O segundo mensageiro cGMP está envolvido em diversas funções celulares incluindo a visão em mamíferos. Embora trabalhos anteriores mostrassem variações nos níveis de cGMP durante o ciclo de vida de Blastocladiela emersonii e evidências da existência de enzimas específicas envolvidas na sua síntese (guanilato ciclase) e degradação (cGMP fosfodiesterase), nenhum genoma de fungo publicado até o momento mostrou a existência de genes codificando estas enzimas. Este fato é atribuído por evolucionistas à completa perda de motilidade dos fungos em geral, já que cGMP está primordialmente associado a células com cílios. Blastocladiomicetos, como Blastocladiella, apresentam células móveis em pelo menos um estágio do seu ciclo de vida, o que poderia explicar a existência dessa via nesses fungos. Uma investigação no banco de ESTs de B. emersonii revelou a existência de cDNAs codificando parte de prováveis guanilato ciclases (BeGC1, BeGC2 e BeGC3) e uma possível cGMP fosfodiesterase (BePDE). Assim, este trabalho buscou confirmar a existência destas enzimas e caracterizar a sinalização por cGMP em B. emersonii. A proteína recombinante selvagem correspondente ao domínio catalítico de BePDE mostrou atividade de degradação sobre cGMP e a mutação E389A foi capaz de alterar a especificidade por cGMP. Com o sequênciamento do genoma de B. emersonii obteve-se as sequências completas das guanilato ciclases. Em BeGC2 não foi possível identificar o ligante responsável por sua ativação. Em BeGC3, a presença de um domínio Heme-Pas sugeriu sua ativação por óxido nítrico. A presença de um domínio rodopsina em BeGC1 sugeriu sua ativação por luz. Experimentos de microscopia por imunofluorescência localizaram BeGC1 no \"eyespot\", BeGC2 no capacete nuclear e BeGC3 no citoplasma de zoósporos de B. emersonii. Verificamos também que zoósporos realizam fototaxia em direção à luz verde e que a adição de hidroxilamina, inibidor de rodopsina, ou do inibidor de guanilato ciclase LY83583 tem efeito negativo na fototaxia, bem como impede o aumento dos níveis de cGMP observado em zoósporos expostos à luz verde. O bloqueio da síntese de retinal por Norflurazon também inibiu a fototaxia sendo esta restaurada quando adicionamos retinalA1. Estes dados, juntamente com o fato de o domínio rodopsina de BeGC1 ser a única rodopsina presente no genoma, indicam que BeGC1 é responsável pela fototaxia nos zoósporos de B. emersonii. O genoma do fungo apresenta ainda um possível canal de potássio ativado por cGMP (BeCNG1) localizado na membrana plasmática de zoósporos, similar ao canal regulado por cGMP envolvido na visão em humanos. Ensaios de microfluorimetria também evidenciaram a presença de um canal ativado por cGMP relacionado com o influxo de potássio e a motilidade dos zoósporos. Um modelo para a via de sinalização da fototaxia em B.emersonii foi proposto e comparado com a sinalização presente na visão de mamíferos, destacando a existência de cGMP e rodopsina em ambos os processos e sugerindo uma possível origem comum. Portanto, os resultados obtidos suportam a existência da sinalização por cGMP em B. emersonii, além de indicar o papel dessa sinalização na fototaxia dos zoósporos, sendo esta a primeira via de sinalização por cGMP caracterizada em fungos. / The second messenger cyclic GMP is involved in a wide array of cellular processes including vision in mammals. Although previous studies demonstrated changes in cGMP levels during the life cycle of Blastocladiela emersonii and evidences of specific enzymes involved in its synthesis (guanylyl cyclase) and hydrolysis (cGMP-phosphodiesterase), no fungal genome published so far shows the presence of genes encoding these enzymes. Evolutionists attribute the absence of cGMP signaling pathways in higher fungi to the sedentary life style of these organisms, since cGMP is primarily associated with ciliated cells. However, blastocladiomycetes like Blastocladiella, have motile cells in at least one stage of their life cycle, which could explain the existence of this pathway in these primitive fungi. Inspection of B. emersonii EST data bank, revealed cDNAs encoding part of three putative guanylyl cyclases (BeGC1, BeGC2 e BeGC3) and one possible cGMP phosphodiesterase (BePDE). Thus, the purpose of this study was to confirm the existence of these enzymes and characterize the cGMP signaling pathway in this model. The recombinant protein containing the wild type catalytic domain of BePDE presented activity towards hydrolysis of cGMP and the E389A mutation of this domain changed the cGMP specificity of this enzyme. The complete nucleotide sequence of the guanylyl cyclases were obtained by sequencing of B. emersonii genome. In BeGC2 we were unable identify the ligand responsible for its activation, but in BeGC3, the presence of a Heme-Pas domain suggested its activation by nitric oxide. The presence of a rhodopsin domain in BeGC1 suggested its activation by light. Immunofluorescence microscopy localized BeGC1 in the \"eyespot\" structure, BeGC2 in the nuclear cap and BeGC3 in the cytoplasm of zoospores of B. emersonii. We found that Blastocladiella zoospores performed phototaxis toward green light and photobleaching of rhodopsin function using hydroxylamine prevented both phototaxis and the increased cGMP levels observed when zoospores were exposed to green light. The same effect was observed using the guanylyl cyclase inhibitor LY83583. Inhibition of retinal synthesis using Norflurazon prevented the phototaxis response, which could be restored by zoospore complementation with retinalA1. The BeGC1 gene is the only rhodopsin found in the draft assembly of B. emersonii genome, which indicates that BeGC1 is responsible for phototaxis observed in zoospores. We also found in the genome a possible cGMP-activated potassium channel (BeCNG1), localized in the plasma membrane of the zoospores, which is similar to the cGMP-activated channel involved in human vision. In addition, microfluorimetry assays revealed the presence of a cGMP-activated potassium channel involved in potassium influx and zoospore motility. The signaling model of B. emersonii phototaxis was proposed and compared with the mammalian vision system, with cGMP and rhodopsin acting in both signaling pathways, suggesting a common origin. Altogether our data indicate that Blastocladiella emersonii has a cGMP signaling system involved in phototaxis, being the first cGMP signaling pathway characterized in fungi.

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Rhodopsin ist der Photorezeptor der Stäbchenzellen in der Retina von Vertebraten und wird als Prototyp für die gesamte Gruppe der GPCRs beforscht. Trifft ein Photon auf das Protein, so wird der über eine Schiffbase kovalent gebundene Chromophor von seiner 11-cis- in die All-trans-Konfiguration isomerisiert und setzt infolgedessen den Aktivierungsprozess in Gang. Dieser mündet in der aktiven Rezeptorkonformation, die das G-Protein Transducin aktivieren kann und dadurch eine Kaskade weiterer Aktivierungsschritten einleitet, die letztlich ein Nervensignal verursachen. Das Ziel dieser Arbeit war die Aufklärung der späten Aktivierungsschritte und ihrer Ursache-Wirkungs-Beziehungen. Zu diesem Zweck wurden Blitzlichtphotolyse, Elektronenspinresonanz (EPR) mit Spinlabeling (SDSL), UV/vis-Spektroskopie, FTIR-Spektroskopie und Fluoreszenzspektroskopie angewandt. Kinetische Messungen wurden unter identischen Bedingungen durchgeführt, um die Abfolge der mit den unterschiedlichen Techniken zugänglichen Aktivierungsschritte aufzuklären. Nach der Bildung des absorptionsspektroskopisch definierten Meta-II-Zustands bewegt sich die Helix TM6 in einem späteren Schritt als ganzes nach außen und markiert damit den Übergang von Meta-IIa zu Meta-IIb. Dadurch wird die bis dahin in der Membran verborgene D(E)RY-Region für das Umgebungsmedium zugänglich und nimmt ohne Zeitverzögerung ein Proton auf, wodurch der Meta-IIb*H+-Zustand gebildet wird. Die verfügbaren Daten sprechen dafür, dass das D(E)RY-Motiv bei der Aktivierung des Transducins sowohl die Alpha- als auch die Gamma-Untereinheit desselben bindet. Die Bindung von zu Transducin-Abschnitten analogen Peptiden kann dann erfolgen, wenn die Helix TM6 im nach außen bewegten Zustand ist, und führt zur Abgabe von bis zu zwei Protonen vom aktivierten Rhodopsin. Sowohl das D(E)RY- und das NPxxY(x)5,6F-Motiv als auch die beiden Zustände Meta-IIb und Meta-IIb*H+ könnten relevant für den sequenziellen Transducin-Aktivierungsmechanismus sein. / Rhodopsin is the photoreceptor in the rod cells of the vertebrate retina. It is considered as a prototype of the whole group of GPCRs. Upon absorption of a photon the chromophore, which is covalently bound through a Schiff base, is isomerized from its 11-cis into the all-trans configuration. This initiates the activation process and finally results in the active receptor conformation which is capable of activating the G protein transducin and thereby triggers a cascade of further activation steps which finally cause a nerve signal. The aim of this work was the clarification of the late activation steps and their cause-and-effect chain. For this purpose flash photolysis, electron paramagnetic resonance (EPR) with spin labeling (SDSL), UV/vis spectroscopy, FTIR spectroscopy and fluorescence spectroscopy were applied. Kinetic measurements were executed under identical conditions in order to elucidate the sequence of activation steps, which are accessible with the different techniques. After formation of the spectroscopically defined Meta-II state helix TM6 moves outward as a rigid body, thereby marking the transition from Meta-IIa to Meta-IIb. Therefore the D(E)RY region, which is until then buried in the membrane, gets accessible to the surrounding solution. It consequently takes up a proton without delay, thus forming the Meta-IIb*H+ state. Available data argue for the D(E)RY motif binding both the Alpha and the Gamma subunit of transducin during activation of the latter. The binding of peptides which are analogous to sections of transducin is possible when helix TM6 is in the outward position. It causes the release of up to two protons from the activated rhodopsin. Both the D(E)RY motif and the NPxxY(x)5,6F motif as well as both the states Meta-IIb and Meta-IIb*H+ are potentially relevant for the sequential transducin activation mechanism.

Die Aufgabe des Proteins Arrestin ist die Beendigung der Signalweitergabe über den GPCR Signalweg. In Stäbchenzellen bindet Arrestin an Licht-aktiviertes phosphoriliertes Rhodopsin um die Signalweitergabe zu unterdrücken. Die Bindung von Arrestin an Rhodopsin erfolgt in zwei Schritten. Zunächst wechselwirkt Arrestin mit dem phosphorilierten C-Terminus von Rhodopsin und bildet einen prä-Komplex, dies induziert Konformationsänderungen im Arrestin wodurch die Bildung eines High-affinity Komplex unter Kopplung an den helikalen Kern des aktivierten Rezeptors erfolgen kann. Biochemische Untersuchungen und Kristallstrukturen haben einen Einblick in die Konformation des Komplexes aus Arrestin und Rhodopsin ermöglicht. In dieser Arbeit werden site-directed Fluorezenz Experimente angewandt um die strukturellen Änderungen zu untersuchen, die bei der Bindung von Arrestin an Rhodopsin ablaufen und der nterschiedlichen Bindungsmodi innerhalb der Wechselwirkung zwischen Arrestin und Rhodopsin. Insbesondere wird hier eine, bisher nicht beschriebene, Assoziation von Arrestin an die Membran untersucht. Des Weiteren wurden Erkenntnisse über die Struktur des prä-Komplexes gewonnen. Die Konformation vom Arrestin im prä-Komplex scheint die Konformation im Basalzustand nachzubilden unter Beteiligung zweier Kontaktstellen: Interaktion mit dem phosphorilierten C-Terminus des Rezeptors und Assoziation mit der Membran. Beim Übergang in den High-affinity Komplex durchläuft Arrestin eine Konformationsänderung in eine aktivere Konformation: der C-Terminus wird verdrängt, es erfolgt eine Neuausrichtung der zentralen flexiblen Schleifen und die Orientierung des Membranankers ändert sich. Die Aufgabe des prä-Komplexes ist somit Arrestin und den Rezeptor zusammen zu bringen sowie die korrekte Orientierung sicherzustellen um einen schnellen Übergang in den High-affinity Komplex zu ermöglichen. / The protein arrestin is responsible for termination of GPCR signalling. In the rod cell, arrestin binds light-activated phosphorylated rhodopsin in order to block further signal transduction. The binding of arrestin to rhodopsin is a two-step process. Arrestin first interacts with the phosphorylated receptor C-terminus in a pre-complex, which induces conformational changes in arrestin that allow coupling to the helical core of the active receptor in a high-affinity complex. Biochemical studies and crystal structures have provided insights into the conformation of the arrestin-rhodopsin complex. This dissertation describes site-directed fluorescence experiments, which were carried out to further investigate the conformational changes occurring upon arrestin binding to rhodopsin and the nature of different binding modes of the arrestin-rhodopsin interaction. In particular this involved characterization of a previously unidentified association of arrestin with the membrane, as well as further elucidation of the structure of the pre-complex. The conformation of arrestin in the pre-complex is indicated to resemble that of the basal state of arrestin, and involves two sites of contact: interaction with the phosphorylated receptor C-terminus, and association with the membrane. Upon transition to the high-affinity complex, arrestin undergoes a conformational change to a more active conformation: the auto-inhibitory C-tail is displaced, there is movement within the central flexible loops, and the orientation of the membrane anchor changes. The pre-complex therefore most likely functions to bring arrestin and the receptor into close contact, and in the correct orientation, to allow for fast transition to the high-affinity complex.

Das aus dem Apoprotein Opsin und dem kovalent gebundenen Liganden bestehende Rhodopsin dient als Modellsystem für den Aktivierungsmechanismus der größten Klasse von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR). Infolge einer photochemischen Reaktion vollführt Rhodopsin eine Bewegungsabfolge von Sekundärstrukturelementen, wodurch es aktiviert wird, das G-Protein bindet und den Stimulus auf zellinterne Signalwege überträgt. Mithilfe der ortsspezifischen Mutagenese wurden Mutanten des bovinen Rhodopsins erzeugt, in eine künstliche Lipidumgebung eingelagert und hauptsächlich mittels FTIR-Spektroskopie untersucht. Anhand der Y191F- und Y192F-Mutanten konnte die Translokation des transienten Gegenions der Schiffschen Base Glu181 während der Aktivierung bestimmt werden. Die Interaktionen des Tyr206 sind für die gekoppelte Bewegung von EL2 und TM5 mitbestimmend, was mittels Y206F-Mutante gezeigt wurde. Eine Anhäufung von Methioninen auf der cytoplasmatischen Seite des Rezeptors ist u.a. für das Ausklappen der TM6 zuständig. Diese Bewegung ist wichtige Determinante der Rezeptoraktivierung. Hierfür wurden insgesamt fünf Mutanten verwendet. Im zweiten, hauptsächlichen Teil der Arbeit wird das bislang kaum untersuchte humane Rhodopsin mit dem bovinen Rezeptor verglichen. Ausgehend von verschiedenen Dunkelzuständen, konnte gezeigt werden, dass die Aktivierungsmechanismen beider Rezeptoren voneinander divergieren, um letztlich bei der Bildung der aktiven Spezies wieder zu konvergieren. Über die Analyse der Aminosäuresequenzen der Mammalia-Rhodopsine wurden zwei Bereiche hoher Variabilität identifiziert, die u.a. die molekulare Ursache für diese Diskrepanzen liefern. Diese Feststellung wurde mit human-bovinen-Rhodopsinchimären bewiesen. Ergänzend zu dieser Studie wurde Schafsrhodopsin einem Vergleich sowohl mit bovinem als auch mit humanem Rezeptor unterzogen. Es zeigte, als eine weitere natürlich vorkommende Variante des Lichtrezeptors, einen eigenständigen Weg der Aktivierung. / Rhodopsin, which consists of the apoprotein opsin and its covalently bound ligand, is used as a model system to understand the activation mechanism of the large family of G protein coupled receptors (GPCRs). As a result of a photochemical reaction, rhodopsin undergoes activating structural changes, enabling it to bind the G protein and transmitting the stimulus to intracellular signaling pathways. In the first part of this work, site-directed mutants of bovine rhodopsin were produced, incorporated into an artificial lipid environment, and studied mainly by FTIR spectroscopy. The translocation of the transient Schiff base counterion (Glu181) during the activation process was determined using the Y191F- and Y192F-mutants. The interactions of Tyr206 contributed to the coupled movement of EL2 and TM5, which was shown by Y206F-mutant. A striking accumulation of methionines on the cytoplasmic side of the receptor was observed to be a key-player for the activating outward motion of TM6. In the second and primary part of this work, human rhodopsin, which has been rarely studied, was compared with the bovine receptor. Starting from various dark states, it was shown that the activation mechanisms of both receptors diverge from each other and yet ultimately converge in the formation of the active species. By analyzing the amino acid sequences of mammalian rhodopsins, two regions of high variability were identified, which provide the molecular basis for these discrepancies. This finding was verified by the investigation of human/bovine rhodopsin chimeras. In addition to this study, ovine rhodopsin was compared with both the bovine and human forms. It showed, as another naturally occurring variant of the light receptor, an independent pathway of activation.

Das Außensegment der Stäbchenzelle ist aus einem Stapel von flachen Membransäckchen, den Diskmembranen, aufgebaut. Entlang dessen existiert ein Cholesterolgradient mit 24 mol% Cholesterol in den basalen Diskmembranen und 5 mol% in den apikalen. Das Außensegment enthält alle Proteine der Signaltransduktion. Der Photorezeptor Rhodopsin ist als integrales Membranprotein in die Diskmembran eingebettet. Das G-Protein Transducin und das Effektorprotein, die Phosphodiesterase (PDE), sind periphere Proteine mit Lipidankern und somit reversibel mit der Membranoberfläche assoziiert. Um den Einfluss des Cholesterolgehaltes der Diskmembranen auf diese drei Proteine zu untersuchen, wurden Diskmembranen mit unterschiedlichem Cholesterolgehalt präpariert (Simulation des Cholesterolgradienten). Die Untersuchungen zur transversalen Verteilung des Cholesterols in der Diskmembran ergaben eine schnelle Transmembranbewegung mit einer Halbwertzeit von weniger als einer Minute bei 35 °C. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass es zu kopfgruppenspezifischen Wechselwirkungen von Cholesterol mit dem Phospholipid Phosphatidylcholin kommt. Cholesterol verschiebt das Meta I-Meta II-Gleichgewicht (nach Lichtaktivierung von Rhodopsin) auf die Seite von Meta I (inaktiv). In dieser Arbeit konnte jedoch gezeigt werden, dass durch die Anwesenheit des Transducins das Gleichgewicht vollständig auf die Seite von Meta II (aktiv) verschoben wird, da Transducin spezifisch die Meta-II-Form stabilisiert. Somit kann die verminderte Meta II-Bildung des Rezeptors in Diskmembranen mit hohem Cholesterolgehalt durch Transducin ausgeglichen werden. Lediglich die Geschwindigkeit der Transducinaktivierung ist verlangsamt. Durch den erhöhten Cholesterolgehalt werden die Membraneigenschaften für eine Bindung der beiden peripheren Proteine Transducin und PDE über deren Lipidanker optimiert. Somit kann die Signaltransduktion auch in den basalen Diskmembranen des Stäbchenaußensegmentes stattfinden. / The rod outer segment consists of a stack of flat membrane saccules called disc membranes. Along this stack a cholesterol gradient exists with 24 mol% cholesterol in the basal and only 5 mol% in the apical disc membranes. The outer segment contains all the proteins necessary for signal transduction. The photoreceptor rhodopsin as integral membrane protein is embedded in the disc membrane. The G protein transducin and the effector protein phosphodiesterase (PDE) are soluble proteins with lipid modifications, which are associated reversibly to the membrane surface. Disc membranes with different cholesterol contents were prepared to simulate the cholesterol gradient along the rod outer segment and to investigate the influence of disc membrane cholesterol content of these three proteins. Investigations of the transversal distribution of cholesterol in the disc membrane revealed a fast transmembrane movement with a half life of less than one minute at 35 °C. Further, head group specific interactions between cholesterol and phosphatidylcholine could be shown. The Meta I Meta II equilibrium after light activation of rhodopsin was shifted to the Meta I (inactive) site in membranes with high cholesterol. In this work it was shown that in the presence of transducin this equilibrium is shifted completely to the Meta II (active) site because transducin stabilizes specifically the Meta II form of the receptor. Hence the reduced Meta II formation in disc membranes with high cholesterol could be compensated by transducin. The speed of transducin activation is decelerated. By the increased cholesterol content membrane properties are optimized to the binding of transducin and PDE via their lipid modifications. Thus the signal transduction can take place also in disc membranes with high cholesterol.