No description available.

Les protéines de liaison à l'ARN (PLA) s'assemblent en complexes cytoplasmiques avec les ARNm pour contrôler la traduction locale des ARNm et le transport axonal. Ces processus sont essentiels au maintien de la survie des neurones et leur déficience est impliquée dans le développement de nombreuses maladies neurodégénératives, telles que la SLA. Il a été montré ultérieurement que la déplétion nucléaire de TDP-43, liée à la SLA, entraîne l'accumulation d'une variante épissée alternativement de la ribonucléoprotéine nucléaire hétérogène A1 (hnRNP A1). Cette isoforme, appelée hnRNP A1B, possède une région désordonnée (RID) et, dans le contexte neuronal, localise dans les neurites et dans le noyau, alors que la hnRNP A1 localise majoritairement dans le noyau. Ceci appui l'hypothèse que la hnRNP A1B peut avoir une fonction cytosolique dans les neurones qui n'est pas partagée avec la hnRNP A1. En outre, les hnRNP A1 et hnRNP A1B sont mutées dans de rares cas de SLA familiale, dont certaines mutations sont spécifiques à la hnRNP A1B. Jusqu'à présent, la littérature se concentre sur l'isoforme hnRNPA1 tandis que peu est répertorié sur la fonction de la hnRNP A1B. Ainsi, cette étude vise à déterminer et caractériser la fonction cytosolique de la hnRNP A1B dans les neurones. Puisque très peu est répertorié sur la hnRNP A1B, il a fallu tout d’abord déterminer des partenaires d’interaction. Ainsi, une immunoprécipitation utilisant un anticorps spécifique à la hnRNP A1B suivi d'une spectrométrie de masse (IP-MS) a été réalisée sur la moelle épinière de souris. Les résultats soulèvent que de nombreux interacteurs de la hnRNP A1B sont associés au trafic intracellulaire dépendant du cytosquelette. Les interactions avec KLC1/KIF5C/Myh9/DyncIHI ont été validées par des tests d'immunoprécipitation et de colocalisation. Aussi, l’impact de certains mutants hnRNP A1B associés à la SLA ont été étudiées au niveau des interactions avec les protéines motrices. Des expériences visant à évaluer comment la hnRNP A1B peut être transportée, ainsi que réguler le transport, sont en cours. Les résultats confirment que la hnRNP A1B peut avoir une fonction cytosolique dans les neurones pour le transport axonal/dendritique de l'ARNm. Des études futures exploreront cette nouvelle fonction dans le contexte de la SLA. / RNA-binding proteins (RBPs) assemble into cytoplasmic complexes with mRNAs to control mRNA local translation and axonal transport. These processes are essential for maintaining neuronal survival and their impairment is implicated in the development of many neurodegenerative diseases, such as ALS. We have discovered that TDP-43 depletion, linked to ALS, drives the accumulation of an alternatively spliced variant of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1 (hnRNP A1). This isoform, termed hnRNP A1B, has an elongated prion-like domain (PrLD) and is present in neuronal processes, while hnRNP A1 is not. This finding supports a hypothesis that hnRNP A1B may have a cytosolic function in neurons that is not shared with hnRNP A1. In addition, hnRNP A1 and hnRNP A1B are mutated in rare cases of familial ALS with some mutations specific to hnRNP A1B. To date, the literature has mostly focused on the hnRNPA1 isoform and little is known about hnRNP A1B function. Thus, this study aims to identify and characterize the cytosolic function of hnRNP A1B in neurons. Since very little is known about hnRNP A1B, it was first necessary to identify interaction partners of the protein. Thus, immunoprecipitation using an antibody specific to hnRNP A1B followed by mass spectrometry (IP-MS) was performed on mouse spinal cord. Our results show that many hnRNP A1B interactors are associated with cytoskeletal-dependent intracellular trafficking. We then proceed to validate the interactions with the motor proteins KLC1/KIF5C/Myh9, by immunoprecipitation and proximity ligation assays. In addition, some hnRNP A1B ALS mutants were studied in the context of these interactions. Experiments to evaluate how hnRNP A1B may be transported, as well as regulate transport are currently underway. Our findings support that hnRNP A1B may have a cytosolic function in neurons in mRNA axonal/dendritic transport. Future studies will explore this novel function in the ALS context.

L’élément L1 (Long Interspersed Nuclear Element 1 ou L1) est le seul rétrotransposon autonome et actif connu dans notre génome, représentant 17% de celui-ci. Capable de se répliquer grâce à un intermédiaire à ARN et un mécanisme de transcription inverse initiée au site d’intégration, il encode deux protéines ORF1p et ORF2p, qui s’associent à l’ARN L1 pour former une particule ribonucléoprotéique (RNP). L’élément L1 rétrotranspose préférentiellement en cis : un L1 défectif est complémenté en trans par un élément fonctionnel de façon inefficace. Ce travail s'intéresse à deux étapes clefs du cycle réplicatif du L1 : l'assemblage de la RNP L1 en cis ou en trans afin d’explorer le mécanisme de la cis-préférence et la spécificité de l’initiation de la reverse transcription initiée. Nous avons d’abord comparé deux méthodes d’analyse de l’activité RT. Puis, nous avons montré l’importance de la complémentarité entre queue poly(A) de l’ARN L1 et site d’intégration durant l’initiation de la RT, ainsi que l’impact de mésappariements terminaux éventuels. Enfin, nous avons étudié les bases biochimiques de la cis-préférence, à travers la coexpression et la purification de deux éléments distincts étiquetés, ce qui nous a permis de suivre l'assemblage et l'activité de leurs RNPs respectives. Nos données suggèrent que ORF1p et ORF2p peuvent lier en trans l’ARN L1 de façon efficace et que la cis-préférence pourrait nécessiter des quantités limitantes de L1. / The Long Interspersed Nuclear Element 1 (LINE-1 ou L1) is the only known active and autonomous retrotransposon in the human genome and constitutes around 17% of our genomic DNA. The L1 element is able to replicate through an RNA intermediate by a mechanism called target-primed reverse transcription and encodes two proteins ORF1p and ORF2p, which associate with the L1 RNA to form a ribonucleoprotein particle (RNP). L1 preferentially retrotranspose in cis: a defective L1 can only be rescued in trans at low levels by a replication-competent copy. During this work, we focused on two essential steps of the L1 replication cycle: the assembly of the L1 RNP in cis or in trans to explore the mechanism of the cis-preference and the specificity of L1 reverse transcription priming. First, we compared two different methods to detect L1 RT activity. Then, we showed the importance of base-pairing between the poly(A) tail of the L1 RNA and the integration site to prime reverse transcription and the impact of potential mismatches. Finally, we investigated the biochemical basis of the cis-preference through the coexpression and purification of two different tagged L1 elements, which allowed us to follow the assembly and activity of their RNP. Our data suggest that binding of ORF1p and ORF2p in trans is efficient and that the cis-preference might requires limiting L1 levels.

Une étape importante du cycle viral du virus de l'immunodéficience humaine (VIH) est l'export nucléaire de transcrits viraux incomplètement épissés, incluant le génome viral ARN. Ce processus fait intervenir la protéine virale de liaison à l'ARN Rev. Dans le noyau, Rev interagit avec les transcrits viraux non épissés et partiellement épissés en s'oligomérisant sur une séquence intronique de 350 nucléotides, appelée Element de Response à Rev (RRE). Rev recrute également le facteur d'export cellulaire CRM1 et la petite GTPase Ran pour former le complexe d'export RRE/Rev/CRM1/Ran. Connaître l'architecture 3D de ce complexe ribonucléoprotéique fournirait des informations utiles pour une meilleure compréhension de l'export des ARN du VIH incomplètement épissés. Cependant, les détails moléculaires de ce complexe sont mal connus ; en particulier, la stœchiométrie des molécules Rev et CRM1 liées au RRE est en discussion.Mon doctorat vise à étudier l'architecture du complexe RRE/Rev/CRM1/Ran. Dans le cadre de ce travail, j'ai utilisé des essais biochimiques et cellulaires pour caractériser les interactions entre CRM1 et Rev et entre Rev et RRE. La majorité de mes efforts ont porté sur l'étude de ces interactions par spectrométrie de masse (MS) en condition native, une méthode puissante pour déterminer la stœchiométrie de complexes macromoléculaires. J'ai mis en place des protocoles pour la préparation à grande échelle d'un fragment du RRE de 66 nucléotides (IIABC), portant un site de liaison Rev de haute affinité, protocoles que j'ai ensuite adaptés à l'analyse de IIABC par MS en condition native. Comme Rev a tendance à s'agréger et à précipiter en solution, j'ai également conçu une forme mutante de Rev (Rev*) permettant de contourner ces problèmes. L'analyse des complexes IIABC/Rev* par électrophorèse sur gel natif confirme l'oligomérisation de Rev* sur l'ARN. Après d'intenses optimisations, j'ai obtenu des spectres MS en condition native de haute qualité, révélant que IIABC lie jusqu'à 6 monomères Rev*. De plus, j'ai reconstitué un complexe à 4 partenaires IIABC/Rev*/CRM1/Ran et j'ai réussi à déterminer sa masse et sa stœchiométrie par MS en condition native, une tâche techniquement difficile. Des efforts supplémentaires pour analyser le RRE seul et en complexe avec Rev de type sauvage ont également généré des spectres informatifs, alors que l'analyse du complexe intact RRE/Rev/CRM1/Ran a été plus compliquée. Ces résultats illustrent les forces et les limites de la spectrométrie de masse en condition native et son potentiel pour son développement futur en tant qu'outil d'analyse des complexes de ribonucléoprotéines. / An important step in the life cycle of human immunodeficiency virus (HIV) is the nuclear export of incompletely spliced viral transcripts, including the replicated viral RNA genome. This process is mediated by the viral RNA-binding protein Rev. In the nucleus, Rev recognizes unspliced and partially spliced viral transcripts by multimerizing on a 350-nucleotide intron sequence, the Rev-response element (RRE). Rev then recruits the host cell export factor CRM1 and the small GTPase Ran to form the RRE/Rev/CRM1/Ran export complex. Knowledge of the 3D architecture of this ribonucleoprotein complex would provide important insights into how unspliced viral RNA export is achieved. However, the molecular details of this complex are poorly understood. In particular, the stoichiometry of Rev and CRM1 molecules bound to the RRE is under debate.My Ph.D. project aims to investigate the architecture of the RRE/Rev/CRM1/Ran complex. As part of this work, I used biochemical and cell-based assays to characterize the interactions between CRM1 and Rev and between Rev and the RRE. The majority of my efforts focused on investigating these interactions by native mass spectrometry (MS), a powerful method for determining the stoichiometry of macromolecular complexes. I set up protocols for the large-scale preparation of a 66-nucleotide RRE fragment (IIABC) bearing a high-affinity Rev binding site, and adapted these for compatibility with native MS analysis. Because Rev tends to aggregate and precipitate in solution, I engineered a mutant form of Rev (Rev*) to overcome this problem. Analysis of IIABC/Rev* complexes by native gel electrophoresis confirms multimerization of Rev on the RNA. After extensive optimization, I obtained high-quality native MS spectra of these complexes, revealing that IIABC binds up to 6 Rev* monomers. Furthermore, I reconstituted a 4-species complex, IIABC/Rev*/CRM1/Ran, and succeeded in determining its mass and stoichiometry by native MS – a technically challenging task. Additional efforts at analyzing the intact RRE and complexes with wild-type Rev have also yielded informative spectra, while analysis of the intact RRE/Rev/CRM1/Ran holo-complex has had more limited success. These results illustrate the strengths and limitations of native mass spectrometry and its potential for future development as a tool for analyzing ribonucleoprotein complexes.

Résumé La Ribonucléase P (RNase P) est une enzyme principalement reconnue pour sa participation à la maturation en 5’des ARN de transfert (ARNt). Cependant, d’autres substrats sont reconnus par l’enzyme. En général, la RNase P est composée d’une sous-unité ARN (le P-ARN, codé par le gène rnpB) qui porte le centre actif de l’enzyme et d’une ou de plusieurs sous-unités protéiques (la P-protéine). Les P-ARN chez toutes les bactéries, la majorité des archéobactéries et dans le génome nucléaire de la plupart des eucaryotes, possèdent généralement une structure secondaire très conservée qui inclut le noyau (P1-P4); l’hélice P4 constitue le site catalytique de l’enzyme et l’hélice P1 apparie les extrémités du P-ARN en stabilisant sa structure globale. Les P-ARN mitochondriaux sont souvent moins conservés et difficiles à découvrir. Dans certains cas, les seules régions de structure primaire qui restent conservées sont celles qui définissent le P4 et le P1. Pour la détection des gènes rnpB, un outil de recherche bioinformatique, basé sur la séquence et le profil de structure secondaire, a été développé dans le laboratoire. Cet outil permet le dépistage de toutes les séquences eucaryotes (nucléaires et mitochondriales) du gène avec une très grande confiance (basée sur une valeur statistique, E-value). Chez les champignons, plusieurs ascomycètes encodent un gène rnpB dans leur génome mitochondrial y compris tous les membres du genre d’Aspergillus. Cependant, chez les espèces voisines, Neurospora crassa, Podospora anserina et Sordaria macrospora, une version mitochondriale de ce gène n’existe pas. Au lieu de cela, elles contiennent deux copies nucléaires du gène, légèrement différentes en taille et en contenu nucléotidique. Mon projet a été établi dans le but d’éclaircir l’évolution de la RNase P mitochondriale (mtRNase P) chez ces trois espèces voisines d’Aspergillus. En ce qui concerne les résultats, des modèles de structures secondaires pour les transcrits de ces gènes ont été construits en se basant sur la structure consensus universelle de la sous-unité ARN de la RNase P. Pour les trois espèces, par la comparaison de ces modèles, nous avons établi que les deux copies nucléaires du gène rnpB sont assez distinctes en séquence et en structure pour pouvoir y penser à une spécialisation de fonction de la RNase P. Chez N. crassa, les deux P-ARN sont modifiés probablement par une coiffe et les extrémités 5’, 3’ sont conformes à nos modèles, ayant un P1 allongé. Encore chez N. crassa, nous avons constaté que les deux copies sont transcrites au même niveau dans le cytoplasme et que la plus petite et la plus stable d’entre elles (Nc1) se retrouve dans l’extrait matriciel mitochondrial. Lors du suivi du P-ARN dans diverses sous-fractions provenant de la matrice mitochondriale soluble, Nc1 est associée avec l’activité de la RNase P. La caractérisation du complexe protéique, isolé à partir de la fraction active sur un gel non dénaturant, révèle qu’il contient au moins 87 protéines, 73 d’entre elles ayant déjà une localisation mitochondriale connue. Comme chez la levure, les protéines de ce complexe sont impliquées dans plusieurs fonctions cellulaires comme le processing de l’ADN/ARN, le métabolisme, dans la traduction et d’autres (par exemple : la protéolyse et le repliement des protéines, ainsi que la maintenance du génome mitochondrial). Pour trois protéines, leur fonction est non déterminée. / Abstract Ribonuclease P (RNase P) is an endonuclease that cleaves 5’- leader sequences from tRNA precursors and a few other small RNAs. In most cases, the enzyme is a ribonucleo-protein complex (ribozyme), containing an RNA subunit (P-RNA; encoded by the rnpB gene) that carries the active centre of the enzyme, plus one or more protein subunits. P-RNAs in Bacteria, Eukarya and Archaea have a highly conserved secondary structure including the core P1 and P4 helices. P4 forms the catalytic site of the ribozyme, and P1 pairs the RNA termini, stabilizing overall structure and protecting from nuclease degradation. For processing of mitochondrial (mt) tRNAs, certain eukaryotic species (e.g., Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus nidulans) have separate mtDNA-encoded P-RNAs (of bacterial origin). Mt P-RNAs are often less conserved, and difficult to discover. To identify rnpB genes, we have developed a search tool based on sequence plus secondary structure profiles. It predicts all known eukaryotic (nuclear and organellar) rnpB genes with high confidence (based on E-values). In fungi, many ascomycetes encode a mitochondrial rnpB gene, including all members of Aspergillus. Yet, the closely related Neurospora crassa, Podospora anserina and Sordaria macrospora lack an mtDNA-encoded gene version. Instead, they contain two nuclear gene copies with slightly different sequences. My project aims to elucidate the evolution of mitochondrial RNase P in these three closely related species. We have established secondary structure models based on comparisons with the universal minimum consensus secondary structure for all nuclear gene mtP-RNAs copies in all three species. By comparison of these secondary structure models, we have established that the two nuclear copies of rnpB gene are quite distinct in sequence and structure, suggesting a specialization of function. In N. crassa, both P-RNAs are modified most likely by capping, and 5’- 3’ termini perfectly conform to P-RNA structure models that have an elongated P1 helical pairing. Furthermore, we find that the two nuclear copies of rnpB gene are present at about the same level in the cytoplasm, and that the shorter form of P-RNA (Nc1) translocates into the (soluble) mitochondrial matrix. When tracing P-RNA in different mitochondrial sub-fractions of a native gel, the presence of Nc1 and mitochondrial RNase P activity are associated. A proteomics characterization of a P-RNA complex isolated by native gel electrophoresis reveals that it contains at least 87 proteins, 73 of which are of known mitochondrial localization. Like in yeast, the complex contains proteins potentially involved in other DNA/RNA processing activities, but also in translation, in metabolism, and in protein folding. Only three proteins are of unknown function.

Spinal Muscular Atrophy (SMA) is a neurodegenerative, inherited disease caused by an insufficient amount of functional Survival of Motor Neurone protein (SMN), though the exact mechanism underlying this is not fully understood. The primary function of SMN is assembling a ring of Sm proteins around small nuclear RNA (snRNA) in an early, cytoplasmic stage of small nuclear ribonucleoprotein (snRNP) biogenesis, a process essential in eukaryotes. SMN, together with several mRNA binding proteins, has been linked to neural transport of mRNA towards areas of growth in Motor neurons for local translation of transcripts. Previous research in our group has found that this may involve Coatomer protein-containing vesicles transported by Dynein and requiring the Sm family protein, SmB, for maintenance. Little is known, however, about what other proteins are also present and required for correct transport and localisation of these vesicles. To further investigate this, we have produced plasmids expressing each Sm protein tagged to fluorescent proteins to help track their behaviour, in some cases for the first time, and developed a detergent-free fractionation protocol to enrich for SMN containing vesicles, providing tools that can be used to further probe behaviour and interactions in the future. Using these approaches, SmN, a neural specific Sm protein, was identified to also be present in SMN-containing vesicles similarly to SmB. Analysis of the interactomes of different Sm proteins identified a novel interactor of SMN, Neurochondrin (NCDN), that appears to be required for the correct localisation of SMN in neural cells. NCDN was found to not associate with snRNPs, indicating an snRNP-independent interaction with SMN. NCDN and SMN both independently associated and co-enriched with Rab5, indicating a potential endocytic and cell polarity role for the interaction. This interaction has the potential to be key in SMA pathology and may have therapeutic potential.

PTB (HnRNP I) is a multifunctional RNA binding protein which participates in a variety of RNA metabolic processes put together called as post transcriptional gene regulation. It interacts with shuttling hnRNPs L, K and E2 of the spliceosomal machinery and also with other RNA binding proteins like PSF, Raver1 and Raver2, which assists PTB in splicing. Based on the complexity of these processes and multifunctional nature of PTB, we hypothesized that; it might interact with various additional proteins not identified till date. Keeping this objective in mind, we set out to screen the custom made 18 day old mouse testes cDNA library in pGAD10 vector available in the laboratory, to hunt for novel interacting partners of PTB using the Clontech’s Matchmaker Gal4 yeast two hybrid system III. PTB1, the prototype of PTB was chosen and the above mentioned cDNA library was screened for novel PTB interacting partners. Twenty five large scale library transformations (spanning 8*106 independent clones) were performed and 99 putatives were obtained. By re-transformation of these library plasmids with bait construct to check for the interaction phenotype and eliminating bait independent activation of reporter genes and elimination of known false positives, only 5 clones were consistent with the interaction phenotype. All these library plasmids were sequenced with vector specific primers, ORF was identified and BLAST analysis for the identification of insert was done. Two of these clones encoded the partial CDS of mouse Protein Inhibitor of Activated STAT3-PIAS3. One of these encoded the partial CDS of mouse TOLL Interacting Protein-TOLLIP. The other two encoded the partial CDS of mouse importin-α and mouse hnRNP K, both of which were already known interacting partners of PTB. GST pull down assay and mammalian matchmaker co-immunoprecipitation was used for confirming the in vitro one to one physical interaction between PTB and these newly identified protein partners. Indirect Immunofloresence was used for demonstrating the co-localization of PTB and PIAS3 in Gc1Spg mouse spermatogonial cell line. The fact that PIAS3 an E3 SUMO ligase was picked up as an interacting partner of PTB was interesting and we hypothesized that PTB might be a sumoylation substrate. Towards this, we first resorted to the prediction of sumoylation consensus motif by using SUMOPLOT. PTB indeed was found to have sumoylation consensus sites. Subsequently, in vivo sumoylation of PTB was demonstrated, where in over expression of donor protein [SUMO-1] and acceptor protein [PTB] in RAG-1 mouse kidney cell line had resulted in the identification of an approximately 67 kDa slow moving SUMO modified myc tagged PTB band apart from the bulk of unmodified 57 kDa myc-PTB. This confirmed the fact that PTB is SUMO modified only at a single consensus target site in vivo and attempts are made to map this site of modification. SUMOylation regulates diverse biological processes in vivo ranging from nucleo- cytoplasmic shuttling, alteration of protein-protein interaction, DNA protein interaction etc. PTB shuttles rapidly between the nucleus and cytoplasm in a transcription sensitive manner and the translocation of PTB to the cytoplasm, happens under the conditions of cell stress, viral infections, apoptosis and exposure of cells to genotoxic agents like doxorubicin. Phosphorylation of PTB at Ser-16 residue has been shown to modulate the nucleo-cytoplasmic shuttling of PTB, albeit shuttling can also occur irrespective of this modification. Interaction of PTB with an E3 SUMO ligase-PIAS3 and the fact that it is SUMOylated in vivo, we hypothesize that K-47 residue present in the NLS/NES might be the most probable site of this SUMO modification and SUMOylation of PTB by PIAS3 might regulate the nucleo-cytoplasmic shuttling of PTB.

Η ριβονουκλεάση Ρ (RNase P) είναι ένα ριβονουκλεοπρωτεϊνικό ένζυμο, απολύτως απαραίτητο για την βιωσιμότητα του κυττάρου, καθώς είναι υπεύθυνο για την ωρίμανση του 5΄ άκρου των προδρόμων μορίων tRNA. Δραστικότητα RNase P έχει απομονωθεί από όλους τους οργανισμούς που έχουν μελετηθεί μέχρι σήμερα και από τις τρεις φυλογενετικές περιοχές (Βακτήρια, Αρχαία και Ευκαρυώτες), όπως επίσης και από τα ημιαυτόνομα υποκυτταρικά οργανίδια, μιτοχόνδρια και χλωροπλάστες [Frank και Pace 1998, Xiao et al. 2002]. Το ένζυμο αυτό διαθέτει μια RNA υπομονάδα απαραίτητη για την κατάλυση ενώ ο αριθμός των πρωτεϊνών που συμμετέχουν στο ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο ποικίλλει από μια στα βακτήρια έως και δέκα στην RNase P του ανθρώπου [Frank και Pace 1998, Chamberlain et al. 1998, Jarrous 2002]. Η RNA υπομονάδα από τα Βακτήρια και ορισμένα Αρχαία παρουσιάζει καταλυτική δραστικότητα απουσία πρωτεϊνών in vitro, σε υψηλή ιοντική ισχύ [Guerrier-Takada et al. 1983, Pannucci et al. 1999]. Παρότι μέχρι στιγμής καμία τέτοια ιδιότητα δεν έχει εντοπιστεί σε ευκαρυωτική RNA υπομονάδα, πιστεύεται ότι στην πραγματικότητα πρόκειται για ένα ριβοένζυμο [Frank et al. 2000]. Η RNase P από το Dictyostelium discoideum είναι ένα ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο που αποτελείται από RNA και πρωτεϊνικές υπομονάδες οι οποίες είναι απαραίτητες για την δραστικότητα του ολοενζύμου. Η πυκνότητα επιπολής που υπολογίσθηκε για την RNase P από το D. discoideum είναι πολύ χαμηλή σε σχέση με τα χαρακτηρισμένα ολοένζυμα ευκαρυωτικής προέλευσης και είναι παρόμοια με αυτή ενός πρωτεϊνικού μορίου [Stathopoulos et al. 1995]. Παρότι έχει αποδειχθεί ότι το ολοένζυμο αποτελείται από RNA και πρωτεΐνες, πολύ λίγα είναι γνωστά για την ακριβή σύσταση του ριβονουκλεοπρωτεϊνικού συμπλόκου. Πρόσφατα εντοπίστηκε το γονίδιο της RNA υπομονάδας της RNase P από το D. discoideum μέσω συγκριτικής φυλογενετικής ανάλυσης, μήκους 369 νουκλεοτιδίων [Marquez et al. 2005]. Χρησιμοποιώντας τις πρωτεϊνικές υπομονάδες Rpp20 και Rpp40 της RNase P του ανθρώπου πραγματοποιήθηκε αναζήτηση στη τράπεζα δεδομένων της αλληλούχισης του γενωμικού DNA του D. discoideum. Το αποτέλεσμα της αναζήτησης ήταν η εύρεση δύο ανοιχτών πλαισίων ανάγνωσης (drpp20 και drpp40) που κωδικοποιούν δύο πρωτεΐνες (DRpp20 και DRpp40) οι οποίες παρουσιάζουν σημαντική ομολογία με τις υπομονάδες. Η επαγόμενη πρωτεΐνη DRpp20 έχει προβλεπόμενο μοριακό βάρος 26,4 KD, pI 5,6 και επιδεικνύει σημαντική ομοιότητα με την χαρακτηρισμένη πρωτεϊνική υπομονάδα Rpp20 του ανθρώπου (34% ταυτότητα, 56% ομοιότητα σε μήκος 140 αμινοξέων). Όμοια, η πρωτεΐνη DRpp40 έχει προβλεπόμενο μοριακό βάρος 48,2 KD, pI 5,5 και παρουσιάζει σημαντική ομοιότητα με την πρωτεϊνική υπομονάδα Rpp40 (26% ταυτότητα, 45% ομοιότητα σε μήκος 302 αμινοξέων). Παρά την συνολική ομοιότητα, τα μοριακά βάρη των DRpp20 και DRpp40 διαφέρουν σημαντικά σε σχέση με αυτά των ομόλογων πρωτεϊνών τους. Η DRpp20 διαθέτει μια περιοχή χαμηλής πολυπλοκότητας, πλούσια σε κατάλοιπα θρεονίνης, γλουταμίνης και λυσίνης που πιθανόν να συνεισφέρει στο επιπλέον μοριακό βάρος όπως φαίνεται από την στοίχιση με το Clustal W. Τόσο οι επαναλήψεις τρινουκλεοτιδίων γενωμικών περιοχών όσο και οι περιοχές χαμηλής πολυπλοκότητας σε επίπεδο πρωτεΐνης υπάρχουν σε αφθονία στο D. discoideum [Eichinger et al. 2005] και παραμένει να αποδειχτεί εάν αυτά τα χαρακτηριστικά συνεισφέρουν δομικά ή λειτουργικά στις DRpp. Από βιοπληροφορική ανάλυση προκύπτει ότι καμία από τις υπομονάδες των Αρχαίων ή τις εννέα υπομονάδες της ζύμης δεν παρουσιάζει ομοιότητα με τις DRpp20 και DRpp40. Επιπρόσθετα, με την βοήθεια του Pfam αλλά και των προγραμμάτων που συνδέονται με τον MetaServer εντοπίσαμε στην περιοχή 56-126 αμινοξέα της πρωτεΐνης DRpp20 το δομικό μοτίβο των Alba πρωτεϊνών. Η μελέτη των δύο πρωτεϊνών με βάση τον αλγόριθμο PSORT υποδεικνύει ότι και οι δύο πρωτεΐνες έχουν μεγαλύτερη πιθανότητα για χωροθέτηση στον πυρήνα παρά σε οποιοδήποτε άλλο υποκυτταρικό διαμέρισμα. Στην παρούσα εργασία τα υπό μελέτη γονίδια drpp20 και drpp40 κλωνοποιούνται σε φορέα υπερέκφρασης pET-29 και εισάγονται σε δεκτικά κύτταρα BL21(DE3)pLysS. Οι ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες απομονώνονται από το κυτταρικό εκχύλισμα με χρωματογραφία συγγενείας σε στήλη νικελίου. Οι πρωτεΐνες DRpp20 και DRpp40 με την μέθοδο που απομονώνονται παραλαμβάνονται σχεδόν στην φυσική τους μορφή όπως προκύπτει και από τα φάσματα του κυκλικού διχρωϊσμού. Οι πρωτεΐνες αυτές χρησιμοποιούνται για την παραγωγή πολυκλωνικών αντισωμάτων καθώς επίσης και για λειτουργικές μελέτες οι οποίες περιγράφονται παρακάτω. Όπως αποδεικνύεται οι πρωτεΐνες DRpp20 και DRpp40 αποτελούν τμήματα του μακρομοριακού συμπλόκου της RNase P. Πολυκλωνικά αντισώματα έναντι των συγκεκριμένων πρωτεϊνών ανιχνεύουν μία ζώνη που συνεκλούεται με την δραστικότητα του ολοενζύμου σε ανάλυση κατά Western. Επιπρόσθετα, η ισχύς αυτής της αλληλεπίδρασης επιτρέπει την κατακρήμνιση καταλυτικά δραστικού ενζύμου με την χρήση των πολυκλωνικών αντισωματών anti-DRpp20 και anti-DRpp40. Μεταξύ των πρωτεϊνών και της RNA υπομονάδας καθώς επίσης του tRNA υποστρώματος αναμένεται να υπάρχουν αλληλεπιδράσεις RNA πρωτεϊνών. Για το λόγο αυτό ελέγχθηκε η ικανότητα των πρωτεϊνών DRpp20 και DRpp40 να αλληλεπιδρούν με μόρια RNA και ιδιαίτερα με μόρια tRNA. Σε μία σειρά πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν δοκιμάστηκαν μόρια tRNA, ολικό RNA αλλά και πλασμιδιακό DNA χωρίς όμως κάποιο αποτέλεσμα στις συνθήκες που πραγματοποιήθηκε η αντίδραση, παρότι άλλες πρωτεΐνες που φέρουν το μοτίβο των Alba πρωτεϊνών έχουν την ικανότητα να αλληλεπιδρούν με μόρια DNA ή δίκλωνα τμήματα RNA. Τέλος, για τις DRpp20, DRpp40 αλλά και το ολοένζυμο, πραγματοποιήθηκε έλεγχος για δραστικότητα ΑΤΡασης κυρίως εξαιτίας της ομολογίας της πρώτης με την Rpp20 του ανθρώπου που διαθέτει τέτοια ιδιότητα, χωρίς να ανιχνεύεται μέσω βιοπληροφορικής ανάλυσης σημαντική ομολογία με αντίστοιχα ένζυμα. Στις συνθήκες που δοκιμάστηκαν δεν ανιχνεύτηκε δραστικότητα ΑΤΡασης που να σχετίζεται με κάποια από τις δύο πρωτεΐνες ή το ολοένζυμο. Ο απώτερος στόχος μας είναι ο προσδιορισμός της ελάχιστης λειτουργικής δομής καθώς και η χαρτογράφηση των αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης-πρωτεΐνης και RNA-πρωτεΐνης στο ολοένζυμο της RNase P. Η ολοκλήρωση της μελέτης θα συμβάλλει στην κατανόηση του καταλυτικού μηχανισμού και της εξέλιξης της ριβονουκλεάσης Ρ από ένα αρχέγονο ριβοένζυμο σε ένα υψηλά οργανωμένο ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο. / Ribonuclease P (RNase P) is a ubiquitous and essential ribonucleoprotein enzyme that matures the 5´ end of all primary tRNA transcripts. It has been studied from a variety of organisms, representing the three domains of life (Bacteria, Archaea and Eukarya), as well as from the major subcellular organelles, mitochondria and chloroplasts [Frank and Pace 1998, Xiao et al. 2002]. RNase P enzymes contain a similar in size RNA subunit which is absolutely required for catalysis. However, the size and number of protein subunits of the holoenzyme varies significantly, from one small subunit in bacteria to ten subunits in human RNase P [Frank and Pace 1998, Chamberlain et al. 1998, Jarrous 2002]. The RNA subunit from bacteria and some archaea is catalytically active in vitro in high ionic strength and in the absence of the protein fraction of RNase P [Guerrier-Takada et al.1983, Pannucci et al. 1999]. No such activity has been proven yet for eukaryotic RNA subunit but is still considered to be intrinsically a ribozyme [Frank et al. 2000]. Dictyostelium discoideum RNase P holoenzyme is a ribonucleoprotein complex, consisted of RNA and proteins essential for catalytic activity. Considering its buoyant density, D. discoideum RNase P exhibits one of the most proteinaceous idiosyncrasies, among the characterized holoenzymes of eukaryotic origin [Stathopoulos et al. 1995]. Although it has been established that this enzyme contains both RNA and protein components, very little is known on the exact composition of the ribonucleoprotein complex. A recent report identified a putative RNA subunit of D. discoideum RNase P of length of 369 nucleotides through phylogenetic comparative analysis [Marquez et al. 2005]. Genomic analysis of the available data from D. discoideum sequencing projects, revealed among others the existence of two open reading frames (drpp20 and drpp40) encoding two proteins (DRpp20 and DRpp40) that show significant similarity to previously characterized proteins subunits Rpp20 and Rpp40 from human RNase P. The encoded protein DRpp20 has a predicted molecular mass of 26,4 KD, pI 5,6 and exhibits significant similarity to characterized human RNase P protein subunit, Rpp20 (34% identity, 56% similarity at a length of 140 amino acids). Likewise, the protein DRpp40 of a predicted mass of 48,2 KD and pI 5,5, displays significant similarity to its human counterpart, Rpp40 (26% identity, 45% similarity at a length of 302 amino acids). DRpp20 harbors a region of low complexity (rich in threonine residues) which confers to higher MW in comparison with the human homologue. Such regions have not been encountered so far in proteins of this kind in other organisms. Tandem repeats at the genomic and the protein level, are abundant in D. discoideum [Eichinger et al. 2005] and it remains to be proven if these features contribute to the structure and function of DRpp proteins. To the best of our knowledge no homologues of DRpp20 and DRpp40 have been identified in yeast and archaeal RNase P enzymes. Additionally, pattern search of the D. discoideum protein sequences using MetaServer and Pfam prediction tools identified a DRpp20 region (amino acids 56 to 126) that bears similarity to the Alba domain. PSORT analysis of DRpp20 and DRpp40 predicts that these proteins are likely to localise into the nucleus. In this study the putative ORFs were subcloned into pET-29 expression vector and the recombinant vectors were used for the transformation of BL21(DE3)pLysS. The recombinant polypeptides were purified from the cell extract using Ni2+-nitriloacetic acid agarose column. The purified proteins are isolated in their native form as supported by circular dichroism analysis of the preparations. These preparations were used for the production of polyclonal antibodies as well as functional studies as described below. DRpp20 and DRpp40 are functionally associated with the RNase P ribonucleoprotein catalytic complex. Using anti-DRpp20 and anti-DRpp40 polyclonal antibodies we ascertained the concurrence of DRpp20 and DRpp40 with purified RNase P activity after standard purification schemes. Moreover, the nature of this association permits the precipitation of RNase P activity through antigen-antibody interaction using the same antibodies. RNA-proteins interactions between the protein subunits, the RNA moiety and/or the RNA substrate are expected in the holoenzyme complex, and therefore the ability of DRpp40 and DRpp20 to bind to RNA molecules was investigated. In a series of experiments using a variety of binding partners (plasmids, tRNAs and total RNA), we did not detect any DNA or RNA binding properties for DRpp20 and DRpp40, although other proteins that contain the Alba core interact with DNA or double stranded RNA regions. Although neither DRpp20 nor DRpp40 harbours an ATPase domain, we tested DRpp40 and DRpp20 for ATPase activity mostly due to the latter homology with human Rpp20, which was shown to have ATPase activity. We could not detect any ATPase activity associated with aforementioned proteins or holoenzyme. Our future prospects are the determination of minimal catalytic core and the complete mapping of all protein-protein and RNA-protein interactions within RNase P holoenzyme. The completion of this project will contribute in a decisive manner to the understanding of both the catalytic mechanism and the evolution of RNase P from a primordial ribozyme to a highly organized ribonucleoprotein complex.

Η ριβονουκλεάση P είναι το ένζυμο το οποίο αναλαμβάνει την δημιουργία του 5´ ώριμου άκρου όλων των πρόδρομων μορίων tRNA. Πρόκειται για ένα ριβονουκλεο-πρωτεϊνικό σύμπλοκο το οποίο εντοπίζεται στα κύτταρα των οργανισμών και από τις τρεις κύριες φυλογενετικές περιοχές, τα Βακτήρια, τα Αρχαία και τους Ευκαρυώτες. Αποτελείται από μια υπομονάδα RNA απαραίτητη για την κατάλυση, ενώ το μέγεθος και ο αριθμός των πρωτεϊνικών υπομονάδων ποικίλλει από μια μικρή στα βακτήρια έως δέκα πρωτεΐνες στο ολοένζυμο που απομονώνεται από τα ανθρώπινα κύτταρα. Η υπομονάδες RNA των βακτηρίων καθώς επίσης και μερικών αρχαίων μπορούν να καταλύσουν την αντίδραση ωρίμανσης του tRNA απουσία της πρωτεΐνης in vitro, είναι δηλαδή ριβοένζυμα. Η ανακάλυψη αυτή διεύρυνε τις αντιλήψεις μας για τις ιδιότητες των βιομορίων και επανέφερε στο προσκήνιο την θεωρία του κόσμου του RNA. Στο ευκαρυωτικό ριβοένζυμο, ο ρόλος των πρωτεϊνών είναι πιο ουσιαστικός, καθώς η υπομονάδα RNA φαίνεται ότι χάνει μεγάλο μέρος της λειτουργικής της ανεξαρτησίας. Η διαλεύκανση των λειτουργών της κάθε υπομονάδας θα δώσει σημαντικές πληροφορίες για την εξέλιξη της RNase P από ένα αρχέγονο ένζυμο σε ένα πολύπλοκο ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο. Η RNase P από το Dictyostelium discoideum διαθέτει μια απαραίτητη για την δραστικότητα υπομονάδα RNA όπως και όλα τα ένζυμα αυτού του είδους. Παράλληλα διαθέτει έντονο πρωτεϊνικό χαρακτήρα καθώς διαθέτει την χαμηλότερη πυκνότητα επιπολής σε σχέση με ένζυμα RNase P από άλλους οργανισμούς. Οι πληροφορίες αυτές προέρχονται από τον αρχικό χαρακτηρισμό του ενζυμικού συμπλόκου, και δεν παρέχουν στοιχεία για την ακριβή σύστασή του. Στην παρούσα μελέτη, πραγματοποιήθηκε κλωνοποίηση και χαρακτηρισμός ενός από τα γονίδια που εντοπίστηκαν στο γονιδίωμα του Dictyostelium, ομόλογα προς χαρακτηρισμένα γονίδια από τον άνθρωπο και άλλους ευκαρυώτες. Το γονίδιο drpp30 κωδικεύει μια πρωτεΐνη 40.7 kDa, σημαντικά μεγαλύτερη από τις ομόλογες της. Η πρωτεΐνη DRpp30 υπερεκφράστηκε σε βακτηριακά κύτταρα, και μετά τον χρωματογραφικό καθαρισμό της χρησιμοποιήθηκε για την παρασκευή πολυκλωνικών αντισωμάτων. Η συμμετοχή της DRpp30 στο μακρομοριακό σύμπλοκο της RNase P πιστοποιήθηκε με ανοσοβιοχημική προσέγγιση, ενώ η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη προσδένει τo pre-tRNA υπόστρωμα του ενζύμου, καθώς και την υπομονάδα RNA in vitrο. Το μοντέλο ομολογίας της DRpp30 βάσει της κρυσταλλικής δομής της ορθόλογης Ph1877 από τα αρχαία, φανερώνει ότι η πρωτεΐνη αποκτά τη δομή αβ βαρελιού (ΤΙΜ barrel fold). Κατά τη διάρκεια της διατριβής, οι προσπάθειες για τον εντοπισμό του γονιδίου της RNA υπομονάδας ήταν σε εξέλιξη, όταν το εν λόγω γονίδιο αναγνωρίστηκε μέσω φυλογενετικών συγκρίσεων από την ομάδα του Norman Pace. Το μετάγραφο του γονιδίου εντοπίστηκε σε ενεργά κλάσματα RNase P, και παράλληλα εντοπίστηκε και ένα μικρότερο μετάγραφο του ίδιου γονιδίου. Προσδιορίστηκαν τα ακριβή 5´και 3´ άκρα των δύο αυτών μορίων και ακολούθησε κλωνοποίηση τους. Τα in vitro μετάγραφα των δύο κλωνοποιημένων αλληλουχιών μπορούν να υποκαθιστούν την ενδογενή RNA υπομονάδα του ολοενζύμου in vitro, ενώ δεν εντοπίστηκε έως τώρα ενζυμική δραστικότητα που να σχετίζεται με τα δύο αυτά μόρια. / Ribonuclease P is a ubiquitus ribonucleoprotein enzyme, responsible for the production of the 5´ mature ends of all precursor tRNA molecules. RNase P endonucleolytic activity has been isolated from organisms representing the three domains of life, namely Bacteria, Archaea and Eukarya. It has been shown to contain an essential RNA subunit and one (Bacteria) or more (Archaea, Eukaryotes) proteins. The RNase P RNA subunits from bacteria and some archaea are catalytically active in vitro, whereas those from eukaryotes and most archaea have lost most of their functionality and require protein subunits for activity. RNase P has been characterized biochemically and genetically in several systems, and structures for both RNA and protein subunits have emerged. The integration of structural and functional data is slowly forming a scenario for the evolution of RNase P from an ancient enzyme to a highly organized ribonucleoprotein complex. Dictyostelium discoideum RNase P harbors an essential RNA subunit, and has high protein content, as judged by its low boyant density. Nevertheless, our knowledge on the exact composition was limited. In the current study, a gene showing significant similarity to human Rpp30 RNase P protein subunit was identified in Dictyostelium genome. The gene encodes a protein (DRpp30) which is significantly larger than its homologues, due to an unusual C-terminus. The gene was cloned, overexpressed, and was used for the production of polyclonal antibodies. The participation of DRpp30 in the macromolecular complex of RNase P was verified by an immunobiochemical approach. The recombinant protein was shown to bind specifically both the RNase P RNA subunit and the pre-tRNA substrate in vitro, thus giving a first insight of its role in the holoenzyme complex. Homology modeling using as a template the archaeal Ph1887p, and molecular dynamics simulations of the modeled structure suggest that DRpp30 adopts a TIM-barrel fold. While our efforts to isolate the gene encoding the RNA subunit of D. discoideum RNase P were in progress, Norman Pace and his group identified it through phylogenetic comparison. The full transcript of the gene was detected in active RNase P samples along with a smaller transcript of the same gene. The exact 5´and 3´ ends of both transcripts were identified and were cloned. Both these transcripts can substitute the endogenous RNA subunit in vitro, but no enzymatic activity associated with these RNA molecules could be detected so far.

For the past 45 years, QKI has been studied for its role in the processes of development and central nervous system myelination using the qkv mouse. The presence of a single KH domain and the recent identification of a high-affinity binding site in mRNAs, suggests that it can bind to and regulate mRNAs through processes such as stability, splicing and transport. As a member of the STAR RNA binding family of proteins the QKI isoforms may also be involved in cell signaling pathways. / QKI's involvement in all of these processes, lead us to examine both the protein partners and the mRNA targets of the QKI complex in order to identify potentially new pathways regulated by QKI. In doing so, we identified a novel direct protein-protein interaction with PABP and for the first time described the relocalization of QKI to cytoplasmic granules following oxidative stress. In addition, in vivo mRNA interaction studies were performed and allowed the identification of approximately 100 new mRNA targets in human glioblastoma cells. One of the targets identified was VEGF mRNA. / Another QKI target mRNA is MBP, a major protein component of the myelin sheath and the candidate auto-antigen in multiple sclerosis (MS). In vivo MBP is symmetrically dimethylated on a single arginine residue. To further establish the role of the methylation of MBP in myelination, a methyl-specific antibody and an adenovirus expressing a recombinant protein arginine methyltransferase 5 (PRMT5) was generated. We show that methylated MBP is found in areas of mature myelin and that overexpression of the PRTM5 blocked the differentiation of oligodendrocytes. / Taken together these datas implicate QKI for the first time in the process of human cancer angiogenesis and could explain the vascularization defects observed in some of the qkI mutant mice. In addition, arginine methylation of MBP may prove to have an important role in the process of myelination and in the pathogenesis of demyelination and the autoimmune reaction in diseases such as MS.