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Identificação e caracterização de inibidores de serino-endopeptidases (serpinas) em Rhipicephalus (Boophilus) microplus

Tirloni, Lucas January 2012 (has links)
Carrapatos são animais hematófagos transmissores de diversas doenças para animais e seres humanos. O Rhipicephalus (Boophilus) microplus é um ectoparasito específico de bovinos. É responsável por importantes perdas econômicas na pecuária de países produtores de carne e leite. O aumento de populações de carrapatos resistentes aos principais acaricidas usados e a possível contaminação ambiental e dos produtos derivados como carne e leite impõem estudos para desenvolver novos métodos de controle. O controle imunológico é uma estratégia comprovadamente viável, porém ainda falta encontrar antígenos suficientemente eficientes. Uma das estratégias para atingir esse fim é o estudo de proteínas participantes de processos fisiológicos de grande importância para o carrapato, como é a aquisição e digestão de sangue. Proteínas pertencentes à superfamília das serpinas (serine protease inhibitors) participam do controle de diversos processos fisiológicos em mamíferos, inclusive coagulação sanguínea, fibrinólise e ativação do sistema complemento. Uma vez que carrapatos possuem informação para a síntese de serpinas, supõe-se que algumas têm como função perturbar a homeostase de seus hospedeiros. Analisando banco de sequências de cDNA identificamos 16 sequências que codificam serpinas no carrapato bovino, que foram nomeadas RmS (R. microplus serpin). Análises por RT-PCR mostraram que na maioria dos tecidos e estágios de desenvolvimento do parasito há expressão das RmS. Todas as sequências identificadas mostram conservação com serpinas de outras espécies de carrapatos. Aproximadamente 41% das RmS (7 de 16) provavelmente são secretadas, pois possuem predição para peptídeo-sinal. Assim como em outras serpinas, todas RmS possuem entre 1 e 4 sítios para N-glicosilação. Modelos tridimensionais revelam conservação de estrutura terciária das RmS analisadas com outras serpinas de mamíferos. Devido à presença de peptídeo-sinal, conservação com serpinas de outros carrapatos e presença em saliva, que foi revelada pelo estudo proteômico preliminar da saliva do parasito, RmS-3 foi escolhida para estudos mais pormenorizados. Para isso, a sequência codificadora foi clonada e ela foi obtida em forma recombinante. Anticorpos policlonais produzidos contra a proteína recombinante revelaram a presença da proteína em todos os tecidos analisados, e também na saliva, o que sugere participar na modulação das respostas do hospedeiro. / Ticks are hematophagous animals vectors of several human and animal diseases. Rhipicephalus (Boophilus) microplus is a bovine-specific ectoparasite. It is causes significant economic losses in livestock-producing countries. Increasing tick acaricide-resistant populations and, possible contamination on the environmental and on bovine-derived products contamination such as meat and milk impel the study of new control methods. Immunological control is a strategy proved to be feasible, but it requires really efficient antigens. A strategy to achieve this purpose is the study of proteins acting in physiological processes of major importance for the tick, as blood intake and digestion. Proteins belonging to the superfamily of serpins (serine protease inhibitors) have a role in several mammalian physiological processes, including blood coagulation, fibrinolysis and complement activation. As ticks encode information for serpins synthesis it is assumed they disrupt homeostasis their hosts. Through analysis of the cDNA sequences database, we identified 16 sequences coding for serpins in cattle tick, which were named RmS (R. microplus serpin). RT-PCR analyses showed RmSs are expressed in most tick tissues and developmental stages. All identified sequences are conserved concerning other tick species serpins. Around 41% of RmS (7 out 16) are probably secreted, since they have sequences predicting for signal peptide. Similarly as other serpin, all RmSs have 1 to 4 N-glycosylation sites. Protein modeling showed all RmSs have a conserved tertiary structure with other mammal serpins. RmS-3 was chosen for further studies due to presence of signal peptide, conservation with serpin inform other ticks and the presence in saliva revealed by an initial a proteomic study of tick saliva. In these studies, its gene was cloned RmS-3 was obtained as a recombinant protein. Polyclonal antibodies were against the recombinant protein showed RmS-3 presence in all analyzed tissues and also in saliva, suggesting it have a role disturbing host responses.
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Farmacologia da saliva do carrapato Rhipicephalus (Boophillus) microplus : papel da modulação da hemostasia na relação parasito-hospedeiro

Reck Junior, José January 2009 (has links)
Carrapatos são artrópodos hematófagos distribuídos por todo o mundo e vetores de diversas doenças. Como todos os hematófagos, os carrapatos possuem um arsenal de moléculas que inibe a resposta hemostática do hospedeiro, o que viabiliza o repasto sanguíneo bemsucedido. O carrapato bovino Rhipicephalus (Boophilus) microplus é um carrapato de um só hospedeiro e considerado o mais importante parasito de animais domésticos da América Latina. O R. microplus causa sérios danos aos bovinos, direta, e principalmente, devido à espoliação de sangue que leva à anemia e diminuição da produção de leite e do ganho de peso; e, indiretamente, via a transmissão de patógenos, como Babesia spp. e Anaplasma spp. O R. microplus é também um modelo interessante para o estudo das relações parasitohospedeiro, visto que ele permanece fixado ao mesmo hospedeiro durante toda a sua vida parasitária, o que leva em torno de três semanas. Os objetivos deste trabalho são explorar os mecanismos farmacológicos da saliva do carrapato R. microplus capazes de modular o sistema hemostático, bem como o papel que esta modulação desempenha na relação parasito-hospedeiro. Nesse sentido, este estudo foi organizado em duas partes. Primeiramente, foi realizada uma investigação sobre os parâmetros hemostáticos em bovinos infestados por carrapatos. Em um segundo momento, foram estudados os mecanismos da saliva do carrapato envolvidos na inibição da hemostasia, assim como a habilidade do soro de bovinos repetidamente infestados (que apresentam resistência imunológica naturalmente adquirida contra o carrapato bovino) em interferir na ação antihemostática da saliva do carrapato. Na primeira parte do estudo, foi demonstrado que bovinos experimentalmente infestados com 20.000 larvas de R. microplus apresentam uma diminuição na capacidade de agregação plaquetária (em resposta a colágeno e ADP), bem como na coagulação sanguínea (evidenciada por um aumento nos tempos de tromboplastina parcialmente ativado e de protrombina), enquanto a contagem de plaquetas e os níveis de fibrinogênio aumentaram significativamente ao longo da infestação. Na segunda parte, foi demonstrado que a saliva de R. microplus: (i) apresenta atividade inibitória in vitro sobre a agregação plaquetária induzida por colágeno; (ii) inibe a indução de ativação endotelial; e (iii) reduz a trombogênese in vivo. Ademais, o soro de bovinos repetidamente infestados (RIBS) foi capaz de bloquear parcialmente a atividade anticoagulante e antitrombótica da saliva e totalmente a modulação da ativação endotelial, ao passo que o RIBS não apresentou nenhum efeito sobre a inibição da agregação plaquetária. O conjunto dos dados apresentados permite um melhor entendimento dos fenômenos que ocorrem no hospedeiro durante o parasitismo, e também fornece mais subsídios para uma maior compreensão do processo de hematofagia e dos mecanismos fisiopatológicos que regem a relação parasitohospedeiro. / Ticks are blood-feeding arthropods widely distributed in the world and vectors of several diseases. Like all hematophagous animals, ticks resort to a variety of molecules in order to avoid the host hemostatic response, which in turn allow a successful blood-meal. The cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus is an one-host tick, and is considered the most harmful parasite of domesticated animals in Latin America. R. microplus causes expressive injuries to bovines, directly, mainly due to blood spoliation, leading to anemia, and diminution of milk production and weight gain. Indirectly the tick is responsible for the transmission of pathogens such as Babesia spp. and Anaplasma spp. R. microplus is also a consistent model to study the parasite-host relationship, since it remains attached to the same host throughout the whole parasitic stage, which lasts around three weeks. This work aims at exploring the pharmacological mechanisms of R. microplus tick saliva able to modulate hemostasis, and the role of this modulation in tick-host relationship. In this sense, this study was organized in two parts: firstly, an investigation about the hemostatic parameters in tick infested bovines was performed. Secondly, the tick salivary mechanisms involved in the inhibition of hemostasis were studied, and the ability of serum from repeatedly infested bovines (which displays natural acquired immunological resistance to the cattle tick) to interfere in anti-hemostatic activity of tick saliva was also investigated. In the first part of this study it was shown that calves experimentally infested with 20,000 R. microplus larvae display a decrease in platelet aggregation (in response to collagen and ADP) as well as in coagulation ability (evinced by an increase in activated partial thromboplastin time and prothrombin time), whereas platelet blood count and fibrinogen level significantly increased during the course of infestation. In the second part of this work, it was demonstrated that R. microplus saliva: (i) displays in vitro inhibitory activity upon collagen-induced platelet aggregation; (ii) inhibits the induction of endothelial activation; and (iii) reduces thrombogenesis in vivo. Moreover, repeated infested bovine sera (RIBS) were shown to be able to partially block the delay of coagulation and the antithrombotic effect of saliva, and to totally abolish the modulation of endothelium activation, in spite of the fact that RIBS has no effect on the inhibition of platelet aggregation. The set of data presented in this work allows a better understanding of the phenomena occurring in the host during parasitism, and also gives more insights to improve the understanding of the hematophagy process and the pathophysiological mechanisms behind host-tick interaction.
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Secretoma do fungo biocontrolador Metarhizium anisopliae relacionado à infecção do carrapato bovino Rhipicephalus microplus

Scherer, Karine 23 February 2016 (has links)
Submitted by FERNANDA DA SILVA VON PORSTER (fdsvporster@univates.br) on 2016-09-22T18:55:12Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) 2016KarineScherer.pdf: 501039 bytes, checksum: ba846d16b9e36cfee8ac3c7682596d48 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Lisboa Monteiro (monteiro@univates.br) on 2016-09-29T19:18:09Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) 2016KarineScherer.pdf: 501039 bytes, checksum: ba846d16b9e36cfee8ac3c7682596d48 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-29T19:18:09Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) 2016KarineScherer.pdf: 501039 bytes, checksum: ba846d16b9e36cfee8ac3c7682596d48 (MD5) Previous issue date: 2016-09 / Prosup/CAPES / O controle biológico é considerado uma alternativa natural e ecológica para o controle de pragas, evitando os problemas causados pela utilização de agentes químicos. Na comparação entre as duas alternativas, o controle biológico apresenta inúmeras vantagens, principalmente quanto ao impacto ambiental, custo, manuseio, especificidade e não desenvolvimento de resistência. No entanto, os biopesticidas necessitam, na maioria das vezes, de mais tempo para efetivar o controle das pragas-alvo, quando comparado ao controle químico. Entre os microrganismos utilizados no controle biológico de pragas, o fungo Metarhizium anisopliae está entre os mais estudados e aplicados para diversas pragas, inclusive para o controle do carrapato bovino Rhipicephalus microplus, um ectoparasita hematófago responsável por grandes prejuízos econômicos no Brasil e no mundo. O estudo do processo de infecção do hospedeiro pode contribuir muito na otimização do processo de biocontrole visando a redução do tempo de morte da praga a ser controlada. Neste trabalho, utilizando shotgun proteomics e um sistema de cultura in vitro indutor do sistema de infecção, identificamos mais de 400 proteínas. Destas, 133 foram exclusivas da condição de infecção e 56 diferencialmente reguladas quando comparadas ao controle. Nestes resultados, foram identificadas proteínas responsáveis pela degradação e penetração da cutícula, além de moduladores da resposta do hospedeiro e proteção do fungo. Muitas das proteínas foram identificadas pela primeira vez neste sistema e 12 aparentemente são compartilhadas na infecção de M. anisopliae em insetos, portanto, não estando relacionadas à especificidade ao hospedeiro. Este perfil de proteínas secretadas, identificadas neste trabalho, representa uma contribuição para o entendimento da interação patógeno-hospedeiro e futuramente podem contribuir na otimização do controle biológico e na seleção de isolados mais eficientes especificamente para o carrapato bovino R. microplus. / The biological control is considered a natural and ecologic alternative to control pests avoiding the issues related to the use of chemical compounds. The biocontrol presents several benefits as the lower environmental impact, cost, handling, specificity, and the non-development of resistant pest strains. However, normally biopesticides need more time to kill and control pests when compared to chemical control. Among microorganisms used in biological control the fungus Metarhizium anisopliae is one of the most studied and applied to control several pests, including the cattle tick Rhipicephalus microplus. The understanding of the host infection process may contribute to optimize the biocontrol through the reduction of the time to kill the target pest. In this work, applying shotgun proteomics and an in vitro culture strategy to induce the infection system in R. microplus we identified more than 400 proteins. Among these proteins, 133 were exclusively identified in the infection condition and 56 were differentially regulated when compared to control. Several of these proteins are related to host-cuticle digestion and penetration, fungal defense and modulators of host immune system. Besides, many of these proteins are being reported for the first time linked to M. anisopliae infection and 12 are shared in infection of insects and probably not connected to host specificity. The secreted protein profile identified here represents a contribution to the understanding of host-pathogen interaction and may help to optimize the biocontrol and to select fungal isolates more specific and effiicent to control the cattle tick R. microplus.
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Secretoma de Beauveria bassiana relacionado à infecção no carrapato bovino Rhipicephalus microplus

Klein, Lisete Aparecida Silva 24 November 2016 (has links)
Submitted by FERNANDA DA SILVA VON PORSTER (fdsvporster@univates.br) on 2017-06-22T18:56:45Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) 2016LiseteAparecidaSilvaKlein.pdf: 1141562 bytes, checksum: 5b220c02ace2690bb07ba88bb7aeebe6 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Lisboa Monteiro (monteiro@univates.br) on 2017-06-26T18:50:11Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) 2016LiseteAparecidaSilvaKlein.pdf: 1141562 bytes, checksum: 5b220c02ace2690bb07ba88bb7aeebe6 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-26T18:50:11Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) 2016LiseteAparecidaSilvaKlein.pdf: 1141562 bytes, checksum: 5b220c02ace2690bb07ba88bb7aeebe6 (MD5) Previous issue date: 2017-06 / O controle biológico é considerado uma ferramenta natural e alternativa ecológica para superar os problemas causados pela utilização de métodos químicos no controle de pragas. Além disso, os biocontroladores apresentam inúmeras vantagens quando comparados aos seus análogos químicos, principalmente quanto ao impacto ambiental, custo, manuseio, especificidade e desenvolvimento de resistência. Entre os diversos microrganismos utilizados no controle biológico, os fungos se destacam e, entre estes, o fungo filamentoso e patógeno de artrópodes Beauveria bassiana está entre os mais estudados e aplicados. Neste estudo, utilizando proteômica e ferramentas de bioinformática, foram identificadas um total de 256 proteínas. Proteínas envolvidas em diferentes processos importantes para o biocontrole como degradação da cutícula (proteases, lipases), defesa/antioxidantes (catalases, oxidoredutases) e efetoras (glicosil hidrolases) foram observadas. A maioria destas proteínas parecem ser secretadas, seja por rotas clássicas como não clássicas. A identificação dos mecanismos moleculares de infecção do fungo em pragas específicas possibilita o entendimento mais refinado do biocontrole e, consequentemente, no desenvolvimento de estratégias para otimizar este processo. A identificação de proteínas em um sistema que mimetiza as condições de infecção possibilita a busca orientada de microrganismos mais eficientes com maior virulência e especificidade no controle biológico do artrópode R. microplus. / The biological control is considered a natural and ecological alternative tool to overcome the problems caused by the use of chemical methods in pest control. In addition, the biocontrol presents several advantages when compared to its chemical analogues, regarding to environmental impact, cost, handling, specificity and resistance development. Among microorganisms used in biological control, fungi stand out and, the filamentous fungus and arthropod pathogen Beauveria bassiana. This fungus is one of the most studied and applied worldwide. In this study, using proteomics and bioinformatics approaches, a total of 256 proteins were identified. Proteins involved in different important processes for the biocontroling, including degradation of the cuticle (proteases, lipase), defense/antioxidants (catalases, oxidoreductases) and effectors (glycoside hydrolases) were observed. The identification of the molecular mechanisms involved in the fungal infection on specific pests provides understanding of biocontrol and consequently helping to develop strategies to optimize this process. The identification of proteins in a model that mimics the infection condition enables the oriented search for more efficient micro-organisms with greater virulence and specificity in the biological control of R. microplus tick.
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Uso de Babesia bovis como uma vacina de vetor vivo para o controle do carrapato bovino Rhipicephalus microplus

Oldiges, Daiane Patrícia January 2016 (has links)
O carrapato Rhipicephalus microplus é um ectoparasito hematófago de grande importância para a pecuária por ser responsável por perdas massivas na produção animal, de forma que o seu controle é economicamente relevante. Este carrapato, além dos danos que causa por si só, é também um importante vetor para a transmissão de microorganismos patogênicos, entre eles o hemoprotozoário intraeritrocítico Babesia bovis. O presente trabalho descreve o desenvolvimento de uma linhagem de B. bovis capaz de expressar um antígeno protetor, uma glutationa S-transferase do carrapato Haemaphysalis longicornis (HlGST), e o teste desta linhagem como uma vacina de vetor vivo para o controle do carrapato R. microplus. B. bovis, em cultivo, da linhagem S74-T3B foram eletroporados em presença de plasmídeo contendo o promotor bidirecional de B. bovis Ef-1 aresponsável pela expressão independente de dois genes: o repórter fusionado ao agente para seleção (GFP-BSD) e HlGST fusionada à sequência codificadora do peptídeo sinal de MSA-1 (merozoite surface antigen-1). Após a eletroporação, foi feita a seleção com blasticidina para obtenção da linhagem nomeada HlGST. A linhagem HlGST é composta por parasitos contendo diferentes padrões de inserção dos genes exógenos, tanto dentro quanto fora do locus Ef-1. Uma linhagem clonal denominada HlGST-Cln expressando HlGST e GFP-BSD foi obtida a partir da linhagem HlGST. Dois ensaios, independentes, de imunização de bovinos com os parasitos clonais foram realizados, sendo usado como controle uma linhagem clonal previamente caracterizada denominada GFP-Cln. Todos os animais inoculados desenvolveram uma forma branda de babesiose, indicando que ambas as linhagens clonais são atenuadas, mas apenas os animais imunizados com a linhagem HlGST-Cln foram capazes de produzir anticorpos anti-HlGST. O segundo procedimento de imunização foi seguido por um desafio com larvas de R. microplus. O desenvolvimento dessas larvas no hospedeiro levou a fêmeas adultas de menor peso e fertilidade. Coletivamente, esses dados mostram a possibilidade de uso de linhagens transfectadas de B. bovis como vacinas de vetor vivo. / The tick Rhipicephalus microplus is a notorious blood-feeding ectoparasite of cattle, responsible for massive losses in animal production. It is the main vector of pathogenic microorganisms, including Babesia bovis, an intraerythrocytic apicomplexan protozoan parasite responsible for bovine babesiosis. This study describes the development and testing of a live B. bovis vaccine expressing the protective tick antigen glutathione S-transferase from Haemaphysalis longicornis (HlGST). The B. bovis S74- T3B parasites were electroporated with a plasmid containing the bidirectional Ef-1 promoter of B. bovis controlling expression of two independent genes, the selectable marker GFP-BSD, and HlGST fused to the MSA-1 (merozoite surface antigen-1) signal peptide from B. bovis. Electroporation followed by blasticidin selection resulted in the emergence of a mixed B. bovis transfected line (termed HlGST) in in vitro cultures, containing parasites with distinct patterns of insertion of both exogenous genes, either in or outside the Ef-1 a locus. A B. bovis clonal line termed HlGST-Cln expressing HlGST and GFP-BSD was then derived from the mixed parasite line HlGST. Two independent calf immunization trials were performed via intravenous inoculation of the HlGST-Cln and a control consisting of an irrelevant transfected clonal line of B. bovis designated GFP-Cln. The control GFP-Cln line contains a copy of the GFP-BSD gene inserted into the Ef-1 locus of B. bovis in an identical fashion as the HIGST-Cln parasites. All animals inoculated with the HlGST-Cln and GFP-Cln transfected parasites developed mild babesiosis indicating that both transfected cloned parasite lines are attenuated. All animals immunized with HlGST-Cln produced detectable anti-glutathione-S-transferase antibodies. After immunization with HlGST-Cln, calves were challenged with R. microplus larva. Development of these larva produce fully engorged female tick with reduced weight and fertility. Collectively, these data show that transfected B. bovis parasites can be used as vectors in live vectored vaccines.
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Agrupamentos gênicos envolvidos na biosíntese de metabólitos secundários no fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae : identificação genômica e padrões de expressão em cutículas do carrapato Rhipicephalus microplus

Oliveira, Nicolau Sbaraini January 2016 (has links)
O gênero Metarhizium abriga fungos cosmopolitas que infectam hospedeiros artrópodes. Curiosamente, enquanto algumas espécies do gênero infectam um amplo espectro de hospedeiros (hospedeiro-generalistas), outras espécies infectam apenas alguns artrópodes (hospedeiro-especialistas). Esse traço evolutivo singular permite comparações únicas, a fim de determinar como patógenos e fatores de virulência surgem. Dentre os diversos fatores de virulência descritos, se destacam os metabólitos secundários que hipoteticamente desempenhem papéis essenciais na infecção fúngica. No entanto, a maioria dos genes para a produção de metabólitos secundários em Metarhizium spp. não foram ainda caracterizados, e pouco se sabe sobre a organização gênomica, expressão e regulação destes genes. A fim de melhor compreender estes aspectos, nós realizamos uma análise e descrição detalhada de agrupamentos gênicos (clusters) envolvidos na biossíntese de metabólitos secundários em M. anisopliae, analisamos dados de um estudo transcritômico onde o fungo foi cultivado em cutículas de carrapato avaliando a expressão diferencial destes clusters, bem como avaliamos a conservação destes genes entre espécies do gênero Metarhizium. Ademais, nossa análise se estendeu avaliando aspectos evolutivos e filogenéticos para três clusters: MaPKS1 cujo produto é putativamente assemelhado a tropolonas e citrininas, MaNRPS-PKS2 cujo produto é putativamente assemelhado a pseurotina e MaTERP1 cujo produto putativo é o ácido helvólico. Dentre os 73 clusters identificados no genoma de M. anisopliae, 20 % estavam positivamente regulados na condição experimental de infecção inicial, com presumível papel na virulência do fungo. Dentre os clusters positivamente regulados estão genes já caracterizados envolvidos na biossíntese de destruxinas, NG39x e ferricrocina, em conjunto com genes putativamente envolvidos na biossíntese do ácido helvólico, produtos assemelhados a pseurotina e tropolonas e citrininas, além de genes envolvidos na biossíntese de compostos desconhecidos. Curiosamente, diversos clusters positivamente regulados na condição de infecção inicial não estão presentes em espécies hospedeiro-especialistas do gênero Metarhizium, indicando que existem diferenças nas estratégias metabólicas empregadas por espécies hospedeiro-generalistas e hospedeiro-especialistas no ciclo infeccioso. Estas diferenças no potencial metabólico podem ter sido parcialmente moldadas por eventos de transferência horizontal, conforme sugere nossa análise filogenética sobre a origem do o cluster putativamente envolvido na biossíntese do ácido helvólico em Metarhizium spp. Em conclusão, diversos clusters desconhecidos são descritos e aspectos da sua organização, regulação e origem são discutidos, fornecendo evidências sobre o impacto dos metabólitos secundários no ciclo de vida e infecção de espécies do gênero Metarhizium. / The Metarhizium genus harbors cosmopolitan fungi that infect arthropod hosts. Interestingly, while some species infect a wide range of hosts (host-generalists), other species infect only a few arthropods (host-specialists). This singular evolutionary trait permits unique comparisons to determine how pathogens and virulence determinants emerge. Among the several virulence determinants that have been described, secondary metabolites (SMs) are suggested to play essential roles during fungal infection. However, the majority of genes related to SM production in Metarhizium spp. are uncharacterized, and little is known about their genomic organization, expression and regulation. To better understand these aspects, we have performed a deep survey and description of SM biosynthetic gene clusters (BGCs) in M. anisopliae, analyzed RNA-seq data from fungi grown on cattle-tick cuticles, evaluated the differential expression of BGCs, and assessed conservation within the Metarhizium genus. Furthermore, our analysis extended to the construction of a phylogeny for the following three BGCs: a tropolone/citrinin-related compound (MaPKS1), a pseurotin-related compound (MaNRPS-PKS2), and a putative helvolic acid (MaTERP1). Among 73 BGCs identified in M. anisopliae, 20% were up-regulated during initial tick cuticle infection and presumably possess virulence-related roles. These up-regulated BGCs include known clusters, such as destruxin, NG39x and ferricrocin, together with putative helvolic acid and pseurotin- and tropolone/citrinin-related compound clusters, as well as uncharacterized clusters. Interestingly, several up-regulated BGCs were not conserved in host-specialist species from the Metarhizium genus, indicating differences in the metabolic strategies employed by generalist and specialist species to overcome and kill their host. These differences in metabolic potential may have been partially shaped by horizontal gene transfer (HGT) events, as our phylogenetic analysis provided evidence that the putative helvolic acid cluster in Metarhizium spp. originated from an HGT event. In conclusion several unknown BGCs are described, and aspects of their organization, regulation and origin are discussed, providing evidence for the impact of SMs on the Metarhizium genus lifestyle and infection process.
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Caracterização da rVTDCE de Rhipicephalus (Boophilus) microplus : uma peptidase antimicrobiana

Oldiges, Daiane Patrícia January 2012 (has links)
O carrapato bovino, Rhipicephalus (Boophilus) microplus, é um artrópode hematófago, responsável por importantes perdas na pecuária. Durante o desenvolvimento do embrionário do carrapato a cisteíno endopeptidase degradadora de vitelina (VTDCE) participa do processo de hidrólise de vitelina (Vt), a principal fonte de energia e aminoácidos durante esse período. Devido à sua importância na fisiologia do parasita, a VTDCE é um alvo potencial para o desenvolvimento de vacinas anti-carrapatos. Estudos anteriores demonstraram que a VTDCE nativa, purificada de ovos confere proteção contra R. microplus, desencadeada pela resposta imune dos bovinos após a administração deste antígeno. Entretanto, o extenso e dispendioso processo de purificação desta proteína, acrescido do baixo rendimento e fonte escassa de material (ovos de carrapato) inviabiliza a utilização da proteína nativa para fins comerciais. Tais dificuldades podem ser ultrapassadas por meio do uso de uma proteína recombinante. O presente trabalho tem por objetivo a expressão, purificação e caracterização da VTDCE recombinante (rVTDCE). Parte da sequência de aminoácidos da VTDCE nativa foi obtida por sequenciamento de edman e pela análise por especrometria de massas de petídeos obtidos pelo tratamento da proteína com tripsina e. As sequências obtidas assim obtidas foram utilizadas para buscar a sequência da ORF da VTDCE em um banco de cDNA. Por meio de PCR, a ORF da enzima foi clonada em vetor de clonagem e posteriormente de expressão. A rVTDCE expressa em Escherichia coli foi purificada por cromatografia de afinidade e utilizada para determinar algumas de suas propriedades, como atividade enzimática e antimicrobiana. A atividade enzimática foi avaliada através de ensaios fluorimétricos, onde a rVTDCE mostrou características similares à VTDCE nativa. Ensaios antimicrobianos foram realizados para avaliar a possível atividade sugerida após análise da sequencia da ORF da VTDCE. A análise molecular mostrou que a sequência da VTDCE apresenta semelhança com peptídeos antimicrobianos, fato comprovado através de ensaios antimicrobianos. Efetivamente, a VTDCE apresentou atividade antimicrobiana tanto na sua forma nativa como na forma desnaturada desprovida de atividade peptidásica, demonstrando que ambas as atividades são independentes. Foram feitos também ensaios imunológicos, onde anticorpos policlonais anti-rVTDCE foram produzidos em coelhos e bovinos. Por Western blot foi observado que os anticorpos policlonais produzidos contra VTDCE recombinante reconheceram a VTDCE nativa, e o inverso também, indicando que a forma recombinante pode ser utilizada para experimentos de vacinação. / The cattle tick, Rhipicephalus (Boophilus) microplus is a hematophagous arthropod, responsible for significant losses in livestock. During the tick embryo the vitellin-degrading cysteine endopeptidase (VTDCE) participates in the vitellin (Vt) hydrolysis, the main energy source and amino acids during this period. Due to the importance of this enzyme in parasite physiology the VTDCE is a potential target for development of anti-tick vaccine. In previous studies, the immunization with native VTDCE, purified from tick egg, conferred protection against R. microplus. However, the extensive and expensive purification process, plus the low achievement precludes the use of the native protein for commercial purposes. This difficulty can be overcome by the expression of a recombinant protein in heterologous organism. This work aims the expression, purification and characterization of recombinant VTDCE (rVTDCE). Part of the native VTDCE amino acid sequence was determined by Edman sequencing. Native protein was also trypsinized and peptides sequenced by mass spectrometry. The sequences obtained from mass spectrometry and Edman sequencing were used to search the ORF sequence of VTDCE in a tick cDNA library. Through PCR enzyme ORF was cloned into a cloning vector and further into an expression vector. The rVTDCE expressed in Escherichia coli was purified by affinity chromatography and used to determine some of its properties such as antimicrobial and enzyme activity. The enzymatic activity was measured using fluorimetric assays, where rVTDCE had similar characteristics to VTDCE. Antimicrobial assays were performed to evaluate the possible activity suggested after sequence analysis. Molecular analysis showed that the sequence of VTDCE shows similarity with antimicrobial peptides, which was proven through antimicrobial assays. Effectively, the VTDCE presented antimicrobial activity even when the protein didn’t present enzymatic activity, demonstrating that both activities are independent. Immunological assays were also performed. Polyclonal anti-rVTDCE serum were produced in rabbits and cattle. Western blot showed that the polyclonal antibodies raised against recombinant VTDCE recognized the native form, indicating that the recombinant form may be used for vaccination experiments.
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Perfil inibitório e antigenicidade da cistatina JpIocys2a de Ixodes ovatus

Sabadin, Gabriela Alves January 2015 (has links)
Cistatinas são um grupo de inibidores de cisteíno proteases que atuam na regulação da proteólise e estão presentes em uma ampla variedade de organismos. Estudos sobre essa classe de inibidores em parasitas têm contribuído para elucidar suas funções na regulação de processos fisiológicos como a digestão do sangue e a supressão da resposta imune do hospedeiro durante a alimentação. Por isso, cistatinas são um alvo interessante na pesquisa para o desenvolvimento de novos métodos de controle de parasitas. Além disso, a caracterização de proteínas compartilhadas por diferentes espécies de parasitas representa uma estratégia viável para encontrar potenciais alvos para uma vacina multi-espécie. Entretanto, as funções das cistatinas nos carrapatos permanecem obscuras, especialmente na espécie Ixodes ovatus. Neste trabalho, foi caracterizado o perfil inibitório de rJpIocys2a, uma cistatina de I. ovatus, para as catepsinas B, C e L. O perfil de inibição enzimática de rJpIocys2a se mostrou variável entre catepsinas envolvidas na digestão do sangue pelo carrapato e na evasão da resposta imune do hospedeiro. Além disso, um peptídeo baseado na sequência de aminoácidos do inibidor JpIocsy2a (STQ-pep) foi sintetizado e utilizado para imunização de coelhos. O soro anti-STQ-pep foi usado para analisar a antigenicidade cruzada entre cistatinas dos carrapatos Rhipicephalus microplus e I. ovatus. A análise da antigenicidade cruzada revelou que anticorpos gerados contra o peptídeo são capazes de reconhecer cistatinas nativas e recombinante de R. microplus. A habilidade de rJpIocys2a de inibir catepsinas relacionadas a diferentes funções sugere múltiplas funções para esse inibidor. Os resultados obtidos neste trabalho forneceram bases para outros experimentos que utilizem esta proteína como antígeno vacinal. / Cystatins are a group of cysteine protease inhibitors that act on the regulation of physiological proteolysis and are present in a wide range of organisms. Researches on this class of inhibitors in parasites have contributed to clarify their roles in the regulation of important physiological processes, such as blood digestion and suppression of the host immune response during blood feeding. Thus, cystatins are a topic of research for the development of new parasite control methods. Additionally, the characterization of proteins shared by different parasite species represents a valuable strategy to identify potential targets for a multi-species vaccine. However, cystatin functions in ticks remain undetermined, especially in Ixodes ovatus. This work characterized the inhibitory profile of rJpIocys2a, an I. ovatus cystatin, to cathepsins B, C, and L. The enzymatic inhibition profile of JpIocys2a shows a distinct modulation of cathepsins related to tick blood digestion and evasion of host immune response. In addition, a peptide from JpIocys2a amino acid sequence (STQ-pep) was synthesized and used for rabbit immunization. Anti-STQ-pep serum was used to analyze the cross-antigenicity between Rhipicephalus microplus and I. ovatus cystatins. Crossantigenicity assays revealed that antibodies against the JpIocys2a peptide are able to recognize native and recombinant R. microplus ticks cystatins. The ability of rJpIocys2a to inhibit cathepsins related to different functions suggests multiple roles for JpIocys2a. The results obtained in this work provided basis for further experiments using this protein as a vaccine antigen.
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Caracterização da rVTDCE de Rhipicephalus (Boophilus) microplus : uma peptidase antimicrobiana

Oldiges, Daiane Patrícia January 2012 (has links)
O carrapato bovino, Rhipicephalus (Boophilus) microplus, é um artrópode hematófago, responsável por importantes perdas na pecuária. Durante o desenvolvimento do embrionário do carrapato a cisteíno endopeptidase degradadora de vitelina (VTDCE) participa do processo de hidrólise de vitelina (Vt), a principal fonte de energia e aminoácidos durante esse período. Devido à sua importância na fisiologia do parasita, a VTDCE é um alvo potencial para o desenvolvimento de vacinas anti-carrapatos. Estudos anteriores demonstraram que a VTDCE nativa, purificada de ovos confere proteção contra R. microplus, desencadeada pela resposta imune dos bovinos após a administração deste antígeno. Entretanto, o extenso e dispendioso processo de purificação desta proteína, acrescido do baixo rendimento e fonte escassa de material (ovos de carrapato) inviabiliza a utilização da proteína nativa para fins comerciais. Tais dificuldades podem ser ultrapassadas por meio do uso de uma proteína recombinante. O presente trabalho tem por objetivo a expressão, purificação e caracterização da VTDCE recombinante (rVTDCE). Parte da sequência de aminoácidos da VTDCE nativa foi obtida por sequenciamento de edman e pela análise por especrometria de massas de petídeos obtidos pelo tratamento da proteína com tripsina e. As sequências obtidas assim obtidas foram utilizadas para buscar a sequência da ORF da VTDCE em um banco de cDNA. Por meio de PCR, a ORF da enzima foi clonada em vetor de clonagem e posteriormente de expressão. A rVTDCE expressa em Escherichia coli foi purificada por cromatografia de afinidade e utilizada para determinar algumas de suas propriedades, como atividade enzimática e antimicrobiana. A atividade enzimática foi avaliada através de ensaios fluorimétricos, onde a rVTDCE mostrou características similares à VTDCE nativa. Ensaios antimicrobianos foram realizados para avaliar a possível atividade sugerida após análise da sequencia da ORF da VTDCE. A análise molecular mostrou que a sequência da VTDCE apresenta semelhança com peptídeos antimicrobianos, fato comprovado através de ensaios antimicrobianos. Efetivamente, a VTDCE apresentou atividade antimicrobiana tanto na sua forma nativa como na forma desnaturada desprovida de atividade peptidásica, demonstrando que ambas as atividades são independentes. Foram feitos também ensaios imunológicos, onde anticorpos policlonais anti-rVTDCE foram produzidos em coelhos e bovinos. Por Western blot foi observado que os anticorpos policlonais produzidos contra VTDCE recombinante reconheceram a VTDCE nativa, e o inverso também, indicando que a forma recombinante pode ser utilizada para experimentos de vacinação. / The cattle tick, Rhipicephalus (Boophilus) microplus is a hematophagous arthropod, responsible for significant losses in livestock. During the tick embryo the vitellin-degrading cysteine endopeptidase (VTDCE) participates in the vitellin (Vt) hydrolysis, the main energy source and amino acids during this period. Due to the importance of this enzyme in parasite physiology the VTDCE is a potential target for development of anti-tick vaccine. In previous studies, the immunization with native VTDCE, purified from tick egg, conferred protection against R. microplus. However, the extensive and expensive purification process, plus the low achievement precludes the use of the native protein for commercial purposes. This difficulty can be overcome by the expression of a recombinant protein in heterologous organism. This work aims the expression, purification and characterization of recombinant VTDCE (rVTDCE). Part of the native VTDCE amino acid sequence was determined by Edman sequencing. Native protein was also trypsinized and peptides sequenced by mass spectrometry. The sequences obtained from mass spectrometry and Edman sequencing were used to search the ORF sequence of VTDCE in a tick cDNA library. Through PCR enzyme ORF was cloned into a cloning vector and further into an expression vector. The rVTDCE expressed in Escherichia coli was purified by affinity chromatography and used to determine some of its properties such as antimicrobial and enzyme activity. The enzymatic activity was measured using fluorimetric assays, where rVTDCE had similar characteristics to VTDCE. Antimicrobial assays were performed to evaluate the possible activity suggested after sequence analysis. Molecular analysis showed that the sequence of VTDCE shows similarity with antimicrobial peptides, which was proven through antimicrobial assays. Effectively, the VTDCE presented antimicrobial activity even when the protein didn’t present enzymatic activity, demonstrating that both activities are independent. Immunological assays were also performed. Polyclonal anti-rVTDCE serum were produced in rabbits and cattle. Western blot showed that the polyclonal antibodies raised against recombinant VTDCE recognized the native form, indicating that the recombinant form may be used for vaccination experiments.
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Uso de Babesia bovis como uma vacina de vetor vivo para o controle do carrapato bovino Rhipicephalus microplus

Oldiges, Daiane Patrícia January 2016 (has links)
O carrapato Rhipicephalus microplus é um ectoparasito hematófago de grande importância para a pecuária por ser responsável por perdas massivas na produção animal, de forma que o seu controle é economicamente relevante. Este carrapato, além dos danos que causa por si só, é também um importante vetor para a transmissão de microorganismos patogênicos, entre eles o hemoprotozoário intraeritrocítico Babesia bovis. O presente trabalho descreve o desenvolvimento de uma linhagem de B. bovis capaz de expressar um antígeno protetor, uma glutationa S-transferase do carrapato Haemaphysalis longicornis (HlGST), e o teste desta linhagem como uma vacina de vetor vivo para o controle do carrapato R. microplus. B. bovis, em cultivo, da linhagem S74-T3B foram eletroporados em presença de plasmídeo contendo o promotor bidirecional de B. bovis Ef-1 aresponsável pela expressão independente de dois genes: o repórter fusionado ao agente para seleção (GFP-BSD) e HlGST fusionada à sequência codificadora do peptídeo sinal de MSA-1 (merozoite surface antigen-1). Após a eletroporação, foi feita a seleção com blasticidina para obtenção da linhagem nomeada HlGST. A linhagem HlGST é composta por parasitos contendo diferentes padrões de inserção dos genes exógenos, tanto dentro quanto fora do locus Ef-1. Uma linhagem clonal denominada HlGST-Cln expressando HlGST e GFP-BSD foi obtida a partir da linhagem HlGST. Dois ensaios, independentes, de imunização de bovinos com os parasitos clonais foram realizados, sendo usado como controle uma linhagem clonal previamente caracterizada denominada GFP-Cln. Todos os animais inoculados desenvolveram uma forma branda de babesiose, indicando que ambas as linhagens clonais são atenuadas, mas apenas os animais imunizados com a linhagem HlGST-Cln foram capazes de produzir anticorpos anti-HlGST. O segundo procedimento de imunização foi seguido por um desafio com larvas de R. microplus. O desenvolvimento dessas larvas no hospedeiro levou a fêmeas adultas de menor peso e fertilidade. Coletivamente, esses dados mostram a possibilidade de uso de linhagens transfectadas de B. bovis como vacinas de vetor vivo. / The tick Rhipicephalus microplus is a notorious blood-feeding ectoparasite of cattle, responsible for massive losses in animal production. It is the main vector of pathogenic microorganisms, including Babesia bovis, an intraerythrocytic apicomplexan protozoan parasite responsible for bovine babesiosis. This study describes the development and testing of a live B. bovis vaccine expressing the protective tick antigen glutathione S-transferase from Haemaphysalis longicornis (HlGST). The B. bovis S74- T3B parasites were electroporated with a plasmid containing the bidirectional Ef-1 promoter of B. bovis controlling expression of two independent genes, the selectable marker GFP-BSD, and HlGST fused to the MSA-1 (merozoite surface antigen-1) signal peptide from B. bovis. Electroporation followed by blasticidin selection resulted in the emergence of a mixed B. bovis transfected line (termed HlGST) in in vitro cultures, containing parasites with distinct patterns of insertion of both exogenous genes, either in or outside the Ef-1 a locus. A B. bovis clonal line termed HlGST-Cln expressing HlGST and GFP-BSD was then derived from the mixed parasite line HlGST. Two independent calf immunization trials were performed via intravenous inoculation of the HlGST-Cln and a control consisting of an irrelevant transfected clonal line of B. bovis designated GFP-Cln. The control GFP-Cln line contains a copy of the GFP-BSD gene inserted into the Ef-1 locus of B. bovis in an identical fashion as the HIGST-Cln parasites. All animals inoculated with the HlGST-Cln and GFP-Cln transfected parasites developed mild babesiosis indicating that both transfected cloned parasite lines are attenuated. All animals immunized with HlGST-Cln produced detectable anti-glutathione-S-transferase antibodies. After immunization with HlGST-Cln, calves were challenged with R. microplus larva. Development of these larva produce fully engorged female tick with reduced weight and fertility. Collectively, these data show that transfected B. bovis parasites can be used as vectors in live vectored vaccines.

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