Thesis (Ph. D.)--Ohio State University, 2008. / Title from first page of PDF file. Includes vita. Includes bibliographical references (p. 148-158).

Thesis (Ph. D.)--Duke University, 2007. / Includes bibliographical references.

Cell migration is required for a number of physiological processes and is implicated in pathologies such as tumor metastasis. Cell motility is dependent upon dynamic actin reorganization, and is regulated by the Rho family of small GTPases. Rho GTPases are molecular switches that cycle between their active and inactive conformations. The best-studied members of this family are Rac1, RhoA, and Cdc42. Each is responsible for the formation of specific actin structures. Diacylglycerol kinases (DGKs) act at the membrane to convert diacylglycerol (DAG) and phosphatidic acid (PA), maintaining the balance of these two lipid second messengers. Previous studies from our lab have demonstrated that the ζ isoform of DGK facilitates the release of Rac1 and RhoA from their inhibitor, RhoGDI. Here we studied a closely related isoform, DGKι, using mouse embryonic fibroblasts (MEFS) in which the gene for DGKι had been deleted. Aberrations in cell morphology, spreading, and migration were identified in DGKι-null MEFs. We showed that the activity of Rac1 and RhoC, but not RhoA, was impaired in the absence of DGKι, yet only RhoC protein levels were affected. Reduced activation of these Rho GTPases was accompanied by defects in Rac1- and RhoC- related actin structures. These data demonstrate that DGKι, in addition to DGKζ, contributes to the regulation of GTPase activation and remodeling of the actin cytoskeleton.

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Dans le but de déterminer le rôle des Rho GTPases et de leurs régulateurs dans les cellules hématopoïétiques, une analyse des niveaux d’expressions de 300 gènes codant pour des protéines impliquées dans les voies de signalisation dépendantes de Rho a été faite à partir d’échantillons de patients atteints de leucémies de type T-ALL. Il a ainsi pu être mis en évidence qu’un groupe de gènes incluant notamment RacGAP1, Ect2, Citron et ARHGAP19 variaient parallèlement. A l’exception de ARHGAP19, ces gènes avaient une fonction connue au cours de la mitose. Il a donc été entrepris de caractériser ARHGAP19 qui, d’après les banques de données, est spécifique du système hématopoïétique, et pour laquelle aucune fonction n’avait encore été déterminée.Afin de déterminer la fonction biologique de GAP19, un anticorps a été généré. Cet outil nous a permis de montrer que l’expression de la protéine est régulée au cours du cycle cellulaire et que sa localisation varie au cours de la mitose. Par ailleurs, nous avons montré que GAP19, joue un rôle essentiel dans le changement de forme des lymphocytes en mitose, la ségrégation des chromatides sœurs et le recrutement membranaire des effecteurs de RhoA au cours de la mitose. Nous avons aussi mis en évidence le mécanisme par lequel GAP19 permet le changement de forme dans les lymphocytes.Nous avons aussi montré que GAP19 est phosphorylée par CDK1 sur deux résidus présents dans la partie C-Terminale. Afin de mettre en évidence le rôle de ces phosphorylations, nous avons généré des cellules Kit225 transfectées avec des plasmides pour les formes non-phosphorylables de la protéine. Ceci nous a permis de mettre en évidence que la phosphorylation des résidus T404 et T476 permet la localisation cytoplasmique de GAP19 en début de mitose. Nous avons aussi pu observer lors de l’anaphase la formation de ponts de chromatines, ainsi qu’une augmentation significative de cellules multinucléées. Par ailleurs, nous avons procédé à des expériences de cytogénétique et d’immunofluorescence afin de déterminer, si les ponts de chromatines avaient pour origine soit des défauts de condensation de la chromatine, soit un stress réplicatif.Enfin, un possible modèle de la protéine ARHGAP19 a été généré et des simulations de dynamiques moléculaires réalisées afin de comprendre le rôle des phosphorylations par CDK1 a un niveau structurel. / In an attempt to understand the role of Rho GTPases and their regulators in hematopoietic cell lines, expression levels of 300 genes were analyzed for proteins involved in Rho dependent signaling pathways from patients with T-ALL leukemia.It was shown that a group of genes consisting of RacGAP1, Ect2 and Citron varied concomitantly. With the exception of ARHGAP19, all already had a known function during mitosis. Consequently, it was decided to characterize ARHGAP19, which according to databases is specific of hematopoietic cell lines, and whose function was unknown. In order to determine the biological function of ARHGAP19, a specific antibody has been generated. This allowed us to demonstrate that the level of expression of the protein vary during the cell cycle and its localization varies during mitosis. In addition, we have shown that ARHGAP19 plays a central role in regulating cell shapes changes, sister chromatids segregation and RhoA effectors membrane recruitment during mitosis. We have also shown that this occurs by a previously undescribed pathway involving RhoA-ROCK-Vimentin.Finally, we have demonstrated that ARHGAP19 is a substrate of CDK1. It is phosphorylated on two residues located in the C-Terminal region of the protein. For investigating the role of these phosphorylations, we have generated Kit225 cell lines transfected with plasmids coding for the non-phosphorylable forms of the protein. This allowed us to show that phosphorylation of residue T404 and T476 are involved preventing GAP19 recruitment at the equatorial cell cortex during mitosis.In addition, we have observed the formation of chromatin bridges, as well as an increase in multinucleated cells. Thus, we have performed cytogenetic experiments for determining if chromatin bridges are due to chromosome condensation defects, or replicative stress. Finally, a possible tertiary structure of ARHGAP19 has been created de novo, and molecular dynamics simulations were generated in order to understand the role of these phosphorylations by CDK1 at a structural level.

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Cellular Inhibitor of Apoptosis Protein 1 (cIAP1) de la famille des IAP (Inhibitor of ApoptosisProtein) est un oncogène à activité E3-ubiquitine ligase. Notre équipe s’intéresse aux processus de différenciation des cellules hématopoïétique. cIAP1 est localisée dans le noyau des précurseurs hématopoïétiques exprimant le marqueur CD34. Lors de leur différenciationnotamment en macrophages ou en cellules dendritiques, cIAP1 est exclue du noyau. L’objectif de ma thèse a été de caractériser de nouvelles fonctions nucléaires et cytoplasmiques de cIAP1. Mes résultats ont contribués à mettre en évidence une fonction nucléaire de cIAP1 dans la régulation du cycle cellulaire via le contrôle du facteur de transcription E2F1. Dans le cytoplasme, cIAP1 est un régulateur de l’activation de la signalisation NF-kB et TNF-α. cIAP1 est un déterminant de la réponse des cellules au TNF-a, favorisant l’activation de NF-kB aux dépens de la mort cellulaire. Le TNF-α est aussi capable de moduler le cytosquelette d’actine et les propriétés morphologiques et migratoires des cellules. Dans les fibroblastes, il induit la formation de fines protrusions membranaires riches en actine appelées filipodes. Mes travaux ont montrés que cIAP1, associée à son partenaire historique TRAF2, régule la formation de ces filipodes. Elle est capable d’interagirdirectement avec la RhoGTPase Cdc42 et de contrôler son activation après un traitement par le TNF- α, mais aussi EGF. De plus, cIAP1 régule aussi la polarisation de l’appareil de Golgi, une fonction spécifiquement attribuée à Cdc42. Cette nouvelle fonction de cIAP1 dans le contrôle de Cdc42 pourrait contribuer aux propriétés oncogéniques de cIAP1 / Cellular Inhibitor of Apoptosis Protein 1 (cIAP1), a IAP family member (Inhibitor of ApoptosisProtein) is an E3 ubiquitin ligase which displays oncogenic properties. The research project of our team is focused on hematopoietic differentiation. cIAP1 is localized in the nucleus of hematopoietic precursors CD34+, and is excluded to the cytoplasm along macrophage and dendritic cell differentiation. The aim of my thesis was to characterize new nuclear and cytoplasmic fonctions of cIAP1. I have contributed to identify a nuclear function of cIAP1 in the regulation of cell cycle through a control of E2F1 transcription factor. In the cytoplasm, cIAP1 is a well-known modulator of NF-kB and TNF-α signaling pathway. It can determine the response of cells to TNF-α, through stimuling the canonical activation of NF-kB and inhibiting cell death. TNF-α can also promote cytoskeleton remodeling which determine morphogenetic properties including morphology or motility. My results suggest a role for cIAP1, when associated its partner TRAF2, in the control of actin rich protrusions called filipodia upon TNF-α stimulation. cIAP1 can interact and control Cdc42 activation, a member of Rho GTPases protein family. cIAP1/TRAF2 appears to control other process controlled by Cdc42 including, filipodia formation in response to EGF, or Golgi polarization. This function of cIAP1 in the control of Cdc42 could contribute to cIAP1 oncogenic properties