicephalus microplus e I. ovatus. A análise da antigenicidade cruzada revelou que anticorpos gerados contra o peptídeo são capazes de reconhecer cistatinas nativas e recombinante de R. microplus. A habilidade de rJpIocys2a de inibir catepsinas relacionadas a diferentes funções sugere múltiplas funções para esse inibidor. Os resultados obtidos neste trabalho forneceram bases para outros experimentos que utilizem esta proteína como antígeno vacinal. / Cystatins are a group of cysteine protease inhibitors that act on the regulation of physiological proteolysis and are present in a wide range of organisms. Researches on this class of inhibitors in parasites have contributed to clarify their roles in the regulation of important physiological processes, such as blood digestion and suppression of the host immune response during blood feeding. Thus, cystatins are a topic of research for the development of new parasite control methods. Additionally, the characterization of proteins shared by different parasite species represents a valuable strategy to identify potential targets for a multi-species vaccine. However, cystatin functions in ticks remain undetermined, especially in Ixodes ovatus. This work characterized the inhibitory profile of rJpIocys2a, an I. ovatus cystatin, to cathepsins B, C, and L. The enzymatic inhibition profile of JpIocys2a shows a distinct modulation of cathepsins related to tick blood digestion and evasion of host immune response. In addition, a peptide from JpIocys2a amino acid sequence (STQ-pep) was synthesized and used for rabbit immunization. Anti-STQ-pep serum was used to analyze the cross-antigenicity between Rhipicephalus microplus and I. ovatus cystatins. Crossantigenicity assays revealed that antibodies against the JpIocys2a peptide are able to recognize native and recombinant R. microplus ticks cystatins. The ability of rJpIocys2a to inhibit cathepsins related to different functions suggests multiple roles for JpIocys2a. The results obtained in this work provided basis for further experiments using this protein as a vaccine antigen.
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Uso de Babesia bovis como uma vacina de vetor vivo para o controle do carrapato bovino Rhipicephalus microplus

Oldiges, Daiane Patrícia January 2016 (has links)
O carrapato Rhipicephalus microplus é um ectoparasito hematófago de grande importância para a pecuária por ser responsável por perdas massivas na produção animal, de forma que o seu controle é economicamente relevante. Este carrapato, além dos danos que causa por si só, é também um importante vetor para a transmissão de microorganismos patogênicos, entre eles o hemoprotozoário intraeritrocítico Babesia bovis. O presente trabalho descreve o desenvolvimento de uma linhagem de B. bovis capaz de expressar um antígeno protetor, uma glutationa S-transferase do carrapato Haemaphysalis longicornis (HlGST), e o teste desta linhagem como uma vacina de vetor vivo para o controle do carrapato R. microplus. B. bovis, em cultivo, da linhagem S74-T3B foram eletroporados em presença de plasmídeo contendo o promotor bidirecional de B. bovis Ef-1 aresponsável pela expressão independente de dois genes: o repórter fusionado ao agente para seleção (GFP-BSD) e HlGST fusionada à sequência codificadora do peptídeo sinal de MSA-1 (merozoite surface antigen-1). Após a eletroporação, foi feita a seleção com blasticidina para obtenção da linhagem nomeada HlGST. A linhagem HlGST é composta por parasitos contendo diferentes padrões de inserção dos genes exógenos, tanto dentro quanto fora do locus Ef-1. Uma linhagem clonal denominada HlGST-Cln expressando HlGST e GFP-BSD foi obtida a partir da linhagem HlGST. Dois ensaios, independentes, de imunização de bovinos com os parasitos clonais foram realizados, sendo usado como controle uma linhagem clonal previamente caracterizada denominada GFP-Cln. Todos os animais inoculados desenvolveram uma forma branda de babesiose, indicando que ambas as linhagens clonais são atenuadas, mas apenas os animais imunizados com a linhagem HlGST-Cln foram capazes de produzir anticorpos anti-HlGST. O segundo procedimento de imunização foi seguido por um desafio com larvas de R. microplus. O desenvolvimento dessas larvas no hospedeiro levou a fêmeas adultas de menor peso e fertilidade. Coletivamente, esses dados mostram a possibilidade de uso de linhagens transfectadas de B. bovis como vacinas de vetor vivo. / The tick Rhipicephalus microplus is a notorious blood-feeding ectoparasite of cattle, responsible for massive losses in animal production. It is the main vector of pathogenic microorganisms, including Babesia bovis, an intraerythrocytic apicomplexan protozoan parasite responsible for bovine babesiosis. This study describes the development and testing of a live B. bovis vaccine expressing the protective tick antigen glutathione S-transferase from Haemaphysalis longicornis (HlGST). The B. bovis S74- T3B parasites were electroporated with a plasmid containing the bidirectional Ef-1 promoter of B. bovis controlling expression of two independent genes, the selectable marker GFP-BSD, and HlGST fused to the MSA-1 (merozoite surface antigen-1) signal peptide from B. bovis. Electroporation followed by blasticidin selection resulted in the emergence of a mixed B. bovis transfected line (termed HlGST) in in vitro cultures, containing parasites with distinct patterns of insertion of both exogenous genes, either in or outside the Ef-1 a locus. A B. bovis clonal line termed HlGST-Cln expressing HlGST and GFP-BSD was then derived from the mixed parasite line HlGST. Two independent calf immunization trials were performed via intravenous inoculation of the HlGST-Cln and a control consisting of an irrelevant transfected clonal line of B. bovis designated GFP-Cln. The control GFP-Cln line contains a copy of the GFP-BSD gene inserted into the Ef-1 locus of B. bovis in an identical fashion as the HIGST-Cln parasites. All animals inoculated with the HlGST-Cln and GFP-Cln transfected parasites developed mild babesiosis indicating that both transfected cloned parasite lines are attenuated. All animals immunized with HlGST-Cln produced detectable anti-glutathione-S-transferase antibodies. After immunization with HlGST-Cln, calves were challenged with R. microplus larva. Development of these larva produce fully engorged female tick with reduced weight and fertility. Collectively, these data show that transfected B. bovis parasites can be used as vectors in live vectored vaccines.
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Agrupamentos gênicos envolvidos na biosíntese de metabólitos secundários no fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae : identificação genômica e padrões de expressão em cutículas do carrapato Rhipicephalus microplus

Oliveira, Nicolau Sbaraini January 2016 (has links)
O gênero Metarhizium abriga fungos cosmopolitas que infectam hospedeiros artrópodes. Curiosamente, enquanto algumas espécies do gênero infectam um amplo espectro de hospedeiros (hospedeiro-generalistas), outras espécies infectam apenas alguns artrópodes (hospedeiro-especialistas). Esse traço evolutivo singular permite comparações únicas, a fim de determinar como patógenos e fatores de virulência surgem. Dentre os diversos fatores de virulência descritos, se destacam os metabólitos secundários que hipoteticamente desempenhem papéis essenciais na infecção fúngica. No entanto, a maioria dos genes para a produção de metabólitos secundários em Metarhizium spp. não foram ainda caracterizados, e pouco se sabe sobre a organização gênomica, expressão e regulação destes genes. A fim de melhor compreender estes aspectos, nós realizamos uma análise e descrição detalhada de agrupamentos gênicos (clusters) envolvidos na biossíntese de metabólitos secundários em M. anisopliae, analisamos dados de um estudo transcritômico onde o fungo foi cultivado em cutículas de carrapato avaliando a expressão diferencial destes clusters, bem como avaliamos a conservação destes genes entre espécies do gênero Metarhizium. Ademais, nossa análise se estendeu avaliando aspectos evolutivos e filogenéticos para três clusters: MaPKS1 cujo produto é putativamente assemelhado a tropolonas e citrininas, MaNRPS-PKS2 cujo produto é putativamente assemelhado a pseurotina e MaTERP1 cujo produto putativo é o ácido helvólico. Dentre os 73 clusters identificados no genoma de M. anisopliae, 20 % estavam positivamente regulados na condição experimental de infecção inicial, com presumível papel na virulência do fungo. Dentre os clusters positivamente regulados estão genes já caracterizados envolvidos na biossíntese de destruxinas, NG39x e ferricrocina, em conjunto com genes putativamente envolvidos na biossíntese do ácido helvólico, produtos assemelhados a pseurotina e tropolonas e citrininas, além de genes envolvidos na biossíntese de compostos desconhecidos. Curiosamente, diversos clusters positivamente regulados na condição de infecção inicial não estão presentes em espécies hospedeiro-especialistas do gênero Metarhizium, indicando que existem diferenças nas estratégias metabólicas empregadas por espécies hospedeiro-generalistas e hospedeiro-especialistas no ciclo infeccioso. Estas diferenças no potencial metabólico podem ter sido parcialmente moldadas por eventos de transferência horizontal, conforme sugere nossa análise filogenética sobre a origem do o cluster putativamente envolvido na biossíntese do ácido helvólico em Metarhizium spp. Em conclusão, diversos clusters desconhecidos são descritos e aspectos da sua organização, regulação e origem são discutidos, fornecendo evidências sobre o impacto dos metabólitos secundários no ciclo de vida e infecção de espécies do gênero Metarhizium. / The Metarhizium genus harbors cosmopolitan fungi that infect arthropod hosts. Interestingly, while some species infect a wide range of hosts (host-generalists), other species infect only a few arthropods (host-specialists). This singular evolutionary trait permits unique comparisons to determine how pathogens and virulence determinants emerge. Among the several virulence determinants that have been described, secondary metabolites (SMs) are suggested to play essential roles during fungal infection. However, the majority of genes related to SM production in Metarhizium spp. are uncharacterized, and little is known about their genomic organization, expression and regulation. To better understand these aspects, we have performed a deep survey and description of SM biosynthetic gene clusters (BGCs) in M. anisopliae, analyzed RNA-seq data from fungi grown on cattle-tick cuticles, evaluated the differential expression of BGCs, and assessed conservation within the Metarhizium genus. Furthermore, our analysis extended to the construction of a phylogeny for the following three BGCs: a tropolone/citrinin-related compound (MaPKS1), a pseurotin-related compound (MaNRPS-PKS2), and a putative helvolic acid (MaTERP1). Among 73 BGCs identified in M. anisopliae, 20% were up-regulated during initial tick cuticle infection and presumably possess virulence-related roles. These up-regulated BGCs include known clusters, such as destruxin, NG39x and ferricrocin, together with putative helvolic acid and pseurotin- and tropolone/citrinin-related compound clusters, as well as uncharacterized clusters. Interestingly, several up-regulated BGCs were not conserved in host-specialist species from the Metarhizium genus, indicating differences in the metabolic strategies employed by generalist and specialist species to overcome and kill their host. These differences in metabolic potential may have been partially shaped by horizontal gene transfer (HGT) events, as our phylogenetic analysis provided evidence that the putative helvolic acid cluster in Metarhizium spp. originated from an HGT event. In conclusion several unknown BGCs are described, and aspects of their organization, regulation and origin are discussed, providing evidence for the impact of SMs on the Metarhizium genus lifestyle and infection process.
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Perfil inibitório e antigenicidade da cistatina JpIocys2a de Ixodes ovatus

Sabadin, Gabriela Alves January 2015 (has links)
Cistatinas são um grupo de inibidores de cisteíno proteases que atuam na regulação da proteólise e estão presentes em uma ampla variedade de organismos. Estudos sobre essa classe de inibidores em parasitas têm contribuído para elucidar suas funções na regulação de processos fisiológicos como a digestão do sangue e a supressão da resposta imune do hospedeiro durante a alimentação. Por isso, cistatinas são um alvo interessante na pesquisa para o desenvolvimento de novos métodos de controle de parasitas. Além disso, a caracterização de proteínas compartilhadas por diferentes espécies de parasitas representa uma estratégia viável para encontrar potenciais alvos para uma vacina multi-espécie. Entretanto, as funções das cistatinas nos carrapatos permanecem obscuras, especialmente na espécie Ixodes ovatus. Neste trabalho, foi caracterizado o perfil inibitório de rJpIocys2a, uma cistatina de I. ovatus, para as catepsinas B, C e L. O perfil de inibição enzimática de rJpIocys2a se mostrou variável entre catepsinas envolvidas na digestão do sangue pelo carrapato e na evasão da resposta imune do hospedeiro. Além disso, um peptídeo baseado na sequência de aminoácidos do inibidor JpIocsy2a (STQ-pep) foi sintetizado e utilizado para imunização de coelhos. O soro anti-STQ-pep foi usado para analisar a antigenicidade cruzada entre cistatinas dos carrapatos Rhipicephalus microplus e I. ovatus. A análise da antigenicidade cruzada revelou que anticorpos gerados contra o peptídeo são capazes de reconhecer cistatinas nativas e recombinante de R. microplus. A habilidade de rJpIocys2a de inibir catepsinas relacionadas a diferentes funções sugere múltiplas funções para esse inibidor. Os resultados obtidos neste trabalho forneceram bases para outros experimentos que utilizem esta proteína como antígeno vacinal. / Cystatins are a group of cysteine protease inhibitors that act on the regulation of physiological proteolysis and are present in a wide range of organisms. Researches on this class of inhibitors in parasites have contributed to clarify their roles in the regulation of important physiological processes, such as blood digestion and suppression of the host immune response during blood feeding. Thus, cystatins are a topic of research for the development of new parasite control methods. Additionally, the characterization of proteins shared by different parasite species represents a valuable strategy to identify potential targets for a multi-species vaccine. However, cystatin functions in ticks remain undetermined, especially in Ixodes ovatus. This work characterized the inhibitory profile of rJpIocys2a, an I. ovatus cystatin, to cathepsins B, C, and L. The enzymatic inhibition profile of JpIocys2a shows a distinct modulation of cathepsins related to tick blood digestion and evasion of host immune response. In addition, a peptide from JpIocys2a amino acid sequence (STQ-pep) was synthesized and used for rabbit immunization. Anti-STQ-pep serum was used to analyze the cross-antigenicity between Rhipicephalus microplus and I. ovatus cystatins. Crossantigenicity assays revealed that antibodies against the JpIocys2a peptide are able to recognize native and recombinant R. microplus ticks cystatins. The ability of rJpIocys2a to inhibit cathepsins related to different functions suggests multiple roles for JpIocys2a. The results obtained in this work provided basis for further experiments using this protein as a vaccine antigen.

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